Chlamydia trachomatis infection

摘要：疫苗是控制传染病最有效的工具，这些疾病会导致显著的发病率和死亡率。大多数疫苗通过非肠道途径给药，能够引发强烈的系统性体液免疫反应，但它们诱导的T细胞介导的免疫较弱，且在诱导粘膜保护方面效果不佳。考虑到大多数病原体通过粘膜表面进入体内，一种能在宿主与病原体首次接触点引发保护的疫苗是很有前景的。然而，尽管粘膜疫苗作为在粘膜表面提供保护的良好选择具有优势，目前只有少数粘膜疫苗获得批准。在本篇综述中，我们讨论了疫苗在不同粘膜表面的给药影响；适当的佐剂如何增强保护性粘膜免疫的诱导以及其他可能影响疫苗粘膜免疫反应的因素。 1.引言 疫苗是控制传染病、导致发病率和死亡率的重要原因的最有效工具。根据世界卫生组织的数据，疫苗每年在全球范围内预防超过250万人死亡。因此，疫苗成功地根除了天花，并减少了其他几种疾病如脊髓灰质炎和麻疹的发病率。 疫苗通过在体内模拟病原体感染来发挥作用，这导致免疫系统激活以对抗病原体。疫苗给药后，疫苗中的病原体相关分子模式（PAMPs）与注射部位的先天免疫细胞中的模式识别受体（PRRs）相互作用，并触发免疫级联反应，涉及趋化因子和细胞因子的产生增加，导致注射部位的抗原呈递细胞（APCs）数量增加。APCs主要负责抗原的摄取和随后呈递给激活B细胞的T细胞，导致抗体产生。因此，为了对病原体产生强大和有效的免疫反应，强烈激活B细胞和T细胞是必要的。 消除病原体后，适应性免疫系统会对其发展免疫记忆。这种免疫记忆是长期个体保护的基础，其特点是抗体的持续存在和记忆细胞的产生，这些细胞在再次暴露于同一病原体时会迅速重新激活。因此，疫苗接种的目标是诱导记忆细胞。 大多数疫苗通过非肠道途径给药，通常包括：皮下（SC）、皮内（ID）和肌肉内（IM）。ID免疫接种比IM注射诱导更强的免疫反应，而SC和IM在临床研究中诱导相似的反应。一个可能的解释是，真皮含有更多的树突状细胞（DCs），这有助于抗原的捕获，局部炎症诱导DCs的成熟和它们迁移到引流淋巴结，导致疫苗剂量节省。尽管ID疫苗注射比其他非肠道途径更有效地诱导免疫反应，但它在给药部位引起更严重的不良反应，其次是SC和IM途径。有研究表明，在15个月至5岁儿童中，接种B型流感嗜血杆菌多糖疫苗时，SC/ID注射可能比IM注射更疼痛。尽管有其优势，但使用非肠道途径需要针头，这使得这种途径更具侵入性且成本更高，除了由于使用不当而存在感染风险外，还需要训练有素的人员进行给药。此外，非肠道疫苗可以引发强烈的系统性体液反应，但提供较弱的T细胞介导的免疫和粘膜保护。 与非肠道疫苗相关的另一个问题是，这种途径只保护疾病而不是感染。一些研究发现，接种了针对B型脑膜炎奈瑟菌的疫苗的个体对侵袭性疾病有保护作用，但在随后的12个月内，并没有迹象表明N. meningitidis的携带密度有所减少。 考虑到大多数病原体通过粘膜表面进入体内，因为这些表面直接与空气、水、食物和环境接触，针对宿主与病原体首次接触点的疫苗具有吸引力，因为它们有潜力从首次接触点保护宿主免受病原体侵害。 通过粘膜表面和ID途径给药的疫苗显示出抗原的快速和广泛生物分布，以及诱导保护性粘膜和系统性细胞和体液反应的能力。特别是，粘膜疫苗更安全，因为它们不需要针头。这一方面也导致依从性增加。因此，它们便于在流行病/大流行环境中进行大规模疫苗接种，因为它们易于给药。尽管有所有这些优势，但由于粘膜疫苗需要安全有效的粘膜佐剂来实现预期的免疫反应，此外，抗原必须根据粘膜给药途径免受降解，目前只有少数粘膜疫苗可供商业使用，如表1所示。 鉴于上述情况，在本篇综述中，我们讨论了疫苗在粘膜表面的给药影响，适当的佐剂或载体配方如何促进保护性粘膜免疫的诱导，以及其他可能影响疫苗粘膜免疫反应的因素。 2.粘膜表面的免疫防御 粘膜表面覆盖了身体的400平方米，包括胃肠道、泌尿生殖道和呼吸道。为了防御感染，粘膜表面配备了由粘膜上皮细胞提供的物理、化学和免疫机制（图1）。物理屏障由细胞间的紧密连接和浓密的粘液层组成，防止外来物质的进入和/或粘附。生化屏障由pH差异和微生物群产生的抗菌肽提供。最后，免疫防御包括先天和适应性免疫反应。 图1 粘膜表面和防御机制。上皮细胞之间的紧密连接是抵御病原体的物理屏障。微生物群和抗菌肽分别是病原体的生物和生化屏障。为了引发特异性免疫反应，微褶(M)细胞负责在腔内摄取抗原并将其呈递给树突状细胞，树突状细胞通过MHC-II将其呈递给T淋巴细胞。T细胞分泌细胞因子，调节细胞反应的模式（Th1、Th2、Th17、Treg），并促进B细胞分化为浆细胞，这些浆细胞产生分泌型IgA（SIgA），能够在粘膜中和病原体。 粘膜组织拥有一个被称为粘膜相关淋巴组织（MALT）的有组织的淋巴组织团块。MALT包括被滤泡相关上皮覆盖的淋巴滤泡，其中含有微褶（M）细胞，它们负责在腔内摄取抗原并呈递给树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，在那里它们被处理并呈递给淋巴细胞。DCs将抗原呈递给初始T细胞，以克隆扩增并分化为T辅助（Th）细胞亚群（Th1、Th2、Th17或调节性T细胞）。每个亚群将决定细胞因子分泌的轮廓，之后，T细胞与B细胞相互作用，促进它们在多个粘膜部位的分化和抗体产生。这些B细胞将产生抗原特异性的分泌型免疫球蛋白A（SIgA），它防止病原体在粘膜表面的侵袭，以及IgG抗体。Th细胞在粘膜免疫中扮演重要角色。一些报告表明，主要由Th17细胞分泌的白介素（IL）-17是疫苗诱导的对肺炎链球菌、结核分枝杆菌和流感的保护所必需的。此外，IL-17可以通过上调粘膜上皮中的多聚Ig受体水平来增加SIgA水平，并促进B细胞不依赖T细胞分化成SIgA。 在肠道中，免疫系统级联反应发生在有组织的肠道相关淋巴组织（GALT）中，主要在Peyer氏斑中，这是IgA类别转换的主要部位。在上呼吸道中，它发生在小鼠的鼻相关淋巴组织中，由位于鼻咽管入口的硬腭上的一对有组织的淋巴聚集体组成。这种鼻组织在功能上似乎与人类的Waldeyer环扁桃体和腺样体相当。在下呼吸道中，发现了支气管相关淋巴组织。它是肺淋巴系统的一部分，通常在健康成人中不存在，但在抗原刺激下出现，包括炎症、吸烟习惯、胶原血管疾病、感染和艾滋病。 2.1.分泌型IgA：粘膜武器 如前所述，SIgA通过控制与宿主的首次接触以来的病原体定植，从而预防传染病，这是粘膜免疫的一个主要特征。IgA抗体，以其α重链为特征，存在于血清和粘膜中，有两种亚型：通常在血清中发现的IgA1，以及在粘膜中经常出现的IgA2。虽然IgA1主要由蛋白质抗原诱导，但IgA2在抗脂多糖（LPS）反应中占主导地位。 SIgA和血清IgA在位置、结构和功能上有所不同。SIgA通常呈现二聚体结构，并具有分泌成分，这为分子提供了稳定性，保护免疫球蛋白不被降解（鉴于粘膜环境的侵略性），从而帮助抗体与病原体蛋白结合。此外，SIgA是局部产生的，分泌量高，能够中和病原体。有证据表明粘膜中B细胞的快速周转以及长寿浆细胞的存在。最有可能的情况是，浆细胞会根据微生物群组成的变化而持续存在，微生物群的组成受到饮食、感染和抗生素治疗的影响，因此建立了一个动态平衡。 相反，血清IgA通常呈现单体结构，并且分泌滴度较低。有证据表明它有助于控制炎症，但关于其激活补体系统和促进病原体吞噬的能力存在矛盾的研究。SARS-CoV-2感染的粘膜性质导致了几项针对血清IgA的研究。早在2020年，就已验证人类单克隆IgA抗体能够有效地与SARS-CoV-2结合，并阻断血管紧张素转换酶2（ACE2）和受体结合域（RBD）的相互作用，表现出中和活性。因此，当转化为SIgA和IgG结构时，只有前者能够中和SARS-CoV-2。血清IgA也能够中和SARS-CoV-2，如Sterlin等人的研究，而Mazzini等人发现ELISA-IgA与微量中和试验有很好的相关性，因此，从血清样本中去除IgA显著降低了中和活性。比较表明，二聚体IgA比单体IgA表现出更强的中和能力，以及单体IgA和IgG。最近，Fox等人验证了COVID-19患者的牛奶样本在假病毒试验中具有中和作用。此外，粘膜免疫可以改善血清IgA的诱导，可能是因为B细胞在粘膜激活后归巢到脾脏边缘区。 目前的SARS-CoV-2疫苗也可以诱导IgA的产生，这一点已经对Moderna（mRNA1273）和辉瑞/BioNTech（BNT162b2）的mRNA疫苗以及牛津/阿斯利康（ChAdOx1）的病毒载体疫苗进行了验证。未来的粘膜疫苗可能会从异源初免-加强方法中受益。虽然粘膜免疫会诱导SIgA抗体，但非肠道剂量会改善系统性反应。啮齿动物的数据显示鼻内免疫增强了血清中的IgA以及血清和呼吸道粘膜中的IgA。然而，来自人类研究的证据很少。以前感染过COVID-19的疫苗接种志愿者，可能已经诱导了IgA反应，表现出比没有COVID-19病史的受试者更高的IgA滴度和更持久的IgA反应。我们可以推测，如果自然感染被视为鼻内初免，随后的非肠道疫苗将提供更好的免疫反应。另一项研究验证了mRNA疫苗在人乳中增加了IgA和IgG，尽管IgA比IgG更早减少。 有建议认为非肠道部位的淋巴引流可以作为系统性和粘膜免疫之间的交叉路径。这种观察可能让我们对通常分开的粘膜和系统免疫的观点产生疑问，并假设疫苗策略将从初免-加强方法中受益。尽管证据有限，但SIgA的贡献和血清IgA的前景作用应在疫苗研究中进行评估。 3.给药途径 粘膜疫苗能够在系统和粘膜部位诱导抗原特异性的体液和细胞介导的免疫反应。因此，粘膜免疫反应的诱导取决于疫苗的给药部位。口服免疫通常刺激胃肠道、唾液腺和乳腺的免疫反应和抗原特异性SIgA，而鼻内免疫诱导上呼吸道、下呼吸道、唾液腺和生殖器粘膜的抗体产生，舌下疫苗接种诱导胃肠道以及上下呼吸道的抗原特异性免疫反应，如图2所示。上述所有途径以及其他途径，例如阴道内和直肠途径，已在实验动物模型中应用，但只有口服和鼻内途径已在许可的人类疫苗中使用。 图2 粘膜部位的免疫接种不仅引发局部和系统性免疫反应，还在不同部位诱导粘膜反应。(a) 口服免疫刺激胃肠道、唾液腺和乳腺，考虑到母体-胎儿抗体转移，这一点尤其重要。(b) 鼻内途径在上呼吸道、下呼吸道、唾液腺和生殖器粘膜中诱导免疫。(c) 舌下疫苗接种在胃肠道以及上下呼吸道中引发反应。 尽管粘膜疫苗具有已知的潜力，但每种途径都有其含义。口服疫苗的开发代表了最大的挑战，这不仅是由肠道环境的侵略性所构成的——它降解了在其中传递的大多数抗原表位，影响疫苗的生物利用度——而且还由粘膜耐受性所构成，粘膜耐受性保护了对消化抗原的不希望的免疫反应。鼻内途径是一个有吸引力的部位，因为它所需的抗原和佐剂剂量比口服途径少，但它也面临着疫苗开发的挑战。鼻内疫苗配方需要到达呼吸道腔并穿过粘液层，其吸收就在那里发生；为此，疫苗配方需要考虑鼻腔的解剖和生理特征，如前庭区域的通透性差，以及毛发和粘液的快速周转，这些都干扰了成分的吸收。此外，鼻腔酶和局部pH可能影响疫苗的稳定性。 理想的粘膜疫苗在物理和化学屏障（pH和酶）方面是稳定的，将抗原传递到特定的免疫诱导部位，适应粘液周转，能够穿过上皮屏障，并且最终被APCs捕获，并且不诱导粘膜耐受性。使用佐剂是一种改善疫苗稳定性和吸收的策略，由于粘膜的生理和化学屏障，提供了更好的抗原传递。 4.粘膜佐剂 “佐剂”一词源于拉丁语adjuvare，意为帮助或援助。佐剂被定义为添加到疫苗配方中的功能性辅料，以增加其抗原的免疫原性。它们允许使用较低剂量的抗原和较少剂量的疫苗免疫方案。因此，佐剂通过增强其在粘膜部位的生物利用度来帮助增加配方的稳定性，其中自然防御机制，如pH、粘液层和运动可能会限制与APCs的相互作用，甚至降解抗原。这一方面影响了免疫反应的强度和持续时间。佐剂构成了一个异质化合物群，可以分为传递系统或免疫刺激分子。 4.1.免疫刺激佐剂 免疫刺激佐剂通过三种机制启动免疫激活：(1) 与非Toll样受体（非TLR）结合后的毒素介导的免疫刺激，例如宿主细胞表面存在的糖鞘脂。这一类别的最好代表是霍乱毒素（CT）和大肠杆菌产生的热敏毒素（LT）；(2) 是PRR配体的物质，例如TLR激动剂；(3) 天然免疫调节剂，如细胞因子、补体片段和信使分子。 研究最深入和最有效的粘膜佐剂是CT、LT和白喉毒素。这些毒素具有佐剂效应，被认为是粘膜佐剂的黄金标准；然而，由于它们的有害毒性效应，它们并未用于临床应用。为了避免这些毒性效应，已经创造了较少毒性的突变体，并连接到其他部分或肽以破坏毒素的活性位点，例如，重组霍乱毒素亚单位B已在Dukoral®疫苗中使用。 另一种使用的佐剂是PRRs配体。这些佐剂基于PAMPs激活，并通过TLR刺激作用。一个有前景的粘膜佐剂是单磷酸脂质A（MPL），源自大肠杆菌的LPS，其中MPL通过与TLR4相互作用刺激免疫反应。单独使用MPL不会引起系统性抗体或T细胞反应。因此，MPL已在包括脂质体和乳液的复合配方中使用，以及与Quillaja saponaria树皮的活性部分（QS-21）结合，形成AS01，它被包括在最近的疟疾疫苗RTS,S（Mosquirix）和目前正在开发的其他疫苗中，以诱导抗原特异性CD4+ T细胞反应，或与氢氧化铝结合形成AS04，由Glaxo-SmithKline在Cervarix™（人类乳头瘤病毒疫苗）和Fendrix™（乙型肝炎疫苗）中使用。 含有未甲基化CpG的合成寡脱氧核苷酸（ODNs）是另一种TLR激动剂。其基序触发表达TLR9的细胞，引发以Th1和促炎细胞因子产生为特征的先天免疫反应。CpG ODN诱导强烈的Th1反应，支持其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和干扰素（INF）-γ分泌的能力。它促进抗原的免疫调节效应，激活APCs，并加快免疫反应。CpG促进浆细胞样DCs上MHC、CD40和CD80的表达，并增强抗原处理和呈递。此外，存在于人类肠道粘膜的B淋巴细胞表达TLR9并响应CpG刺激，导致IgA水平增加。2017年FDA批准的乙型肝炎疫苗HEPLISAV-B是第一个使用CpG ODN作为佐剂的疫苗。 人类TLR5的天然激动剂鞭毛蛋白是细菌鞭毛的关键组成部分，也是另一种粘膜佐剂。鞭毛蛋白与TLR5结合，动员核因子（NF）-κB并通过MyD88依赖途径刺激肿瘤坏死因子（TNF）-α的产生。鞭毛蛋白也可以被NOD样受体（NLR）家族的另外两个受体NLRC4和NAIP5识别；然后，它激活炎症体途径。鞭毛蛋白是先天和适应性免疫系统的有效激活剂。已经证明，促进最大抗原特异性抗体反应所需的鞭毛蛋白剂量低于刺激最大先天免疫反应所需的剂量，因为鞭毛蛋白能够诱导包括DCs、自然杀伤细胞、上皮细胞和淋巴结基质细胞在内的许多先天和非免疫细胞产生促炎细胞因子和趋化因子。 细胞因子和趋化因子已被证明在粘膜部位作为佐剂发挥作用。包括干扰素（INF）-γ、INF-α、IL-12、IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和Flt-3配体在内的重组细胞因子类似物已被报道具有佐剂活性。IL-1家族细胞因子能够诱导IgA和IgG抗体，而IL-6、IL-12和IL-15诱导CTL反应和疫苗特异性IgA抗体。然而，剂量相关的毒性和稳定性问题等限制阻碍了它们在疫苗中的应用，尽管通过将其包裹在脂质体或微/纳米颗粒中已用来克服这些问题。 4.2.传递系统 传递佐剂包括微球、纳米或微粒、聚合物、乳液、脂质体和免疫刺激复合物（ISCOM），它们被用来包裹抗原并将其传递给特定细胞。传递系统旨在改善抗原在粘膜表面的运输，同时保护它不受降解和/或在局部粘膜环境中的清除，以改善疫苗分布。 脂质体是具有两亲性质的球形脂质双层结构。由于一些优势，它们已被用作疫苗抗原的传递载体，例如防止抗原降解、组织储存效应或抗原的缓慢释放以及促进APCs对抗原的摄取，除了它们的生物相容性、生物可降解性、低毒性和两亲性质。此外，可以在脂质体表面添加：配体，用于特定细胞靶向，粘膜粘附剂和甘露糖衍生物，除了纳入TLR配体或其他PRR配体和免疫球蛋白以有效传递包裹或结合的抗原。阳离子脂质体比阴离子和中性脂质体更具免疫原性；此外，带正电荷的脂质体更好地与带负电荷的抗原结合，并影响它们在给药部位的保留，从而产生储存效应。二甲基二十八烷基铵（DDA）是一种广泛使用的阳离子脂质体，它主要由于抗原负载脂质体和单独给药的抗原之间的大小特征，在注射部位促进储存形成。阳离子佐剂配方01（CAF01）由DDA和海藻糖二油酸酯组成，这是一种合成变体，位于结核分枝杆菌细胞壁的绳索因子。这种配方已在动物模型中与不同病原体一起使用，如结核分枝杆菌、沙眼衣原体、链球菌等，以及基于重组蛋白亚单位（CTH522）的沙眼疫苗的1期临床试验，该疫苗用CAF01佐剂。CAF01被观察到是一种良好的粘膜佐剂；小鼠研究表明，它诱导Th1/Th17谱并增加IgA抗体反应。 粘膜粘附和粘液穿透成分的结合补偿了疫苗配方在粘膜液体中的稀释以及它们在粘膜更替中的损失，通过它们与粘膜上皮表面粘液层和粘液分子的相互作用，增加了剂量配方在吸收部位的抵抗时间。聚乙二醇是一种亲水成分，可以与粘液形成氢键，导致粘膜粘附，并帮助颗粒穿透粘膜，防止聚集，从而促进其穿过粘膜屏障。 另一种广泛研究的粘膜粘附剂是壳聚糖，它是一种低毒性的亲水、生物相容性和生物可降解的聚合物。壳聚糖具有一些对粘膜疫苗接种相关的属性，例如其带正电荷的分子与带负电荷的粘液相互作用以改善粘附；它增强了由于其能够短暂打开上皮紧密连接而增强的穿透性，从而改善了抗原取样及其促进INF-γ、IgG和SIgA分泌的佐剂属性。一项研究评估了一种基于壳聚糖功能化的铁氧化物纳米酶的鼻内流感疫苗，该研究发现壳聚糖增加了抗原对鼻粘膜的粘附，促进了DC的招募和跨上皮树突的形成以进行病毒摄取，并增加了小鼠的IgA-粘膜适应性免疫，提供了针对病毒的保护。 ISCOM是一种直径为30-40纳米的带负电荷颗粒，用作抗原的传递系统。ISCOM是在将抗原与胆固醇、磷脂（通常是磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱）以及从Quillaja saponaria Molina树树皮提取的皂苷Quil A混合后形成的。ISCOM的物理特性有助于抗原稳定性，减少与皂苷相关的溶血作用，并改善与DCs的相互作用，从而增强了所结合抗原的交叉呈递，产生抗体和CD4+和CD8+ T细胞反应。ISCOM上调Th1和Th2反应，并刺激强烈的体液反应（IgG1、IgG2a和IgG2b）以及细胞毒性T细胞诱导。已证明ISCOM佐剂是一种良好的粘膜佐剂，因为它诱导强烈的粘膜免疫反应，包括在鼻内接种ISCOM复合多种抗原后在鼻洗液和肺部产生大量IgA。使用与CT和金黄色葡萄球菌蛋白A（CTA1-DD）融合的ISCOM通过口服或鼻内给药诱导强烈的细胞介导和体液免疫反应，包括粘膜IgA。 5.母体-胎儿抗体转移 母体IgG抗体在怀孕期间通过胎盘被动转移到胎儿体内，这对出生后第一年系统免疫至关重要，因为此时免疫系统正在适应和成熟。推荐孕妇接种一些疫苗加强剂，例如针对流感、破伤风、百日咳和白喉的疫苗，以确保母亲和婴儿都受到保护。 然而，SIgA也通过母乳喂养传递给新生儿，并保护胃肠道——考虑到儿童经常遭受腹泻性感染，这是一个重要的问题。如本综述（给药途径部分/图2）所述，粘膜免疫可以增强乳腺中的SIgA，这将有利于通过母乳喂养传递SIgA。研究发现，从初乳样本中分离的SIgA在体外抑制了肠致病性大肠杆菌对Hep-2细胞的聚集，而从IgA中耗尽的初乳则无法做到这一点。因此，母亲的初乳和她婴儿的粪便在免疫印迹分析中识别了相同的大肠杆菌抗原，表明这些抗体在整个胃肠道中的持久性。母乳喂养的新生儿自出生后第一周起粪便中就含有SIgA，而配方奶喂养的新生儿直到第三周才含有。鉴于胃肠道感染对儿童的负担，应考虑在怀孕期间进行粘膜免疫。下一节将讨论微生物群对免疫反应调节的重要性。值得注意的是，母乳喂养可能通过传递微生物和作为益生元来塑造微生物群，这表明这些主题是多么复杂。 6.影响粘膜免疫反应的其他因素 6.1.维生素 维生素A（VA）是一种脂溶性维生素，包括视黄醇、视醛和视黄酯。VA通过食物途径从植物和水果中的前维生素A类胡萝卜素（如β-胡萝卜素）中获取。VA通过一系列酶，包括醇脱氢酶和视醛脱氢酶，代谢成其生物活性形式视黄酸（RA）。RA对激活的淋巴细胞上肠归巢分子α4β7和CCR9的诱导至关重要，并且对依赖于RA和TGF-β结合的FoxP3 Treg细胞的诱导至关重要。因此，RA被报道指导B细胞中免疫球蛋白类别转换，增加IgA的产生，这有助于宿主抵御肠道中的微生物。 维生素A缺乏症（VAD）与疾病易感性增加、疫苗反应差和死亡率增加有关。VAD导致大鼠和小鼠的肠粘膜以及雏鸡的气管上皮中IgA的产生减少。此外，VAD损害疫苗接种后的免疫反应：研究表明，在VAD小鼠中FluMist疫苗接种损害了免疫反应，而接种疫苗时口服RA或视黄棕榈酸酯增加了VAD小鼠中IgA的产生。在接种肺炎球菌疫苗（Prevnar-13）时，通过腹膜内途径给VAD小鼠口服VA补充剂（VAS），结果显示肺炎球菌（T4）特异性抗体（IgM和IgG1）得到改善。另一项研究表明，VAS和重组沙眼衣原体抗原的非肠道疫苗在小鼠中增加肠道IgA。因此，所有这些研究表明VAD损害了对疫苗的粘膜免疫反应，但VAS可以逆转这种效应，即使在非肠道免疫中也能增加IgA的产生。 补充全反式视黄酸（ATRA），VA的活性代谢物，导致恒河猴、黑猩猩和人类血液样本中DCs的α4β7整合素表达增加，这对肠道归巢运输很重要。这种治疗还改善了人类B细胞在体外培养中向浆细胞的分化和成熟。 研究表明，维生素A和D补充剂改善了儿童对流感疫苗的体液反应，这些儿童在基线时这些营养素的水平不足。在儿童和成人的混合队列中，评估了VA、抗流感抗体和炎症相关细胞因子。VA水平较高与IgA抗体和更高滴度的中和抗体相关。有趣的是，VA水平低的个体的鼻腔冲洗样本表达了更多的细胞因子和生长因子，使作者建议VA可能在控制粘膜组织中的炎症中发挥作用。 在婴儿中，一些研究表明VAS可以改善对某些疫苗（如破伤风、白喉类毒素、麻疹和乙型肝炎）的抗体反应。 尽管实验模型的证据非常充分，但关于VAS和疫苗反应的人类研究仍然很少，这使其成为一个有前景的研究领域。 6.2.微生物群 微生物群在许多身体功能中发挥关键作用，如食物消化、合成必需维生素和抵御病原体入侵。微生物群落稳态的改变导致肠道微生物失衡和肠道屏障异常。 已经表明微生物群影响疫苗的免疫反应，微生物的改变影响对注射和口服疫苗的免疫反应。无菌（GF）小鼠缺乏微生物群，显示Peyer氏斑的数量和大小减少，更少的固有层CD4+ T细胞，除了降低类别转换抗体IgA和IgG的水平；它们还缺乏发达的GALT。此外，小鼠早期生活中的抗生素驱动的失衡导致对全球通常给婴儿接种的五种不同疫苗的抗体反应受损——B群脑膜炎球菌疫苗（Bexsero）、C群脑膜炎球菌疫苗（NeisVac-C）、13价肺炎球菌结合疫苗（Prevenar）、六联疫苗（对抗乙型肝炎、白喉、破伤风、百日咳、B型流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎病毒，INFANRIX Hexa），以及结核BCG疫苗。另一项研究还表明，抗生素治疗导致微生物组失衡，并影响健康成人对H1N1疫苗的免疫反应。 在中国婴儿中，梭菌科的富集与口服脊髓灰质炎疫苗最后一剂后抗脊髓灰质炎粘膜IgA的阴性检测有关，而放线菌的丰富与抗脊髓灰质炎粘膜IgA呈正相关，多样的肠道微生物群与口服脊髓灰质炎疫苗的粘膜免疫反应呈负相关。 加纳的一项研究报告称，口服轮状病毒疫苗（ORVV）的应答者在接种疫苗前6周大的婴儿中，Bacilli类成员（特别是Streptococcus bovis）的丰度较高，而非ORVV应答者在Bacteroidetes门中，特别是Bacteroides和Provotella种的丰度较高。 另一项研究分析了微生物群对成人接种口服伤寒沙门氏菌疫苗前1周的免疫反应的影响。研究发现，具有更多样化、复杂细菌群落的参与者具有多相细胞介导的免疫反应，这与对疫苗的更好反应相关；然而，该研究没有显示体液应答者和非应答者之间的群落多样性差异。 益生菌对先天和适应性免疫反应有影响。它们通过与肠道免疫细胞和上皮细胞的相互作用或间接通过肠道微生物组调节来介导免疫效应。一项研究表明，每天服用动物双歧杆菌（BB-12®）和副干酪乳杆菌（L. casei 431®）的志愿者，连续6周，并在接种三价灭活流感疫苗后，流感特异性IgG、IgG1、IgG3水平增加，特异性IgA水平更高。 另一项研究中，志愿者连续5周服用L. acidophilus和L. rhamnosus，结果显示接种疫苗后，脊髓灰质炎病毒中和抗体水平和脊髓灰质炎病毒特异性IgA和IgM水平增加。此外，一项比较7种不同益生菌菌株（B. lactis、L. acidophilus、L. plantarum和L. paracasei）连续3周的研究表明，在口服霍乱疫苗接种后，霍乱特异性IgG水平提高，接种B. lactis和L. acidophilus的个体诱导了高滴度的霍乱特异性IgA和IgM。 6.3.在发展中国家口服疫苗的问题 当分析现实世界证据时，口服疫苗在高收入国家的效能高于中低收入国家。值得注意的是，这些国家胃肠道感染的负担更为突出。 虽然在美国和芬兰等国家，活体口服轮状病毒疫苗的效能超过70%，但在非洲国家的效能为61%——值得一提的是，个体评估在南非为76.9%，而在马拉维为49.4%。在美国与印度相比，口服脊髓灰质炎疫苗后的血清转换率更高。在接种口服霍乱疫苗后，来自瑞典斯德哥尔摩的儿童比来自尼加拉瓜莱昂的儿童表现出更高的IgA和弧菌杀菌滴度。这样的方面引发了一个问题：是什么损害了这些疫苗的免疫原性？ 正如本综述前面所讨论的，VAD和微生物群的损害影响免疫反应。食物不安全导致微量营养素营养不良；缺乏清洁水源、适当的卫生设施和卫生教育可能会破坏微生物群的构成，增加肠道病原体的定植。这些问题在发展中国家更为常见，妨碍了口服疫苗的效能。另一个相关问题是新生儿肠道中存在高滴度的抗体，可能通过母乳喂养从不断接触肠道病原体的母亲那里转移。因此，应该研究疫苗接种时间表。有报告称，最近的脊髓灰质炎疫苗接种限制了轮状病毒疫苗的效果，可能是因为口服脊髓灰质炎疫苗可能与口服轮状病毒疫苗竞争，妨碍了强大的体液反应。 总之，一系列因素妨碍了贫困国家口服疫苗的效能。建议使用加强剂量作为克服这些障碍的方法。然而，造成这个问题的社会经济差异应该是讨论的话题，需要政府、科学家和私营部门的参与来解决——就像公共卫生的任何话题一样。 6.4.我们应该针对SARS-CoV-2开发粘膜疫苗吗？ SARS-CoV-2是一种呼吸道病原体——累积证据表明也涉及胃肠道。有效的粘膜免疫被认为是轻度和重度患者之间的差异性方面，提供对上呼吸道病原体的控制。到目前为止，证据已经指出，尽管肌肉内疫苗激发了有效的系统性免疫，但它们未能激活粘膜免疫，这将解释为什么SARS-CoV-2的传播仍然是一个问题。鼻微生物组也被认为是COVID-19临床表现的决定性方面。如前所述，粘膜疫苗易于给药并诱导局部免疫，这两个方面在考虑SARS-CoV-2的粘膜性质和在大流行情况下迫切需要大规模免疫的情况下都是有趣的。 确实，目前有多种粘膜COVID-19疫苗正在进行临床试验，主要是鼻内给药。然而，非肠道疫苗与粘膜疫苗的数量差异——分别是118种和16种，更不用说目前有20多种非肠道疫苗在使用中——留下了一个未解的问题：粘膜免疫是一种被低估的技术，还是前面讨论的障碍阻碍了这种有前途的工具的开发，以控制COVID-19？ 7.结论 粘膜疫苗可以在粘膜表面保护宿主免受病原体的初次接触，并且由于其给药方便和患者接受度高，其应用成为流行期间的一个良好选择。然而，尽管有所有这些优势，但并没有很多粘膜疫苗被批准用于人类使用，因为许多疫苗配方需要根据粘膜给药途径保护抗原免受降解。因此，在疫苗配方中应用佐剂是克服问题的一个好策略。然而，选择一个好的佐剂并不足以改善粘膜疫苗，因为微生物群和维生素可以影响粘膜免疫反应。 一些疾病对微生物群落和维生素吸收有显著影响，如肥胖、糖尿病、炎症性肠病等，这可能妨碍粘膜疫苗的效能。此外，在疫苗接种时间表中应用VA补充剂和益生菌似乎是一个调节粘膜免疫和增加某些个体对疫苗免疫反应的好策略。 因此，开发理想的粘膜疫苗不能仅仅归结为选择完美的佐剂；有必要考虑患者特定的因素，并且，这样分析可能影响疫苗粘膜免疫反应的所有方面。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：合成生物学的目标是设计或组装现有的生物部件或生物组件，以获得有用的生物特性。在过去的几十年中，人们已经取得了进展，构建了精细的生物回路、标准化的生物学构建模块，并开发了各种基因组/代谢工程工具和方法。医疗和制药需求也推动了合成生物学的发展，包括将异源途径整合到设计好的细胞中，以高效生产医疗剂；在细胞生长介质中提高天然产物的产量，使其等同于或高于从植物或真菌中提取的产物；构建新的遗传回路以实现肿瘤靶向，可控释放治疗剂以响应特定生物标志物，以对抗糖尿病和癌症等疾病。此外，还开发了新策略来治疗传统方法难以治愈的复杂免疫疾病、传染病和代谢紊乱。总的来说，合成生物学为医疗和制药研究带来了新的能力。本综述总结了合成生物学发展的历程，合成生物学在微生物生产药物、配备合成DNA电路的工程细胞用于诊断和治疗、活体和自动组装的生物材料用于医疗治疗、无细胞合成生物学在医疗和制药领域的应用，以及具有生物医学应用潜力的DNA工程方法的过去和现在。 1.引言 合成生物学的概念最早由Stephane Le Duc在1910年代提出。在这个领域，研究策略已经从描述和分析生物事件转变为设计和操纵期望的信号/代谢途径，类似于已经定义好的有机合成。与19世纪初成功发展的有机合成不同，合成生物学受到生物系统内部DNA、RNA和蛋白质技术的复杂性的限制。如今，合成生物学已经得到了广泛的开发。它已经成为一个多学科领域，旨在基于现有知识开发新的生物部件、系统甚至个体。研究人员可以应用工程范式来生产具有可预测和健壮的系统，这些系统具有自然中不存在的新功能。合成生物学与生物技术、生物材料和分子生物学等多个学科紧密相连，为这些领域提供了方法论和学科。 合成生物学发展的时间线在这里进行了总结（图1）。总的来说，合成生物学的历史可以分为三个阶段。最初阶段贯穿了整个20世纪。尽管在20世纪，病毒颗粒、细菌、古菌和真菌等最简单的生物体很难被工程化，但在早期探索中仍然取得了一些成就，包括结晶牛胰岛素的合成、DNA和RNA的化学合成、遗传密码的破译以及分子生物学中心法则的建立。在这个时期，随着20世纪末基因组生物学和分子生物学的快速发展，合成生物学一直在积累力量（图1）。 图1 合成生物学主要里程碑的时间线。时间线从20世纪50年代开始，扩展到21世纪20年代。重要事件列在右侧面板中。 发展阶段始于21世纪。在新千年的第一个十年中，合成生物学已经成为每个生物学研究人员都知道的领域，包括生物开关、基于群体感应信号的基因回路、酿酒酵母细胞工厂合成变形螺烯、BioBrick标准化组装和iGEM会议的发明。在这个阶段，合成生物学设计中考虑了两个原则，包括瓶颈和自上而下的原则，分别指通过组装基本生物分子创造人工生命的新创举和工程改造自然存在的细胞以满足实际需求。然而，大多数回路设计得很好，但仍然不足以生产复杂的代谢物或感知多种信号，特别是应用尚未为医疗和制药用途做好准备。无论如何，合成生物学逐渐成为一个最热门的领域，在快速发展的前夕。 快速增长阶段始于2010年代，特别是CRISPR/Cas9基因组编辑技术、低成本DNA合成、下一代DNA测序和高通量筛选方法的出现，以及设计-构建-测试-学习（DBTL）的工作流程和工程生物学的进步，使合成生物学进入了快速发展时期，无论是在实验室规模的发现还是工业规模的生产。典型地，Venter等人组装了一个人工染色体的支原体并将其移植到M. capricolum中，创造了新的活细胞。此外，新方法加速了代谢生物合成途径的发现和工程，微生物合成青蒿酸已成为可能，这是第一种由微生物细胞生产的工业化植物代谢物。要实现设计生物系统的最终目标，就像设计电子或机械系统一样，这仅仅是个开始。需要更多的努力来生成复杂和稳定的生物回路，以满足当前合成生物学的各种应用。 除了科学家，投资者也意识到了这个领域的潜力。金融投资帮助建立了与合成生物学相关的公司，预计到2021年全球合成生物学市场价值95亿美元，包括合成生物学产品（例如，BioBrick部件、合成细胞、生物合成化学品）和使能技术（例如，DNA合成、基因编辑），预计到2026年将达到370亿美元。大多数投资都集中在医疗应用上。科学家和资本市场对未来都持乐观态度。 从化学生物合成开始，合成生物学已经扩展到医疗治疗、药物开发、化学工程、食品和农业以及环境保护等领域。本文重点关注合成生物学在医疗和制药领域的进展，包括细胞治疗、细菌活体诊断和治疗、治疗性化学品的生产、纳米技术及纳米材料应用以及靶向基因工程。 2. 基因工程治疗载体 2.1. 用于医疗应用的工程哺乳动物细胞 随着合成生物学的进步，研究人员利用现有信号网络合理设计出用于特定目的的活细胞载体，并为其创建新的结构，开发了各种新疗法，包括例如生产医用生物分子、用于传感或诊断的合成基因网络，以及可编程生物体，以处理疾病背后的机制和相关生物体/个体事件（图2）。在这里，我们重点介绍了哺乳动物细胞工程中的合成生物学策略，用于代谢紊乱、组织工程和癌症治疗，以及细胞治疗和基因回路设计的方法。 图2 基于合成生物学策略的智能活细胞的发展。智能细胞能够感应各种环境生物标志物，从化学物质到蛋白质。外部信号被转导到细胞内以触发下游反应。产品也以化学物质或蛋白质的形式存在，以满足定制需求。感应-反应系统赋予细胞新的或增强的能力。P代表启动子。 基于嵌合抗原受体（CAR）T细胞的疗法。CAR是包含抗原结合和T细胞激活域的工程受体。T细胞从患者体内获取并在体外进行工程化，以表达特定的CAR，然后转移回原始供体患者体内，在该患者体内消除表面展示目标抗原的癌细胞。CAR-T是一种始于2000年代的新型细胞疗法。第一代CAR是针对CD19的单链可变片段（scFv）。人工CAR的发展包括三代。第一代CAR仅包含CD3ζ细胞内域，而第二代CAR还具有共刺激域，例如4-1BB或CD3ζ（图3）。研究还在进行中，以开发具有多个共刺激信号域的第三代嵌合抗原受体（图3）。由于scFv具有识别细胞表面蛋白的能力，通过CAR-T细胞介导的肿瘤靶向既不受限制也不依赖于抗原的处理和呈递。因此，CAR-T细胞不仅限于MHC丧失的肿瘤逃逸。对于癌症免疫疗法，采用基于CAR的方法的主要优势归因于源自抗体的scFv，其亲和力比传统TCRs高几个数量级。此外，CAR可以靶向糖脂、异常糖基化蛋白和构象变体，这些通常不容易被TCRs识别。根据临床试验结果，越来越多的证据表明CAR-T细胞具有传递强大的抗肿瘤治疗效果的能力，从而导致最近FDA批准了针对CD19蛋白的CAR-T疗法，用于治疗急性淋巴细胞性白血病（ALL）和大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。 图3 合成生物学在设计嵌合抗原受体（CAR）中的应用。a 人工CAR中使用的与门。从左到右展示了三种典型的CAR：基于共刺激域的第二代CAR、由synNotch受体辅助的具有多重识别机制的CAR以及基于嵌合共刺激受体（CCR）的CAR。b 配备有抑制性CAR（iCAR）系统的人工CAR。该系统可以防止识别体细胞上的自身抗原。c 感应不同肿瘤抗原的人工CAR。两个识别不同靶标的ScFv串联融合，工程化的CAR可以被多种抗原触发。 此外，CAR-T应用正在进入商业化阶段。首个获批的CAR T细胞疗法是Kymriah，这是由诺华公司和宾夕法尼亚大学开发的针对DLBCL的CD19靶向疗法。DLBCL是一种典型的非霍奇金淋巴瘤（NHL），占所有淋巴瘤的40%。FDA还于2017年批准了Yescarta（axicabtagene ciloleucel）用于DLBCL治疗。在临床研究中，DLBCL患者接受了CD19靶向CAR T细胞治疗，有25%的部分反应者和超过50%的完全反应者。观察到超过两年的持久反应，表明CAR-T细胞的治疗效果。然而，在Yescarta治疗的患者中观察到细胞因子风暴（13%），表明需要提高安全性。 在CAR-T细胞疗法中，目标抗原的选择是决定性的。如果CAR-T细胞能够识别非恶性细胞上表达的蛋白，可能会发生严重的细胞毒性，因为非靶向活性。最佳目标抗原是在癌细胞表面一致表达但不在正常细胞表面表达的抗原。多发性骨髓瘤很难通过化学疗法或干细胞移植治疗。CAR-T细胞疗法在多发性骨髓瘤的临床前研究中显示出有效性。然而，到目前为止，还没有发现任何抗原在多发性骨髓瘤细胞上强烈且恒定地表达，但在体细胞上没有表达。在迄今为止使用过的抗原中，TNF超家族蛋白之一，B细胞成熟抗原（BCMA），是多发性骨髓瘤细胞定向CAR-T疗法目标的最佳候选。BCMA在几乎所有多发性骨髓瘤患者的癌细胞中表达，这种抗原在体细胞上的表达仅限于浆细胞和一些B细胞。BCMA是第一个通过CAR-T细胞方法在多发性骨髓瘤患者中使用的抗原，导致这些癌症患者出现系统反应。在剂量梯度临床试验中，12名患者接受了BCMA CAR-T细胞。接受9 × 10^6 CAR-T细胞/kg体重治疗的两名患者获得了良好的缓解，尽管治疗与细胞因子风暴相关的毒性。目前正在进行或已完成许多临床试验，研究抗BCMA CAR-T细胞的安全性和/或有效性。 Idecabtagene vicleucel（Abecma，也缩写为Ide-cel）由Bristol-Myers Squibb开发，使用与NCI测试的11D5-3-CD828Z CAR相同的抗BCMA 11D5-3 scFv。然而，共刺激域不同，用于idecabtagene vicleucel的CAR是使用慢病毒载体传递的，并且具有4-1BB共刺激域而不是CD28域。在idecabtagene vicleucel的多中心I期试验中，该疗法对治疗多发性骨髓瘤患者非常有效。正在进行的KarMMa II期试验旨在进一步评估idecabtagene vicleucel的安全性和能力。KarMMa的初步结果表明，它在大量预处理的多发性骨髓瘤患者中显示出深入、持久的反应。有效性和安全性反映在早期报告中，支持idecabtagene vicleucel在主要临床结果中的目标剂量范围内具有良好的临床益处-风险概况。 在医疗疗法中的受体工程。SynNotch受体是一类在医学应用中使用的人工工程受体（图3）。Notch受体是参与信号转导的跨膜受体，包括一个细胞外域、一个跨膜和细胞内域。通常在SynNotch架构中保留跨膜和细胞内域，而信号输入的细胞外域被设计为感应scFvs和纳米体，为在活细胞中启动信号提供了可能性。 另外，基于SynNotch理念，开发了模块化细胞外传感器架构（MESA），旨在检测细胞外游离配体。MESA设计包含两个跨膜蛋白，每个蛋白都包含一个细胞外配体结合域，该域感应化学物质或蛋白质，可以是小分子结合域或基于抗体的感应模块，一个跨膜域，以及一个细胞内转录因子，该因子具有从复合体中释放的能力、蛋白酶识别序列或蛋白酶。配体结合到细胞外域后，MESA受体二聚化并诱导细胞内蛋白水解裂解，允许转录因子解离以进行下游调节。该方法允许更灵活的传感器设计，不仅限于Notch受体。这个系统最近也被改造为通过分裂蛋白酶或分裂转录因子模式进行信号转导。SynNotch设计已经构建了一系列名为合成内膜蛋白酶受体（SNIPRs）的受体，包含来自除小鼠Notch蛋白外的其他天然受体的域，这些域也可以被内源性蛋白酶裂解。与SynNotch类似，SNIPRs结合它们的抗原并通过解离转录因子来感应细胞和免疫因子。对于SynNotch、SNIPR和MESA，配体结合域和转录因子域的选择使得在使用这些系统时可以定制感应（信号输入）和功能（信号输出）步骤。SNIPR和MESA还丰富了人工受体效应器的可用工程工具。然而，仍然存在一些限制，如高背景信号、非靶向效应、来自小鼠Notch蛋白的免疫原性、人工受体和转录调节因子的大尺寸。需要许多努力来改进这个系统。 受体工程应用通常与CAR-T疗法相关。受体可以被设计为针对两个特定抗原，一个使用SynNotch，另一个通过传统的CAR。在临床前模型中，建立了针对双重抗原表达细胞的T细胞。TEV蛋白酶可以融合到MESA受体上，裂解转录因子以实现功能化。人源化的合成构建可以减少免疫原性并最小化非靶向效应。Zhu等人构建了一个人类SNIPRs的框架，未来应用于CAR-T疗法，防止CAR-T细胞通过非肿瘤信号被激活。除了上述合成受体外，基于相同理念，Engelowski等人设计了一种合成细胞因子受体，通过将GFP/mCherry纳米体融合到天然IL-23细胞内域来感应纳米体。另一种受体工程策略是将受体转导的信号重新连接到新的效应基因。使用与VEGF互补的scFv，工程化受体感应VEGF并释放dCas9蛋白，然后IL-2表达上调。该系统已成功在Jurkat T细胞中探索。 用于糖尿病治疗的HEK-β细胞。β细胞存在于胰岛中，合成并分泌胰岛素。作为哺乳动物唯一的胰岛素合成场所，β细胞通过包括糖酵解和刺激-感应-分泌耦合过程的信号转导途径来感应血糖。胰岛素的分泌包括以下步骤。血糖被输送到β细胞内，通过细胞内的糖酵解代谢，导致细胞膜去极化、能量产生和K+ATP通道关闭，激活钙通道Cav1.3以诱导钙内流和胰岛素颗粒的分泌。糖尿病患者过高的血糖浓度源于1型糖尿病胰岛素产生β细胞的缺乏，或2型糖尿病身体细胞对胰岛素敏感性低。使用基于合成生物学的多重筛选方法，Xie等人将人类肾脏细胞HEK-293工程化，以感应血糖水平进行胰岛素分泌。设计结合了糖尿病治疗中的自动诊断和治疗。研究人员证明，Cav1.3的过度表达为在体细胞中构建类似β细胞的葡萄糖感应模块提供了途径。Cav1.3控制的钙和合成Ca2+诱导型启动子的结合，允许使用调整后的体内转录反应来监测血糖水平。在构建人工HEK-293-β细胞后，通过将细胞植入小鼠腹腔内，这种细胞系HEK-293-β用于葡萄糖反应性胰岛素生产，维持了超过3周的血糖稳态，也在本研究中在1型糖尿病小鼠内3天内自我校正了高血糖。 HEK-293-β细胞的优势是明显的。与灵长类动物胰岛相比，HEK-293-β细胞在稳定1型糖尿病小鼠的餐后血糖代谢方面同样有效。此外，HEK-β细胞更容易在体外培养。预计工程化的人类细胞有望根据当前的制药生产规则和法规，容易、成本效益高且稳健地生产，允许生产具有良好产品纯度、稳定性和质量的即用型商业产品。这种高度创新的工程细胞提高了任何细胞类型都可以通过合理重编程实现定制能力的可能性，如血糖控制。 诱导多能干细胞（iPSCs）在医学应用中的作用。合成生物学还有助于通过过表达某些与去分化相关的基因来生成人类干细胞。其中一种应用是诱导多能干细胞。iPSCs是从体细胞中生成的多能干细胞。由山中伸弥实验室开创，引入包括Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4在内的四个转录因子，将成纤维细胞转变为类似胚胎干细胞（ES）的细胞，这些细胞可以重新分化为血细胞、骨细胞或神经元，用于可能治疗各种组织和器官的损伤。iPSCs不是使用人类胚胎创建的，避免了与ES细胞相比的伦理问题。此外，来自自体体细胞的iPSCs避免了免疫排斥。iPSCs具有自我更新能力，并具有持续的亚培养特性。来自患者的体细胞样本被诱导成iPSCs，能够作为医学研究的无限资源库。已经建立了唐氏综合症和多囊肾病的iPSC细胞系。一个名为StemBANCC的项目呼吁收集iPSC细胞系，用于药物筛选。结合治疗化学物质和iPSC细胞系的各种应用正在进行高通量药物筛选和分析。 iPSCs旨在用于组织再生和疗法开发。可以从iPSCs中衍生出O型红细胞，以满足输血需求。当癌症患者需要大量NK细胞进行免疫疗法时，可以使用iPSCs制造这些细胞，以解决它们的低可用性问题。在小鼠研究中观察到iPSCs的抗衰老效果。iPSCs的化学诱导分化为心肌细胞已被广泛使用。这些iPSC心肌细胞具有与患者衍生的遗传代码相同的特征，允许建立长QT综合征和缺血性心脏病的模型。可以诱导脐带血细胞成为多能干细胞，用于治疗小鼠视网膜功能障碍，重新分化的iPSCs被用来治疗小鼠的脑损伤，治疗后它们的运动能力得到恢复。 iPSCs已成功用于器官再生，例如，体外心肌细胞可以通过山中的方法用于将胎儿心脏再生为正常心脏。可以从包括iPSCs、内皮干细胞和间充质干细胞在内的三种不同的细胞中生成人类“肝脏芽”。生物模拟过程使肝脏芽自包装成一个复杂的器官，用于移植到啮齿动物中。它在药物代谢方面功能良好。 一些iPSC应用已进入临床阶段。例如，大阪大学的一组人员从iPSCs中制造了“心肌片”，将它们移植到严重心力衰竭的患者中，日本的临床研究计划已经获得批准，正在招募患者。此外，中国的两名男性接受了iPSC分化的心肌细胞治疗。据报道他们状况良好，尽管没有透露详细数据。来自六名患者的皮肤细胞的iPSCs被重新编程为视网膜上皮细胞（RPCs），以替换正在进行的I期临床试验中的退化RPCs。类似地，使用自体iPSCs分化的造血干细胞治疗地中海贫血的I期临床试验也在进行中，正在招募患者。 到目前为止，还没有进行过任何与干细胞治疗相关的III期研究。主要关注点是iPSCs的安全性，存在致癌可能性：在注射iPSCs的小鼠中观察到畸胎瘤，低诱导效率，基因组的不完全重编程，免疫原性和载体基因组整合也是令人关注的问题。需要更多的努力用于临床应用。 合成生物学在组织工程中的应用。组织工程旨在修复受损组织并恢复其正常功能。合成生物学在组织工程中的应用可以控制细胞行为。人工遗传构件可以通过重新连接细胞信号来调节细胞功能。作为具有特殊属性的组织工程中的构建块，以实现更智能的功能，合成生物学允许复杂的组织工程用于新的医学研究。 通过过表达功能基因或转录因子，干细胞可以成功分化生成特定组织细胞。这是基于干细胞的组织工程中一种简单而常见的方法。然而，基因过表达缺乏反馈控制机制，以避免过量营养消耗或细胞毒性。例如，抗凋亡因子Bcl-2的持续过表达导致肿瘤形成风险。CRISPR/dCas9生物开关或合成mRNA被发现能够通过时间和空间特异性的基因表达来解决问题。此外，引入感应小分子或细胞表面蛋白的遗传电路已经得到了深入研究，特别是基于四环素抑制子的系统。Gersbach等人设计了一个四环素关闭系统来控制Runx2因子，可以调节体内的成骨过程。Yao等人使用了一个四环素开启系统，在工程化的大鼠软骨细胞中特异性表达Sox9，Sox9是维持软骨细胞活性的关键因子，激活软骨组织中II型胶原蛋白和聚合蛋白的蛋白表达。在植入的细胞支架中注射Dox（四环素系统诱导剂）后，软骨细胞降解被抑制。四环素开启系统也被用于在软骨修复过程中过度表达白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）基因，以调节炎症细胞因子（表2）。四环素开关有助于组织工程中的时间控制基因表达。 表2. 哺乳动物细胞基础治疗中的合成生物学 光遗传诱导系统也用于控制组织工程中的细胞行为。光诱导蛋白能够响应紫外线和远红外光，使光诱导成为可能。通过将光敏感基序融合到特性良好的转录因子中，构建了各种光遗传电路。成功地使用空间特异性基因激活来指导细胞的排列。Sakar等人使用蓝光诱导的通道视紫红质-2实现了组织的动态和区域特异性收缩。光遗传控制工程化的小鼠来源肌肉细胞提供了通过光敏感膜Na+通道和离子诱导的下游元素进行远程基因激活或沉默，用于组织工程。 受到CAR-T细胞成功的启发，G蛋白偶联受体（GPCRs）被工程化以感应人工配体，用于组织工程。Park等人成功设计并使用了GPCR感应氯氮平-N-氧化物（CNO）在原代细胞中控制细胞迁移，响应CNO浓度梯度。这项技术可以成为创伤愈合和细胞再生的宝贵模块。 合成生物学使得将细胞编程到多细胞结构以自组装方式成为可能。Toda等人使用synNotch方法在一群小鼠成纤维细胞中工程化细胞粘附信号，这些细胞根据synNotch受体类型变成了多层并极化。 除了细胞，生物材料在组织工程中也常用作支架和仿生器官。生物材料的自调节特性，响应刺激或化学物质，对基于生物材料的组织工程非常有用。Baraniak等人通过RheoSwitch配体1（RSL1）诱导的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因工程化B16细胞系，RSL1涂覆在聚酯脲烷膜上，允许在膜上激活GFP长达300天。Deans等人在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中构建了一个异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的Lac-off系统，IPTG被封装在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架或PEG珠子中，并以可持续的方式释放。报告基因显示，在小鼠模型中，通过背部皮下植入，诱导持续了10天以上，GFP荧光水平被观察到受其位置的控制。空间诱导的基因表达调控已成为许多应用中的概念验证，如软骨修复和体内3D细胞支架。 总之，生物回路的表达可以为组织工程生成功能化的细胞。多种合成生物学设计，例如时间和空间依赖的基因表达、诱导和自调节系统以及智能生物材料，在这一领域都是可用的。尽管最先进的发展仍然存在许多障碍，将真正的合成组织真正地应用到临床，但至少为未来的研究奠定了一些基础。 2.2. 工程化细菌细胞在治疗应用中的作用 合成生物学方法促进了基因工程细菌作为新型活体治疗剂的开发（图2）。包含合成基因回路的细菌可以控制细菌治疗活动的时机、定位和剂量，感应特定的疾病生物标志物，从而开发出一种强大的新方法来对抗疾病。基于合成生物学的工程方法允许将活细菌细胞与独特的治疗功能编程，提供灵活性、可持续性和可预测性，为传统疗法提供新的设计和工具包。这里介绍了一些进展，包括能够感应和转导来自细胞内或细胞外生物标志物信号的基因回路的工程化细菌细胞，以及基于这些信号通路的治疗和诊断。基于细菌细胞的活体治疗和诊断的概念是快速增长的策略，为有效治疗各种人类疾病提供了希望。 工程化细菌细胞在癌症诊断和治疗中的应用。一些厌氧/兼性厌氧细菌细胞是肿瘤治疗的良好候选者。它们可以靶向肿瘤的厌氧微环境，它们还具有诱导肿瘤溶解和触发炎症的能力，有助于对抗实体瘤。工程化微生物可以成为癌症体内诊断的合适工具。Danino等人将含有LacZ报告基因的大肠杆菌工程化，当细菌与肿瘤细胞接触时，产生LacZ。随后，小鼠被注射了LacZ的化学发光底物（表3）。尿液中的发光在富含时呈现红色。该方法比显微镜更敏感，可以检测到小于1厘米的肿瘤。同样，Royo等人构建了一个由水杨酸诱导的回路，将5-氟胞苷转化为毒性产物，用于杀死肿瘤的减毒沙门氏菌。注射沙门氏菌后，沙门氏菌在肿瘤组织中定位，通过额外提供水杨酸（诱导剂）和5-氟胞苷（底物），肿瘤细胞通过细菌细胞形成5-氟尿嘧啶而被消除。 表3. 微生物基础疗法中的合成生物学 为了提高基于细菌的癌症治疗效果，一些研究旨在进一步提高细菌对肿瘤的趋向性。一些细菌对实体肿瘤的厌氧环境具有天然亲和力，如大肠杆菌或减毒的霍乱弧菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。然而，这种亲和力对于靶向治疗来说还不够，体内的细菌细胞仍然普遍分散。通过引入合成表面粘附素，可以增强与肿瘤特异性分子（如新抗原）或其他在癌细胞中富集而不是在体细胞中积累的化学物质或蛋白质的结合。粘附素工程已被证明在增强细菌对肿瘤的反应方面是有效的。粘附素是具有细胞外免疫球蛋白结构域的膜展示蛋白，可以通过库定向进化筛选进行工程化。Piñero-Lambea等人在大肠杆菌中构建了一个构成型遗传回路，其中包含一个人工粘附素，靶向绿色荧光蛋白（GFP）作为概念验证的证据，证明了工程化细菌细胞膜与GFP表达的HeLa细胞的结合在体外和小鼠中都成功。重要的是，这种工程化细菌的静脉注射到小鼠体内，在HeLa细胞的异种移植实体瘤中实现了有效和高效的定植，剂量比表达不相关对照粘附素的细菌株或野生型菌株低100倍，表明类似的工程化细菌可以用来在低剂量和边际潜在系统基础毒性的情况下将治疗剂运送到肿瘤。然而，很少有针对肿瘤的细菌进入了临床阶段。兼性厌氧的鼠伤寒沙门氏菌VNP2000已经在临床前研究中进行了安全性工程化，并具有抗肿瘤能力，但在I期临床试验中失败了，因为其抗肿瘤效果边缘化和剂量依赖的副作用。一些其他基于细菌Clostridia novyi-NT或Bifidobacterium longum APS001F的临床研究正在进行或招募进行I期试验。 工程化细菌细胞在糖尿病诊断和治疗中的应用。细菌已被工程化以检测糖尿病的葡萄糖浓度。Courbet等人描述了一种在人类尿液样本中感应异常葡萄糖浓度的方法。他们将细菌传感器封装在水凝胶珠中，尿液中的葡萄糖将珠的颜色变为红色。体外细菌血糖仪发现，尿液试纸的检测限低了一个数量级。 一些蛋白质和肽在工程化肠道细菌中生物合成，用于糖尿病治疗。工程化益生菌L. gasseri ATCC 33323产生GLP-1蛋白，细菌口服给糖尿病大鼠，证明了血糖水平降低到33%。同样，工程化L. lactis FI5876被重建为在高葡萄糖浓度条件下生物合成并递送肠促胰岛素激素GLP-1以刺激β细胞分泌胰岛素。结果表明，高脂饮食小鼠的葡萄糖耐量得到改善。工程化益生菌L. paracasei ATCC 27092被设计为分泌血管紧张素（1-7）[Ang-(1-7)]，增加Ang-(1-7)（一种抗炎、血管舒张和血管生成肽类药品）的浓度，并减少了糖尿病小鼠视网膜和肾脏的副作用，因为口服细菌后胰岛素产量增加。按照设计，口服工程化B. longum HB15产生穿透素（一种具有增强胰岛素递送能力的细胞穿透肽），和GLP-1融合蛋白也增强了结肠中GLP-1的产生。L. paracasei BL23也成功设计为通过将GLP-1与肽聚糖锚蛋白PrtP融合，将单体GLP-1类似物展示在细菌膜上，工程化细菌增强了糖尿病大鼠的血糖控制。然而，效果仍然有限，需要进一步研究。除了GLP-1，一些其他蛋白质，如免疫调节细胞因子IL-10和人类胰岛素原，同时被引入到工程化L. lactis MG1363中，与低剂量系统性抗-CD3的联合治疗允许逆转非肥胖糖尿病小鼠中失调的自身免疫触发的糖尿病。这个设计可能对人类1型糖尿病的治疗有效。 工程化细菌细胞在胃肠道疾病的诊断和治疗中的应用。益生菌可用于治疗炎症性肠病（IBD）。IBD 是消化道组织慢性炎症，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。患者遭受腹泻、疼痛和体重减轻的折磨。合成生物学方法和理念帮助细菌获得了对抗胃肠道疾病更强大的能力。Praveschotinunt 等人设计了一种工程化的大肠杆菌 Nissle 1917（EcN），它能产生胞外纤维基质，增强肠道粘膜愈合能力，以缓解小鼠的 IBD。通过将卷曲蛋白（CsgA）与三叶因子（TFF）结构域融合，促进细胞表面重建，细菌能够通过修饰的卷曲蛋白的原位蛋白自组装产生纤维基质。结果表明，设计的 EcN 显著抑制了促炎细胞因子的产生，缓解了小鼠的体重减轻，维持了结肠长度，证明了其在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的急性结肠炎小鼠模型中的抗炎能力。该设计可扩展为基于益生菌的 IBD 治疗的通用方法。 细菌工程化后可望直接消除病原体，预防消化道传染病。铜绿假单胞菌是一种常见的多重耐药病原体，难以治疗。工程化的 EcN 已被用于检测、预防和治疗 P. aeruginosa 引起的肠道感染。设计的 EcN 能够感应 P. aeruginosa 产生的生物标志物 N-酰基高丝氨酸内酯，并且自溶释放生物膜降解酶分散素和 pyocin S5 细菌素，以消除肠道中的病原体。此外，重新编程的细菌显示出长达 15 天的预防 P. aeruginosa 的能力，并且在小鼠模型中比治疗已建立的感染更有用。3-羟基丁酸（3HB）是具有治疗结肠炎效果的人类酮体成分。Yan 等人构建了一个过表达 3HB 生物合成途径的 EcN。与野生型 EcN 相比，工程化大肠杆菌在小鼠体重、结肠长度、潜血水平、肠道组织髓过氧化物酶活性和促炎细胞因子浓度方面显示出更好的效果。然而，这些研究是小鼠中的初步结果，尚未进入临床试验。需要进一步努力以评估它们在人类中的应用。 工程化细菌细胞在代谢紊乱中的应用。工程化肠道微生物也已被用于针对代谢紊乱。设计了大肠杆菌来治疗肥胖，在高脂饮食的小鼠中合成厌食脂质前体。一些努力通过活细菌降解在患者中积累的有毒化合物。Kurtz 等人设计了大肠杆菌 Nissle 1917 菌株，在肠道中将氨转化为 L-精氨酸，减少系统性高血氨症，在小鼠和猴子模型中。Isabella 等人重新编程大肠杆菌 Nissle 1917 以过表达苯丙氨酸降解途径，以代谢苯丙酮尿症（PKU）患者中过量的苯丙氨酸。在 Pahenu2/enu2 PKU 小鼠模型中，口服工程化细菌显著降低了血液中苯丙氨酸浓度 38%。 酒精性肝病是肝病的主要原因，普遍危及重度饮酒者的健康。工程化的枯草杆菌和乳杆菌可用于表达乙醇降解途径（酒精脱氢酶和乙醛脱氢酶），以解毒酒精并减轻酒精过量摄入引起的肝损伤。此外，在慢性饮酒期间，胃肠道中的凝集素再生胰岛衍生 3 γ（REG3G）蛋白减少。乳杆菌 reuteri 被设计为过表达白细胞介素-22（IL-22）基因，这增加了肠道中 REG3G 的丰度，减少了使用酒精性肝病小鼠模型的炎症和肝损伤。 合成生物学方法已允许构建和设计工程化活体生物治疗剂。许多案例针对未来的临床应用。这里讨论的示例表明，随着电路设计和微生物宿主理解的发展，研究人员可以构建活体生物治疗剂，以精确、系统、可诱导和稳健的方式发挥作用。然而，仍需付出许多努力以降低细菌毒性并增加体内可控性。 3. 合成生物学在新兴治疗材料的制造中 除了工程化细胞外，工程化纳米材料也在医疗领域中得到广泛应用。纳米生物技术旨在解决重要的生物学问题，如基于其独特的物理、化学和生物学性质的微纳尺度材料的药物递送、疾病诊断和治疗（图4）。纳米材料具有独特的机械、磁性和电子性质，能够响应外部信号，控制其下游电路。然而，传统的纳米材料是通过物理和化学过程产生的，溶剂和修饰分子经常引起生物安全问题。最近，生物纳米材料在合成生物学的指导下得到了发展，展现出其在环保、增强生物相容性和生物活性以及低组织毒性方面的优势。基于合成生物学的概念和方法，基因工程细菌、酵母和烟草花叶病毒（TMV）可以作为纳米材料的生物工厂。哺乳动物细胞衍生的囊泡和纳米颗粒具有适宜的生物相容性，也常用作纳米药物。生物材料可以在合成生物学的帮助下进行构建和工程化，扩大其在现代疾病治疗中的应用场景。 图4 合成材料生物学中的设计与应用。通常，构建一个遗传电路来合成生物材料或感应环境。工程化细菌被赋予了新的特性，如颜色变化和独特的表面特性。具有细胞外基质的细胞应用多样，包括磁场诱导治疗、新型药物载体的开发或通过复杂的生物制造过程进行健康监测。 3.1.合成生物学在人工细胞器中的应用 遵循合成生物学的原则，生物催化或触发感应模块的纳米颗粒可以被加工成自组装细胞器，这些细胞器模仿活细胞的特征，如酶反应的分隔和刺激响应（图4）。这种设计还为构建人工细胞提供了新的输入。此外，人工细胞器与工程化活细胞载体的结合，包括CAR-T细胞和工程化细菌，纳米活体混合系统可以发挥其双重效应，以增强治疗效果或更严格地控制人工系统。 聚合物体是由两亲性聚合物制成的人工空心囊泡，用作人工细胞器的外壳。van Oppen等人使用了一个聚合物体系统，其外膜上锚定了细胞穿透肽。人工细胞器内部含有过氧化氢酶，允许降解外部活性氧分子，作为合成细胞器，保护细胞免受H2O2触发的活性氧损伤，这在人原代成纤维细胞和人胚肾细胞中显示出摄取能力。一个类似的设计依赖于聚合物体配备了两种酶和相关的跨膜通道，被用来模拟细胞过氧化物酶体。这些细胞器能够处理H2O2和超氧自由基。结果进一步证明了具有过氧化氢酶活性的人工细胞器的可行性。基于类似的想法，工程化聚合物体可能在治疗帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、代谢疾病、癌症和无过氧化氢酶症等医疗状况中发挥作用，通过在人工细胞器内装载各种治疗蛋白。 此外，纳米生物技术和合成生物学的融合可能实现新功能。首先，研究人员可以通过遵循“封闭”原则组装纳米颗粒来创造“人工生命”。这个想法可以应用于使用无机支架和纳米颗粒内部的核酸和蛋白质构建生物组件。“自上而下”的原则，或为实际需求工程化自然细胞，可以作为使用纳米材料在活细胞中的指导，以增加特定医疗应用中的稳健性、稳定性和灵敏度。 3.2.构建纳米颗粒介导的遗传电路 通过内部环境刺激实现自动响应，可以诱导遗传开关开启/关闭（图4）。然而，遗传开关的不可逆情况是一个常见且难以解决的问题。为了规避遗传结构的弱点，纳米颗粒被用来感知体内信号并进行转导。光、声、热和磁刺激对纳米颗粒来说容易响应，它们可以用作实体肿瘤和糖尿病治疗的诱导系统。然而，物理刺激的空间特异性诱导很难实现。总体而言，通过结合遗传传感器和纳米颗粒的优势，通过引入纳米颗粒进行信号转导，将物理刺激转换为具有特定输入信号的遗传开关是可行的，并且通过这种方式实现了基因表达的时间空间控制。 近红外（NIR）光响应基因电路对于体内治疗应用是可行的，因为它们更好的NIR光传输能够穿透组织并降低毒性。NIR感应蛋白在植物和细菌中被发现，如细菌光敏色素（BphPs）。然而，NIR感应蛋白通常亮度较低。此外，缺乏结构信息阻碍了它们的合理工程化。为了规避NIR光响应蛋白的缺点，研究人员使用纳米材料将NIR光转换为可见光。例如，Chen等人使用掺杂了镧系元素的纳米颗粒将980 nm NIR光转换为可见光，控制小鼠模型中表达光敏蛋白的神经元的遗传门。另一种设计使用等离子金纳米棒或光热响应纳米颗粒将NIR光转换为温度上调，然后热休克蛋白的启动子被激活以进行下游基因表达。纳米颗粒的一个缺点是它们必须注入人体，这可以通过开发基因工程化纳米颗粒来解决。类似于磁遗传学，生物合成的铁蛋白可以用作准备外源顺磁性纳米颗粒的工具。然而，这些样品的穿透深度需要大大改进（不到1厘米），这不足以满足人类细胞治疗应用的需求。一些研究人员将光产生微设备与光敏感工程治疗细胞配对来解决这个问题（图4），患者可以通过自己的智能手机应用程序控制药物释放或实时监测他们的健康状况。此外，一些遗传编码的发光模块可以在现场产生光，使用各种荧光素酶等蛋白质，所有这些都在相应的底物下发出所需的波长。体内光诱导光敏感蛋白触发定制需求的转基因表达。 除了光遗传学，磁遗传学也出现了，用于调节细胞活动，并已应用于远程和非侵入性控制纳米材料治疗（图4）。磁场可以穿透人体而无损失，这是深层组织靶向治疗的首选特征。以前的磁遗传学工具主要是外部注射的磁性纳米颗粒。纳米颗粒通常半径小于10纳米，无毒且水溶性。使用远程磁场加热纳米颗粒可以激活细胞中的温度敏感阳离子通道。下一代工具是在工程化细胞中异源表达受体靶向铁蛋白蛋白，以纳米颗粒（铁载颗粒）的形式，这些可以感应并转导磁性信号到细胞膜锚定受体，如瞬时受体电位通道1（TRPV1）或TRPV4。膜受体是允许钙离子流入的离子通道，具有磁刺激。所述基因电路可以被操纵以控制NFAT依赖的转录调节因子，用于下游功能基因。植入的工程治疗细胞可以在磁场下实现目标特异性治疗和精确控制治疗剂量、时间和位置。 然而，磁性激活传感器通道的机制仍然不清楚，长期以来提出的理论一直存在争议。TRPV通道被各种信号激活，包括但不限于机械力和热量。最近，提出了一种新机制来解决射频弱磁场（1 mT）如何触发带有铁蛋白锚定的TRPV通道的活细胞中的瞬态响应的问题。机制是铁蛋白蛋白中游离Fe3+的解离，导致通过增加活性氧（ROS）的产生来增强膜脂的氧化。这些氧化脂质有能力激活TRPV通道，导致钙离子内流。最近，ROS被报道参与了在2型糖尿病小鼠中结合电场和静态磁场治疗的研究，以增加它们的胰岛素敏感性。在这项研究中，低能场可以诱导表达核因子红细胞2相关因子2（Nrf2），这是一种控制ROS水平的转录调节因子。此外，局部ROS积累在小鼠中没有副作用，通过电磁场介导的氧化还原状态诱导基因表达是有希望的。磁遗传学在远程控制和靶向治疗方面展现出潜力。然而，需要更多的努力来建立磁遗传平台。尽管近年来有所改进，细胞毒性和生物相容性是磁性纳米颗粒的两个主要障碍，仍然挑战它们在体内的应用。 3.3.合成生物学在药物递送中的应用 合成生物学构建物通常被封装在载体中，以实现其在体内的功能。病毒载体的安全性问题限制了它们在编辑人类基因组中的应用。因此，非病毒载体越来越受到关注。纳米技术可以帮助递送治疗剂，包括遗传电路和基因组工程工具。随着纳米技术的进步，有更多的选择可用于DNA/RNA递送系统的靶向和可控释放。 其中一个例子，基于脂质体纳米材料的DNA/RNA递送系统，已成为一种有效且有潜力的基因疗法方法，有多种人工脂质载体被批准用于临床用途。例如，由Alnylam Pharmaceuticals开发的RNAi治疗剂Onpattro。该药物于2018年获得批准，用于治疗多发性神经病。脂质体是小的脂质囊泡，大小在50纳米和1微米之间。脂质体通常是两亲性的，由疏水尾部和亲水头部组成，用于在各种治疗中递送药物。由于脂质体降低药物毒性，通过特异性注射直接将药物递送到目标，并通过封装药物免受降解，它们在递送方面比传统药物治疗具有优势。CRISPR/Cas9辅助的基因疗法通常使用基于脂质的纳米颗粒，通过静电相互作用将带负电荷的mRNA、gRNA支架和CRISPR基因与带正电荷的脂质体整合。Felgner等人首次设计并使用脂质体，通过将DNA封装并递送到质膜中的目标哺乳动物细胞，导致其内吞后DNA表达。脂质体载体不仅帮助治疗DNA通过细胞膜屏障，而且保护它们免受DNase降解和免疫反应，以维持它们的活性。部分受到脂质体可以应用于人类治疗的启发，脂质体还作为疫苗将编码SARS-CoV-2抗原的mRNA递送到人类。Moderna mRNA-1273和BioNTech/Pfizer BNT162b2疫苗都被封装在脂质体中，并获得了它们的临床使用批准。 纳米技术也可以帮助合成生物学递送化学物质。纳米载体递送化学物质最小化了非靶向效应，与传统药物递送相比，增强了治疗效果。外部物理刺激也可以启动化学物质的释放，使系统可持续和可控。这里，我们讨论合成生物学引导的生物化学载体的应用。 遗传编码的翻译后修饰蛋白可以自组装携带疏水药物。具有不同结构和材料性质的蛋白质可以在氨基酸序列水平上轻松操纵。基于合成生物学方法，Mozhdehi等人设计并共表达了大肠杆菌中的弹性蛋白样多肽和N-肉豆蔻酰转移酶。 N-肉豆蔻酰转移酶酶在细菌中修饰多肽，生成肉豆蔻基团，产生温度诱导的自组装行为。纯化的重组蛋白的脂质核心可以携带疏水化合物，延长药物半衰期。该蛋白可以形成复杂的组装系统，包裹化学物质。Li等人使用设计好的阳离子嵌合体近红外荧光蛋白和阴离子羧基末端PEG，准备蛋白质-PEG纳米载体。纳米蛋白是两亲性的，导致在水溶液中聚集和相分离形成纳米颗粒。工程化纳米颗粒实现了体内实体肿瘤和转移的成像，无需转染即可利用蛋白质的荧光特性，同时，纳米蛋白作为长期药物载体，可以显著提高IL1-Ra的半衰期和治疗效果。 3.4.工程化细菌外膜囊泡（OMVs）作为纳米载体 细菌外膜囊泡（OMVs）是来自革兰氏阴性细菌外膜的脂质球，它们可以用于将生化物质运输到环境中的其他细胞。合成生物学的基因操作方法可以提高生物起源纳米颗粒的能力，扩大外膜囊泡（OMV）和工程化细胞的应用场景。 带有重组蛋白的工程化OMVs潜在地用于医疗和临床领域（图4）。在OMV工程中表面展示蛋白的一般策略是在OMV表达系统中将它们的基因融合在一起。许多研究已经使用大肠杆菌溶素A（ClyA）蛋白作为融合载体，将外源蛋白锚定到OMV膜上。最近的研究表明，ClyA已成功融合到炭疽杆菌保护性抗原的域4、流感A病毒基质蛋白2（M2）的细胞外域以及GFP上，而不影响OMV形成。另一种策略是将蛋白表达到周质中，并在融合步骤妨碍蛋白功能时组装到OMV中。然而，异源蛋白被包裹在OMV内部，这是策略的主要缺点。 Bartolini等人还使用该方法将沙眼衣原体蛋白HtrA携带在OMVs中，作为针对沙眼衣原体感染的疫苗。一些链球菌蛋白使用大肠杆菌OmpA信号肽表达到周质中，并将它们打包到OMVs中。即使这些蛋白位于OMV内部，它们也能够激活免疫反应，在小鼠模型中产生的IgG抗体对特定病原体具有很强的活性。结果表明，抗原位置不是OMV诱导的免疫反应的决定性因素。 除了蛋白质，OMVs可以被工程化以携带化学物质。LPS和装饰在病原体细胞膜上的荚膜多糖（CPS）也是疫苗候选物。然而，多糖除了T细胞外还能触发免疫反应，无法建立免疫记忆。为了规避这个问题，将多糖锚定到纳米载体上以引发免疫记忆。多糖和荚膜合成基因在大肠杆菌中表达，使用上述方法打包到OMVs中。设计的OMVs经过进一步优化后，可用作疫苗。Chen等人使用了弗朗西斯杆菌O-抗原多糖，基因在大肠杆菌中异源表达，产生糖基化修饰的OMVs。注射工程化OMVs的小鼠对弗朗西斯杆菌菌株具有保护作用。另一个类似的设计使用肺炎链球菌CPS（Sp-CPS）生物合成基因。它们在大肠杆菌中过表达，位于工程化OMVs和细菌细胞的膜上。注射这些收集的OMVs进行疫苗接种后，疫苗在吞噬作用测定中有效，并且针对Sp-CPS触发了IgG抗体。总的来说，合成生物学方法已经开发了更好的工程化OMVs用于免疫疗法，在药物靶向递送和联合治疗方面前景光明。 3.5.生物模拟医用粘合材料 传统的医用粘合材料在水下使用受到限制，这限制了它们在体液中的应用。最近，基于合成生物学理念，进行了一些生物模拟设计来解决这个问题（图4）。许多海洋生物（例如贻贝和藤壶）具有非凡的粘附能力，能够粘附在岩石表面， 这是因为它们产生L-3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA），作为水下表面粘附蛋白的重要组成部分。Zhong等人报道了通过融合CsgA菌毛蛋白和贻贝足蛋白制造出一种强大的水下粘合剂。这种出色的设计结合了生物相容性和粘附活性，有希望用于体内应用，如组织修复。Zhang等人受到骨骼和贻贝足等天然生物材料的启发，他们开发了一种基于Bacillus spp.胞外基质的活性胶。这种活材料具有粘附性和再生能力。工程化哺乳动物细胞可以构建具有粘附蛋白，作为体内活功能胶。如上所述，新型活医用生物医学粘合剂是医学合成生物学的热点。然而，大多数研究集中在材料属性上，而不是它们的生物相容性和生物可降解性，需要充分的努力来推动材料用于临床应用。 3.6.医学应用中的基因编码点击化学 受点击化学启发，为建立蛋白质-蛋白质链接，工程化了异肽键。与传统点击化学相比，基因编码点击化学在活体生物中更适用。SpyTag/SpyCatcher系统是革兰氏阳性菌毛中天然类似点击反应的应用，使用生物学方法在氨基酸之间形成稳定的化学键，在点击化学导向的蛋白质中不需要额外修饰生物大分子（图4）。基因编码点击化学（或Spy化学）是通过合成生物学制造材料的强大工具。 水凝胶是交联的亲水聚合物网络，由于其生物相容性和类似细胞外基质（ECM）的属性，作为生物大分子和干细胞的载体。通过化学聚合合成的水凝胶材料面临生物活性问题。蛋白质特性由氨基酸序列决定。蛋白质水凝胶更容易使用不同的DNA序列进行合成和控制。Yang等人利用SpyTag/SpyCatcher系统合成了一种四臂星状光敏蛋白。该蛋白质可以分别响应AdoB12和光迅速形成溶胶-凝胶和凝胶-溶胶相变。生物膜降解糖苷水解酶PslG可以封装到水凝胶中，赋予材料对抗慢性感染中多重耐药细菌的能力。Sun等人设计了一个含有多个SpyTags和SpyCatchers的Spy网络，包含在弹性蛋白和白血病抑制因子中。这些蛋白质变成了一种高强度水凝胶，允许小鼠胚胎干细胞在不添加其他细胞因子的情况下保持多能性。 基因编码点击化学也在疫苗开发中使用。一些设计蛋白可以自组装成类似病毒颗粒（VLPs），以在表面展示抗原，模仿病原体。合成疫苗因其效率和安全性而越来越受到关注，与传统的死菌或减毒微生物疫苗相比。基因编码点击化学是修改表面以增强免疫原性的有用方法。基于Spy化学的化学键容易形成，为设计合成疫苗提供了定制和方便的方法，通过编码蛋白自组装。Liu等人使用SpyCatcher/SpyTag化学通过共价连接特定抗原和化学物质开发了一种合成疫苗。结果表明，这种工程化疫苗成功地靶向了树突状细胞。产生的蛋白质-化学混合疫苗保持了各自的功能，并具有触发B细胞和T细胞反应的能力。Brune等人通过在材料表面展示SpyCatcher，进一步使VLPs与SpyTag表达的疟疾抗原结合，开发了新的疫苗。VLP-抗原疫苗可以通过仅一次免疫迅速有效地触发免疫反应，表明这种有效、简单、模块化的修改方法的潜力。 3.7.医学和制药应用中的遗传密码扩展 一种蛋白质通常由20种天然氨基酸组成。为了将非典型氨基酸（ncAAs）添加到蛋白质中，已经开发了遗传密码扩展技术。ncAAs可以通过与肽或化学物质的结合来修饰蛋白质，根据实际需求。使用终止密码子（UAG/UGA/UAA），异源生物正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）-tRNA对可以将ncAAs添加到蛋白质的任何位点。已经开发了许多不同的aaRS/tRNA对。高效的遗传密码扩展装置允许生产含有ncAA的蛋白质和多个插入ncAA的蛋白质。ncAA插入在所有主要模型生物中都已成功。遗传密码扩展系统在医学领域的应用在这里总结。 遗传密码扩展用于抗体-药物偶联物。抗体-药物偶联物（ADC）结合了抗体的抗原识别能力和化学物质的肿瘤杀伤能力，通常用于肿瘤治疗。传统的ADC药物是抗体中半胱氨酸或赖氨酸的化学修饰，这可能会影响免疫原性、稳定性和半衰期。随着遗传密码扩展技术的发展，抗体中引入功能性ncAA是可行的。抗体和化学物质之间的位点特异性、高效共轭是可以实现的。Oller-Salvia等人开发了一种新的遗传密码扩展系统，将赖氨酸的环丙烯衍生物并入抗体中。抗体通过快速Diels-Alder反应与单甲基auristatin E (MMAE)偶联。得到的ADC在血清中稳定有效。Wang等人使用遗传密码扩展方法将Lck抑制剂dasatinib偶联到单克隆抗体CXCR4上。ADC避免了化学修饰过程中的副反应。得到的dasatinib-抗体偶联物以低EC50抑制T细胞激活，对细胞活性影响可忽略不计。 遗传密码扩展在双特异性抗体中的应用。双特异性抗体（BsAb）具有两个特定的抗原结合位点，具有增强的杀伤肿瘤能力。一些BsAb已经获得FDA的批准。传统的BsAb生产方法依赖于蛋白质的融合，导致配体结合域的立体位阻。此外，抗体的产量低，半衰期短。通过化学修饰合成BsAb会遇到与ADC生产类似的问题。遗传密码扩展方法可以通过PEG链接剂将两个抗体偶联起来，以规避这些挑战。Kim等人在抗HER2和抗CD3抗体的抗原结合片段Fab区域引入了一个非典型氨基酸（pAcF），通过两步反应形成BsAb。BsAb在皮摩尔浓度下诱导体外效应细胞介导的细胞毒性。利用含四嗪的非典型氨基酸和含双环庚炔的非典型氨基酸之间的Diels-Alder反应，开发了一种靶向BCMA的BsAb，用于治疗多发性骨髓瘤，成功克服了多发性骨髓瘤患者的耐药性。 遗传密码扩展用于工程化腺相关病毒（AAV）。AAV是人类和灵长类动物的小病毒。AAV通常用于基因治疗，以实现非致病性、宿主范围广和高转染及表达效率。然而，它们的可控性和靶向能力有限，限制了它们的应用。Zhang等人使用遗传密码扩展技术增强了AAV的靶向能力，将环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（cRGD）偶联到AAV的壳蛋白上，以靶向整合素。Erickson等人工程化AAV以实现感染的光控制。AAV2的vp1蛋白中的R585和R588残基被替换为光敏感的非典型氨基酸，这阻碍了vp1和HSPG蛋白的相互作用，从而抑制了AAV的感染。暴露于UV光会移除光敏基团，恢复AAV的感染能力。该方法提高了AAV载体的时间空间可控性。 遗传密码扩展用于延长蛋白质半衰期。PEG通常用于延长治疗蛋白的半衰期。然而，随机修饰的PEG通常会影响治疗剂的结合位点。因此，遗传密码扩展在修饰蛋白质方面可能具有优势。Cho等人使用遗传密码扩展在人类生长激素中位点特异性地修饰PEG，这种激素在临床应用中非常不稳定。修饰后的生长激素在生产过程中也具有良好的批次重复性。一些非典型氨基酸本身可以增加蛋白质的稳定性。Xuan等人证明将反应性异硫氰酸酯基团并入蛋白质可以提高肌红蛋白的热稳定性。类似地，使用长链含硫或氟化非典型氨基酸的设计也得到了验证。 遗传密码扩展用于开发新型疫苗。非典型氨基酸为潜在的疫苗候选物提供了广泛的抗原修饰。Gauba等人在小鼠TNF-α蛋白中插入含有硝基苯基的非典型氨基酸，即使有佐剂也能引起强烈的抗体反应。含有非典型氨基酸的基因修饰生物（GMO）对疫苗开发很有用。灭活或减毒病原体基疫苗通常效果降低。构建依赖非典型氨基酸存活的GMO菌株以放大活病毒疫苗。通过在流感A病毒、HIV-1或乙型肝炎病毒的基因组中引入终止密码子，病毒只能在具有特定aaRS/tRNA对和非典型氨基酸的工程细胞中复制。Si等人在流感A病毒的NP蛋白中插入了终止密码子，导致更强的免疫原性并触发更广泛的免疫反应。基于相同理念，越来越多的活细菌疫苗正在开发中。然而，与病毒相比，细菌更为复杂。许多突变机制可以帮助细菌逃脱表达终止。终止逃逸限制了遗传密码扩展在细菌中的进一步应用。Mandell等人构建了一种细菌，代谢上依赖于非典型氨基酸生存。这种细菌表现出前所未有的抗进化逃逸能力，为活细菌疫苗的开发提供了线索。 遗传密码扩展的其他医学应用。遗传密码扩展技术可以应用于构建可控的CAR-T细胞。将p-叠氮苯丙氨酸（pAzF）并入Fab中，允许识别和偶联荧光素异硫氰酸酯（FITC），激活抗体进行癌症治疗。将诱导剂FITC改为短肽在癌症治疗中也证明是可行的。FITC或肽被用作CAR-T细胞的诱导剂，为免疫疗法提供了更安全控制的方法。遗传密码扩展也已应用于肽类天然产物的生物合成。Nisin是一种具有广泛抗细菌活性的复杂兰肽。Zambaldo等人将多种非典型氨基酸引入nisin中，赋予其新的大环拓扑结构和增强的活性。 遗传密码扩展方法正在快速发展，体内和位点特异性地修饰蛋白质。这种方法最复杂的生物是斑马鱼和小鼠。该方法应该改进，以应用于更多的高等物种。尽管已有200多种不同的非典型氨基酸用于遗传密码扩展，但大多数非典型氨基酸基于相似的结构单元。丰富结构类型是发展的另一个方向。未来，遗传密码扩展技术将为人类带来更多精细的治疗方法。 4.合成生物学在治疗药物的生物合成中 近年来，合成生物学方法在药物的可持续和成本效益生产中展现出前景。合成生物学设计（图5）构建了包括细菌、酵母、细胞培养或整个植物在内的生物电路或底盘，用于有效生产高附加值的制药产品或制药中间体。它提供了一种可扩展且可持续的生产生物产品的方式，使用基于CO2的基质，生产过程快速且稳健，适用于大规模工业生产，可以在不过度种植和收获药用植物的情况下生产生物产品（表1）。 表1. 生物合成药物的应用和产量 作为合成生物学的一个经典领域，药物合成与其他医疗应用不同。它通常使用酵母或细菌作为生产底盘。合成生物学概念在微生物中得到广泛应用，特别是DBTL（设计-构建-测试-学习）（图5）。DBTL循环包括最初的分子生物学设计和构建，实验结果为新的设计周期提供基础。单细胞系统比哺乳动物细胞更容易操作，在哺乳动物系统中，DBTL周期可能很长，这也是哺乳动物合成生物学的障碍之一。在药物的微生物合成中，高通量筛选和定向进化常用于加速实验步伐。微生物中的合成生物学在某种意义上指向了哺乳动物合成生物学的发展方向。 图5 合成生物学中常用的技术。为了推动细胞工厂构建的设计-构建-测试-学习循环，已经开发了各种合成生物学方法和工具，这些技术正在改革合成生物学在医学应用中的使用。路径设计是第一步，通过构建的遗传电路获得初步结果。在下一轮测试之前需要进行一些优化，并且从初步数据中更好地理解系统的特性。设计-构建-测试-学习循环是提高合成生物学系统稳健性和有效性的迭代过程。 4.1.萜类药物的生物合成 萜类化合物是5碳化合物异戊二烯衍生物，也是植物次级代谢产物中最大的一类，约占已鉴定天然产物的60%。它们中的许多是具有生物活性的医疗成分。抗疟药青蒿素是一种含有内过氧化物桥的倍半萜内酯。最初，青蒿素从植物青蒿中提取，含量非常低（0.01%-1%），远低于实际医疗需求。通过化学途径合成青蒿素是困难且效率低下的，主要是由于该分子的多个手性中心。微生物合成青蒿素前药降低了药物成本。合成 amorpha-4,11-diene 是合成生物学中的一个里程碑。最初重组大肠杆菌合成的量仅为24µg caryophyllene equivalent/ml。9经过持续优化，另一种青蒿素前药，即青蒿酸，通过工程化酵母生产，产量达到了25 g/L。青蒿酸的生物合成是合成生物学成功的一个例子。 紫杉醇是一种从太平洋紫杉树中提取的二萜，用作抗癌剂。其生产主要依赖于费力且效率低下的植物细胞培养。Ajikumar等人通过工程化大肠杆菌细胞生产紫杉醇前体taxadiene，产量为1 g/L。人参皂苷是存在于人参属植物中的三萜皂苷，具有预防癌症和抗衰老作用。利用酵母细胞工厂，合成了包括人参皂苷Rh2和人参皂苷化合物K在内的各种人参皂苷，产量分别为2.2 g/L和5.0 g/L。微生物方法减少了人参皂苷用于临床的短缺。 4.2.生物碱类药物的生物合成 生物碱是一类至少含有一个氮原子的有机化合物。作为天然产物，生物碱通常因其具有药理活性而被使用。生物碱的生物合成绕过了种植某些植物（如罂粟和大麻）的禁令。在生物合成过程中形成的手性中心也使大多数手性生物碱化合物的化学合成相形见绌。Galanie等人利用工程化酵母细胞生产thebaine和hydrocodone。过表达21个基因（用于thebaine）或23个基因（用于hydrocodone）导致它们的产量分别为6.6 × 10^−5 g/L和3 × 10^−7 g/L。Nakagawa等人改进了使用大肠杆菌底盘的过程。324thebaine和hydrocodone的产量分别提高到2.1 × 10^−3和4 × 10^−5 g/L。阿片类药物的生产达到了毫克级。需要进行后续的代谢工程以促进生物合成的阿片类药物满足市场需求。 类似青蒿酸的生物合成，大麻素是大麻中的天然产物，通常用于止痛和抗焦虑作用。(S)-四氢棕榈酸和cannabigerolic acid是两种难以从植物中提取的著名大麻素。Luo等人建立了cannabigerolic acid的生物合成过程。酵母的产量达到了0.1 g/L。Hafner等人通过酵母生物合成的(S)-四氢棕榈酸达到了3.6 × 10^−6 g/L，这是微生物生产复杂大麻素的成功概念验证。 4.3.氨基酸衍生药物的生物合成 氨基酸衍生物使用氨基酸作为构建块，在人类健康中也扮演着重要角色。这类化合物通常通过生物途径而不是化学合成进行合成，因为它们具有多个手性部分。与生物碱和萜类化合物相比，氨基酸衍生物结构更简单，但多样性更大。Psilocybin是L-色氨酸衍生物，具有抗药物成瘾、缓解抑郁和抗创伤后应激障碍的作用。大肠杆菌或酿酒酵母已被工程化以异源表达合成途径，分别形成1.2 g/L和0.6 g/L的psilocybin。Dencichine，也称为β-N-草酰基-L-α,β-二氨基丙酸（β-ODAP），是从蚕豆种子中首次分离出的植物代谢物。Dencichine可以在人体血液中诱导血小板聚集，是中药云南白药的主要成分。作者优化了大肠杆菌中的代谢通量，使dencichine的产量达到了最终滴度1.29 g L−1和产量0.28 g g−1甘油。微生物生产dencichine是利用人工酶和途径在合成生物学应用中生产所需化学物质的一个例子。 4.4.不对称合成的生物催化 合成生物学可以协助多个手性中心化学发展。Sitagliptin（Januvia）是一种常用的糖尿病治疗药物，通过竞争性方式抑制DPP-4酶，减少GLP-1的裂解，增加胰岛素的分泌。到2021年，Januvia市场达到了14亿美元。对于sitagliptin的化学合成，手性胺通过基于铑的手性催化剂转移，立体选择性低，产品被铑污染。利用转氨酶和基于同源建模和饱和突变的合成生物学工程方法，开发了一种显著提高sitagliptin合成效率和纯度的过程。 5.无细胞合成生物学在医学应用中 迄今为止，合成生物学的努力主要集中在重新编程生物体、开发遗传电路和生物模块上。然而，由于我们对生命运作方式的了解有限，生物体的复杂性阻碍了合成生物学的进展。用户定义的系统可以解决这个问题。无细胞系统是准备好的，在没有活细胞的情况下执行体外生物活动（例如转录和翻译）。由于它是开放的、易于控制、灵活的，并且对细胞毒性具有高耐受性，该系统已被用于合成难以表达或在细胞中有毒的蛋白质（图6）。此外，无细胞系统非常适合高通量筛选。最近，随着无细胞生物传感诊断的发展和冻干技术的进步，无细胞合成生物学的应用已经扩展到医学和制药领域。 图6 无细胞合成生物学的特点。这张图总结了无细胞系统的类型、优势、产品和瓶颈。通常，无细胞系统用于生产药物或作为体外传感器。主要优势是方便、灵活和对细胞毒性的高耐受性。在解决了高成本和不稳定等问题之后，该系统在实际医疗应用中具有前景。 5.1.无细胞合成生物学在药物蛋白合成中 蛋白质和肽类药物大多数具有目标特异性，具有高活性和低毒性，适用于医疗用途。许多知名药物是蛋白质或肽，如曲妥珠单抗（赫赛汀）、阿达木单抗（修美乐）、甘精胰岛素（来得时）和13价肺炎球菌结合疫苗（PCV13）。70%的蛋白质药物是使用CHO细胞生产的。然而，有些蛋白质对细胞宿主的生长是有毒的。无细胞蛋白质合成（CFPS）为毒性问题提供了解决方案。此外，CFPS系统中的细胞内蛋白质筛选是可行的，而且冻干技术允许无细胞系统在一年保存后仍保持高度活性。 基于细胞裂解物和纯化组分系统的CFPS系统是两种常用的CFPS系统。理论上，任何生物体都可以作为基于细胞裂解物系统的来源。最常见的细胞提取物来自大肠杆菌、小麦胚芽和酵母。大肠杆菌裂解物通常用于蛋白质合成，小麦胚芽裂解物用于构建蛋白质阵列，酵母裂解物用于合成糖蛋白。纯化组分系统包括所有纯化的翻译元素。Shimizu等人使用36种与转录/翻译相关的酶和高度纯化的核糖体开发了一种无细胞系统。该系统虽然最小化，但效率很高。然而，纯化组分的高成本限制了其应用。基于细胞裂解物的系统是CFPS系统的首选。 疫苗接种是预防大流行最有效的方法。无细胞系统为快速生产疫苗提供了平台。Kanter等人开发了一种无细胞系统，高效生产一种由单链Fv抗体片段（scFv）连接到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的融合蛋白，这是一种B细胞淋巴瘤疫苗。Lu等人描述了一种CFPS，过度表达大流行H1N1流感病毒的一个域，用于潜在的广泛保护性流感疫苗。除了细菌系统，真核无细胞系统可以表达复杂的疫苗。Tsuboi等人在基于酵母裂解物的无细胞系统中成功表达了三种疟疾蛋白，这在重组细胞中很难生产。 抗体对于疾病治疗和诊断很重要。CFPS通常用于抗体的合成。Ryabova等人在基于大肠杆菌裂解物的无细胞系统中成功生产了功能性scFv片段。翻译后修饰（PTM）是蛋白质的最终成熟步骤。糖基化是PTM的主要形式，对于维持蛋白质药物的半衰期和活性很重要，包括一些抗体。CFPS也可以向蛋白质引入功能性PTM。Jaroentomeechai等人使用CFPS在大肠杆菌无细胞系统中合成N-糖基化scFv。总的来说，无细胞系统是有用的补充，用于重组表达系统，因为它们快速且按需。 5.2.无细胞合成生物学用于诊断 通常，病原体的检测基于生物传感器。传感元件包括酶、转录因子、抗体、细胞器、全细胞和组织。尽管许多生物传感器快速且敏感，但缺点包括酶的不稳定性、全细胞生物传感器的生物安全性问题以及微流控传感器制备的复杂性。因此，开发了无细胞传感器。Pellinen等人使用荧光素酶作为报告基因，Tet阻遏蛋白和MerR调节蛋白作为传感元件，在无细胞系统中检测四环素和有毒的汞。Davies等人构建了一个无细胞蛋白质阵列，筛选病毒感染后人类血清中的高免疫原性蛋白质，用于预防性使用和诊断。在偏远地区或恶劣环境中，无细胞系统冻干并附着在纸张上（或其他基质）是方便和稳定的。Pardee等人使用冻干的无细胞传感器快速检测埃博拉和寨卡病毒。未来的无细胞合成生物学可能会导致更复杂的治疗剂的复杂设计和合成，或者用于慢性疾病诊断的快速和敏感的生物传感器。 6.讨论与未来展望 自十多年前开始迅速发展以来，合成生物学已经取得了显著增长，并在科学和应用方面取得了许多成就（图1）。在这篇综述中，我们总结了合成生物学在传统制药和医疗应用方面的先进策略和设计，例如工程智能细胞（图2）、活体益生菌治疗、诊断、干细胞、药物生产、纳米载体和人工疫苗开发。这种新方法将丰富临床方案，缩短药物开发周期并降低制药价格。 合成生物学方法最有可能带来（或已经带来）生物医学领域巨大变化的包括：使用光进行时间-空间可控的精确细胞治疗（光遗传学）、设计细菌靶向癌细胞、工程细胞重构人体代谢通量或肠道-大脑-肝脏轴（工程活体治疗）。近期研究表明，上述生物系统在哺乳动物中运行良好，并在动物模型甚至志愿者中显示出相当的治疗效果。然而，它们仍处于早期发展阶段。仍需付出许多努力，将实验室发现转化为商业产品，供患者使用。 个性化工程药物是未来治疗策略的下一代。基于能够将环境信号解释为效应器活动的遗传编码电路的智能治疗将被广泛使用。自动调节的治疗细胞，能够感应诊断输入以进行治疗效果，是诊断、疾病预防和治疗的一站式解决方案（图2）。一些应用，如CAR-T疗法，已经进入临床阶段，但大多数智能细胞尚未进入。许多尝试在早期临床阶段失败，主要原因是人类治疗能力低和意外的副作用。未来的工作应该强调其安全性以及治疗中的有效性和稳定性。 合成生物学与人工智能（AI）的结合有望加速医疗和制药领域的进展，尽管该领域仍处于初期阶段。AI不仅在计算机科学中取得了巨大成功，也在生物学研究中取得了突破。AI预测蛋白质结构被评为2021年十大科学突破之一。AI和大数据时代已经到来，深度学习技术在表征复杂对象、融合多模态特征和自动样本生成方面具有优势。AI可以应用于合成生物学领域。目前，AI与合成生物学的结合应用主要集中在以下三个方面：首先，预测未来研究方向；收集相关合成生物学数据，然后区分因果关系，分析和评估应用和发展方向。这在分析大量临床数据集时非常有帮助。其次，在制药应用中，基于AI和生物信息学大数据筛选有效药物，测试候选化学物质，并在疾病模型中模拟治疗过程。这是一种节省人力的高通量方法。第三，通过深度AI学习模型重建或修改基因组，开发新化合物用于药物发现。未来，AI有望协助医疗合成生物学根据实际需求设计更复杂的系统（工程细胞或组织），大幅减少研究人员的工作量。 图7 合成生物学基础基因治疗的现状、技术瓶颈及未来发展。目前，通过重新连接代谢和（或）信号通路，合成生物学已经提供了一些诊断和治疗方法。然而，仍需解决安全性、多功能性和有效性等瓶颈问题。此外，像AI辅助合成生物学和合理构建的活体生物和蛋白质等新设计正在进展中。 然而，医疗合成生物学仍需解决一些短板和瓶颈问题。尽管基于遗传电路的工程细胞是近几十年来最令人兴奋的设计之一，它们在实际应用中存在局限性，包括细胞外、信号转导自由疾病，这些疾病可以通过传统方式治疗。组织特异性工程治疗至今尚未成功。哺乳动物代谢的干扰仍然未知。解决这些问题将有助于合成生物学的临床应用。 大多数合成生物学仍应用于微生物。然而，解决人类健康问题的大部分重大问题需要哺乳动物系统。因此，必须付出巨大努力，推动哺乳动物合成生物学发展到下一代治疗，包括工程合成基因网络用于疾病治疗、组织工程或干细胞的生成和分化。 此外，基于合成生物学的治疗仍面临与转基因食品和干细胞治疗类似的社会问题，如伦理和法律领域，尽管它们可以通过严格的途径获得更好的控制。 即便如此，基于合成生物学的治疗前景光明，在二十一世纪的生物医学领域开发了新的工具和应用，并在高效微生物制药生产方面取得了进展。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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CINCINNATI, Nov. 21, 2022 (GLOBE NEWSWIRE) -- Blue Water Vaccines Inc. (“BWV” or “Blue Water Vaccines” or “the Company”) a biopharmaceutical company developing transformational vaccines to address significant global health challenges, today announced the signing of an exclusive, global license agreement for the development of a live attenuated, oral Chlamydia vaccine candidate from The University of Texas Health San Antonio (“UT Health San Antonio”). “With millions of new and existing infections each year and no preventative treatment available, there remains a large unmet need for an efficacious Chlamydia vaccine both here in the U.S. and on a global scale,” said Joseph Hernandez, Chairman and Chief Executive Officer of Blue Water Vaccines. “We are thrilled to enter into this partnership with UT Health San Antonio and to pursue development of this groundbreaking vaccine candidate.” Developed in the laboratory of Guangming Zhong, Ph.D., at UT Health San Antonio, the novel vaccine candidate utilizes a live attenuated Chlamydia strain, Chlamydia muridarum (“C. muridarum”). After oral delivery of the vaccine, C. muridarum was able to colonize in the gastrointestinal tract of mice and induce transmucosal protection against genital tract Chlamydia infection, without altering the gut microbiota or the development of gut mucosal resident memory T cell responses to a non-chlamydial infection. In addition, the vaccine was shown to be nonpathogenic in mice, indicating the potential to develop the live attenuated C. muridarum vaccine into a protective, human Chlamydia vaccine. “Chlamydia vaccines have historically been challenging to produce, but our novel approach has demonstrated strong results in mouse models, which we believe will translate into a human vaccine candidate,” said Dr. Zhong of UT Health San Antonio. “We look forward to this new partnership with Blue Water Vaccines and to the development of this vaccine to benefit patients worldwide.” According to the CDC, Chlamydia is the most frequently reported bacterial STI in the United States, with about 1.6 million new cases reported in 2020 alone. Globally, the WHO estimates about 129 million new cases of chlamydia each year and may be and underrepresentation given many cases are asymptomatic and low availability of diagnostic testing in low- and middle-income countries. Currently, there is no vaccine available to prevent chlamydia infection, and the main treatment is through antibiotic regimens with the possibility of reinfection after antibiotics have treated the disease. If undetected or left untreated, Chlamydia represents a major cause of pelvic inflammatory disease and infertility in women. About Blue Water Vaccines Blue Water Vaccines Inc. is a biopharmaceutical company focused on developing transformational vaccines to address significant health challenges globally. Headquartered in Cincinnati, OH, the company holds the rights to proprietary technology developed at the University of Oxford, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, St. Jude Children's Hospital, and The University of Texas Health San Antonio. The Company is developing a universal flu vaccine that will provide protection from all virulent strains in addition to licensing a novel norovirus (NoV) S&P nanoparticle versatile virus-like particle (VLP) vaccine platform from Cincinnati Children’s to develop vaccines for multiple infectious diseases, including norovirus/rotavirus and malaria, among others. Additionally, Blue Water Vaccines is developing a Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) vaccine candidate, designed to specifically prevent the highly infectious middle ear infections, known as Acute Otitis Media (AOM), in children. The Company is also developing a Chlamydia vaccine candidate with UT Health San Antonio to prevent infection and reduce the need for antibiotic treatment associated with contracting Chlamydia disease. For more information, visit www.bluewatervaccines.com. Forward-Looking Statements Certain statements in this press release are forward-looking within the meaning of the Private Securities Litigation Reform Act of 1995. These statements may be identified by the use of forward-looking words such as “anticipate,” “believe,” “forecast,” “estimate,” “expect,” and “intend,” among others. These forward-looking statements are based on BWV’s current expectations and actual results could differ materially. There are a number of factors that could cause actual events to differ materially from those indicated by such forward-looking statements. These factors include, but are not limited to, risks related to the development of BWV’s vaccine candidates; the failure to obtain FDA clearances or approvals and noncompliance with FDA regulations; delays and uncertainties caused by the global COVID-19 pandemic; risks related to the timing and progress of clinical development of our product candidates; our need for additional financing; uncertainties of patent protection and litigation; uncertainties of government or third party payor reimbursement; limited research and development efforts and dependence upon third parties; and substantial competition. As with any vaccine under development, there are significant risks in the development, regulatory approval and commercialization of new products. BWV does not undertake an obligation to update or revise any forward-looking statement. 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