Corneal Dystrophies, Hereditary

摘要：充气搅拌槽反应器由于其灵活性和广泛的应用范围，在生物制药行业中被广泛用于细胞培养应用。本章提供了在细胞培养过程背景下，对充气搅拌槽反应器进行主要特性研究方法的概述。描述的方法包括机械功率输入、体积质量传递、流场和混合特性的表征。给出了不同规模的搅拌槽反应器的示例，范围从3升实验室规模到15,000升工业规模。本章还讨论了使用称为拉格朗日传感器粒子（LSP）的移动、封装传感器进行连续数据收集和传输的最新进展，这些传感器能够在整个反应器体积内提供细胞培养过程中细胞视角的洞察。此外，还讨论了数值流场模拟的最新进展，以充气搅拌槽反应器为例，说明了数值流场模拟所面临的挑战和机遇。特别强调所描述的方法专门针对细胞培养应用，与其他类型的应用（如微生物发酵或化学反应）相比，具有较低的特定功率输入和通气率。本章还简要概述了充气搅拌槽反应器的基本原理，包括其设计和组件，并强调了设备特性对于细胞培养过程中成功的过程转移和放大的重要性。 1.摘要 在生物制药行业，充气搅拌槽反应器因其简单性以及良好的混合和质量传递性能而被广泛使用。充气搅拌槽反应器的特点是灵活且应用范围广泛，包括酵母、细菌和哺乳动物细胞的培养。然而，根据选定的细胞类型，对设备和过程的要求差异很大。例如，在培养具有高氧需求的微生物时，必须在短时间内提供氧气和营养物质。在哺乳动物细胞的情况下，其代谢速度明显慢于微生物，持续供氧同样重要。然而，对于哺乳动物细胞，必须额外注意以确保在有限的水动力应力下提供所需的氧气和营养物质的混合。与其他反应器类型（如气泡柱或气升式反应器）相比，充气搅拌槽的特点是，不仅可以通过气体相的浮力驱动流动来保证质量传递和混合，还可以通过搅拌器的动力输入来主动保证，这允许更受控的过程条件。 本章描述了在细胞培养应用背景下，充气搅拌槽反应器的主要特性研究方法。在接下来的内容中，将描述用于描述机械功率输入、体积质量传递、流场以及混合的既定方法。在这一过程中，将反复使用3升实验室规模和15,000升工业规模的搅拌槽反应器作为示例。对于后者，与勃林格殷格翰制药有限公司合作，在汉堡技术大学多相流研究所建造了一个亚克力玻璃反应器。图3.1展示了可用的透明搅拌槽反应器的示意图。 图3.1 汉堡多相流研究所的通气透明丙烯酸玻璃搅拌槽反应器。（左：3 L Applikon，中：15,000 L搅拌槽反应器的30 L缩小模型，右） 基于既定方法和最新发展，下面描述了充气搅拌槽反应器在生物制药细胞培养过程中的特性。多个研究团队已经开发了六十多年的移动、封装传感器在生物技术过程中的潜在应用。也称为拉格朗日传感器粒子（LSP），它们能够在整个反应器体积内收集和传输连续数据，从而可能在细胞培养过程中从细胞的视角提供测量数据。最后，讨论了数值流场模拟的最新进展，以充气搅拌槽反应器为例，说明了数值流场模拟所面临的挑战，但也提供了机遇。 以下描述的所有方法都可以用于充气搅拌槽反应器的特性研究，也适用于其他反应器类型，如气泡柱和气升式反应器。然而，指出以下描述明确考虑了细胞培养应用的背景。这是因为与微生物发酵或化学反应相比，细胞培养过程是在显著较低的特定功率输入和通气率下进行的。此外，发酵液是低粘度的牛顿介质。因此，来自其他类型应用（如微生物发酵或化学工业）的知识不能直接转移。充气搅拌槽反应器在文献中已有详尽描述。因此，有关更多信息，读者可参考Zlokarnik、Nienow和Kraume的相关书籍和出版物。下面简要讨论搅拌槽反应器的基本设计和组件。这用作详细描述的与细胞培养应用相关的特征方法的参考。 1.1.充气搅拌槽反应器的基本原理 搅拌槽反应器的设计不受任何限制，但有设计规则和限制。例如，反应器的大小受到组件可搬运性的限制。此外，哺乳动物细胞的培养需要在材料和表面质量方面达到最高的制造质量标准。由于搅拌槽反应器经常用于过程工程中，其设计在DIN 28130中有规定。搅拌槽反应器主要由搅拌轴、搅拌元件、电机、挡板和温度控制单元组成。然而，正是各个组件的尺寸及其各自的排列决定了最大的设计多样性。此外，在气/液多相系统中，需要一个供气单元。这进一步增加了个别设计的程度。除了经典的不锈钢罐外，一次性生物反应器（SUBs）也越来越受欢迎。 根据列出的基本组件，很明显，由于系统内组件的自由组合和定位，可能存在许多不同的设计。这清楚地表明，文献中描述的物理关系有助于理解，但很少能直接应用于自己的应用。特别是对于细胞培养应用，详细的设备特性对于成功的过程转移和过程放大至关重要。在这种情况下，设备特性集中在机械功率输入、氧气体积质量传递系数和混合时间上。这是因为在包括mL < Vfill < m3范围内的反应器的种子培养阶段，始终确保相同的过程条件，如氧水平、浓度分布和最大剪切应力。图3.2以多个参数的函数形式图解了描述充气搅拌槽反应器操作的最重要目标值。对于后者，必须区分可调输入参数和固定设计参数。因此，只有输入参数（通气率和搅拌器频率）可用于在操作期间影响质量传递和混合的目标值。此外，还可以表征二氧化碳的体积质量传递系数、气泡尺寸分布、气体保持量、一般流场和最大剪切应力。然而，并不总是需要详细表征所有物理属性，因为在放大过程中并非所有系统物理属性都能保持不变。因此，放大通常基于图3.2中列出的目标值。此外，完全表征所有物理属性几乎没有意义，因为例如体积质量传递系数取决于气泡尺寸分布、局部能量耗散率和气体保持量（见图3.2）。然而，在故障排除的情况下，对更多参数的表征可以帮助找到适当的解决方案。 图3.2 可调输入参数和固定设计参数与目标值之间依赖关系的示意图。 为了更好地理解，也为以下解释提供基础，下面以透明的15,000升亚克力玻璃反应器为例，讨论了充气搅拌槽反应器的主要属性。图3.3显示了搅拌槽反应器设计中常用的基本组件。 图3.3 工业搅拌槽反应器的示意图，显示了主要组件（左）和反应器几何尺寸（右）。 系统中的挡板数量和搅拌器的形状可以自由选择。在低粘度介质的情况下，使用挡板以避免形成涡流并增加湍流，从而增加系统内的机械功率输入。从四个挡板开始，系统也被称为全挡板系统。全挡板系统的特点是，通过安装额外的挡板不能再进一步提高机械功率输入。此外，加热线圈或内置换热器也可以作为挡板。然而，由于其复杂的几何形状，这种安装总是难以清洁，并且对细胞培养过程尤其增加了污染的风险。因此，在细胞培养的热传递情况下，可以使用一个简单的双夹套反应器，在该反应器中，冷/热介质在双夹套中循环，搅拌槽反应器的温度由外部换热器控制。 原则上，推荐填充高度与反应器直径的比率D_H_{STR} = 1，并且在小规模应用中经常可以找到。然而，随着反应器体积D_{STR} > 4.6 m的增加，容器直径迅速增加，这限制了由于运输限制的容器尺寸。因此，对于具有体积V_{STR} > 2 m^3的大尺度搅拌槽反应器，使用比率D_H_{STR} > 1。这导致必须通过修改设计来解决的缺点。一方面，建议在反应器高度H上分布几个搅拌器。这意味着搅拌轴必须更长，因此更稳定。另一方面，随着比率的增加，混合时间相应增加。特别是当使用几个径向泵送搅拌器时，系统可能会出现分隔。这必须在设计中考虑，或者通过替代搅拌器组合进行补偿。 搅拌器的选择基于两个主要操作条件和三个操作任务。对于操作条件，区分轴向和径向泵送搅拌器。对于操作任务，区分均质化、分散和悬浮。图3.4显示了轴向和径向泵送搅拌器作为单级或多级配置的理想单相流结构的示例。可以假设，对于牛顿介质，所示的理想流结构与搅拌器频率无关。与两个轴向泵送搅拌器的双重配置相比，在双重径向泵送配置中会形成多个连贯的涡旋结构。轴向泵送搅拌器用于轴向混合和连续相的均质化。 图3.4 典型理想单相流动行为的表示：(i) 单斜叶涡轮（下泵送），(ii) 单鲁什顿涡轮，(iii) 双斜叶涡轮（下泵送）以及(iv) 双鲁什顿涡轮。 此外，必须始终考虑到传统的细胞培养应用是在分批补料中运行的。在这种情况下，必须保持顶部搅拌器与起始体积的最小重叠高度。这种配置的缺点是，反应器的上部体积没有被积极搅拌。反应器体积的增加导致上搅拌元件上方的体积变大，在最坏的情况下，会形成隔室，其特点是混合程度较低。反应器体积变化造成的影响如图3.5所示。 图3.5 单相流动结构作为培养时间和反应器体积函数的示例性说明。 由液体体积变化引起的隔室可以通过气体相根据操作参数来打破。此外，反应器体积的变化也会导致质量传递和混合行为的偏差。 在传统的细胞培养应用中，搅拌器被用来均质化液相以及分散气相。径向泵送搅拌器特别适合于分散，因为气相被搅拌器叶片引起的涡流尾迹分散，并在反应器横截面上径向分布。然而，分散效果取决于搅拌器类型、通气率以及反应器规模。更精确地说，气泡大小与搅拌器叶片高度的比率决定了搅拌器能有效地对气体分散做出多少贡献，因为特别是细胞培养过程在最大功率输入方面是有限的。根据通气率和搅拌器频率，可以分为三种情况，如图3.6所示。 图3.6 通气搅拌槽反应器中单个径向泵送搅拌器的典型搅拌器气体/液体行为的可视化：(i) 搅拌器淹没，(ii) 搅拌器负载，(iii) 搅拌器负载与气体循环，根据Warmoeskerken和Smith 。 最有效的气体分散发生在装载状态下。然而，如果在恒定通气率下搅拌器频率降低到临界最小搅拌器频率以下，或者在恒定搅拌器频率下通气率上升到临界值以上，搅拌器可能会被气相淹没。淹没状态下的特点是机械功率消耗减少和气体分散显著减少。这通常伴随着质量传递性能的降低。为了描述主导混合和质量传递性能的重要两相流结构，无量纲的流动数（Flow number）被引入。 使用通气率q，搅拌器频率 n 和搅拌器直径 d 以及搅拌器的弗劳德数（Froude number）进行描述。 使用重力常数g 可以描述。图 3.7 展示了根据文献，充气搅拌槽反应器中临界气体流率与弗劳德数（Fr number）的典型依赖关系。从淹没到装载状态的转换点的依赖性，对于不同的相关性，也显示出对弗劳德数的类似依赖。这些差异可以特别通过使用了不同的搅拌器或反应器几何形状来解释。图 3.7 中的数据点显示了来自 Rosseburg 等人的测量数据，这些数据是从汉堡的透明丙烯酸玻璃反应器中获得的，与 Mikulcova 等人的文献数据吻合得很好。此外，图 3.7 还展示了不同反应器规模的典型操作窗口。根据图 3.7 中的操作参数，很明显在细胞培养应用中，工业规模上装载和淹没之间的切换是可以预期的。虽然搅拌器的选择对气体分散有影响，但分散器类型的选择同样重要。随着搅拌槽反应器规模的增加（填充体积 mL < Vfill < m³），气泡大小与搅拌器叶片高度的比率减小。因此，随着搅拌槽反应器规模的增加，搅拌器的影响变得更加重要。常见的分散器几何形状包括简单的开口管、带有多个孔的管、烧结分散器甚至用于无气泡通气的膜。然而，这里不描述膜，因为它们在搅拌槽反应器的操作中是一个特殊情况。 图3.7 不同几何形状和尺寸的通气搅拌槽反应器在负载和淹没区域之间的转换，蓝色框标出了典型的操作窗口。 描述分散器的一个重要参数是韦伯数（Weber number）。 使用孔径 dorifice，液体密度ρ，表面张力 σ 和气体出口速度 v 。初始气泡大小取决于韦伯数，直接影响它们的上升速度，因此也影响两相流结构以及混合和传质性能。因此，了解反应器内气泡大小分布和两相流结构对于高效和成功的放大和工艺转移至关重要。因此，下面描述了充气搅拌槽反应器特性描述的最重要测量方法，并讨论了它们的实际实施。 1.2.充气搅拌槽反应器的实验表征方法 充气搅拌槽反应器的实验特性描述方法如下所述，它们在细胞培养应用的背景下进行了描述。 1.2.1.功率输入特性描述 搅拌器的机械功率输入是充气搅拌槽反应器的一个重要特性参数，它不仅常用于设计，也用于反应器设置的放大。 对于搅拌槽反应器，体积功率输入 P/VP/V 或平均能量耗散率 使用机械功率 P、填充体积 V 和密度 ρ 通常用于描述。平均能量耗散率 ε 进一步用于量化流体动力学应力。特别是对于哺乳动物细胞培养过程，了解最大流体动力学剪切应力和剪切应力分布是很重要的，因为最大剪切应力会影响重要的细胞参数，如活性、细胞生长甚至细胞死亡。因此，精确了解功率输入是决定充气搅拌槽反应器操作成功或失败的决定性特征参数。因此，下面详细讨论了确定机械功率输入的最重要基本原理和方法。机械功率输入的表征区分了单相和双相操作。由于细胞培养过程中的氧气需求相对较低（与微生物应用相比），通常单相操作的表征就足够了。尽管如此，下面也描述了气相对功率输入的影响。描述充气搅拌槽反应器的最重要的无量纲数是雷诺数。 搅拌器频率 n、搅拌器直径 d、液体粘度 ν 以及功率数是描述搅拌槽反应器操作的关键参数。 液体密度 ρ 和机械功率是描述搅拌槽反应器操作的两个重要参数。 搅拌器频率 n 和搅拌器扭矩 Mstirrer 是两个关键参数，用于描述搅拌槽反应器的操作。 如果搅拌器扭矩 Mstirrer 不能直接测量，因为扭矩传感器安装在电机上或轴轴承后面，例如，首先需要在空气中测量轴承的空转扭矩。有多种测量技术用于测量轴上的机械应力。模拟测量技术包括经典的位移和角度指示器，如线性移动线圈运动或摆锤机。模拟仪器基于经典力学定律。数字测量仪器通常基于使用电扭矩传感器。应变片是最著名的扭矩传感器之一。在这种情况下，当长度 Δl 发生变化时，应变片的电阻 R0 会按比例变化 R = R0 ± ΔR。为了在小尺寸组件上实现尽可能大的绝对路径长度变化，应变片通常设计成曲折形状。此外，还有扭矩传感器通过压电传感器测量轴上的扭转力。压电传感器在施加压力时产生与施加力成比例的电压。与应变片相比，压电传感器的特点是测量范围更大、动态响应和更高的过载能力。 无论采用哪种测量方法，扭矩都与频率的平方成正比。这种物理关系可以用来检查扭矩测量的合理性。在完全挡板系统、无通气和湍流状态下操作时，扭矩 与搅拌器频率的平方成正比。回归原点的线性偏差 b 包括测量方法的静态误差，如总测量偏移。必须从测量的扭矩中减去这个误差。因此，对于湍流状态，未充气的功率数 是根据拟合扭矩的斜率 a 来计算的。确定湍流范围的功率数具有决定性优势，因为它减少了确定空转扭矩的不确定性。这一点在图 3.8 中得到了清楚的展示，该图显示了搅拌器扭矩和空转扭矩与搅拌器频率的关系。 图3.8 根据修改后的搅拌器频率n2测量的总扭矩和空载扭矩的示意图。 对于过渡区域和层流区域，这种关系不适用，并且功率数是直接用测量的扭矩计算的，相应的不确定性更高。 图 3.9 显示了单相操作下不同搅拌器和搅拌器组合的功率输入特性。在单相操作中，功率数是雷诺数的函数，并且可以划分为三个区域：层流、过渡和湍流区域。对于完全挡板系统，在层流区域，功率数与雷诺数成反比。而在湍流区域，功率数或多或少是恒定的。在没有挡板的系统中，即使在湍流区域，功率数也会不断减小，这对于放大操作尤其成问题。最后，在完全挡板系统中，可以假设只要搅拌槽反应器在湍流区域操作，牛顿数就会保持恒定。此外，功率数是搅拌器特有的数字，并且进一步依赖于整体反应器几何形状（安装高度、宽高比、挡板数量），因此必须始终针对要描述的搅拌槽进行确定。 图3.9 单相操作的挡板搅拌槽反应器中不同搅拌器的功率输入特性。 图 3.9 说明，为了确定搅拌器在所有流动区域（从层流到湍流）的功率输入特性，必须覆盖几个数量级的雷诺系数。最简单的变体是改变搅拌器频率，对于层流区域必须设置非常低的搅拌器频率。由此产生的非常低的所需扭矩非常难以测量。此外，将需要一个扭矩测量装置，能够测量从几 Nmm 到几 Nm 的范围。因此，使用甘油改变粘度被证明更实用。这样做的优点是既不需要改变设置也不需要改变测量系统。 此外，还必须研究通气条件下的功率输入特性，因为搅拌器的机械功率输入会根据搅拌器类型和搅拌器配置而减小。 在文献中，存在大量不同的经验相关性，描述了通气对机械功率输入的影响 。然而，所提出的相关性并不总是可以无限制地应用，这可以从图 3.10 中看出。它显示了与文献相比，通气导致的功率输入相对下降的一致性图。对于 30 L 和工业用 12,500 L 搅拌槽反应器，在通气条件下测量的功率数下降与根据 Calderbank计算的下降进行了对比。另一个参数也指的是无量纲气体流量数 FlG。 图3.10 不同搅拌槽和搅拌器组合（d：搅拌器直径，s：搅拌器间隙）通气对机械功率输入影响的比较（与文献数据）。 图 3.10 进一步显示了搅拌器配置在通气条件下对功率数的影响。为此，搅拌器之间的间隙 s 相对于搅拌器直径 d 进行了变化。可以看出，对于 30 L 搅拌槽反应器，通气对机械功率输入的影响可以通过相关性很好地预测，而工业搅拌槽的预测则失败了。 1.2.2.全局和局部混合时间的测量 混合时间是一个重要的关键参数，通常用于表征充气搅拌槽反应器。特别是对于多相操作，需要在长时间内不断将两个或更多相接触。在细胞培养过程中，必须确保在整个反应器体积内持续供应恒定的营养物质和溶解氧浓度。有效的混合确保了整个系统在整个过程中的充足营养供应。此外，有效的混合最小化了局部浓度梯度（例如 pH 调节后）。下面，描述了混合和表征搅拌槽反应器中混合时间和混合性能的基础，以及微、中、宏观混合以及局部和全局混合时间等重要术语。此时，讨论了混合的物理基础。基于基础，描述了充气搅拌槽反应器的典型混合行为。最后，描述了确定和表征混合时间的常见测量方法。 1.2.3.混合的定义 混合时间描述了达到两个或更多不同相（液/液或固/液）完全均匀化的时间。因此，混合时间通常由系统中的均匀程度来定义。为了确定混合时间 通常使用 95% 标准，该标准描述了在阶跃响应后，测量变量 I 在最终值周围 5% 范围内保持的时间。图 3.11 显示了阶跃响应测量后测量变量 I 的时间变化。当达到最终值的 95% 时，系统被认为已经均匀化。95% 标准是一个统计工具，用于提高有效性和可比性，因为达到稳定的 100% 均匀状态可能需要无限长的时间。这可能是由于测量位置、探头的响应特性，也可能是由于静态实验误差。 图3.11 脉冲响应测量后测量量I发展变化的示意图。 此外，在描述混合时间时，需要区分宏观、介观和微观混合。由于混合时间是由浓度差异的补偿来定义的，因此必须在微观尺度上实现浓度补偿的均衡。这意味着搅拌器负责宏观尺度上的混合，但如果微观尺度上没有扩散，就无法实现完全均匀 。描述微观混合长度尺度的一个重要参数是 Kolmogorov 长度。 与体积平均能量耗散率 ε 和液体粘度 ν 一起，描述了预期的最小涡旋尺寸。宏观混合依赖于反应器的几何形状和搅拌器，而微观混合的时间 仅依赖于反应器中的扩散系数 D 和最小涡旋尺寸 λ，因此与反应器几何形状无关 。由于宏观混合在很大程度上依赖于反应器的几何形状，因此所使用的设备也很重要。特别是在设备特性、工艺转移和放大时，了解宏观混合至关重要。此外，在细胞培养过程中，总体混合主要取决于宏观混合。因此，已经开发了一种区分微观混合和宏观混合的实验方法。该方法基于光学观察混合时间以及对用于与氢氧化钠溶液中和反应的过量盐酸的特定控制。图 3.12 显示了确定微观和宏观混合的测量程序示例。为了确定微观混合，必须使用 1:1 的酸和碱混合比，因为只有在微观尺度上完全均匀且摩尔比相等的混合才能实现完全的颜色变化。用于观察混合的 pH 指示剂是溴麝香草酚蓝。溴麝香草酚蓝的优点是能够区分酸性（黄色）、中性（绿色）和碱性（蓝色）pH 区域。对于宏观混合的确定，不需要考虑均匀程度，因为在微观尺度上观察示踪剂已经扩散到系统的哪个位置。为了确定宏观混合，微观尺度上不一定需要平衡浓度。反应器体积中酸的分布导致一旦每个子体积中酸过量，颜色就从蓝色变为黄色。 图3.12 微观混合与宏观混合 - 两种物质A和B的宏观和微观混合的示意图，上排是相同物质混合物，下排是物质B双倍过量；M：均匀度。 除了定义微观和宏观混合外，下面更详细地描述了局部和全局混合时间的定义。“局部”和“全局”混合时间这个术语是相对于描述混合时间的框架而言的。系统的全局混合时间是整个系统的平均值，因此是所有局部确定的混合时间的平均值。对于局部和全局描述，可以进一步细分为宏观或微观混合。 1.2.4.两相混合 对于搅拌槽反应器的混合特性，区分了充气和未充气操作下的混合。这种区分很重要，因为分散的气相对混合行为有显著影响。通常，混合时间随着搅拌器频率或未充气时的功率输入的增加而减少。在充气情况下，搅拌器与分散气相的相互作用可能会加强或甚至显著逆转这种效果。这主要由搅拌器的运行条件决定。因此，当搅拌器淹没时，系统的混合时间可以显著减少（见图 3.6）。然而，如果在恒定的通气率下增加搅拌器频率，搅拌器从淹没状态变为装载状态，即使机械功率输入增加，混合时间也会增加。 图 3.13 显示了两相混合时间特性。混合时间特性与搅拌器雷诺数 Re 相对应，该雷诺数已由 Rosseburg 等人在工业规模充气搅拌槽反应器上进行了测量和相关性分析。在雷诺数和通气率较小的范围内，全局多相混合时间远小于单相混合时间。在 2 × 10^5 < Re < 4 × 10^5 的范围内，随着雷诺数的增加，多相混合时间随着通气率的增加而增加，直到高雷诺数时多相和单相混合时间值重合。 图3.13 工业规模通气搅拌槽反应器的多相混合时间特性，蓝色框标出了所研究STR的典型操作窗口。 混合所需时间的确定通常基于对脉冲响应的测量。例如，使用局部电导率峰值来测量电导率随时间的变化。为此，在时间 t0 时局部加入少量电导率较高的物质，以便测量电导率随时间的变化。除了通过增加电导率的阶跃响应外，也可以使用温度或 pH 阶跃，或者使用任何其他可以可靠测量的过程变量。为了解释不同的实验测量方法，下面列出了最重要的方法，并在细胞培养应用的背景下进行了讨论。 1.2.5.测量方法 通常，确定混合时间的测量方法可以分为侵入性和非侵入性方法。图 3.14 提供了用于确定搅拌槽反应器混合时间的侵入性和非侵入性测量方法的总体概述，下面将更详细地讨论。 图3.14 搅拌槽反应器混合时间测定的侵入性和非侵入性测量方法概览。图片显示了使用溴酞蓝可视化的酸-碱反应混合。 非侵入性方法基于光学或断层成像观察混合过程，可以通过比色法、荧光或密度差异等不同方法进行可视化。侵入性方法通常涉及使用局部探头进行浓度、温度或 pH 测量。此外，必须在化学和物理方法之间进行区分。 化学或物理方法在量化混合的机制上有所不同。基本上，通过测量阶跃响应来量化混合。产生阶跃响应的具体方法取决于每种方法。例如，在化学方法中，使用中和反应来侵入性地测量 pH 或使用比色 pH 指示剂进行非侵入性可视化。在物理方法中，通过添加少量具有相应较高物理性质的液体来影响电导率、温度、密度或 pH，这些可以通过局部探头侵入性地测量。物理性质的变化也可以通过非侵入性成像方法如 PLIF（平面激光诱导荧光）或断层成像方法进行测量。 化学方法也常被称为“光学方法”，因为搅拌槽反应器中的介质颜色会根据化学反应而变化。在化学方法中，单次和多次过渡系统之间有区别。单次过渡系统包括硫代硫酸钠与碘的氧化还原反应或氢氧化钠溶液与盐酸的中和。多次过渡系统包括通过多色 pH 指示剂如溴麝香草酚蓝可视化的中和反应。 此外，区分局部和全局测量也很重要。局部测量是指通过单个或多个探头在特定位置测量系统的物理参数（例如电导率）。全局测量意味着观察例如通过 pH 敏感示踪剂的中和反应。在局部探头的情况下，探头的响应时间尤为重要，并且必须比预期的混合时间短得多。光学方法通常不会遇到测量方法的响应时间问题，因为在中和反应中，pH 变化几乎可以立即可视化。此外，在侵入性测量的情况下，测量位置对结果有几种影响，这取决于用于测量混合时间的搅拌槽的大小。在小型搅拌槽反应器中，探头由于其相对于反应器直径的大小而影响流场，从而也影响混合时间。在较大的搅拌槽反应器中，例如，探头可能安装在一个小的、混合不良的区域，这不代表整个搅拌槽反应器。 全局测量可以通过 PLIF 或其他光学可视化方法进行。PLIF 是一种在系统中的单个切片上测量浓度场的成熟方法。该方法也可以用来观察浓度随时间的变化，从而描述混合。然而，由于该方法需要昂贵的激光器和光学透镜以及高度敏感和快速的相机，因此不容易实施。PLIF 的一个限制是只能在一个平面上观察混合。这意味着得出的混合时间仅对评估的切片有效，但与仅在一点进行的局部测量相比，这仍然具有显著更多的意义。使用简单颜色变化的测量方法也被称为脱色方法。颜色的变化可以通过硫代硫酸钠与碘的氧化还原反应或氢氧化钠溶液与盐酸的中和来实现。脱色方法的优点是可能的死区清晰可见，但无法检测到过量的碘或盐酸。这是因为颜色变化的阈值不一定与系统中的完全均匀性相关。为了获得更广泛的“脱色”范围，例如在中和反应中，可以使用多色 pH 指示剂如溴麝香草酚蓝，而不是常用的酚酞。 1.2.6.流动可视化 了解充气搅拌槽反应器中的流场对于理解过程至关重要。基于对流场的确切了解，可以更好地理解混合过程。此外，流场测量可以用来识别可能存在的梯度（温度、氧气或营养成分浓度、pH）并根据它们优化过程。最后，实验确定的流场有助于验证数值模拟，这些模拟反过来可以提供对过程更深入的了解。下面描述了最重要的理论原则，以及可用测量技术的概述。 在描述流场时，区分了欧拉方法和拉格朗日方法。在欧拉方法中，流场主要被视为连续相，使用有限体积方案方法求解流场的 Navier-Stokes 方程。这种方法主要在三维笛卡尔坐标中使用，涉及在空间中建立一个固定的测量体积，流体通过该体积移动。拉格朗日方法将流场视为由在空间中移动并携带特定物理性质的粒子组成的离散相。根据流体粒子相对于其周围的位置绘制并监控其轨迹。在流体元素的观点中，它保持静止，而周围的流体在移动。通过结合欧拉和拉格朗日方法，可以将微生物的反应（在拉格朗日框架内）与其遇到的环境（在欧拉框架内）结合起来 。下面，更仔细地研究了欧拉和拉格朗日流场规格，以及它们是如何相互联系的。 欧拉流场规格定义了流特征（如速度或压力）在控制体积上的瞬时分布。因此，欧拉速度 uE 被定义为空间和时间的函数。对于每个时间步长，三个分量 u、v 和 w 描述了空间中某个点沿各自轴 x、y 和 z 方向的速度。 拉格朗日流场规格定义了流的特征，作为流体包位置和时间的函数。速度的三个分量给出了流体包在各自轴方向上的瞬时速度。拉格朗日视角被理解为不是定义一个分布，而是作为在欧拉流场中移动的个别小流体包的观察。这些包必须足够小，意味着它们不应该以任何方式影响欧拉速度场，而只是随它被动流动。拉格朗日速度 uL 包裹XL在给定时间t的速度等于该时刻包裹位置的欧拉速度。拉格朗日速度的导数，即流体包裹的物质导数或加速度，可以表示为： 拉格朗日包裹遵循其轨迹，该轨迹定义为包裹的初始位置和拉格朗日速度的积分，如方程3.15所示。对轨迹进行积分可以得到拉格朗日包裹的位置，如方程3.16所示。 多种测量方法可以用来描述充气搅拌槽式反应器中的流速场。然而，在为特定系统选择适当的方法时，需要考虑一些方面。需要克服的主要困难是通常难以接触到系统，因为要被表征的系统通常是永久安装的，这意味着对于现有工厂要么需要制作一个透明的复制品，或者对于新工厂，在投产前需要安排适当的测量时间进行表征。此外，发酵液通常是不透明的介质，因此对光学测量方法的可访问性较差，这进一步限制了合适的测量方法的选择。因此，细胞培养应用的表征研究通常是在PBS-Pluronic介质中进行的，它具有可比的流变特性，也更容易使用。 图3.15给出了描述细胞培养应用中流场的最常见测量技术的概览。此外，文献中还可以找到更多的测量技术以及这里列出的测量技术的变体。 图3.15 搅拌槽反应器流场测定的侵入性和非侵入性测量方法概览。图片显示了流场测量与酸-碱反应混合可视化的溴酞蓝图像相结合。 1.2.7.拉格朗日传感器粒子的开发与应用 过去几十年，由于微生物学、遗传工程、动物细胞培养、基因组学和蛋白质组学的显著进步，生物技术过程的发展有所增长。因此，过程监测和过程控制是保证可重复性、高质量标准以及提高效率和生产力的关键。为此，使用了局部固定的环境传感器，如温度、压力、（溶解）气体、pH值或生物量密度传感器。然而，尤其是工业规模的生物反应器需要对过程参数进行时空获取，因此这些静态探头可能无法构成系统内部真实发生情况的代表性画面。它们在反应器壁附近的单点测量只能描述相应体积分数的时间依赖平均值。需要估算微生物在培养过程中经历的死区和区间形式的空间和时间梯度。关于群体感应和细胞间相互作用的最新研究表明了在动态变化环境中的影响，这就是为什么必须彻底研究微生物生命线以理解发酵过程中的群体异质性。多个研究小组从数值角度解决了这个问题或在多室缩放反应器中调查大规模影响。然而，为了验证拉格朗日粒子模拟、校准室模型并最终提高对这个话题的理解，仍然需要实验数据。这就是为什么医疗行业的一个独特发展为过程工业克服上述障碍提供了一个例子：移动局部传感器。由于Rowlands和Wolff在1961年以及Watson等人一年后描述的商业开发的无线电药丸，这些长约20毫米的圆柱形颗粒随后被用于测量料仓中颗粒材料的内部应力。这种传感器和发射器在封装壳体内的直接连接可以被认为是用于过程工程研究的第一种无线自由浮动传感器粒子系统。2005年和2007年，Wadke等人展示了他们的“智能”球体，直径25毫米，如何在被引入旋转鼓式混合器时无线接收命令并持续在其内部存储温度数据。此外，Deng等人展示了移动的环境传感器设备，以评估在水电站大坝安装挡板前后，鱼在溢洪道通道中受伤的风险。另一个团队使用直径70毫米的仪器化颗粒来评估各种环境中的水文地质过程，如河流、沿海和风成环境，以了解粗颗粒在床面上的初始卷入。关于生物技术，为了测量发酵过程中搅拌槽式反应器内的液体循环时间，第一次实施是在1969年通过一个直径20毫米的空心球体，配备了一个约2MHz载波频率的无线电发射器。在450升容量的搅拌槽中成功获得了基本评估。之后，通过小型封装无线电发射器对搅拌和充气槽中的循环时间进行了进一步的开发。在下一节中，简要介绍了九个最近采用这种方法来获得生物反应器内部视图的研究小组（见图3.16）。 图3.16 用于生物技术应用的拉格朗日传感器粒子（LSP）开发者 - 1: "Sens-o-Sphere"，Lauterbach等人（德国德累斯顿工业大学）；2: "smartCAPS"，Zimmermann等人（法国smartINST SAS）；3: Todtenberg等人（德国高性能微电子创新与Fraunhofer IBMT）；4: "BPOD"，Stine等人（美国马里兰大学）；5: Reinecke & Buntkiel（德国Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf）；6: "Xploring WiseMotes"，Duisterwinkel等人（荷兰埃因霍温理工大学 & INCAS3）；7: "Fermsense 3D"，Bisgaard等人（丹麦Freesense ApS）；8: Cabrera & Cobelli（法国CNRS、阿根廷布宜诺斯艾利斯大学和IFIBA）；9: Hofmann等人（德国汉堡工业大学）；传感器类型 - T: 温度；p: 压力；pH: pH值；C: 电导率；cgas: 溶解气体；IMU: 惯性测量单元。 这九种设计中有五种可能使用无线数据传输，其余四种设计旨在内部存储记录的数据。通过应用和合并多个传感器系统到一个移动的、封装的、自由浮动的拉格朗日传感器粒子（LSP）中，他们的共同目标是理解细胞间和细胞-生物反应器的相互作用，并模仿细胞的运动。为了进行彻底和批判性的审查，评估现有的数值和实验思想以及与确定生命线和应用生命线分析相关的障碍，读者可以参考Blöbaum等人。 Lauterbach等人开发了最小的生物技术应用拉格朗日传感器粒子（LSP），称为Sens-o-Spheres，直径仅为7.9毫米。这些感应式可充电球体包含一个天线，用于通过433 MHz的载波频率将测量到的温度数据（最快传输频率为0.1 Hz）发送到反应器外部的接收器。最多可以同时使用24个LSP。实验试验表明，不仅在实验室摇瓶中成功实施，还在装有去离子水的200升和2000升一次性生物反应器中成功实施。 第二个团队是smartINST，他们实施了不同类型直径为25毫米的LSP的现场无线测量。基于Zimmermann等人的研究结果，将温度、pH值、电导率或压力传感器集成到由聚醚醚酮（PEEK）制成的外壳中。 第三个研究团队是Todtenberg等人，他们实施了LSP和基站之间的无线电通信系统，载波频率为433 MHz。该团队的目标是设计一种传感器胶囊，能够通过电位、电流和电导率传感器远程监测光生物反应器内藻类培养的生长。第一个原型在流经反应器的营养液中显示出26%的汇聚数据包错误率。尽管对第二个原型的电位传感器值成功展示了一个信号处理链，但据作者所知，专有的生化测量系统（BMS）芯片的进一步测试仍在进行中。 Stine等人展示了一种有前途的现场氧气测量方法。他们的LSP被称为“bPod”，直径为60毫米，已在2升玻璃容器和10升实验室规模生物反应器中进行了测试。它包括一个电位统计模拟前端、一个蓝牙低功耗微控制器和一个Clark型溶解氧（DO）传感器。bPod经过测试，发现其电化学电流响应与DO饱和水平呈线性关系。与前述研究团队相比，数据传输通过蓝牙低功耗无线通信进行。 Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf与可再生资源机构（FNR）合作，在“NeoBio”项目和明斯特应用科学大学内开发LSP，已在空气-水柱反应器、多个沼气反应器和废水处理厂进行了测试。由于其集成的浮力控制单元，通过活塞实现，并且可以将空隙填充有效载荷，第一个形状相当是圆柱形的，直径为45毫米，高度约为85毫米。2021年，展示了一个直径为90毫米的球形设计。在已经集成的IMU、温度和压力传感器中增加了一个电导率传感器。此外，基于超宽带无线电技术的模块在流体表面执行定位和数据传输。第三个设计也是球形的，但直径只有40毫米，因此由于空间有限，配备了较少的传感器。当前的研究在15000升生物反应器中显示出有希望的结果，用于表征轴向泵送叶轮的流体动力学行为，关于循环时间分布和停留时间。 研究小组Duisterwinkel等人引入了直径为39毫米的Xploring WiseMotes，以便在现场进行操作管道的测量。它们配备了惯性测量单元和超声波发射器，并被引入到260米的管道段中。随后离线分析数据。另一个应用是在气泡柱中，分析LSP与气泡的相互作用，以确定空隙分数和气泡尺寸分布。超声波发射器的概念基于他们在2013年的研究，在该研究中他们提出了一种技术，其中一群传感器motes进行超声波测距测量，以确定motes在群内的位置，同时同时绘制群穿越的周围环境。 成立于2016年的公司Freesense开发了LSP，这是丹麦制药行业和丹麦技术大学（DTU）之间的合作。基本上，发布了两种类型的LSP，一种直径为43毫米，另一种直径为52毫米。第一种（“FermSense 3D”）配备了ISFET pH传感器、温度传感器、压力传感器和惯性测量单元（IMU）。对于后者（“FermSense DO”），pH传感器被溶解氧传感器取代。第一个设计已在600立方米的气泡柱中实施，以监测温度和pH水平。数据与从压力测量导出的轴向位置相关，并进一步用于开发自动化室模型。 Cabrera & Cobelli的LSP设计被介绍为表征湍流自由表面流动的方法。该粒子能够测量其三维平移加速度和角速度，并将它们记录在可移动的存储卡上。粒子的外壳是使用丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS）3D打印成型的，呈球形，直径为36毫米。尽管该设备不是专门浸入使用的，但其基本结构由商业现成组件构建，为可访问的、可复制的和开源的LSP开发项目提供了一个示例。 在德国研究基金会（DFG）资助的优先计划InterZell（SPP 2170）框架内，Hofmann等人开发了两种直径为40毫米的LSP设计，一种配备了压力传感器，另一种配备了IMU。由于外壳由加工聚甲基丙烯酸甲酯（亚克力玻璃）制成，因此可以从外部检测到外壳内不同颜色安装的LED，并用于验证记录的位置数据。在200升和15000升的亚克力玻璃生物反应器中进行了IMU和压力数据的评估。这种分析通过确定循环时间和停留时间来识别室。利用LSP进行的多尺度实验与数值方法相结合，可以帮助理解并成功放大过程。通过为缩小规模的实验提供指导，并确定菌株工程或生物反应器优化的目标，LSP的开发和应用对生物技术和与气候变化相关的即将到来的挑战至关重要。 1.2.8.氧气和二氧化碳质量传递 对于哺乳动物细胞的发酵，必须始终向细胞提供足够的溶解氧。特别是由于其在水中的低溶解度，了解向发酵液中理想供氧的知识对于成功操作至关重要。此外，必须从发酵液中移除细胞呼吸产生的二氧化碳，以防止过度酸化。描述气液质量传递的两种最常用的理论是双膜理论和渗透理论。由于本章旨在总结实践经验，只回顾了最广泛应用的双膜理论。以下首先讨论质量传递理论，然后描述确定氧气和二氧化碳体积质量传递系数的方法。 图3.17 双膜理论，气体和液体边界层及其各自的厚度δG和δL对应于界面两侧的kG和kL。 对于两相系统，双膜理论提出了在界面两侧各有两个层流浓度边界层，如图3.17所示。在距离界面足够远的地方，认为每种物种A和B的浓度保持不变。在边界层内，描述了大体积和界面之间的浓度梯度。通过气态边界层的气态物种A的摩尔通量由以下公式描述： 而物种A通过液态边界层的通量定义为： 在界面处，两相之间保持平衡状态，其中亨利定律常数描述了浓度的不连续性： 对于亨利定律常数的高值，意味着气相在液相中的低溶解度，液相边界层的阻力远高于气相边界层，从而得到远高于kG的kL值。因此，质量传递速率kG通常被认为可以忽略不计，因此，气相中气态物种A的浓度被认为是恒定的，如图3.18所示。 图3.18 气泡向液相主体的质量传递。 在两相气液反应器中，使用体积质量传递速率kLa来量化质量传递。由于实验上通常不可能分别确定液相质量传递系数kL和单位体积比表面积a，因此它们被一起作为一个系数来确定。要计算体积质量传递系数， 求解得到 为了确定反应器中的体积质量传递系数，需要随时间测量溶解气体的浓度。这可以通过动态脱气、动态压力法或化学方法进行。然而，目前的重点是基于第一种方法，因为在哺乳动物细胞培养和相应的低氧吸收率的情况下，动态脱气是最高效的测量方法。有关后者的更多信息，请参阅Garcia-Ochoa和Gomez。 1.2.9.确定体积氧质量传递速率kLaO2 体积氧质量传递系数kLaO2是一个重要的特定过程参数，可以用来计算氧传递速率（OTR）。确定体积氧质量传递系数的最常见方法是动态法。一般来说，动态法基于在实际工艺条件下氧气的连续吸收和解吸。由于大多数氧探头不能测量绝对值，只能测量相对氧饱和度（0-100%），因此在以下内容中我们不会将其转换为绝对值。在测量过程中，如果流体性质、系统参数以及亨利定律常数保持不变，则在相对值和绝对值之间进行转换是不必要的。这大大简化了评估，因为不需要事先确定亨利定律常数。 为了确定体积氧质量传递系数，需要测量液相中溶解氧的浓度随时间的变化。因此，首先通过用氮气脱气将氧浓度降至零。接下来，通过通气再次增加空气或纯氧浓度，直到达到氧饱和。然后可以根据公式3.22计算体积质量传递系数kLa。实际上，为了节省时间和资源，只需在较小的氧饱和度范围内工作即可。因此，建议用氮气脱气直到溶解氧浓度低于10%的阈值。为确保所有氮气气泡在评估的浓度范围内已离开系统，可以使用饱和度浓度20%以上的数据。为了更好地理解，图3.19显示了完全脱气后的理想浓度模式以及典型的测量浓度曲线。特别是在最初的几分钟内，测量的氧信号落后于实际过程。 图3.19 动态脱气测量中相对氧浓度模式的示意图。 进一步降低氧浓度是不合理的，因为一方面由于浓度梯度（液相到气相）的减小，质量传递速率显著降低。这导致需要用氮气对系统进行非常长时间的通气。另一方面，由于氧探头的响应时间，在氧通气开始时无论如何都会在测量信号中出现时间延迟，这会导致错误的测量，因此得到错误的体积氧质量传递系数值。图3.20特别说明了初始上升阶段对最终体积氧质量传递系数的影响，该图显示了理想和非理想模式下氧浓度曲线的对数。图3.20中显示的体积氧质量传递系数是在20-80%氧饱和度范围内评估的。图3.20清楚地表明，即使是很小的偏离理想浓度曲线也会导致得到的体积质量传递系数有显著差异（8.13与8 h^-1相比）。需要注意的是，图3.20中显示的情况明显夸大了，以说明非理想测量的影响。在现实中，影响要小得多，这取决于质量传递性能和特定的氧传感器。然而，每次测量都应该在这方面进行审查。 图3.20 非理想测量对体积质量传递系数影响的示意图。 此外，为了将实验时间保持在可接受的范围内，以及由于传感器校准错误而导致的误差，因此建议进行直到80%饱和度的分析。显著高于80%氧饱和度的测量是不合理的，因为相应探头的静态和统计测量误差会导致更大的误差，这进一步增加了评估的复杂性。图3.21显示了探头校准到错误饱和浓度（±2%）的情况下的对数浓度曲线。很明显，当评估中包含超过80%的值时，体积氧质量传递系数值的计算误差会增加。因此，饱和浓度c*必须在实际工艺条件下（温度、过压、盐浓度、表面活性剂）通过通气直到液体被空气饱和，且氧浓度保持恒定来测量。这里给出的（20-80%）评估范围是基于作者的经验。需要注意的是，考虑到上述测量误差，评估范围可以调整，当然也可以变化。 图3.21 错误校准的氧传感器对体积质量传递系数影响的示意图。 1.2.10.确定体积二氧化碳质量传递速率kLaCO2 除了向系统中提供足够的溶解氧供应外，高效地去除二氧化碳对于哺乳动物细胞的培养也非常重要。哺乳动物细胞代谢产生的二氧化碳被运输出细胞，因此溶解在培养基中。如果培养基主要由水组成，一小部分溶解的二氧化碳会与水（H2O）反应形成碳酸（H2CO3） 碳酸是一种强的双质子酸，首先解离成氢碳酸盐（HCO3^-）和质子（H+） 氢碳酸盐随后解离成碳酸盐（CO3^2-）和另一个质子 对于稀释溶液，质子的浓度可以用pH值来描述。由于三种碳酸酸种——二氧化碳、氢碳酸盐和碳酸盐——通过质量作用定律相互关联，因此可以在给定的pH值下确定每种酸种的比例F。在图3.22中，对数化的比例作为pH值的函数绘制出来。 图3.22 碳酸酸种的比例作为pH值的函数 。 当pH值小于8.3时，碳酸的比例低于1%（lg F = -2）。因此，第二步解离（方程3.24）不显著，可以忽略不计。然而，在pH值低于8.3时，二氧化碳的比例是关键，第一步解离（方程3.23）在pH范围4.3–8.3中是相关的。 二氧化碳是一种弱酸，不会使水的pH值降低到4.5以下。此外，pH值还影响二氧化碳的溶解度。在生物过程工程中，生产是在不影响哺乳动物细胞生长或生产力的溶解二氧化碳浓度条件下进行的。这些过程在pH环境4–8中运行，因为哺乳动物细胞也对pH值敏感。这个pH范围对应于第一步解离（方程3.23）。然而，在准静态条件下，氢碳酸盐浓度对二氧化碳的质量传递没有影响。准静态意味着pH值和二氧化碳形成速率保持不变或缓慢变化，这适用于大多数生产过程。 对于去除产生的二氧化碳，体积质量传递速率是一个决定性参数。为了确定二氧化碳去除的体积质量传递速率，测量通气期间的二氧化碳浓度。因此，饱和浓度c*设置为零，方程3.22修改为 原则上，图3.20和3.21所示和讨论的测量误差在测量体积二氧化碳质量传递系数时也可能发生。然而，由于二氧化碳在水中的溶解度比氧气大得多，与氧气相比，随时间变化的浓度梯度要小得多。因此，在确定体积二氧化碳质量传递系数时，图3.20和3.21中描述的误差要小得多。 1.2.11.静水压力的影响如亨利定律所示， 氧气的饱和浓度取决于气泡中氧气的分压。在大型反应器中，分压ppart随着静水压力phyd的增加而线性增加，因此可达到的饱和浓度也会发生变化。在几升液体体积的小反应器中，这种饱和浓度的变化可以忽略不计，但在工业规模或中试规模的反应器中则不然。在这类反应器的顶部，可以使用大气条件下的分压。然而，静水压力每下降一米表面以下大约增加0.1 bar，因此气相的分压也会增加。这种分压的线性变化以及可达到的饱和浓度的变化分别在图3.23中描述，温度为T = 37°C，液体体积为12 m³，高度为4m。因此，假设反应器中有一个全局饱和浓度可能会导致错误的结论。为了克服这个限制并获得合理的实验数据，最好的做法是在反应器的高度上放置多个探头，并确定每个探头的饱和浓度。 在良好混合的、由浮力驱动的系统中，Rosseburg等人在工业规模的反应器中测量了一个全局饱和浓度。反应器顶部和底部的探头都测量了反应器顶部和底部理论饱和浓度之间的平均值。对于图3.23中的示例反应器，全局饱和浓度将产生c* = 8.7 mg L^-1。尽管如此，建议使用多个探头通过实验确定系统的饱和浓度。 图3.23 静水压力对工业规模反应器中氧饱和浓度和分压的影响。 1.3.对于通气搅拌槽反应器的特征描述，数值流动模拟方法 设备特征描述如今像实验方法一样依赖于计算方法。计算流体动力学（CFD）通常被用作模拟搅拌槽内多相流动的工具。它可以提供从非常小的尺度到非常大的尺度的单相和多相变量的详细信息。为了计算流体速度和压力，CFD通过求解Navier-Stokes方程来工作。此外，质量、动量和能量守恒方程可以用来计算流体的浓度或温度分布。这些方程通常使用有限体积或有限元素方法数值求解，使用雷诺平均Navier-Stokes方程（RANS）湍流模型。通常使用k-ε两方程作为搅拌槽湍流流动模拟的湍流模型。求解两个输运方程，分别用于湍流动能和耗散率，以闭合RANS方程。结合稳态多参考框架（MRF）方法来考虑叶轮旋转，这种设置已被证明能准确预测搅拌槽反应器中的功率数。该方法在时间和空间上对方程取平均，简化了计算，但会导致一些精度损失。由于雷诺平均Navier-Stokes（RANS）k-ε模型是一种计算成本相对较低的方法，它经常被应用，并已被证明是设备特征描述的有价值工具。 另一种但计算上要求更高的模拟搅拌槽内流动的方法是大涡模拟（LES）。这种方法将流动分成大尺度和小尺度，并求解大尺度的Navier-Stokes方程，同时使用子网格尺度模型模拟小尺度的影响。结果，LES方法可以捕捉到湍流和非定常流动的更详细的效应，这在搅拌槽中很重要。Haringa等人能够清楚地表明，LES方法或RANS滑动网格比静态RANS MRF方法表现更好。 最近流行的另一种替代方法是格子玻尔兹曼模拟。格子玻尔兹曼方法基于玻尔兹曼方程，该方程描述了概率分布函数（PDF）的演变。该技术在格子上离散玻尔兹曼方程，其中每个节点代表粒子的可能速度方向。与传统CFD技术相比，其优点是计算效率高。该技术可以在相对较粗的网格分辨率下模拟流体流动，降低了计算成本并允许更快的模拟。此外，格子玻尔兹曼方法是一种高度局部的技术，可以通过使用图形处理单元（GPU）进行并行化，从而进一步减少模拟时间。 工业应用中搅拌槽的标准模拟程序仍然缺乏，使得很难比较不同出版物或公司的结果，即使美国食品药品监督管理局为CFD报告的格式、组织和内容提供了一些建议。 CFD模拟的准确性取决于几个因素，如网格质量、湍流模型和边界条件。CFD模型通常可以在不估计参数的情况下进行预测，这使得CFD在没有严格与实验数据比较的情况下就可以使用，许多模型的可信度未知。因此，在将CFD用于设计和优化目的之前，必须用实验数据验证CFD模拟。对于实验室规模的生物反应器，有几项研究比较了实验和模拟的流动模式。对于LB LES方法，Kuschel等人最近发表了一项针对3 L生物反应器系统的类似研究。模拟结果与新颖的4D粒子跟踪速度测量（4D PTV）实验进行了比较，显示出LB LES的时间平均流场与实验测量结果一致。Haringa提供了54 m³生物反应器和单个叶轮案例的RANS和LB LES方法的比较。 网格质量，包括其大小、形状和分布，可以显著影响CFD模拟的准确性和计算效率。为确保CFD模型的有效性，进行网格研究以优化网格参数，并确保网格足够精细以捕捉生物反应器中流体流动的细节，但又足够粗糙以确保计算时间较短。这涉及到评估不同的网格技术、网格元素大小和单元形状，以及评估网格对模拟结果的影响。 由于许多生物制药过程是基于特定功率输入转移的，准确识别功率数Po是CFD模拟的主要目标。在网格研究方面，通常在不同的网格尺寸下确定功率数。通常，在较粗的网格上功率数不稳定，一旦网格变细就会收敛。在相对粗的网格尺寸上功率数的收敛已在文献中得到证明。除了网格，功率数还受到搅拌器周围旋转参考框架的影响。在CFD模型验证过程中，应研究参考框架的大小和长宽比的影响。 图3.24显示了一个2000 L一次性生物反应器的单相经典模拟结果。湍流动能耗散率（A）指示了引入的功率，而速度流线（B）展示了生物反应器中的流体流动。这些是通常与CFD模拟相关的经典图片，可以让人对流场有所了解，并可能指示死区和最佳叶轮配置。 图3.24（左）Sartorius STR 2000 L一次性生物反应器在70 rpm下的湍流动能耗散率；（右）同一模拟的流线；两个等高线图中的最小值和最大值都被截断了。 在文献中，使用CFD模拟混合时间是一个已建立的程序，通常与实验数据非常吻合。为了提高准确性，应使用滑动网格或LES而不是MRF方法。由于混合强烈依赖于流场，特别是在搅拌槽反应器中的湍流流动条件下，重要的是基于瞬态速度数据计算混合。通常，通过在液面顶部放置一个球体并用追踪器标记，然后在定义的位置追踪追踪器来模拟混合过程。混合时间模拟通常使用实验中的探针位置进行。混合时间是追踪器浓度信号小于平均最终浓度的5%变化的最后时间点。这种方法在更复杂过程的放大中也可以是有益的，如灌注系统。 剪切应力是另一个可以通过CFD很好地预测的水动力参数。尽管有时对动物细胞培养的剪切应力的严重性表示怀疑，但Šrom等人最近确认了动物细胞培养的应力阈值。关于通过CFD模拟应力的详细讨论可以在文献中找到。 CFD对质量传递的建模需要多相模拟，更具挑战性。通常使用两种通用方法。Euler-Euler模型假设所有相都是连续的，并由同一组控制方程描述。每个相的性质是在流动的小体积上平均的。Euler-Lagrange模型将一相视为连续相，另一相视为一组离散粒子。连续相使用标准CFD方程建模，而离散相使用拉格朗日粒子追踪计算。通常，可以为单个生物反应器建立良好的模型，但在用于另一个容器时必须进行调整。通常，应用Higbie的表面更新理论形式来计算体积质量传递系数kLa值。很少将气泡尺寸分布纳入模型，尽管有一些破裂和聚并的模型可用。在最近的格子玻尔兹曼研究中，模拟和测量的体积质量传递系数之间的良好一致性已被展示，在两种情况下都存在较大尺度和非常高数量的气泡的问题。Krýsa和Šoóš有一篇新出版物，预测了小规模中气泡尺寸分布的良好结果。对于工业规模的反应器进行此类研究，尤其是具有初始气泡尺寸的实验值，对于建立多功能多相模型至关重要。 在混合时间、功率输入和质量传递系数kLa的成功应用示例已导致其在工业中的其他单元操作中使用，包括：离心、色谱、超滤、膜系统、微滤、喷雾干燥和冷冻干燥。总体而言，CFD方法是表征搅拌槽的重要工具。通过提供有关流场、剪切率和混合特性的详细信息，CFD模拟可以帮助优化这些系统的设计和操作，从而提高性能和效率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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点击蓝字 关注我们 2024年10月18日至20日，由江苏省医师协会血液科医师分会主办，南京医科大学附属泰州人民医院和南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）承办的“2024年江苏省医师协会血液科医师分会学术会议”在江苏省泰州市召开。本次会议聚焦于血液疾病的规范化诊治，为血液学同道提供一个高水平的学术交流、经验分享、共同进步和发展的平台。《肿瘤瞭望-血液时讯》特邀执行主席南通大学附属医院施文瑜教授接受采访，现整理成文，以飨读者。 01 《肿瘤瞭望-血液时讯》 老年DLBCL患者往往合并多种基础疾病，且体能状态较差，这对诊治带来了不少挑战。在您看来，老年DLBCL患者在诊断和治疗过程中相较于其他患者有哪些独特的难点？这些难点如何影响了治疗的选择和效果？ 施文瑜教授 老年弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者在诊断和治疗过程中面临着一些独特的挑战，主要体现在以下几个方面： 01  基础疾病和合并症 老年患者常伴有多种基础疾病，如心血管疾病和糖尿病等，这些合并症可能影响DLBCL的治疗选择。例如，心脏问题患者可能无法耐受蒽环类药物（如R-CHOP方案中的阿霉素），因此医生在制定化疗方案时需避免使用这些药物或考虑降低剂量。同时，肝肾功能不全患者在接受化疗时需特别关注药物的代谢和毒性。 02 生物学特征的差异 研究表明，老年DLBCL患者的肿瘤生物学特征与年轻患者可能存在显著差异，预后不良因素更多。例如，老年患者中non-GCB亚型（非生发中心型）DLBCL的比例较高，这种亚型通常预后较差。 03 体能状态较差 老年患者常存在身体机能减退和营养不良的问题，导致他们难以耐受标准剂量的化疗。体能状态通常使用体能评分（如ECOG评分）来评估，这对治疗方案的选择至关重要。体能状态较差的患者可能无法完成标准的R-CHOP方案，需考虑减量治疗或替代方案，如靶向药物治疗或低剂量化疗。这在一定程度上影响了治疗效果和生存期。 04 对化疗毒性的耐受性差 老年患者对化疗相关毒性（如骨髓抑制、感染、恶心呕吐）的耐受性较差，容易出现严重的不良反应，导致治疗中断或剂量减少，从而影响疗效。此外，化疗后免疫功能低下的老年患者更容易发生感染和其他并发症，需要加强监测和支持治疗。 05 认知功能和依从性问题 老年患者中常见认知功能障碍和依从性问题，这可能影响他们按时就诊、服药和接受治疗。这些因素可能导致治疗不规范或延误，从而影响治疗效果。此外，患者家庭也可能需承担额外的支持角色，以帮助患者完成治疗计划。 如何影响治疗选择和效果：为了提升诊疗规范性，我们江苏淋巴瘤协作组特此制定了针对初治老年弥漫性大B细胞淋巴瘤的临床路径，以指导临床实践并优化患者的治疗效果。老年独特的挑战使得老年DLBCL患者的治疗策略需要兼顾规范化和个体化。治疗方案的选择通常需在疗效与毒性之间进行权衡，以最大程度地降低治疗带来的不良反应。通过综合评估患者的整体健康状况和肿瘤特征，医生可以制定出更适合患者的治疗方案，从而提高治疗效果和生存率。 02 《肿瘤瞭望-血液时讯》 老年DLBCL患者难以耐受标准化疗方案，存在有效率下降、药物不良反应增加等问题。目前老年DLBCL的标准治疗方案存在哪些局限性？近年来，针对老年DLBCL患者的治疗有哪些新的突破？ 施文瑜教授 老年DLBCL患者在接受标准治疗时面临以下局限性： 01 化疗耐受性差 标准化疗方案（如R-CHOP）在老年患者中引发的毒性反应更为明显，导致严重的不良反应和化疗中断，从而影响治疗效果。 02 个体化治疗不足 目前的治疗方案往往未充分考虑患者的年龄、功能状态及合并症，导致治疗效果不尽如人意。 03 药物交互作用 老年患者通常需要使用多种药物来管理合并症，这增加了药物相互作用的风险，可能影响治疗的安全性和有效性。 近年来针对老年DLBCL患者的治疗突破包括： 01 抗体偶联物 如维泊妥珠单抗（Polatuzumab vedotin）与R-miniCHP的组合，展现出良好的耐受性和效果，适合老年患者。此外，维布妥昔单抗（Brentuximab Vedotin）等药物为高表达CD30的患者提供了新的治疗选择，结合化疗可显著提高疗效。 02 双特异性抗体 如莫妥珠单抗（Mosunetuzumab）和格菲妥单抗（glofitamab），显示出显著的有效性和较好的安全性，成为老年患者的有力治疗选项。 03 小分子靶向药物 如BTK抑制剂，为老年患者，特别是MCD亚型DLBCL患者提供了新的治疗选择。 04 免疫调节剂 如来那度胺，在某些DLBCL患者中显示出潜在的益处，尤其是在联合其他治疗时效果显著。 01 组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs） 如西达本胺，对双表达DLBCL表现出潜在的有效性。 这些新疗法为老年DLBCL患者提供了更安全有效的治疗选择，显著改善了患者的预后和生活质量。总之，少化疗甚至无化疗策略是老年DLBCL的治疗方向。 03 《肿瘤瞭望-血液时讯》 为了进一步优化老年DLBCL患者的规范化诊治路径，您认为我们还需要做出哪些具体的努力或改进？ 施文瑜教授 为了进一步优化老年DLBCL患者的规范化诊治路径，可以考虑以下具体努力或改进： 01 综合评估工具 开发和推广更具可操作性的综合评估工具，如综合老年评估（CGA），以便更好地评估患者的生理、心理和社会支持状况，从而制定个体化治疗计划。全面关注老年患者健康和功能状态相关的所有问题，包括医学、躯体、认知功能、心理状态和社会支持等多层面。将患者分为健康（Fit）、一般健康（Unfit）和衰弱（Frail）三组，根据评估结果制定适合的治疗方案，从而改善老年DLBCL的生存率。例如，健康组患者可选择标准治疗方案，而对于一般健康和衰弱患者，可能会采用减量的化疗方案或结合靶向药物（如BTK抑制剂）等新疗法，以降低毒性。 01 多学科团队合作 建立包括血液、肿瘤科、老年医学、营养学和心理健康专家在内的多学科团队，确保在治疗过程中全面考虑患者的多重需求。 01 个体化治疗策略 根据患者的生物标志物、基因组特征和体能状态，制定个体化治疗方案，以提高疗效并降低不良反应风险。 01 强化支持治疗 提供更全面的支持性护理，包括营养干预、疼痛管理和心理支持，以提高患者的治疗耐受性和整体生活质量。 05 临床试验 鼓励老年患者参与新的临床试验，以获取最新的治疗方法和药物，同时确保试验设计充分考虑老年患者的特殊需求。例如，江苏省人民医院的李建勇教授与南通大学附属医院的施文瑜教授联合国内多家中心发起了一项前瞻性、单臂、多中心的临床研究，探讨维泊妥珠单抗、利妥昔单抗和奥布替尼联合治疗老年虚弱初治非生发中心亚型DLBCL的效果。目前，该研究已入组10例患者，取得了理想的治疗效果，且安全性可控。我们诚邀符合条件的患者加入，共同探索这一创新疗法的潜力，同时欢迎医学专业人士参与研究方案的讨论与交流，为淋巴瘤治疗领域带来新的突破。 通过这些努力，可以改善老年DLBCL患者的诊治路径，提高治疗效果和患者满意度。 （左右滑动查看更多会议日程） （来源：《肿瘤瞭望–血液时讯》编辑部） 声 明 凡署名原创的文章版权属《肿瘤瞭望》所有，欢迎分享、转载。本文仅供医疗卫生专业人士了解最新医药资讯参考使用，不代表本平台观点。该等信息不能以任何方式取代专业的医疗指导，也不应被视为诊疗建议，如果该信息被用于资讯以外的目的，本站及作者不承担相关责任。

摘要：重组腺相关病毒（AAVs）已经成为有前途的基因传递载体，导致美国食品药品监督管理局（FDA）批准了三种基于AAV的基因疗法，欧洲药品管理局（EMA）也批准了一种。尽管AAV是多项临床试验中治疗性基因转移的领先平台，但宿主对AAV载体和转基因的免疫反应阻碍了它们的广泛应用。多种因素，包括载体设计、剂量和给药途径，共同影响了AAVs的整体免疫原性。对AAV衣壳和转基因的免疫反应涉及最初的先天感知。随后，先天免疫反应触发适应性免疫反应，以引起针对AAV载体的强烈和特定的反应。AAV基因疗法的临床试验和临床前研究提供了有关与AAV相关的免疫介导毒性的重要信息，但研究表明，临床前模型未能准确预测基因传递在人类中的结果。本综述讨论了先天和适应性免疫反应对AAVs的贡献，强调了挑战和潜在策略，以减轻这些反应，从而增强AAV基因疗法的治疗潜力。 1.引言 近年来，使用重组腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗取得了令人鼓舞的成果。除了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的三种AAV基因治疗产品Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX，分别用于治疗Leber先天性黑蒙、脊髓性肌肉萎缩症（SMA）和血友病B型，欧洲药品管理局（EMA）最近还批准了一种AAV5-因子8载体（Roctavian）用于治疗血友病A型患者。目前，正在进行大量的AAV基因治疗临床试验，针对多种疾病，包括血友病、神经退行性疾病和肌营养不良症。然而，阻碍这些试验临床成功的一个因素是AAV的免疫原性，这在该领域仍然是一个未解决的挑战。 已经鉴定并分类了13种不同的AAV野生型血清型和100多种衣壳变体。AAV最初在1965年作为腺病毒（Ad）制剂中的污染物被发现，是自然存在于多种脊椎动物物种中，包括人类和非人灵长类（NHPs）的细小病毒，但从未与任何已知疾病相关联。AAV迅速成为体内基因传递的首选载体，并携带一个由反向末端重复序列（ITRs）包围的转基因表达盒，而不是病毒蛋白编码序列。这些ITRs源自野生型AAV2，是复制和包装所需的唯一顺式作用序列，但它们是非编码区域。AAV作为染色体外DNA存在，能够在非复制细胞中实现稳定转基因表达。尽管AAV的免疫原性较弱，但在AAV基因治疗临床试验中观察到的免疫反应限制了其治疗应用。由于AAV载体不包含任何表达的病毒基因组，因此在基因转移过程中引入的唯一外来抗原来源是病毒衣壳和转基因盒。然而，宿主对AAV载体和传递的转基因的免疫反应影响了有效和稳定的转基因表达。 已经做出了重大的研究努力来评估与AAVs相关的免疫介导毒性。免疫系统的主要作用是识别自身与非自身，以保护免受病原体侵害。包括补体系统在内的先天免疫反应可以被AAV衣壳和AAV基因组以及其他宿主特异性因素触发。随后的激活信号有助于招募抗原呈递细胞（APCs）、T细胞和B细胞，这些细胞负责介导适应性免疫。许多报告已经剖析了适应性免疫反应对AAVs的作用。由于AAV在人类中的广泛传播，许多人群中普遍存在针对AAV衣壳的预先存在的中和抗体（NAbs）。这些抗体可以阻止AAV转导目标细胞。此外，还可能针对传递的转基因产生抗体，这可能中和可溶性转基因产品并干扰成功的基因治疗。此外，针对衣壳的细胞介导的细胞毒性T细胞反应影响转基因表达，并导致转导细胞的清除，阻碍治疗效果。近年来，接受高系统剂量AAV治疗的SMA1、杜氏肌营养不良症（DMD）和X连锁肌管性肌病（XLMTM）患者经历了不同程度的不良反应。这些结果在很大程度上可以归因于对载体的先天和适应性免疫反应。因此，了解免疫系统对AAV的反应对于提高AAV基因治疗的安全性和治疗效果至关重要。 AAV载体激活宿主免疫反应取决于多种因素，包括给药途径和剂量，宿主细胞和体液遇到载体的部位，载体组分以及转基因产品。直接注射到视网膜下空间，如第一个FDA批准的AAV载体的途径，导致较少暴露于血浆蛋白、循环抗体、血细胞和组织驻留的吞噬细胞。注射到其他部位，如中枢神经系统（CNS），可能在一定程度上限制了血清抗体在目标细胞进入之前的暴露。相比之下，AAV的静脉注射使载体广泛暴露于血细胞、血浆蛋白，包括抗体，以及广泛的组织驻留细胞，如肝脏内的Kupfer细胞。最大限度地发挥潜在的载体-抗体相互作用导致降低基因治疗的有效性或安全性。几乎所有衣壳类型和给药途径，广泛生物分布的AAV载体基因组到肝脏，取决于所给剂量。因此，虽然直接注射途径可能在很大程度上绕过了预先形成的抗体，但对载体组分的新的免疫反应可能仍然很强。最后，某些宿主反应仅在非常高剂量的静脉AAV中观察到，这表明这些宿主反应的阈值效应。这表明在评估AAV基因治疗的免疫反应时，需要考虑多种因素，而不仅仅是AAV载体的组成部分。 在这篇综述中，我们提供了针对AAV衣壳和转基因的先天和适应性免疫反应的概述，并讨论了规避这一主要障碍的策略，以发展成功的基于AAV的治疗性基因传递平台。 2.对腺相关病毒（AAVs）的免疫反应 免疫反应可以分为先天和适应性免疫反应。在以下部分中，我们简要概述了AAVs刺激的先天和适应性免疫途径，并讨论了AAV感染响应中激活的机制，这些机制导致转基因表达的抑制（图1）。 图1 AAV基因治疗中的免疫反应。AAV衣壳或引入的转基因可以被先天免疫系统识别，导致细胞因子产生、先天免疫细胞激活、补体激活，并为适应性免疫反应做好准备。在MHC I分子上的衣壳肽段或传递的转基因呈递导致CD8+ T细胞激活和转基因表达的清除。在MHC II上的抗原呈递激活CD4+ T细胞，这导致细胞因子的产生，并进一步诱导体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。Treg的激活导致细胞和体液免疫反应的抑制以及转基因表达的长期维持。AAV：腺相关病毒，APCs：抗原呈递细胞，FoxP3：叉头框蛋白3，GzmB：颗粒酶B，IFNγ：干扰素γ，MHC：主要组织相容性复合体，NAbs：中和抗体，PFN：穿孔素，rAAV：重组腺相关病毒，TCR：T细胞受体，TLR9：Toll样受体9，TNFα：肿瘤坏死因子α，Tregs：调节性T细胞。 2.1.对AAV的先天免疫反应 暴露于病原体时，先天免疫系统以一种非特异性方式被触发，并随后刺激激活更特异性的适应性免疫反应。在本综述中，我们简要讨论了感知AAV载体元素的关键参与者，这些元素导致先天免疫信号级联的激活。 2.1.1.病原体相关分子模式和模式识别受体 具有独特病原体相关分子模式（PAMPs）的外来病原体被高度表达在先天免疫细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）上的模式识别受体（PRRs）识别。PRRs已被分类为不同的家族，即Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）、C型凝集素受体（CLRs）和DNA传感器。相应的PRRs识别PAMPs主要激活信号通路，如通过适配蛋白如MyD88激活NF-κB。这些信号级联诱导主要组织相容性复合体（MHC）基因表达和促炎细胞因子或Ⅰ型和Ⅲ型干扰素（IFN）的分泌。分泌的IFNs和细胞因子反过来介导表达限制病毒复制的基因，并刺激适应性和记忆免疫反应。适应性抗衣壳体液和细胞毒性免疫反应已被证明在体内受到限制，通过抑制先天免疫激活途径。 TLR介导的信号，触发先天免疫和随后激活适应性免疫反应，是重要的AAV感知机制。TLRs主要表达在免疫细胞上，如DCs和巨噬细胞，以及一些非免疫细胞，如上皮细胞和成纤维细胞。细胞表面TLRs识别病原体的膜成分，如脂蛋白和脂质，细胞内TLRs识别病原体衍生的核酸。研究表明，细胞内TLR9有助于对转基因和衣壳的免疫反应。除了ITRs，插入的转基因、启动子序列和载体表达的RNA可能包含TLRs识别的炎症信号。存在于Kupfer细胞或DCs中的内体TLR9，特别结合双链DNA（dsDNA）载体基因组中的未甲基化CpG二核苷酸。研究表明，密码子优化，一种提高转基因表达的技术，可能增加AAV载体中的CpG基序。TLR9的参与有利于激活AAV特异性细胞毒性CD8+ T细胞反应，由于MHC I上抗原呈递的增加。由IFN诱导的免疫反应导致AAV在小鼠中传递的转基因表达的丧失。此外，TLR9/MyD88途径不仅对激活AAV衣壳的CD8+ T细胞反应至关重要，而且对肝脏和肌肉定向的转基因。研究表明，空AAV衣壳本身也可以触发先天免疫反应，可能通过非实质肝细胞表面的TLR2介导。或者，一些研究报告称，抗AAV衣壳免疫球蛋白（Ig）G2抗体的产生不依赖于任何特定的TLR，而是依赖于B细胞中固有的MyD88信号。此外，其他研究表明，自互补AAV（scAAV）载体与单链AAVs（ssAAVs）相比，表现出对转基因的增加的先天免疫反应，可能由于TLR9/MyD88信号级联的增强激活。 细胞质DNA传感器，如环状GMP-AMP合成酶（cGAS），被AAV基因组激活。AAV转导可能导致细胞将其线粒体DNA释放到细胞质中，从而激活细胞质DNA传感器。另一种可能性是，AAV衣壳的蛋白酶体降解在进入后导致基因组暴露，然后可能被DNA传感器感知。最近的研究指出dsRNA传感器在先天感知AAVs中的作用。ITRs的内在启动子活性可以在细胞质中产生dsRNA中间体，这可能刺激黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和视黄酸诱导基因（RIG）传感器。在AAV转导人肝细胞后，一些人类受试者观察到MDA5和RIG-1的上调，触发IFN-β的产生。在灵长类视网膜中AAV转导后，也观察到高水平的MDA5和RIG-1。需要进一步的研究来阐明dsRNA形成在AAV转导细胞中启动适应性免疫反应中的作用。 2.1.2.AAV与补体系统 补体系统由多种可溶性和膜结合蛋白组成，是无细胞先天免疫系统的一部分。它可以通过三种不同的途径被激活——经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径与抗体结合到抗原靶标上协同工作，而替代途径是通过外来大分子与循环补体成分的相互作用而被激活，因此不需要预先形成的抗体。这三条途径汇聚在补体成分C3转化酶上，它将C3蛋白裂解为功能性亚基C3a和C3b，最终形成终端膜攻击复合体。 AAV介导的补体激活成为了许多近期研究的焦点。一项研究表明AAV衣壳与C3相互作用，导致巨噬细胞中AAV2的摄取增加，并随后上调了如IL-8、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白等细胞因子。缺乏补体蛋白CR1/2或C3的小鼠对AAV没有表现出强烈的体液免疫反应，这表明补体系统在产生AAV特异性抗体中发挥作用。 在DMD和SMA1的临床试验中，接受静脉AAV剂量>1×10^14病毒基因组(vg)/kg的患者表现出补体激活和血栓性微血管病(TMA)的症状。此外，最近在一份新闻稿中报告，两名接受5×10^13 vg/kg AAV-LK03的甲基丙二酸血症(MMA)患者在最近出现了TMA。这些患者中替代补体途径的激活似乎导致血小板激活并与白细胞和内皮细胞结合，从而触发消耗性血小板减少症、微血管性贫血和播散性血管内凝血，这由D-二聚体和纤维蛋白裂解产物的升高证明。在一些患者中，这些机制可以发展成一系列不同程度的症状，如呕吐、急性肝衰竭和心脏及肾脏损伤（非典型溶血性尿毒症综合征[aHUS]）在AAV给药后（NCT03362502和NCT03368742）。这种综合征通常在输注后5-10天发展。Eculizumab的治疗已在AAV接受者中用于TMA综合征，以中断TMA级联。然而，这些试验的结果尚属初步，需要进一步调查。 2.2.适应性免疫反应 除了启动对AAV的初级免疫反应外，先天免疫还为适应性反应做好准备。适应性免疫反应诱导抗原特异性反应，同时创建免疫记忆。适应性免疫由两个主要机制组成：通过B细胞和抗体的体液免疫，以及通过细胞毒性CD8+ T细胞的细胞免疫。CD4+辅助T细胞在体液和细胞免疫中都是关键的中介，通过激活B细胞和细胞毒性T细胞。 在初次接触AAV后，先天免疫细胞通过PRRs的表达和细胞因子的释放被广泛激活。在长期接触AAV后，如DCs的APCs通过转导或吞噬作用摄取AAV颗粒，并向B或T细胞激活呈现处理过的抗原。B细胞识别可溶性或呈现的抗原并产生抗体。T细胞的激活涉及辅助CD4+细胞，它们进一步诱导炎症反应和激活CD8+细胞毒性T细胞，导致去除AAV感染的细胞。在炎症信号解决后，调节性T细胞抑制免疫反应以恢复稳态。以下部分将强调适应性免疫反应在AAV基因治疗中的作用。 2.2.1.体液免疫反应 体液免疫是通过产生针对特定抗原的抗体来介导的。抗体通过多种机制发挥作用：NAbs阻止病原体进入细胞，覆盖在病原体表面的抗体将它们标记为吞噬作用，或抗体结合导致经典补体途径激活的开始。 体液免疫反应，特别是NAbs的产生，对AAV成功基因传递构成了最有效的障碍之一。AAV转导后，APCs向CD4+辅助T细胞呈现抗原，这导致B细胞成熟、扩增、类别转换，并增加针对AAV衣壳的抗体产生。 在人类中，抗AAV NAbs（以其损害AAV感染或病理学的能力为特征）通过自然接触野生型AAVs形成。根据AAV衣壳变体的不同，2-60%的人类血清含有限制AAV基因治疗应用的抗体。其中，抗AAV2和AAV1 NAbs是AAV衣壳变体中最常见的NAbs。然而，抗AAV NAbs通常在多个衣壳变体之间高度交叉反应，可能由于AAV衣壳变体之间的高度同源性。一些研究表明，在AAV给药后，产生的抗体对其他未给药的AAV衣壳变体也具有交叉反应性。对AAV NAbs的表征显示IgG1是NAbs中的主要亚类，其次是IgG2和IgM。接受AAV基因治疗的患者也会发展出特异性抗体，防止AAV的后续再剂量。在一项研究中，NHP中AAV8的再给药没有导致转基因表达增加，但观察到抗AAV抗体水平增加。然而，目前的治疗方法表明，由于载体稀释或丢失，可能需要在新生儿、儿童和成年退行性疾病患者中重复给药AAV。 结合抗体（BAbs）参与免疫细胞的招募和触发抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。一项研究报告称，在体外存在BAbs的情况下增加了衣壳内化。此外，与接受NAbs免疫的小鼠相比，接受BAbs免疫的小鼠显示出更有效的肝脏转导。BAbs在AAV免疫反应中的作用目前正在进一步调查中，可能会突出BAbs可能的作用以及重新考虑筛选技术的必要性。 大多数系统性（静脉内）AAV基因治疗的临床试验已经排除了针对使用的血清型的显著抗衣壳抗体的患者。例如，BioMarin AAV5-FVIII载体（Roctavian）的关键试验排除了可检测到抗AAV5 NAbs滴度和抗AAV5总结合抗体（TAb）滴度的患者。目前测量抗衣壳抗体的检测包括TAb检测和NAb检测，但NAb检测和TAb检测都难以标准化。NAb检测是基于细胞的或基于小鼠的，因此昂贵、耗时，并有低估TAb滴度的风险。由于TAb检测筛选出针对AAV衣壳的所有抗体，包括中和和非中和的，所得的滴度更为保守和安全。此外，FDA和EMA已经批准了不同的衣壳血清型，每种产品都需要开发不同的抗AAV抗体检测。例如，AAV9的伴随诊断检测不适用于AAV1、AAV2或AAV5。最近的一项研究建立了基于Meso Scale Discovery（MSD）的检测，用于定量BAbs和NAbs，允许快速和定量评估AAV特异性抗体。 除了体液免疫反应外，T细胞介导的反应在限制AAV基因治疗中也起着重要作用，如下一节所强调的。 2.2.2.衣壳特异性T细胞反应 T细胞反应由多种T细胞亚群介导。效应CD4+ T细胞通过细胞因子产生诱导炎症和免疫激活。而细胞毒性CD8+ T细胞通过分泌颗粒酶、穿孔素和炎症细胞因子介导感染细胞的靶向杀伤。此外，Tregs通过与免疫细胞的直接相互作用或产生免疫抑制细胞因子，防止超免疫激活，并将免疫反应恢复到稳态。 在动物研究中，由AAV引起的细胞介导的免疫反应导致转基因表达丧失并不普遍观察到。启动T细胞反应需要通过APCs进行抗原呈递。内源性或细胞内抗原在MHC I上呈递，而外源性或细胞外抗原在MHC II上呈递。在某些APCs中，交叉呈递允许通常在MHC II上展示的外源性抗原在MHC I上呈递。研究表明，浆细胞样DCs、常规DCs和CD4+ T细胞之间的合作导致AAV颗粒在MHC I上的交叉呈递，随后激活CD8+ T细胞。细胞介导的免疫反应首次在血友病临床试验中观察到，其中AAV2表达人类凝血因子9（hFIX）的肝脏传递导致肝脏转氨酶升高和转基因表达丧失。后续研究证实了衣壳特异性CD8+ T细胞的存在。衣壳特异性CD8+ T细胞的扩增可能清除AAV转导的细胞，导致转基因表达丧失和靶器官炎症。此外，APCs在MHC II上呈递衣壳肽段，导致CD4+ T细胞激活。CD4+ T细胞的激活导致细胞因子的产生，进一步激活体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。在随后的研究中，接受高剂量AAV8-hFIX的人类受试者观察到衣壳特异性T细胞反应，导致肝脏酶升高和hFIX表达下降。类固醇治疗降低了肝脏酶并部分恢复了hFIX表达。此外，中等剂量的AAV给药导致可检测到循环的衣壳特异性T细胞，但没有观察到转氨酶升高和转基因表达丧失。进一步的研究表明，衣壳特异性免疫反应是剂量依赖性的，低剂量的AAV载体给药更有可能引起可由类固醇管理的轻度炎症。额外的表征显示衣壳特异性CD8+ T细胞在体外通过MHC I上的衣壳肽段交叉呈递后消除人类肝细胞。 与其他试验观察到的T细胞免疫反应不同，特别是在肌肉导向的试验中，并没有清除转基因表达。包括在大多数肌肉传递试验中使用非分泌性转基因，以及反应性T细胞的凋亡等因素，使得分析这些结果变得复杂。在α1-抗胰蛋白酶（AAT）缺乏症和Glybera研究中，除了CD8+ T细胞外，还报道了CD4+叉头框P3+（FoxP3）T细胞的浸润。同样，在DMD临床试验中限制或未观察到衣壳特异性T细胞反应。由于Tregs具有抑制免疫反应的能力，因此在局部肌肉导向的AAV基因治疗中诱导免疫耐受和转基因的长期表达归因于Tregs。尽管如此，肢带型肌营养不良的AAV基因治疗导致了衣壳特异性T细胞反应。 需要额外的研究来进一步表征T细胞免疫反应以及Tregs在诱导免疫耐受中的作用，这需要合适的动物模型。一些研究已经集中在模仿在动物中观察到的人类免疫反应。向AAV衣壳引入卵清蛋白免疫优势表位并未能触发特定的杀伤。然而，将扩增和激活的衣壳特异性T细胞转移到小鼠体内，导致转基因表达减少和转导细胞的丧失。此外，用表达VP1衣壳蛋白的AAV或腺病毒免疫小鼠，导致衣壳特异性T细胞的诱导。另一项研究利用嵌合抗原受体（CAR）技术创建衣壳特异性T细胞。AAV-CAR T细胞在体外对多种AAV衣壳变体有反应，并在体内减少了转基因表达。然而，AAV的趋向性和免疫反应在人类和小鼠中并不相同。需要进一步的研究来创建能够准确模拟人类AAV特异性T细胞反应的动物模型。 除了在引入AAV后观察到的细胞介导反应外，免疫记忆在第一次接触AAV后形成，无论是通过AAV基因治疗还是暴露于野生型AAV。这种记忆反应的激活不需要先天免疫反应。与体液免疫类似，衣壳特异性T细胞反应在年幼儿童中较少见，可能在婴儿期在感染野生型AAV后产生。研究表明，在二次AAV暴露后，衣壳特异性记忆T细胞会产生细胞因子并获得细胞毒性表型。一些研究对健康人类受试者的T细胞反应进行了表征，并报告了10-100%的人类受试者具有针对多种AAV血清型的功能性循环衣壳特异性T细胞。进一步分析证实，大多数AAV特异性CD8+和/或CD4+ T细胞属于中央记忆亚群。尽管AAV特异性免疫反应对基因治疗和再剂量研究至关重要，但传递的转基因可以引起免疫反应。下一节将讨论针对转基因的免疫反应。 3.针对转基因的免疫反应 传递的转基因产品通常包含外来抗原，因此它们可能诱导体液或细胞免疫反应，中和分泌性转基因并清除转导细胞。在暴露于AAV传递的转基因后，APCs通过转导或吞噬作用获得蛋白质产物，并在MHC I或MHC II分子上呈现处理过的抗原，分别导致细胞或体液免疫反应。针对转基因的免疫反应持续到转导细胞被清除，或由Tregs或T细胞耗竭抑制免疫反应。然而，与腺病毒和慢病毒载体相比，由于AAV对APCs的转导效率较低，AAVs诱导针对转基因的免疫反应的风险较低。在这篇综述中，我们总结并讨论了转基因免疫反应的复杂性。 迄今为止，AAV基因治疗中针对转基因的免疫反应主要在肌肉导向的临床试验中报告。在一项研究中，AAV的肌肉传递在一些患者中导致了针对转基因的抗体形成，这在NHP研究中已被预测。此外，研究表明，在没有残留蛋白表达或大片段缺失的基因转移的人类受试者中，针对转基因的免疫反应风险更高，而在具有错义突变的受试者中，基因传递更易被耐受。一些临床试验通过简单地不招募有更高风险发展反应的患者来控制针对转基因的免疫反应。在大多数肝脏导向的临床试验中，排除了有蛋白替代疗法免疫反应史或空突变的人类受试者。然而，在庞贝病临床试验中，AAV被肌肉注射，观察到缺乏功能性酶表达或非常低水平的患者出现免疫反应，类似于蛋白替代疗法中观察到的情况。在一项肌肉传递AAV的AAT临床试验中，只有在一个具有常见非病理性多态性和较不常见的HLA-单倍型的人类受试者中观察到转基因免疫反应。此外，当在肌肉传递hFIX中包括具有错义突变的患者时，未观察到转基因免疫反应。最近的一篇摘要表明，包括在转基因蛋白中存在的N-末端表位的基因组缺失的DMD患者，对转基因免疫反应的风险更高。这些观察表明，残留蛋白表达水平和患者基因型在影响针对转基因的免疫反应方面发挥了更关键的作用。此外，在临床环境中，眼部和鞘内AAV基因传递显示出有限的与转基因相关的免疫反应，可能是由于它们的分隔和减少的抗原呈递。AAV衣壳变体是另一个促进针对传递转基因的免疫反应的因素。在APCs中转导效率较低的衣壳可能具有较低的风险诱导针对转基因的免疫反应。 总结来说，针对转基因的免疫反应主要在没有残留蛋白表达的患者中观察到；因此，临床研究更倾向于选择具有错义突变的受试者或在蛋白替代疗法中没有反应的受试者。然而，这种方法排除了需求最迫切的目标人群。为了满足这一未满足的需求，已经采用了几种策略，将在第5.3节中描述。 4.监管批准后的AAV载体免疫反应 临床试验在标准化条件下进行，涉及的小规模、同质人群与批准后的患者选择和治疗条件不同。因此，可能会观察到安全性概况和反应的差异。迄今为止，已有三种基于AAV的药物（Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX）获得FDA批准，为许可后研究提供了更大的数据集。在这一部分，我们简要讨论与Luxturna和Zolgensma相关的整体安全性概况和免疫反应。 4.1.Luxturna Luxturna（voretigene neparvovec）是FDA批准的第一种用于治疗双等位基因视网膜色素上皮特异性65千道尔顿（RPE65）突变相关视网膜营养不良的眼部AAV基因治疗。通过单次AAV基因传递，将RPE65基因的功能性拷贝直接传递到视网膜细胞，恢复患者的视力。无论是对AAV2衣壳还是转基因，都没有观察到有害的免疫反应。报道了Luxturna的轻微免疫反应，并通过Luxturna的视网膜下传递前后的系统性皮质类固醇治疗得到了控制。同样，在用AAV2-ND4（玻璃体内注射）治疗的Leber遗传性视神经病变（LHON）患者中，体液和细胞免疫反应有限。Luxturna和LHON患者观察到的轻微免疫反应可以归因于局部注射到含有高浓度免疫调节神经肽和细胞因子的分隔环境中。 4.2.Zolgensma Zolgensma（onasemnogene abeparvovec）是FDA批准的第一种基于AAV的基因替代疗法，用于治疗SMA。Zolgensma由一个自互补的、复制缺陷的AAV9组成，编码功能性SMN蛋白，通过单次静脉注射以1.1×10^14 vg/kg体重的剂量给药。 Zolgensma能够实现临床相关的治疗结果，并在减少SMA患者的过早死亡方面取得了有希望的结果。来自临床试验和市场后监测的数据显示，存在诸如肝毒性、血小板减少、TMA、心脏事件和神经节病等安全风险。在SMA许可后，报告了肝转氨酶的暂时升高，这些通过强的松治疗得到了解决。所有SMA患者都接受了预防剂量的强的松，但激素治疗的剂量和持续时间是可变的。当转氨酶水平低于正常上限的两倍时，才开始逐渐减少剂量。表现出急性肝衰竭的患者接受了暂时的高皮质类固醇剂量。对于接受长期激素治疗的患者，建议咨询内分泌学家以评估肾上腺功能不足。 肝毒性可能归因于衣壳特异性的细胞介导免疫反应。在急性疾病的情况下，即使经过长期皮质类固醇治疗，也可能考虑使用氢化可的松进行应激剂量。迄今为止，强的松已被证明在SMA临床试验和许可后经验中有效地恢复了肝转氨酶水平。然而，尽管接受了类固醇治疗，仍有SMA患者出现急性肝毒性的证据。诺华最近报告了两名儿童SMA患者因急性肝衰竭死亡。这些患者的肝功能严重受损，并迅速发展为肝性脑病和多器官衰竭。死亡发生在Zolgensma治疗后6-7周，开始逐渐减少强的松后。 除了肝毒性，其他不良反应包括短暂的血小板减少症。在一个患者中，观察到血小板减少症和多器官衰竭的晚期发作，但机制仍然不明。在接受Zolgensma治疗的1400多名患者中，FDA报告了9例TMA病例。EMA报告了在接受Zolgensma治疗的800名患者中有5例TMA病例。在基因治疗后第12天被诊断为TMA的一名患者，由于多种因素，面临致命结果。有趣的是，报告了该患者补体激活的生物标志物可溶性C5b9复合物（sC5b9）的水平增加。患者逐渐恶化，症状符合非典型溶血性尿毒症（aHUS）。根据儿童aHUS的治疗建议，患者接受了依库珠单抗治疗，这是一种单克隆抗体，已知可抑制补体因子C5的裂解。依库珠单抗注射导致EsC5b9 C3水平恢复正常，C3减少，C4正常，血小板计数轻微增加，表明1个月后TMA恢复。然而，在第40天，由于表皮葡萄球菌感染的发生，TMA复发，患者不幸心脏骤停。另一项研究报告称，在Zolgensma治疗1周后，也有三名患者发展为TMA，这表明了免疫介导的病因。其他因素，如并发细菌感染和最近的疫苗暴露，也促成了TMA。在两个病例中报告了通过替代途径激活补体系统，接受依库珠单抗治疗的一名患者没有显示出显著的临床改善。需要进一步调查，以评估依库珠单抗在由AAV基因治疗引起的TMA中的有效性。值得注意的是，其他基于AAV9的基因治疗在DMD和Danon病中也报告了伴有补体激活的TMA。未来的研究需要阐明补介导因素在SMA患者TMA中的作用。 最近的一项研究报告了一名接受Zolgensma治疗的SMA患者出现血嗜性淋巴组织细胞增多症（HLH）。连续3天使用高剂量的甲泼尼龙，随后几天逐渐减量，导致临床改善。因此，需要仔细监测炎症标志物，以避免因HLH导致的致命性。 5.少AAV基因治疗中免疫反应的策略 在这一部分，我们讨论可能的策略，以规避针对AAV衣壳和转基因的有害免疫反应，从而实现成功的转基因传递和表达（表1）。 表1 AAV基因治疗中的免疫反应及可能的调节策略 5.1.减少针对AAV的先天免疫反应的策略 正在积极开发免疫调节技术，以减少AAV载体的免疫原性，并允许安全和重复的干预。尽管在大多数试验中施用的皮质类固醇有助于调节免疫介导的毒性并实现长期转基因表达，但有些病例需要更复杂的类固醇方案和额外的方法，以潜在地减少载体和转基因的免疫原性。 5.1.1.克服Toll样受体激活和DNA感应 TLR激活在触发针对AAV载体的先天免疫反应中起着关键作用。规避TLR激活的策略旨在减轻这些反应。TLR9缺陷的小鼠显示出高水平的转基因表达，这一观察促使几个小组修改转基因序列，以干扰TLR9介导的识别。通过耗尽AAV基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR9信号，已被证明可以增强AAV介导的基因表达。耗尽CpG二核苷酸在免疫原性AAVrh32.33.33载体中显示出稳定的转基因表达，并减少了效应T细胞（Tef）的浸润。此外，CpG缺失在血友病B小鼠的肌肉注射中导致显著减少的CD8+ T细胞浸润，但没有影响抗体水平。ITR区域也含有高CpG含量，因此一项研究产生了功能性无CpG ITR。然而，由于ITR在包装中的关键作用，载体产量减少了约三倍。在另一项研究中，已报告在AAV基因组中加入TLR9抑制（TLR9i）DNA序列可以减少小鼠和猪的免疫反应。TLR9i由多个TTAGGG副本组成，也可以阻断DNA传感器，如cGAS。此外，抗疟药羟氯喹（HCQ）可能作为TLR9抑制剂。在小鼠和人体组织中，HCQ在AAV传递前1小时给药增强了转导效率。其他修改包括工程化表达盒，以便从3′ ITR阻断转录。因此，不会生成dsRNA，并且可以避免源自与细胞质dsDNA和dsRNA结合的先天免疫反应。在AAV表达盒中引入设计用于dsRNA传感器或其下游信号通路的短发夹RNA，可能用于规避dsRNA介导的先天免疫反应。采取多学科方法阻断TLR9激活和DNA感应，以规避先天免疫反应，可能会改善临床反应。 5.1.2.逃避补体系统激活 限制补体激活可能防止炎症反应和随后的组织损伤。Apellis Pharmaceuticals提出了使用一种名为APL-9的聚乙二醇化合成环状肽，它抑制补体激活的所有三条途径，以防止对AAV的补体激活。在I期测试中，静脉注射单剂量的APL-9能够限制补体激活，持续时间长达12小时。没有报告严重的不良事件，APL-9治疗能够完全抑制AH50溶血活性。在最近的一项研究中，APL-9减少了APCs上的CD86水平，AAV摄取和细胞因子/趋化因子分泌，以响应体外的AAV。由于在IgG耗尽的血清中确认了经典途径的参与，减少AAVs与抗体之间相互作用的治疗可能在防止补体激活方面有效。正在测试大量的补体抑制剂，从小分子抑制剂、siRNAs、适体、反义寡核苷酸、抑制肽、药理学药物到阻断抗体等，以抑制补体激活。依库珠单抗是一种针对补体超激活的单克隆抗体，通过抑制C5和MAC形成发挥作用。依库珠单抗已成功用于限制SMA和DMD AAV基因治疗中的补体激活(NCT03362502, NCT03368742, NCT03381729, NCT02122952)。未来需要进行进一步的研究，以抑制AAVs通过补体系统激活。 5.1.3.减少抗原呈递细胞中的转基因表达 正在开发限制免疫细胞激活的策略。例如，TLR9抑制性寡核苷酸恢复了由scAAV给药触发的增加的巨噬细胞浸润。限制泛素化并逃避蛋白酶体介导降解的蛋白酶体抑制剂可以减少MHC I分子上衣壳肽片段的呈递。通过阻断其他细胞的不需要表达，实现目标组织和细胞特异性表达的microRNA(miRNA)介导的去靶向是另一种策略。这种方法可以减少先天免疫细胞的抗原呈递，并随后阻断对AAV传递的转基因的适应性免疫反应。下面讨论了限制对AAV衣壳和转基因的适应性免疫反应的其他方法。 5.2.减轻对AAV衣壳的适应性免疫反应 AAV基因传递后的适应性免疫反应限制了转基因表达，并产生了抑制AAV重复剂量的免疫记忆。因此，正在采用几种策略来限制适应性衣壳特异性免疫反应。在以下部分中，讨论了克服针对AAV衣壳的体液和T细胞介导的免疫反应的策略。 5.2.1.克服体液免疫反应的策略 AAV基因治疗受到NAbs形成的阻碍，因此采用了多种策略来克服体液免疫反应。需要系统给药AAV的患者尤其处于NAbs的更大劣势。一种方法是剂量受试者缺乏对AAV的预先存在的免疫力，这在年轻患者中更为常见，但在青少年和成人中则相当少。 由于NAbs的高流行率，已经采用了几种策略来抑制或消融基因治疗受试者的体液免疫反应。抑制体液免疫的主要方法是使用免疫抑制药物（IS）。一种广泛适用的策略是使用B细胞耗竭单克隆抗体。研究表明，使用利妥昔单抗，一种抗CD20抗体，进行B细胞耗竭后，NAb滴度降低的有希望的结果。利妥昔单抗与雷帕霉素，mTOR抑制剂，或与雷帕霉素和皮质类固醇的组合，在临床试验中成功诱导耐受并防止抗体形成。贝利木单抗，一种抗B细胞激活因子(BAFF)的抗体，是另一种B细胞耗竭抗体，在控制自身免疫疾病方面显示出有希望的结果。此外，使用ibrutinib，一种B细胞抑制剂，在小鼠模型中减少了针对AAV的初级抗体反应。然而，全身性IS可能增加感染风险，并且对于完全缓解高滴度NAbs无效。除了传统的IS，AAV载体和合成疫苗封装雷帕霉素(SV[rapa])的联合给药，ImmTOR，是另一种有希望的方法。ImmTOR治疗导致抑制AAV特异性抗体形成，并减少了B和T细胞的激活。最近的一篇摘要显示，ImmTOR与贝利木单抗联合给药减少了抗AAV IgM抗体，提供了更持久的抗AAV IgG抗体抑制，并允许在小鼠中多次重新给药AAV8载体。当ImmTOR与ibrutinib组合时，观察到减少的效果。然而，将ImmTOR与空AAV8联合给药给健康人体受试者只延迟了NAbs的形成。 多种方法专注于直接逃避NAbs。一种方法利用细菌衍生的抗体降解酶。另一种方法是血浆置换，它用于减少循环抗体，但可能无法完全根除NAbs或需要多个周期。此外，血浆置换去除总抗体含量，因此增加了传染病的风险。为了克服这个障碍，一项研究使用AAV特定的血浆置换柱从NHP的血浆中耗尽抗AAV NAbs，而不影响总IgG水平。另一项研究表明，AAV9颗粒结合到Sepharose珠子上在大鼠中选择性地耗尽抗AAV抗体。这种方法的治疗窗口有限，因为血浆置换不去除产生抗体的细胞。在另一项研究中，使用盐水冲洗或带气囊导管隔离目标组织与系统循环。这种策略相对侵入性，并且可能不适用于所有目标组织和AAV的系统给药。此外，在这项研究中，使用了NAbs低的NHP，这种方法在NAbs高的动物中的有效性需要进一步评估。建议使用最小暴露于NAbs的途径。在一项血友病临床试验中，与系统给药途径相比，AAV的肌肉传递对预先存在的NAbs不太敏感。此外，在动物模型中，直接将AAV传递到CNS被良好耐受。然而，改变给药途径可能会潜在地减弱转导效率并改变AAV载体的生物分布。 其他方法专注于AAV衣壳以调节体液免疫反应。一种方法是使用诱饵空衣壳吸收循环NAbs。空衣壳的添加通常不是有效的，可能会加剧AAV的免疫毒性并降低转导效率。此外，除了携带转基因的衣壳外，还生产大量空衣壳，这给过程增加了额外的复杂性和相关成本。 衣壳工程是另一种方法，用于生成具有所需趋向性和降低免疫原性的重组AAV。在NAb识别位点的修改可以提高转导效率。或者，通过定向进化产生的衣壳可以逃避NAb感应。与自然变体相比，由AAV2、AAV8和AAV9变体的残基组成的工程化AAV-DJ变体已被证明在存在人类静脉注射IgG的情况下转导肝细胞。此外，从人源化小鼠模型中分离的AAV3b对NAb识别不敏感，并且在人类肝细胞中具有更高的转导效率。尽管如此，与使用当前可用且研究充分的衣壳相比，工程化AAV衣壳是耗时的、劳动密集的，并且需要识别NAb识别位点。为了避免工程化AAV衣壳的复杂性，建议对AAV衣壳进行化学修饰，包括聚乙二醇化和聚合物封装。然而，这些化学修饰可能会潜在地降低转导效率，降低产量，改变AAV载体的生物分布，并导致抗聚合物抗体的形成。除了化学修饰的衣壳外，多项研究表明，外泌体封装的AAV可以在预先存在的免疫存在下转导目标细胞，诱导耐受性，并赋予AAV改变的趋向性。然而，用外泌体封装AAV可能进一步复杂化生产过程并引入核酸或蛋白质污染。 通常，AAV基因治疗的单一治疗可能不够。除了AAV基因治疗后的免疫反应外，暴露于野生型AAV导致预先存在的免疫力，阻碍了AAV再剂量。多项研究表明，CD28/B7和CD40/CD40L阻断导致炎症反应的缓解并允许载体再给药。在这个策略中，CTLA4融合蛋白与B7的相互作用比CD28具有更高的亲和力，导致免疫反应的下调。这种方法与一种抗CD40配体抗体结合使用，阻断了B细胞的刺激信号。尽管结果有希望，但CD28/B7和CD40/CD40L阻断广泛抑制NAbs并需要进一步调查。此外，血浆置换、衣壳诱饵和更换衣壳变体的缓解策略不是有效的。此外，免疫抑制和使用抗体降解酶不针对AAV特异性免疫反应。需要进一步研究开发更具体和有效的方法。更换衣壳变体是另一种允许AAV再剂量的选择，但受到AAV衣壳的不同趋向性、NAbs的交叉反应性和开发不同产品的复杂性的限制。逃避允许基因治疗的体液免疫反应仍然难以捉摸。包括给药途径、所需剂量和目标组织在内的几个变量在选择适当策略中起着关键作用。此外，使用除B细胞耗竭之外的其他策略，如针对IL-1β和IL-6的抗体、etanercept（TNFα抑制剂）或anakinra（IL-1R阻断剂）可能有助于调节AAV基因治疗中的体液免疫反应。使用一种或多种策略可能允许在否则不符合条件患者中进行AAV基因治疗。 5.2.2 克服细胞介导免疫反应的策略 与可以预测的患者体液免疫反应不同，患者对AAV的细胞介导反应在临床试验中差异很大。自从在血友病临床试验中首次观察到以来，通过免疫抑制方案广泛抑制了衣壳特异性T细胞反应。在AAV临床试验中使用的IS治疗包括类固醇、单克隆抗体和蛋白酶体抑制剂。类固醇通常用于临床试验，以通过影响T细胞受体信号减少T细胞激活和细胞因子产生。此外，它们增加抗炎细胞因子的产生和Treg增殖。类固醇通过抑制血管生成、白细胞迁移到炎症部位以及改变免疫细胞死亡和迁移来抑制炎症反应。如前所述，糖皮质激素被用于所有人类受试者中，以抑制Zolgensma试验中的衣壳特异性T细胞反应，然而在类固醇逐渐减少期间，两名患者死于急性肝衰竭。多项临床研究表明，使用类固醇未能防止转基因逐渐丧失。因此，一些研究专注于使用免疫抑制剂药物组合和优化治疗时机。环孢素和他克莫司下调IL-2转录，从而抑制T细胞增殖和激活。他克莫司的日常给药允许NHP中AAV传递的转基因持续表达。麦考酚酸莫非特（MMF）优先耗尽T和B淋巴细胞中的鸟苷核苷酸，并抑制它们的增殖。环孢素和MMF的组合在Glybera临床试验中使用，但未能抑制所有人类受试者的免疫反应。后续研究表明，在AAV剂量之前开始免疫抑制和额外的皮质类固醇治疗是有益的。体外研究表明他克莫司和环孢素抑制Treg增殖。一项研究表明，他克莫司治疗损害了肾脏和肝脏移植患者的Treg功能，而雷帕霉素对Treg有有益的效应。因此，雷帕霉素与利妥昔单抗或强的松的组合已在AAV临床试验中频繁用于诱导耐受。此外，环孢素和非耗尽性CD4受体抗体诱导Tregs并允许在小鼠中重新剂量。建议使用蛋白酶体抑制剂如硼替佐米。体外和临床前动物研究表明，硼替佐米的给药可以防止内化的AAV降解，减少衣壳呈递，并增加通过增强AAV的核转移来提高转导效率。尽管应用广泛，系统性免疫抑制可能会导致Treg抑制和多种不良效应，包括肠道并发症、肌肉疼痛和头痛，这使得其他策略受到关注。 在AAV运输过程中，AAV衣壳表面的酪氨酸残基可以被磷酸化并随后泛素化，这导致衣壳降解并呈现在转导细胞表面。因此，建议突变表面酪氨酸，这导致AAV衣壳的呈递减少，T细胞毒性降低，并需要治疗剂量。多项研究减少了AAV的治疗剂量，并使用了转基因的超活性变体。并非每个转基因都有超活性版本，并且可能并不总是导致减少的T细胞反应。 除了前面讨论的策略外，降低给药剂量和去除空衣壳已被提出。这种方法试图减少AAV衣壳对抗原呈递的可用性。然而，降低AAV剂量可能会降低转导效率，并导致NAbs中和AAV。 Tregs的浸润和肌肉导向AAV基因治疗试验中转基因的长期表达强调了Treg在诱导免疫耐受中的作用。因此，Treg诱导表位，Tregitope，被纳入AAV衣壳结构，成功扩大了Treg并抑制了CD8 T细胞。除了工程化AAV衣壳，ImmTOR颗粒在衣壳特异性T细胞和体液免疫反应方面显示出有希望的结果。然而，这些新策略需要进一步的功效和安全性调查，因为它们是非抗原特异性治疗。 为了诱导局部和特异性耐受，另一项研究结合了Tregs抑制免疫反应的能力以及CAR的抗原特异性。在这项研究中，使用了AAV特异性CAR Tregs和多克隆Tregs，尽管存在衣壳特异性T细胞反应，但允许转基因表达。 在临床上，衣壳特异性T细胞反应主要通过使用类固醇来控制。免疫抑制增加了感染风险，并且在需要高剂量AAV时效果较差。因此，开发一种新的抗原特异性策略似乎是不可避免的。 5.3.减轻转基因免疫反应 为了避免针对传递转基因的免疫反应，已提出几种方法，包括限制目标人群、免疫抑制、使用组织特异性启动子、miR技术以及免疫细胞疗法。 短期使用环磷酰胺治疗，这是一种烷基化剂，可减少促炎细胞因子的产生，在小鼠和犬模型中成功实现了基因表达。此外，在犬研究中，使用环孢素、抗胸腺细胞球蛋白和MMF的短暂免疫抑制预防了免疫反应并实现了转基因表达。除了系统性免疫抑制外，临床前研究指出了组织特异性启动子在减少针对传递转基因的免疫反应中的作用。当转基因由普遍性启动子驱动时，与肌肉特异性启动子相比，观察到较低水平的转基因表达和强烈的体液和细胞免疫反应。此外，使用肌肉特异性启动子在犬模型中实现了转基因的稳定表达，而没有免疫反应。此外，NHP的一项研究报告称，肝脏导向的表达可能有助于限制抗转基因抗体，诱导耐受，并允许重新使用不同衣壳变体的再剂量。 其他研究利用Tregs来抑制与转基因相关的免疫反应。一项研究使用多克隆Tregs来抑制蛋白替代疗法中因子8和9的免疫反应。然而，Tregs的低频率和潜在的非特异性免疫抑制限制了多克隆Tregs的应用。因此，多项研究产生了转基因特异性CAR Tregs，在抑制转基因诱导的免疫反应方面显示出有希望的结果。TRuC Tregs是通过将抗人凝血因子VIII (hFVIII) 的单链可变片段与T细胞受体融合而开发的。这项研究表明，与FVIII-CAR Treg相比，F8-TRuC Treg具有更优越的抑制功能。B细胞抗体受体（BAR）是通过将因子8抗原和T细胞刺激信号域结合而产生的。BAR T细胞在体外和体内成功消除了FVIII反应性B细胞。随后，通过将Tregs与BAR构建物共转导而创建的BAR Tregs，在抑制转基因特异性B细胞方面显示出有希望的结果。尽管免疫细胞疗法在抑制转基因免疫反应方面取得了有希望的结果，但其临床安全性和有效性需要进一步调查。 目前，临床研究中招募了可能具有较低转基因免疫反应风险的受试者。利用新开发的方法使我们能够包括更多的代表性研究对象。 6.结论 关于患者对AAV基因治疗的免疫反应仍有许多未知之处。然而，基于正在进行的临床试验和治疗数千而非少数患者的许可后数据，不断积累的证据。为了进一步了解AAV基因治疗的免疫反应的发展，需要对入选受试者进行进一步的免疫监测，包括监测血清因子的策略、外周血免疫细胞的表征以及组织分析。然而，缺乏免疫测定的标准协议以及无法收集相关样本导致研究间的变异性，并进一步复杂化了研究结果的解释。开发标准协议以监测AAV临床试验中的受试者将有利于该领域的更好比较。然而，当前试验中存在的剂量、给药途径和使用多种衣壳血清型的变异性可能进一步使比较和解释AAV基因治疗的免疫反应更加复杂。 在大多数试验中，系统性免疫抑制被广泛施用以调节AAV基因治疗临床试验中的免疫反应，尽管有一些显著的不良效应。然而，免疫抑制方案、剂量和时机也都非常多变，并且该领域没有共识。适当的动物模型来测试当前或新药物并不容易获得，这使得标准化协议变得困难。应用新开发的战略可能比广泛、非特异性的免疫调节更有针对性，可能有助于改善结果并减少并发症。 自1995年第一次AAV临床试验以来，已经观察到有关AAV安全性和免疫反应的显著临床数据，然而免疫反应仍然是成功AAV基因治疗的障碍。克服免疫反应的新兴策略将使AAV基因治疗的全部潜力对数千人的生活产生积极影响。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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