HPV E6 x HPV E7 x MUC1

摘要:针对肿瘤的有效疫苗引发的免疫反应可能为癌症提供终身解决方案，与传统的化疗、手术、免疫疗法和放疗等程序相比。随着基础肿瘤免疫学知识的进展，癌症疫苗（CV）研究取得了显著进展。近期II/III期临床试验的积极结果，如Provenge®，一种基于树突状细胞（DC）的疫苗，表明了新一代免疫疗法疫苗的出现。在过去20年中，已经鉴定并临床测试了几种肿瘤相关抗原（TAAs），作为针对各种类型癌症的免疫疗法显示出有希望的结果。为了解决对TAAs的免疫反应减弱问题，已经开发了包括基于细胞的、基于DNA或RNA的、基于蛋白质或肽的以及基于载体的疫苗在内的各种治疗性CV技术。本综述重点检查最有希望的II/III期临床试验，特别强调旨在预防癌的疫苗。此外，本综述还提供了可能的组合策略的概述，这些策略可以释放CV的独特潜力。 1.引言 癌症是全球第二大死因，2020年导致1000万人死亡。同年，1000万癌症相关死亡中有超过70%发生在低收入和中等收入国家。乳腺癌是最常见的类型，预计2022年美国将有290,560例新病例。前列腺癌（PC）和肺癌（LC）是接下来最常见的恶性肿瘤。男性更容易发展成前列腺、肺和结直肠癌（CRCs），而女性更容易发展成乳腺、肺和CRCs。总体而言，由于早期筛查和治疗进展，包括化疗、手术、放疗和靶向疗法，男性和女性的癌症发病率和死亡率一直在持续下降。 尽管取得了这些积极的进展，癌症仍然是一个需要创新方法和治疗干预的重大全球公共卫生问题，以增强治疗体验。免疫疗法一直被认为是癌症患者的一个有希望且可行的选择。理论上，疫苗接种可以诱导特定的细胞和体液免疫反应，以抑制肿瘤生长并最终消除恶性细胞。20世纪90年代初发现的第一个人类肿瘤抗原黑色素瘤相关抗原1（MAGE-1）开启了肿瘤抗原在癌症疫苗（CVs）应用中的新篇章。2010年成功使用Sipuleucel-T（Dcs疫苗）对抗PC展示了CVs的潜力，并在该领域引起了极大的兴趣。目前，几乎所有CVs都处于临床前和临床开发阶段。 有必要建立疫苗和更具体抗原的开发平台。CVs可以分类为治疗性或预防性疫苗。预防性疫苗可以通过限制致癌微生物的感染来阻止肿瘤发生，而不为恶性肿瘤提供直接的治疗益处。这些中最知名的是乙型肝炎病毒（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗，它们已被广泛使用并获得FDA批准，分别显著降低了肝癌和宫颈癌的发病率。治疗性疫苗通过特别触发自身免疫反应来消除肿瘤细胞。MAGE-1是一种在黑色素瘤组织中但不在健康组织或细胞中发现的人类肿瘤抗原，正如Van der Bruggen进行的研究所示。这一发现开启了疫苗研究的新时代。 这导致了一种理论，即利用肿瘤抗原以“疫苗”格式，由于它们优先针对癌细胞，提供了一种安全有效的治疗方法，能够产生终身免疫。在过去40年中，针对各种恶性肿瘤进行了广泛的CVs的临床前和临床研究。在美国和欧盟，只有两种治疗性CVs，talimogene laherparepvec（T-VEC）和sipuleucel-T，获得了监管批准。 CVs根据各种生产技术分为四组：（i）基于细胞的疫苗；（ii）基于病毒的疫苗；（iii）基于肽的疫苗；以及（iv）基于核酸的疫苗。基于细胞的CVs是主要的疫苗类型，它们使用整个细胞作为抗原载体，而DC疫苗在临床研究中显示出希望。病毒主要用于基于病毒的CVs中，作为治疗和预防癌症的载体。基于肽的疫苗包含已知或预期的肿瘤抗原的表位。必须向基于肽的疫苗中添加佐剂以增强其免疫原性，因为它们通常免疫原性较低。DNA/RNA疫苗由编码微生物抗原的基因组成，是核酸疫苗的例子。基于DNA的疫苗使用编码TAAs复合物的DNA质粒来诱导特定的肿瘤反应。体外生产的mRNA疫苗可能包含抗原，并且在内化后产生蛋白质以引发免疫反应。将CVs与不同的免疫疗法或治疗相结合，已成功克服了肿瘤抗药性并改善了临床结果。本章总结了生产CVs的四种方法，以及CV抗原的介绍。CV研究的发展也得到了解决，重点关注其临床应用和治疗效果，这对未来的设计将是宝贵的。 2.癌症疫苗抗原 在癌症疫苗（CV）的开发中，选择抗原是一个关键步骤。癌症疫苗的有效性在很大程度上依赖于T淋巴细胞识别肿瘤抗原的能力。CV抗原应具有高度免疫原性，仅在癌细胞中表达（不在正常细胞中表达），并且对癌细胞的生存至关重要。肿瘤免疫疗法主要分为两类：（i）被动（或适应性）肿瘤免疫疗法，涉及细胞或抗体（Abs）的给药；以及（ii）主动肿瘤免疫疗法，以疫苗为代表，旨在诱导针对肿瘤特异性抗原（TSAs）和肿瘤相关抗原（TAAs）的特定免疫反应（图2.1）。TAAs，也称为肿瘤共享抗原，包括过度表达的“自身抗原”、分化抗原、癌-睾丸抗原和由病毒感染引起的“非自身”抗原。过度表达的显著肿瘤抗原包括人类端粒酶逆转录酶（hTERT）和人类表皮生长因子受体2（HER2）。前列腺特异性抗原（PSA）和黑色素瘤抗原酪氨酸酶分别在PC和黑色素瘤细胞中表达。这些抗原被称为组织分化抗原。TAAs在特定组织学类型的大多数肿瘤中都很常见，这在CV发展的历史中受到了显著关注。例如，众所周知，表面抗原HER2也是一种促进细胞分裂的癌基因产物。针对HER2的单克隆抗体疗法是乳腺癌和其他HER2+恶性肿瘤治疗的关键组成部分；然而，目前还没有疫苗能够刺激人体产生这些Abs。 图 2.1 肿瘤抗原分类。 TAAs以多种形式存在，可以应用于一系列患者。TAAs是最初CV的主要靶标。由于中枢和外周水平的耐受机制，针对TAAs的高亲和力T淋巴细胞的形成可能不足以产生免疫反应。因此，基于TAA的疫苗需要有效且足够以“打破耐受”。尽管多年来一直关注TAAs，基于TAA的CV的临床研究结果并不一致。此外，TAAs在非恶性组织中的表达引起了对疫苗诱导的自身免疫损伤的担忧。 治疗性CV旨在“训练”宿主防御系统识别并精确靶向肿瘤细胞以实现消除。肿瘤特异性抗原（TSAs）是仅在肿瘤细胞上发现的抗原，由于其特异性，被认为是癌症免疫疗法的理想靶标。TSAs有时被称为新抗原，这些异常肽链是由于遗传和表观遗传变化（如点突变或移码突变，以及插入/缺失事件）在癌细胞中产生的。针对TSAs的优势在于，几种蛋白质在肿瘤发生和癌症发展中发挥着关键作用。然而，针对TSAs也有一个显著的劣势，即大多数变化是每个肿瘤独有的，可能需要为特定个体开发个性化免疫疗法。新抗原的产生在肿瘤突变负担较高的肿瘤中更为常见，提供了一个独特的靶标机会。肿瘤突变负担指的是恶性肿瘤细胞内同时发生的突变事件的累积频率。 新抗原与TAAs在几个方面有所不同，使它们更受欢迎： 它们与人白细胞抗原（HLA）和T细胞受体的结合亲和力更高； 它们的表现仅在肿瘤细胞中发现； 它们的特异性和结合亲和力的结合使它们能够避免中枢耐受和自身免疫问题。 最近，肿瘤疫苗的主要焦点是针对新抗原。新抗原疫苗在几项最近的临床试验中显示出希望，导致患者生存率提高。CV的配方遵循个性化方法，因为它专门针对患者的新抗原。在这个过程中，对肿瘤基因组进行测序，识别突变，并使用计算机系统预测新抗原（通过实验验证产生并结合主要组织相容性复合体（MHC）蛋白）。随后，生产包含预测新抗原的疫苗并给患者施用。 在小鼠上进行的循证研究已经检验了这种策略的可行性和有效性[13]。例如，观察到使用合成长肽（SLP）新抗原的疫苗接种在三种不同的小鼠模型中产生了显著的抗癌活性。另一项涉及含有新抗原的SLP免疫接种小鼠的实验显示了强大的T细胞反应，但并未延长寿命。有趣的是，这两项研究发现大多数新抗原诱导的是CD4 T细胞反应而不是CD8 T细胞反应。 一个显著的例子是mRNA新抗原基础的黑色素瘤疫苗，它诱导T细胞浸润和特异性消除表达新抗原的肿瘤细胞。随后的免疫接种显著降低了转移的发生，导致持续的无进展生存期（PFS）。最近在两项I期临床研究中证明了含有个性化新抗原的疫苗在黑色素瘤患者中的有效性。在这两种情况下，所有患者都显示出免疫反应，包括激活和扩展识别多个新抗原的CD4和CD8 T细胞。科学家们通过利用共享抗原和新抗原的组合来扩大疫苗的抗原池，以提高疫苗的效率。APVAC1/2疫苗可以有效刺激胶质母细胞瘤中的免疫（T细胞）反应，因为它们包含共享的肿瘤抗原和个性化的新抗原。此外，使用免疫抑制受体抑制剂程序性死亡-1（PD-1）或程序性细胞死亡配体-1（PD-L1），以及个性化新抗原疫苗的初步治疗试验，已经显示出抗肿瘤效果。 3.癌症疫苗平台 已经开发了几种类型的癌症疫苗（CVs），每种都依赖于不同类型的抗原。这些包括——（i）基于细胞的疫苗；（ii）基于肽的疫苗；（iii）基于病毒的疫苗；以及（iv）基于核酸的疫苗。 3.1.基于细胞的癌症疫苗 第一种肿瘤疫苗是基于细胞的疫苗，它们通常由整个细胞或模拟肿瘤抗原的细胞片段制成，以引发对抗原的更广泛的免疫反应。树突状细胞（DCs）疫苗是细胞疫苗的一个重要子集。基于DCs的个性化新抗原疫苗的临床试验显示出积极的抗肿瘤结果。作为人类免疫系统中强大的抗原呈递细胞（APCs），DCs对于引发免疫反应至关重要。DCs制备的疫苗在引发抗肿瘤免疫反应方面更有效。 DCs疫苗通常通过收集患者的单核细胞，通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素-4（IL-4）等细胞因子激活它们，并让它们分化成DCs来制造。将患者的肿瘤抗原装载到DCs中，以创建自体抗原脉冲DCs疫苗。DCs疫苗由各种抗原组成，包括与肿瘤细胞或裂解物融合的DCs，以及DNA、RNA、肽和蛋白质的组合，以及其他类型的抗原。因此，DCs疫苗可以通过提高抗原性能、启动不成熟的CD8+ T细胞、促进T细胞分化为记忆T细胞等来增强其效果。FDA批准的代表性DCs疫苗，名为Sipuleucel-T，已经显示出对抗去势抵抗性前列腺癌（PC）的积极效果（表2.1）。它得到了III期IMPACT试验结果的支持，该试验显示，与安慰剂相比，sipuleucel-T治疗将总生存期（OS）从22个月提高到大约26个月（风险比：0.8；p = 0.03）。整个肿瘤细胞疫苗的免疫原性需要提高。活肿瘤细胞释放可溶性化学物质，抑制免疫细胞，从而降低肿瘤细胞的免疫原性。例如，死亡的细胞比活的细胞更有效地刺激免疫系统。肿瘤细胞死亡可以触发适应性免疫反应。有几种方法可以诱导免疫原性细胞死亡： • 干扰素基因，刺激干扰素基因（STING）激活的NPs诱导神经母细胞瘤细胞凋亡； • RAS选择性致死3诱导的铁死亡肿瘤细胞； • 光敏剂诱导的死亡肿瘤细胞可能都表现出显著的免疫原性。 此外，修改肿瘤细胞可能会潜在地增强整个肿瘤细胞疫苗的效果。在整个肿瘤细胞疫苗中使用IL-21和IL-7的遗传修饰显示出显著的有效性。已经采用了各种技术来修改疫苗，例如用CpG载药的NPs涂层死亡的肿瘤细胞以增强抗原呈递。此外，将免疫检查点抑制剂（ICI）与整个肿瘤细胞疫苗结合使用变得越来越普遍，目的是阻断抑制自反应T细胞作用的途径。 大多数DCs疫苗来源于单核细胞，表现出良好的耐受性和效果。相比之下，自然发生的DCs表达更多的MHC分子，使它们在抗原传递方面更有效。已经确定使用的DCs类型可以影响DCs疫苗的效果。髓样/浆细胞样DCs和常规DCs是单核细胞衍生的DCs的两种流行替代品。两项临床试验已经使用自然DCs治疗III期黑色素瘤和转移性去势抵抗性PC患者，包括髓样DCs、常规DCs或两者的组合。 另一种广泛使用的优化技术是放射疗法。DCs疫苗和放射疗法可以结合使用以增强免疫反应。放射疗法有可能吸引肿瘤相关的中性粒细胞，导致增加的氧自由基和肿瘤细胞的氧化破坏。DCs疫苗也可以与佐剂、细胞因子、ICI或化疗结合使用以增强其效果。 3.2.基于病毒的癌症疫苗 源自病毒的疫苗的主要优势在于它们能够刺激先天和固有免疫系统协同作用，从而产生高效且持久的免疫反应。像HBV和HPV这样的病毒源性恶性肿瘤，尽管癌症疫苗技术与针对病毒的技术相比存在固有挑战，但仍有显著潜力通过病毒导向疫苗抑制原发性癌症。FDA批准的疫苗已成功预防了HBV和HPV等病毒感染，它们分别是肝细胞癌和宫颈癌的主要原因。根据Ahmed等人的研究，Epstein-Barr病毒蛋白（BZLF1）可能是免疫抑制实体器官移植中基于树突状细胞（DCs）疫苗的合适候选物。基于病毒的疫苗有三种类型：（i）溶瘤病毒相关疫苗；（ii）病毒相关载体疫苗；以及（iii）针对致癌病毒的减毒活疫苗。据估计，大约12%的癌症病例是由病毒感染引起的。一种名为溶瘤病毒的创新治疗专门针对并杀死肿瘤细胞，同时促进抗肿瘤免疫反应。溶瘤病毒感染的肿瘤细胞产生刺激免疫细胞的氧自由基和细胞因子。这导致溶瘤作用，并且也释放肿瘤相关抗原（TAAs）。几项临床研究已经证明了溶瘤病毒（OVs）对肿瘤的有效性。OVs的种类包括腺病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒、天花病毒、水泡性口炎病毒等。T-VEC是FDA批准的第一个用于癌症治疗的溶瘤病毒（表2.1）。T-VEC利用直接肿瘤内注射来增强抗癌免疫反应，避免在血液中的稀释和中和，并在周围肿瘤中诱导细胞溶解。腺病毒是一种常用的溶瘤病毒，作为基因传递载体，因其易于操作、基因结构明确和宿主细胞嗜性广泛而受到青睐。它可以大量生产，并广泛用于基因转移和肿瘤抗原生产。病毒还被设计为同时表达特定抗原和免疫调节分子，以破坏肿瘤微环境（TME）。例如，TG4010由一种改良的天花病毒（MVA）组成，该病毒产生肿瘤抗原人粘蛋白-1（MUC-1）和免疫刺激性细胞因子白介素2（IL2）。采用异源初免-加强策略来训练T细胞并产生强大的免疫反应。这种方法涉及使用单一病毒载体传递肿瘤抗原，然后使用不同的病毒载体或载体类型施用相同的肿瘤抗原。PROSTVAC-VF/Tricom通过用编码PSA的天花病毒初免，然后施用编码PSA的禽痘病毒加强剂量，已被证明可以提高PC患者的总生存期。 3.3.基于肽的癌症疫苗 目前癌症研究主要集中在基于亚单位疫苗的开发上，而不是研究整个、灭活或减毒的病毒。基于肽的疫苗由包含预期肿瘤抗原表位的多肽组成。这种蛋白（或表位）装载疫苗提供了两个关键优势，与肿瘤细胞/裂解物相比：（i）更快的生产、储存和供应；以及（ii）分离和供应肿瘤特异性抗原（TSAs），因为大多数肿瘤细胞组成包含缺乏药用价值的自身蛋白，甚至可能引发自身免疫反应。然而，这种策略有一些缺点。首先，单一蛋白或表位的免疫原性低。其次，肿瘤可以通过抗原突变或失活迅速逃避免疫识别。第三，它们的使用受到HLA的限制，主要用于基于表位的疫苗，并且限制在特定的患者群体中，通常是HLA-A2+。最后，它们在触发CD4和CD8细胞稳定刺激方面的能力有限，这对于有效和长期的抗肿瘤免疫疗法至关重要。通过使用更长的肽或在一次疫苗接种中结合多个表位，可以解决上述许多问题。然而，肽的相对低免疫原性可能需要使用树突状细胞（DCs）或佐剂。基于肽的疫苗接种通常与佐剂配对以增强整体免疫反应。蛋白抗原对B细胞和T细胞表现出不同的免疫原性。与灭活的肿瘤细胞疫苗相比，基于肽的疫苗激发更有效的免疫反应，特别是针对关键的中和表位。这种免疫学优势被称为免疫优势。 肽疫苗的有效性在很大程度上受肽链长度的影响。CD8+ T细胞的小表位通常是包含15个氨基酸的短肽，其在体内的半衰期较短。因此，短肽往往只能暂时激活细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），甚至可能导致CTL耐受。此外，HLA类型经常对短肽施加限制。相比之下，长肽可以覆盖更广泛的HLA类型，呈现多种表位，支持识别和结合以增强免疫原性。长肽不能直接装载到MHC分子上；它们必须首先被APCs处理。长肽经过大量消化，通过内吞过程分解，然后沉积在MHC-II分子上，被CD4+ T辅助细胞识别。另一方面，为了激活CD8+ T淋巴细胞，其他组分遵循细胞质途径并与MHC-I分子融合。因此，长肽疫苗有更大的潜力诱发持久和强大的抗肿瘤活性反应。长肽通常使用蛋白质表达系统生产，而短肽通常化学合成。各种表达平台，如大肠杆菌、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞和酵母，已被用于CVs的开发。哺乳动物细胞能够表达与天然肿瘤抗原非常相似的蛋白质。小抗原可以与载体蛋白融合以增加其免疫原性。例如，MUC1 CV结合破伤风毒素，显著减缓了小鼠模型中乳腺癌肿瘤的生长。另一个例子是将HER2细胞外结构域中的β-细胞表位与多肽IMU-131和白喉毒素融合。IMU-131诱导产生HER2特异性抗体和细胞反应，如发表的I期临床研究所证明的。针对HER2的CV NeuVax目前正在进行III期临床试验。此外，曲妥珠单抗正在两项正在进行的II期临床试验中用于HER2+乳腺癌。佐剂经常与基于肽的疫苗一起使用。佐剂显著影响免疫接种后T细胞反应的类型和程度。几种新的佐剂，如纳米材料、合成Toll样受体（TLR）配体、Nod样受体（NLRs）、CD40激动剂、视黄酸诱导基因（RIG）受体、STING和细胞因子，显示出有希望的抗肿瘤益处。这些佐剂在各种CVs的开发中被广泛使用，包括核酸和基于细胞的疫苗。理论上，这些新佐剂增强T细胞增殖和激活，促进它们迁移到淋巴结，并协助招募白细胞到免疫部位。最近的研究证明了T辅助细胞在产生强大和持久的免疫介导的抗肿瘤反应中的关键作用。针对T辅助型1（Th1）细胞对启动和维持抗肿瘤免疫有显著影响，而T辅助型2（Th2）细胞可能促进肿瘤转化。由铝制成的佐剂增加了Th2型反应，这使它们不太适合用于CVs。另一方面，AS04，一种铝盐，当与MPL（单磷酰脂A-纯化的脂多糖（LPS））结合时，可以强烈引发Th1反应并产生干扰素-γ（INF-γ）。纳米材料也被广泛研究作为有趣的抗原传递装置，因为它们保护蛋白质免受即时蛋白酶分解，延长了抗原的半衰期。它们可以被设计为针对特定细胞和器官类型。聚乙二醇（PEG）和其他可生物降解的聚合物通常用脂质体处理以增加抗原的半衰期。针对TLR的佐剂在癌症疫苗中显示出相当的希望。例如，TLR3激动剂，聚肌苷-聚胞苷酸（poly I:C），是最有效的Th1型反应诱导剂，与疫苗配对时，产生强大的CTL反应。黑色素瘤和胶质瘤的临床试验已经检验了poly(I:C)。此外，包括GM-CSF、IL-2和IFN在内的细胞因子在临床试验中作为CVs的佐剂显示出希望。使用GM-CSF作为疫苗佐剂的抗肿瘤免疫疗法的临床试验已经在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和皮肤癌中进行。 3.4.核酸（DNA/ mRNA）疫苗 20世纪90年代生物医学进展的一个突出领域是使用核酸开发基因治疗，以产生针对病原体（预防性疫苗）或肿瘤抗原（CVs）的特定抗体（T细胞）反应。利用非活疫苗的概念为增强细胞和体液免疫提供了机会。癌症DNA疫苗是使用细菌质粒构建的，整合多个肿瘤学抗原，激活先天免疫并触发免疫反应。DNA疫苗刺激细胞和体液免疫反应。要被转录成细胞质抗原，DNA疫苗必须穿透细胞核。抗原由MHC I和MHC II分子处理并呈现给CD8+ T和CD4+ T细胞以引发特定的免疫反应。DNA疫苗以三种不同的方式工作：（i）DNA直接转染到体细胞中，如肌肉细胞；（ii）凋亡体（或分泌体）释放体细胞DNA中编码的抗原；以及（iii）DNA直接转染到APCs中。DNA CVs最重要的方法是通过皮内（ID）给药直接将DNA质粒转移到APCs中。 DNA疫苗在人体中已引发免疫反应，尽管其效果仍然相当低。不同类型的抗原呈递细胞(APCs)，如肌细胞、单核细胞和树突状细胞(DCs)，可以摄取裸DNA和RNA。然而，细胞对裸核酸的吸收效率不高，因此研究集中在制定和改进摄取方法上。通过微针阵列、纳米颗粒(NPs)、原位电穿孔和基因枪等传递方法可以显著增强转染。在过去的十年中，对众多DNA癌症疫苗(CVs)进行了临床前和临床研究。然而，只有少数临床试验发表了他们的发现。DNA疫苗的研究主要集中在宫颈癌上。目前，两项III期临床试验正在检验首个DNA疫苗VGX-3100针对HPV的保护和效果，以及“ZycoV-D”COVID-19疫苗。INOVIO这家制药公司最近发布了VGX-3100针对宫颈癌前病变的III期试验的有希望的结果。 以前，由于DNA比mRNA更稳定，且在体内停留时间更长，因此开发了基于DNA的核酸疫苗(NAVs)。然而，现代mRNA癌症疫苗在治疗各种实体癌症方面显示出鼓舞人心的临床结果。RNA癌症疫苗可能比DNA疫苗有一些优势。与DNA分子不同，mRNA转移到细胞质中翻译并直接表达抗原，无需进入细胞核进行转录。因此，mRNA抗原的产生是快速和高效的。与mRNA疫苗相比，DNA疫苗由于需要额外的步骤进入细胞核，引发的免疫反应较小。然而，一旦质粒DNA进入细胞核，它可以产生多个mRNA副本，从而产生比单个mRNA分子更多的抗原。此外，mRNA疫苗不涉及整合到基因组中，而DNA疫苗可能存在插入突变的风险。最近的进步通过各种修改到主链和非翻译区(UTRs)提高了mRNA的稳定性和翻译效率。通过使用快速蛋白液相色谱等新纯化技术从mRNA产品中去除双链，减少非特异性免疫激活。此外，使用脂质纳米颗粒(LNPs)和创新技术显著增强了mRNA的体内分布。大多数LNPs由胆固醇、磷脂和脂锚定的PEG(电离氨基酸脂质样复合物)组成。胆固醇和磷脂在膜融合、体内逃逸和脂质体结构稳定中起着至关重要的作用。脂锚定的PEG有助于减少巨噬细胞介导的清除，防止颗粒聚集，并提高储存稳定性。优化电离脂质对于增强LNPs的传递和功能性至关重要。最近的修改使得LNPs的目标传递成为可能。例如，甘露糖修饰的LNPs可以通过与甘露糖受体结合潜在地靶向DCs。此外，基于芯片的微流体装置生产的LNPs的稳定性和可复制性有利于LNPs的GMP生产。 对体外转录(IVT)的mRNA基础肿瘤疫苗进行的临床试验显示出有希望的结果。mRNA疫苗已用于治疗侵袭性和转移性恶性实体瘤，包括结直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和黑色素瘤。在最近一项涉及转移性黑色素瘤患者的I期研究中，测试了编码四种不同肿瘤相关抗原(TAAs)的mRNA在脂质体配方中的效果。这种mRNA疫苗的一个例子是BNT111，它包含四种TAAs(NY-ESO-1、MAGEA3、酪氨酸酶和TPTE)。BNT111展示了针对常见非突变肿瘤抗原的潜力，并为接受ICIs治疗的黑色素瘤患者提供有效治疗。Moderna和BioNTech开发的针对患者的mRNA疫苗的临床试验也显示出抗癌益处方面的有希望的结果。例如，Moderna开发了mRNA-4157，这是一种能够编码34个新抗原在LNPs中的定制新抗原疫苗(LNPs)。I期研究表明，接受mRNA-4157单独或与Pembrolizumab联合治疗的不可切除实体瘤患者显示出令人满意的抗癌活性。 4.癌症疫苗和组合策略 尽管取得了巨大的突破，癌症疫苗在作为单一疗法用于进展性恶性肿瘤患者时仍然具有有限的临床前景。肿瘤扩散并发展出多种逃避免疫系统的机制，如肿瘤的血管生成、招募免疫抑制细胞和过度表达抑制化合物。免疫接种产生的T细胞未能成功对抗肿瘤。因此，将这些免疫逃逸机制与其他方法结合起来至关重要。治疗性疫苗策略在抗癌工具中发挥了重要作用。在众多已发表的试验中，当放疗或化疗与之结合时，观察到了鼓舞人心的结果。正在探索治疗性疫苗与抗血管生成治疗(ATs)或ICIs的组合，重点是它们的潜在协同作用，并更新了临床前和临床发现(图2.2)。 图 2.2 癌症疫苗与组合策略的类型。(1) 靶向药物促使树突状细胞（DC）成熟；(2) 靶向药物鼓励CD8+ T细胞发展和抗原呈递；(3) 免疫检查点抑制剂（ICIs）阻止肿瘤免疫逃逸效应；(4) 不同的疫苗抗原；以及 (5) 靶向药物增强细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的杀伤能力。 4.1.癌症疫苗和抗血管生成治疗组合 肿瘤在癌变过程中表达增加的促血管生成分子，包括血管内皮生长因子（VEGF），其在肿瘤血管生成中发挥作用。尽管异常形成血管，但这一过程促进了肿瘤获取营养物质和氧气，促进生长和转移扩散。肿瘤血管生成还因其免疫抑制功能而有助于免疫逃逸。在此背景下，已开发出几种抗血管生成化合物以靶向肿瘤血管生成。过继疗法（ATs）通过抑制肿瘤产生的抑制细胞，促进树突状细胞（DC）成熟和分化，增强对肿瘤细胞的抗原呈递反应，诱导T细胞形成，激活CD8+ T细胞，并增强其杀死肿瘤细胞的能力。它们还针对肿瘤微环境（TME）的多个组分。目前临床环境中使用的大多数抗血管生成药物针对VEGF/VEGF受体（VEGFR）途径。例如，贝伐珠单抗（抗VEGF抗体）、索拉非尼、舒尼替尼或阿西替尼（酪氨酸激酶抑制剂）。基于前期试验中令人鼓舞的结果，目前正在对人类患者评估ATs和治疗性疫苗的组合。在一项II期临床研究中，舒尼替尼与AGS-003（一种从单核细胞衍生的DC疫苗，用同种异体肿瘤RNA和CD40L RNA处理）联合用于中危和低危转移性肾细胞癌（mRCC）患者。在疫苗引入时开始第二周期的舒尼替尼。联合疗法已被证明可以增加免疫反应并延长生存期。乳腺癌恶性肿瘤常表现出高水平的HER2表达。在小鼠模型中，曲妥珠单抗和全细胞疫苗的组合显示出增强CD8+ T细胞影响和延长存活时间的能力。然而，某些靶向药物可能不会增加疫苗效率，甚至可能由于它们与其他肿瘤信号通路的相互作用而降低免疫反应。例如，Hipp等人发现，索拉非尼通过抑制DC活性，可能会减少疫苗诱导的免疫反应。尽管正在进行临床试验，但疫苗和靶向疗法的组合相比其他组合受到的关注较少。因此，靶向药物和疫苗仍处于癌症治疗的早期阶段，预计会有更多积极结果。 4.2.癌症疫苗和检查点抑制剂组合 免疫检查点抑制剂（ICI）抗体已被公认为在与其他免疫疗法联合使用时是癌症治疗的有效方法，因为肿瘤细胞通过选择性免疫检查点限制T细胞功能。FDA已批准许多免疫检查点阻断抗体（表2.2）。例如，伊匹单抗阻断黑色素瘤中的CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞抗原-4），Pembrolizumab和Nivolumab阻断黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）中的PD-1，Atezolizumab阻断NSCLC和其他特定恶性肿瘤中的PD-L1。在一项Ib期研究中，胰腺腺癌患者接受了伊匹单抗和GM-CSF基因（GVAX）疫苗。与单独使用伊匹单抗相比，疫苗和抗CTLA-4疗法增强了总生存期（OS）。在一项类似的研究中，在三阴性乳腺癌（TNBC）中使用了合成癌症治疗疫苗和CTLA-4阻断抗体。研究发现，T细胞表面参与疫苗诱导的T细胞激活的TCR和CD28将促进CTLA-4的表达，这最终减少并消除T细胞反应。当与抗CTLA-4抗体联合使用时，疫苗对TNBC的治疗特性得到了显著改善。此外，还发现T细胞在肿瘤组织中的渗透有所改善，这是成功抑制CTLA-4途径的另一个因素。目前正在进行的II期试验评估PD-1拮抗剂nivolumab与HPV E6和E7多抗原疫苗的使用，在患有无法治愈的HPV阳性口咽癌的患者中产生了平均总生存期，几乎是单独使用ICIs的两倍。最重要的是，当免疫检查点阻断（ICB）疗法与治疗性癌症疫苗（CVs）联合使用时，会产生协同效应。然而，联合效应可能会受到临床应用中出现的大量无反应病例的影响。因此，有必要提供额外的输入，以评估患者对ICI的反应，并确定合理组合多种免疫检查点阻断技术。 4.3.放疗和化疗与癌症疫苗的组合 最后，一些最近的论文描述了将癌症疫苗（CVs）与化疗和放疗结合起来使用。前期研究表明，放疗可以诱导肿瘤细胞中的免疫原性应激和细胞死亡，从而增强T细胞反应力和与CVs的协同作用。在原位疫苗接种的情况下，细菌膜包被的纳米颗粒（BNP）与放疗相结合以增强免疫反应激活。BNP可以通过肿瘤内注射捕获放疗产生的新抗原，然后被树突状细胞（DCs）摄取并刺激先天免疫反应。BNP和放疗的联合效应导致显著的肿瘤退缩和肿瘤特异性免疫记忆的发展。化疗药物在肿瘤细胞中引起细胞毒性，导致肿瘤退缩。使用化疗的癌症免疫疗法旨在诱导目标肿瘤细胞中的免疫原性细胞死亡，进而在体内产生多种肿瘤抗原并释放各种免疫刺激分子。此外，研究表明，某些化疗药物的低剂量，如吉西他滨，可以调节免疫抑制细胞并重塑肿瘤微环境中的免疫耐受。传统的癌症治疗，如环磷酰胺（CP），损伤DNA并增强身体对抗肿瘤的能力。研究表明，在给荷瘤小鼠接种DC疫苗之前，单次低剂量CP治疗也通过减少调节性T细胞（TReg）和增加免疫刺激细胞因子的释放，如IFN-γ，来改善抗肿瘤免疫反应。紫杉醇的给药顺序和剂量显著影响疫苗诱导的肿瘤退缩，即使与GM-CSF修饰的CV和其他药物联合使用。已确认低剂量紫杉醇主要在疫苗接种后给药时增强抗肿瘤免疫反应，而不是之前。在使用癌症治疗疫苗时，还必须考虑化疗药物给药后的适当时间。 5.结论和展望 除了手术、化疗和放疗，癌症免疫疗法已成为抗癌治疗的第四个要素。基于有效的前期模型，各种疫苗平台已在临床试验中应用。产生肿瘤抗原的主要障碍包括免疫原性不足和肿瘤异质性。肿瘤细胞裂解物、RNA、肽、病毒和微生物载体以及肿瘤细胞，可以作为肿瘤抗原的来源。临床试验的信息可能不足以确定哪种抗原或抗原集合是更好的选择。不会使用单一抗原或一组抗原来治疗每种类型的癌症。含有相同抗原的疫苗的效力因所治疗的恶性肿瘤而异，这从现有的有限临床试验数据中可以看出。此外，CV佐剂也遇到了许多挑战。FDA仅批准了少量佐剂，并对CVs有限制。此外，大多数FDA批准的佐剂机制不确定，这进一步复杂了CVs的开发。治疗性CVs在癌症免疫疗法中扮演着越来越突出的角色，这从基础科学和临床研究中的鼓舞人心的发现中可以看出。然而，迫切需要改进疫苗技术，这可能涉及将它们与检查点抑制剂或其他技术结合起来，以抵消肿瘤的免疫抑制。尽管许多疫苗在产生肿瘤特异性免疫反应方面显示出效力，但它们在引发临床反应方面并未成功。必须考虑每个步骤的各种限制因素，包括肿瘤抗原、疫苗佐剂、递送方法和组合策略，因为这些未解决的问题限制了治疗性疫苗的有效性。CVs作为长期癌症治疗方案的潜在基石具有很大的希望。它们提供了一个可以轻松与现有药物集成的平台，表现出低毒性，并具有迄今为止已广泛研究的疫苗中观察到的理想安全特性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:核酸技术彻底改变了疫苗开发，使得RNA和DNA疫苗的设计和生产能够快速进行，以预防和治疗疾病。针对COVID-19的mRNA和质粒DNA疫苗的成功部署进一步验证了这项技术。目前，由于其更高的有效性，mRNA平台占据主导地位，而DNA平台正在快速进化，因为它拥有独特的优势，有可能克服与mRNA平台相关的问题。为了帮助理解这两种疫苗平台的最新表现，并认识到它们在未来的临床潜力，本综述比较了文献中目前已知的mRNA和DNA疫苗的优势和缺点，包括开发时间线、财务成本、分发便利性、有效性、安全性和产品的监管批准。此外，综述还讨论了正在进行的临床试验、改进策略，以及RNA和DNA平台的替代疫苗设计。 1.引言 核酸疫苗因其在临床试验中对多种疾病（包括癌症和SARS-CoV2等病毒感染）的治疗或预防显示出有希望的结果，最近受到了极大关注。与传统的基于蛋白质或病毒的疫苗相比，核酸疫苗拥有众多优势，这些优势已经并将继续使它们成为疾病控制和治疗最有希望的平台。与基于蛋白质和病毒的疫苗生产所需的在孵化鸡蛋或培养细胞中的漫长过程不同，核酸疫苗的开发和制造简单快捷，并且可以迅速扩大生产规模，特别是在应对新兴大流行病时。核酸疫苗的生产过程中不包含传染性病原体，这也消除了不完全灭活病毒或纯化的问题，并确保了它们在人类中的安全性。此外，核酸疫苗的基因序列可以轻松修改以针对特定病原体和疾病，使它们能够适应新兴传染病和快速演变的病原体，或者适应癌症等异质性疾病中的个性化疫苗。除了安全性和生产便利性，核酸疫苗能够通过MHC I类和II类分子呈现抗原，并诱导宿主免疫系统的细胞和体液反应，而蛋白质疫苗在诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应方面效率较低，激活这些细胞需要MHC I分子呈现抗原。同样重要的是，核酸疫苗避免了当前基于鸡蛋的疫苗中病毒适应在鸡蛋中复制的问题，这可能导致关键抗原位点的变化，干扰保护性免疫反应。核酸疫苗的另一个优势是，与基于蛋白质或病毒的传统疫苗相比，它们在最终溶液产品中的添加剂更少。传统疫苗的溶液通常含有MF59、铝盐和CpG等佐剂。Saponin作为佐剂被添加到Novavax（一种针对COVID-19的蛋白质亚单位疫苗）的溶液中。Thimerosal有时被用作传统疫苗的防腐剂，以防止细菌或真菌污染。尽管没有证据表明疫苗中使用Thimerosal是有害的，但公众担心Thimerosal可能导致儿童自闭症等神经系统疾病。相比之下，Moderna或Pfizer的COVID-19 mRNA疫苗的溶液中不包含额外的佐剂或防腐剂。用于mRNA传递的脂质纳米颗粒（LNPs）也作为疫苗佐剂。此外，疫苗溶液通常含有稳定剂。明胶是病毒疫苗溶液中常用的稳定剂（例如，Flumist®用于流感，M-M-R® II用于麻疹、腮腺炎和风疹，Varivax®用于水痘）以保护病毒在制造和运输过程中免受冻干或解冻的损害。接种疫苗的患者血液中可能产生抗明胶抗体，这可能导致严重的过敏反应。Polysorbate 80是另一种用于基于蛋白质和病毒的疫苗（例如，HPV疫苗、Novavax和J&J/Janssen COVID-19疫苗）溶液中的稳定剂，也可能在一些患者中引起过敏反应。相比之下，Moderna和Pfizer的COVID-19 mRNA疫苗使用蔗糖作为mRNA疫苗溶液中的稳定剂，没有数据显示蔗糖的存在与任何疫苗相关的不良反应有关。然而，需要注意的是，mRNA疫苗含有聚乙二醇（PEG）在脂质纳米颗粒中用于稳定脂质结构，这被认为是引起mRNA疫苗在临床上观察到的严重过敏反应的潜在因素之一。为了解决这个问题，已经开发了新的聚合物，如聚（寡（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸酯）（POEGMA）作为PEG的替代品，可能稳定LNPs并减少免疫原性（见第2.4.2节）。 目前，两种主要类型的核酸疫苗在研究实验室和临床上越来越受到关注，分别是DNA疫苗和RNA疫苗，它们分别以DNA和mRNA作为主要疫苗成分。RNA和DNA疫苗都通过使用宿主自身的蛋白质合成机制来产生“抗原”，这些抗原是病毒或致病细胞表面可以被宿主免疫系统识别并触发免疫原特异性免疫反应的免疫原性蛋白。这个过程模仿了自然感染而不引起疾病，允许身体以受控的方式发展免疫力。DNA疫苗通常通过将编码抗原的基因片段克隆到一个圆形载体中（如质粒和微环DNA）来创建，这些载体可以在哺乳动物细胞中高效表达，并通过肌肉内和皮内注射等途径将修饰后的DNA构建物传递给宿主。宿主细胞，例如肌肉内传递中的肌细胞，将摄取DNA，读取其序列中的遗传信息，并合成编码的抗原（图1）。RNA疫苗可以通过mRNA和其他RNA载体（如自复制RNA和环状RNA（见第3.3节））来创建。在这种情况下，RNA而不是DNA负责携带生产抗原所需的遗传信息。在抗原呈递细胞（APCs）如树突状细胞（DC）和巨噬细胞的帮助下，产生的抗原被宿主免疫系统识别为外来物，并将对其产生免疫反应。对于抗病毒疫苗，将产生能够识别和中和病毒的抗体。对于所有疫苗，T细胞也被激活以帮助破坏感染的细胞或带有目标抗原的细胞。 RNA和DNA疫苗都需要被传递到细胞中以表达抗原。单独的裸DNA已在许多临床试验中作为疫苗使用，并被证明是有用的，尽管需要进一步提高裸DNA疫苗的传递效率和因此的免疫原性，以扩大其应用。与通常直接注射到宿主中的DNA疫苗不同，RNA疫苗（例如mRNA）通常被包裹在脂质纳米颗粒（LNPs）中，这有助于保护RNA并促进其进入细胞和内质网逃逸。这些LNPs通常是免疫原性的，并表现出对RNA疫苗的重要佐剂作用。在被注射部位附近的细胞摄取后，RNA从LNPs中释放出来，进入细胞的细胞质中进行后续的翻译和呈递过程，这些过程与DNA疫苗相似（图1）。 图1. mRNA和DNA疫苗的作用途径。（1）mRNA和DNA疫苗可以通过肌肉注射或其他方法给药，之后疫苗将被宿主的体细胞内化（2）。mRNA和DNA疫苗编码抗原的遗传信息，并依赖宿主自身的蛋白质合成机制来产生抗原。mRNA需要在进入宿主细胞后从其递送载体中释放出来，例如LNP，然后直接翻译成蛋白质抗原。质粒DNA疫苗需要被运送到细胞核中，DNA中的遗传信息才能被读取并转录成mRNA。之后，mRNA从细胞核中出来并翻译成编码的蛋白质抗原。（3）合成的抗原被转移到抗原呈递细胞（APCs）中，这些细胞迁移到次级淋巴器官，通过MHC分子与T细胞受体（TCR）之间的相互作用以及共刺激分子之间的相互作用（例如APC表面的CD86和T细胞上的CD28等受体）来（4）激活T细胞。激活的CD4+ T细胞分泌促炎细胞因子以激活负责（5）建立针对抗原的体液免疫反应的B细胞。 RNA和DNA疫苗平台在包括寨卡病毒、流感、狂犬病等疾病的临床前和临床研究中都显示出了有希望的结果。正在进行的DNA和RNA疫苗的大量临床试验强调了它们在未来医学中的重要角色。然而，这两种疫苗平台也有限制，这些限制目前阻碍了它们充分发挥潜力，并在临床试验中造成了许多失败。由于这两种疫苗在疫苗接种中相对较新，缺乏来自已完成的后期临床试验的足够支持数据，而且目前可用的长期安全性和有效性数据非常有限，因此很难判断哪一种在临床使用中具有更大的潜力。此外，这两种方法都在不断地被开发和优化，这增加了未来DNA和RNA疫苗之间胜者的不确定性。 迄今为止，大多数数据都是通过质粒DNA和基于mRNA的疫苗产生的。因此，本综述聚焦于讨论和比较当前质粒DNA和mRNA疫苗的成就和正在进行的发展，尽管也提到了其他平台。目的是提供洞见，了解它们在预防和治疗疾病方面可能产生重大影响的潜力。 2.mRNA和DNA疫苗的优势和考虑因素 mRNA疫苗高效、安全且多功能。最近，由于在COVID-19大流行期间成功应用于减少可能导致患者住院或死亡的严重病例，它们成为了热门话题。这一成功也减弱了对DNA疫苗的热情。 尽管目前产生的热情较少，DNA疫苗有一些独特的优势，可能克服mRNA疫苗的局限性。它们在热稳定性上更强，保质期更长。因此，它们不需要冷链基础设施进行运输和储存，这降低了疫苗分发的成本，并允许在基础设施有限的地区获得疫苗。此外，DNA疫苗可以在细胞中提供比mRNA更持久的基因表达，这可能会延长对抗原的免疫反应。DNA疫苗更便宜且更容易扩大生产规模。此外，裸DNA疫苗可以直接交付，而不需要与生物材料（如LNPs）包装，这与mRNA疫苗相比进一步简化和降低了设计和制造过程的成本。没有包装材料中的炎症因子，DNA疫苗更安全，因为它们会引起较少的不良副作用。 此外，最近一项关于COVID-19疫苗的临床前研究表明，DNA和mRNA平台之间存在不同的免疫反应。DNA疫苗触发了更强的T细胞反应，而mRNA引发了更强的体液反应，这表明每个平台可能特别适合针对特定疾病。为了深入理解两种疫苗接种方法，我们从几个不同的方面系统比较了mRNA和DNA疫苗的优势和劣势：开发时间线和财务成本、储存和运输要求、剂量和保护效力、监管批准以及安全性和副作用。 2.1.开发时间线和财务成本 与mRNA和DNA疫苗的设计和生产相关的时间和财务成本取决于各种因素，如病原体类型、监管要求和全球需求。这两种疫苗平台有很多共同点。与传统的基于蛋白质和病毒的疫苗相比，它们的生产相对较快，因为它们的生产不需要使用受精鸡蛋或培养细胞。mRNA和DNA疫苗都需要一个类似的初始步骤，即确定正在开发的疫苗的抗原的基因序列（图2）。对于DNA疫苗，基因序列将被克隆到DNA载体中，如质粒DNA，并伴有选定的启动子和增强子以实现优化的转录。DNA载体首先在细菌中扩增，然后从细菌培养中收获。分离和纯化后，它们被重新溶解在水溶液中，准备用于给药。 图2. mRNA和DNA疫苗的生产。（左）生产mRNA-LNP疫苗的一种常见方法。（1）将目标抗原的遗传序列插入到一个环形DNA载体中。（2）然后在细菌中扩增环形DNA并分离出来。（3）线性化环形DNA模板后，遗传序列被（4）体外的噬菌体聚合酶转录成mRNA，并且（5）通过高性能液相色谱（HPLC）纯化mRNA转录本。（6）mRNA与脂质在微流体混合器中迅速混合，导致mRNA被脂质瞬间包裹并沉淀为自组装的纳米颗粒（mRNA-LNPs）。（7）通过透析或过滤纯化mRNA-LNP溶液，以去除非水溶剂和未包裹的mRNA。（8）纯化的mRNA疫苗产品在无菌瓶中包装，供使用前准备。（右）生产DNA疫苗的一种方法。（1）将目标抗原的遗传序列插入到质粒DNA载体中。（2）然后在细菌中扩增质粒DNA并分离出来。（3）通过HPLC纯化质粒DNA后，（4）得到的DNA疫苗产品在无菌瓶中包装，供使用前准备。 mRNA疫苗的设计需要相同的初始步骤，即基因序列鉴定。但是，mRNA疫苗的生产涉及更多的步骤，因为它依赖于双链线性DNA作为模板，如线性化的质粒DNA，其本身可以作为DNA疫苗。模板包含感兴趣的序列和通常来源于T3、T7或SP6噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶启动子。mRNA是通过体外转录（IVT）从模板产生的。通过在DNA模板的3′端包含或在IVT后通过酶反应，将聚(A)尾添加到mRNA转录本。由于mRNA分子不稳定，并且在宿主内给药后高度易受核酸酶降解，裸mRNA很少用作疫苗。相反，mRNA被包裹在纳米颗粒（NPs）中，如LNPs，以稳定mRNA，保护其免受降解，并促进其进入细胞。用于mRNA疫苗的LNPs，如针对COVID-19大流行的Comirnaty（辉瑞-BioNTech）和Spikevax（Moderna），通常包含4种不同类型的脂质：可电离阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。脂质与纯化的mRNA在微流体混合器中迅速混合，形成mRNA-LNP复合物。经过透析或过滤以去除未复合的成分后，mRNA-LNP重新分散在通常含有磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或Tris（三甲胺）（pH 7-8）的盐溶液中。NPs的设计和筛选是耗时的，因为已经开发了成千上万的NPs用于不同的目的，选择最佳的一种用于特定的mRNA疫苗取决于目标组织/器官和细胞类型、mRNA大小和序列、期望的佐剂作用以及可接受的炎症水平。通过传统实验筛选NP库是识别特定设置中最佳配方的常见方式，但可能成本高昂且耗时。随着机器学习和计算方法的最新进展，这一问题可以得到缓解，这些进展有潜力显著加快这一过程并降低成本。 除了NPs的设计和筛选，通常用于LNPs的材料，如可电离脂质，可能很昂贵。Moderna mRNA疫苗的脂质成本为每剂2.85美元。从2020年7月到2022年7月，美国政府花费了253亿美元购买辉瑞和Moderna COVID-19疫苗，平均每剂20.69美元。没有政府支持，美国那些无保险和保险不足的个人可能面临财务障碍。生活在低收入和中等收入国家的人的成本障碍将更高。mRNA疫苗的成本效益因此仍然是一个问题，需要解决。 由于不需要LNPs，DNA疫苗的开发和生产成本明显低于mRNA疫苗，但由于与临床前和临床试验以及政府法规相关的成本，仍然不特别便宜。在印度获批紧急使用的COVID-19 DNA疫苗ZyCov-D的报告价格为每剂3.57美元。 随着越来越多的mRNA和DNA疫苗进入临床试验和公共使用，预计它们的价格将下降，但也应该考虑大幅降低设计、制造和原材料成本的策略，特别是对于mRNA-LNP疫苗。 2.2.运输和储存要求 为了防止mRNA和LNPs的结构变化，mRNA疫苗必须在（超）低温下长期储存和运输。目前Moderna和辉瑞的COVID-19 mRNA疫苗分别需要在-15至-25°C和-60至-90°C之间冷冻储存。对于短期储存，Moderna mRNA COVID-19疫苗在室温下稳定长达12小时，在2-8°C下稳定长达30天；辉瑞-BioNTech mRNA COVID-19疫苗在室温下稳定长达2小时，在2-8°C下稳定长达5天。两种疫苗的温度要求差异的确切原因尚待确定。此外，已经表明，在25°C下储存7天的mRNA LNPs导致转基因表达比在-30°C下储存的减少90%以上。 关于mRNA疫苗在延长储存期间的稳定性以及LNPs中mRNA封装对疫苗稳定性的影响，公开可用的数据很少。保持mRNA疫苗在（超）低温下增加了储存和运输的成本，并限制了mRNA疫苗在全球所有地区或国家的可获得性。这可能导致疫苗获取的不平等，导致疫苗接种率和医疗结果的不均衡。解决这个问题的一个潜在解决方案是对mRNA-LNPs进行冻干，因为Muramatsu等人已经证明冻干的mRNA-LNPs可以在室温下保持物理化学稳定性长达12周，在4°C下超过24周，而不损害它们在小鼠中的免疫原性。Popowski等人也表明，冻干的mRNA疫苗干粉在室温下稳定一个月。在含有蔗糖的溶液中储存mRNA-LNP产品也可以提高其稳定性。为确保有效的全球分发，疫苗应具有足够长的保质期，理想情况下在冰箱可达到的温度（2-8°C）或以上。在这方面，DNA疫苗比mRNA疫苗更好，因为DNA的卓越热稳定性允许它们在4°C甚至环境温度下运输和储存，使它们成为控制资源有限的发展中国家和农村地区传染病传播最有希望的候选疫苗。例如，在印度获得紧急使用授权的COVID-19 DNA疫苗ZyCoV-D，可以在2-8°C下储存，并且在至少三个月内稳定在25°C，保留美国食品药品监督管理局（FDA）要求的所有规格。乙型肝炎的重组DNA疫苗（Engerix-B）可以在45°C下储存一周或在37°C下储存一个月。涉及138名健康成年人的临床研究结果表明，与在4°C的正常储存条件相比，这两种储存方式都没有改变疫苗诱导的保护性抗体滴度。DNA疫苗的显著热稳定性使得运输和储存变得容易，减轻了与冷链要求相关的挑战，并最小化了因冷链中断而导致的疫苗浪费风险。 2.3.剂量和保护效力 当前的DNA疫苗在临床试验中比mRNA疫苗具有更低的效力，并且需要更高的剂量来产生有效的免疫反应。对于初次接种COVID-19疫苗（附录表1），辉瑞的mRNA疫苗以两剂，每剂30微克的形式给予，Moderna mRNA疫苗包含两剂100微克的剂量；相比之下，ZyCoV-D被批准为三剂方案，每剂含有2毫克质粒DNA，分别是辉瑞和Moderna疫苗mRNA剂量的100倍和30倍。据报道，ZyCoV-D的两剂方案，每剂3毫克，在临床试验中产生了相当的保护，但低于6毫克的总剂量仍需验证有效的疫苗接种。 最初的单价Moderna和辉瑞mRNA疫苗在2020年的3期临床试验中对COVID-19的效力相似（附录表1），Moderna疫苗在预防COVID-19疾病方面的有效性为94.1%，在预防严重病例方面的有效性为100%，辉瑞疫苗在预防COVID-19方面的有效性为95%。然而，尽管使用了更高的剂量，ZyCoV-D的效力较低——在接种两剂后预防COVID-19的有效性为66.6%，在预防严重和中度病例方面的有效性为100%（附录表1）。值得注意的是，ZyCoV-D的3期临床试验发生在印度Delta株流行期间，这可能是单价DNA疫苗相对较低效力的直接原因。 两种疫苗平台之间在剂量和效力方面的巨大差异主要是由于DNA传递在启动抗原生产之前的细胞内障碍更大。无论注射途径如何，DNA疫苗都需要克服细胞膜和核膜的生理屏障，才能到达细胞转录机制。之后，从DNA转录的mRNA离开细胞核并在细胞质中进行翻译。相比之下，mRNA疫苗在被翻译成目标抗原之前不需要到达细胞核，LNP配方中的可电离阳离子脂质可以大大促进细胞表面的跨膜运输和细胞内mRNA的内质网逃逸。因此，开发策略以克服DNA疫苗传递的生理屏障对于提高其效力和减少所需剂量至关重要。 基于mRNA和DNA疫苗治疗癌症的临床数据也已经发表，尽管与COVID-19疫苗研究相比，涉及的患者数量较少。在针对多种自体癌症的1/2期试验（NCT03480152）中，包括肝细胞癌（HCC），编码新抗原的mRNA疫苗每两周肌肉注射一次，最多4剂，剂量为0.13毫克或0.39毫克。所有接种疫苗的患者（100%，2名患者中的2名在任何剂量水平）显示出循环抗原特异性T细胞的增加。然而，他们中没有人（在任何剂量水平）显示出对治疗的临床反应（客观肿瘤退缩）。 在完成的1期研究（NCT00199849）中，使用NY-ESO-1质粒DNA疫苗（pPJV7611）治疗表达NY-ESO-1或LAGE-1抗原的各种肿瘤患者，如非小细胞肺癌（NSCLC）。参与者在近距离的不同位置通过粒子介导的表皮传递接受pPJV7611。第一组参与者接受了4×1微克pPJV7611在4个不同位置的传递；第二组参与者接受了8×1微克pPJV7611在8个位置的传递；第三组参与者接受了2×4微克pPJV7611在2个不同位置和4个不同时间（第1、3、5和8天）的传递。治疗在4周和8周后重复。研究报告表明，在第一次疫苗治疗后13周，所有三个队列中对肿瘤反应的受试者数量为0（0.0%）。在多达13周内具有NY-ESO-1特异性CD4+T细胞免疫的受试者数量分别为第一队列3（100.0%），第二队列5（83.3%），第三队列7（100.0%）。在多达13周内具有NY-ESO-1特异性CD8+T细胞免疫的受试者数量分别为第一队列1（33.3%），第二队列0（0.0%），第三队列1（25.0%）。 这些研究中取得的有限效力可能归因于给予患者的质粒DNA或mRNA疫苗的低剂量以及缺乏与其他免疫治疗剂的联合使用；否则，在临床研究中观察到了有利的结果。在针对晚期HCC的1/2期试验（NCT04251117）中，一种编码多达40个新抗原的个性化治疗性癌症DNA疫苗（GNOS-PV02）与编码白介素-12（pIL12）的质粒共同配制，并以1毫克GNOS-PV02和0.34毫克pIL12的剂量每3周一次皮内注射给参与者，随后进行电穿孔。在前四次治疗中，参与者接受了1毫克GNOS-PV02和0.34毫克pIL12的剂量，随后每9周一次直至第二年结束，之后每12周一次直至第五年结束。此外，参与者每3周接受一次200毫克的PD-1抑制剂pembrolizumab治疗，为期2年。治疗结果很有希望，因为新抗原特异性T细胞反应率为86.4%（22名可评估患者中的19名），客观反应率为30.6%（36名患者中的11名），其中8.3%（36名患者中的3名）实现了完全反应。 在另一项1/2期研究（NCT03164772）中，NSCLC受试者要么接受Durvalumab（一种抗PD-L1抗体）和包含6个编码不同肿瘤相关抗原（MUC1、Survivin、NY-ESO-1、5 T4、MAGE-C2和MAGE-C1）成分的BI 1361849 mRNA疫苗的联合治疗（A组），要么接受Durvalumab、Tremelimumab（一种抗CTLA-4抗体）和BI 1361849 mRNA疫苗的联合治疗（B组）。BI 1361849 mRNA疫苗的每个成分分别以80微克的剂量给予两次。在研究期间，每位参与者共接受了12次mRNA皮内注射（总共960微克mRNA）。A组估计的中位无进展生存期为2个月，B组为1.8个月。在第8周无进展的受试者数量分别为A组11（47.8%）和B组11（32.4%）。这些数字在8周到第24周之间随时间单调下降。 2.4.不良事件和安全数据 2.4.1.常见观察到的不良事件 mRNA和DNA疫苗相关的不良事件（AEs）通常与注射外来物质有关，如核酸、水溶液和脂质纳米颗粒（LNPs），尽管在一些研究中，ZyCoV-D疫苗注射相关的AEs低发生率归因于使用无针皮内注射系统而非针头。大多数mRNA或DNA疫苗接种相关的AEs轻度至中度。大多数可用数据基于COVID-19疫苗的临床研究。比较两种平台COVID-19疫苗的表现，DNA疫苗在诱发和非诱发AEs的严重程度和发生率方面比mRNA疫苗展现出更好的安全档案。在mRNA-1273的3期临床试验（附录表2）中，接种组比安慰剂组更频繁地报告诱发AEs，第一剂后（87.8%对48%）和第二剂后（92.2%对42.8%）。并且局部和全身AEs的严重程度和发生率在第二剂后比第一剂后增加。在ZyCoV-D的3期临床试验（附录表2）中，接种组（4.49%）和安慰剂组（4.47%）之间诱发AEs的发生相似。中期分析还表明，疫苗作为加强剂对接受者来说耐受性良好，因为与第一剂相比，第三剂后AEs的频率没有增加，大多数报告的事件是在第一剂而不是第二剂或第三剂后。这与mRNA-1273试验的结果形成对比，表明重复接种会引发更强的诱发AEs。mRNA-1273和ZyCoV-D的非诱发AEs与相应的安慰剂组相似，但mRNA-1273的发生率高（23.9%）比ZyCoV-D试验（3.27%）。有趣的是，尽管ZyCoV-D使用的核酸剂量是mRNA-1273的30倍，但ZyCoV-D的AEs严重程度和发生率更低。这可能归因于mRNA-1273中使用的LNP在ZyCoV-D中不存在。然而，重要的是要注意，这两项临床试验由不同的科学家在不同的国家和人类群体中进行，这可能会使不同疫苗报告的AEs之间的比较复杂化。与ZyCoV-D类似，另一种DNA疫苗COVID-eVax在1期试验中显示出在第二次免疫后全身和局部诱发AEs的发生率比第一次后低。第一次后局部为35-87%，全身为40-50%，第二次后局部为20-55%，全身为30-45%，取决于疫苗剂量。这些发生率高于ZyCov-D，可能由于COVID-eVax使用了不同的给药程序：肌肉内针头注射后通过移动电脉冲发生器进行电穿孔，这些程序更具侵入性和炎症性。DNA疫苗作为加强剂比mRNA疫苗更易被耐受的原因尚不清楚，了解它们的分子机制对于设计更好的平台很重要。对于mRNA和DNA疫苗在预防除COVID-19以外的疾病方面的安全性数据也有一些，但不多。例如，一项mRNA疫苗已在临床试验中用于预防狂犬病。在10%的接受者中观察到3级全身AEs，这些被归因于mRNA疫苗的炎症特性。 2.4.2.其他安全问题 除了常见的AEs外，关于DNA疫苗的一个主要担忧是其可能被整合到受体细胞的基因组中，因为它们需要进入细胞核以表达抗原。已经进行了大量研究以确定DNA整合到人类染色体的风险，从而激活致癌基因或增加染色体不稳定性。这些研究的数据表明，这种风险低于由自发基因组突变引起的风险。人类临床试验研究进一步证实了DNA疫苗的安全性和耐受性，尽管仍需要更多的长期临床数据来完全解决这一安全问题。另一方面，mRNA疫苗在患者中相对安全，因为它们在宿主中的保留时间相对较短，mRNA不太可能进入细胞核。对于mRNA疫苗，超敏反应是一个主要问题。它们是由某些材料如非天然脂质的传递载体引起的。在一项临床前研究中，Ndeupen等人表明，一些已经过仔细表征并在临床前mRNA疫苗研究中广泛使用的商业LNPs具有高度炎症性，并导致动物中高死亡率（约80%）。还有临床证据表明，COVID-19的一些mRNA疫苗中的聚乙二醇（PEG）可以诱导血液中的抗PEG抗体，导致过敏反应。然而，报告的结果相互矛盾。Carreno等人的研究表明，BNT162b2接种患者的血清中未检测到PEG特异性抗体，并且过敏反应与mRNA-1273诱导的抗PEG抗体之间没有明显的相关性。此外，mRNA疫苗接种诱导的抗PEG抗体对疫苗效力的影响仍然未知。Kozma等人的一项研究表明，这些抗PEG抗体可能会降低疫苗效力，而Guerrini等人和Ju等人的其他研究表明，抗PEG抗体对mRNA疫苗产生的抗刺突中和抗体没有影响。因此，PEG对mRNA疫苗的潜在不良影响仍然是一个活跃的研究和辩论领域。需要更多的研究和监测数据来对这个问题得出明确结论。与此同时，已经开发了下一代PEG衍生物，如POEGMA，作为改善药物和基因传递的替代聚合物。这些聚合物具有与PEG相似的功能属性，但引起的抗PEG抗体较少。它们可能被用来稳定mRNA疫苗。mRNA和DNA疫苗的另一个潜在安全问题与反复接种可能产生的抗mRNA或DNA反应和诱导全身自身免疫疾病有关。但发表的研究有限，以解决这个问题。一项关于癌症DNA疫苗的1期临床试验报告称，在66名注册患者中，没有检测到抗双链DNA抗体或PBMCs中的质粒，并且报告称没有接受者出现自身免疫疾病的症状，但需要更大规模的临床研究的证据来完全解决这一问题。总体而言，迄今为止mRNA和DNA疫苗显示出良好的安全档案，并且由于安全问题而退出临床试验的疫苗候选者很少。有必要进行更多的研究和分析，以全面评估安全方面，为在行业和临床中建立更好的标准和法规。 2.5.临床使用的批准 由Zydus Cadila开发的ZyCoV-D获得了印度药品监管总局（DCGI）在2021年8月批准的紧急使用限制，迄今为止，它是唯一获得批准的DNA疫苗。它包含一个编码SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白和免疫球蛋白E（IgE）信号肽的单一质粒DNA，以促进转染细胞的分泌。 康希诺（研究名称：BNT162b2）由辉瑞-BioNTech开发，于2020年12月获得美国FDA的紧急使用授权（EUA），适用于成人，并于2021年8月获得同一机构的批准，用于预防16岁及以上个体的COVID-19。斯皮克瓦克斯（研究名称：mRNA-1273）由Moderna开发，于2020年12月获得美国FDA的EUA，适用于18岁及以上个体。其在成人中的完全批准于2022年1月获得。斯皮克瓦克斯和康希诺及其后续加强疫苗的更详细的临床试验和批准历史在图3中说明。到目前为止，它们是唯一获批用于常规临床使用的mRNA疫苗。更多的DNA和mRNA疫苗用于预防和治疗许多其他疾病，目前处于不同的临床试验阶段，并已显示出令人兴奋的疗效和安全数据。我们将在第3.1节中更详细地讨论正在进行和已完成的临床试验。作为首批展示强大保护效果并获得批准的疫苗，mRNA疫苗在COVID-19大流行期间受到了公众和研究领域的前所未有的关注。它们在大流行情况下的历史性批准以及后来在预防疾病传播方面的出色表现，使它们立即比DNA疫苗处于更有利的位置。当前的资金和研究重点显然倾向于mRNA疫苗，原因之一是更高的效力和较少的公众对基因插入突变的担忧。然而，考虑到上述讨论的所有DNA疫苗的独特优势，mRNA疫苗的成功不应成为忽视DNA疫苗的理由。同样，正如我们社会在应对COVID-19大流行中的经验所证明的那样，平行开发多种替代疫苗平台也很重要，在大流行之前，mRNA疫苗也基本上被忽视，不被认为是与基于蛋白质和病毒的疫苗相竞争的。 图3. COVID-19 mRNA和DNA疫苗的临床试验及里程碑。辉瑞-BioNTech于2020年4月开始对其COVID-19 mRNA疫苗候选物BNT162b2进行I/II期临床试验，随后在2020年7月进行了II/III期试验。BNT162b2（商品名：Comirnaty）是首个获得美国紧急使用授权（EUA）的COVID-19疫苗——成人使用的EUA于2020年12月授予。2021年8月，FDA完全批准Comirnaty用于16岁及以上个体。Moderna于2020年3月开始对其COVID-19 mRNA疫苗候选物mRNA-1273进行I期临床试验，5月进行II期试验，7月进行III期试验。美国FDA于2020年12月授予mRNA-1273（商品名：Spikevax）紧急使用授权，紧随Comirnaty之后获得紧急使用授权。2022年1月，FDA完全批准Spikevax用于成人。印度制药公司Zydus Cadila于2020年7月开始对其COVID-19 DNA疫苗候选物ZyCoV-D进行I/II期临床试验，并于2021年1月进行III期试验。2021年8月，印度药品监管总局（DCGI）批准ZyCoV-D在印度限制性紧急使用。 3.mRNA和DNA疫苗的正在进行开发 本节重点讨论已完成和正在进行的mRNA和DNA疫苗的临床试验结果，这些结果可能影响它们未来的临床使用，改进空间，以及新平台的开发。 3.1.已完成和正在进行的临床试验 尽管目前获批的mRNA和DNA疫苗仅用于COVID-19，但正在进行的研究正在扩大它们的应用范围，以应对其他疾病。在COVID-19 mRNA和DNA疫苗取得胜利后，核酸疫苗（图4）的临床试验数量和规模都有了显著增加。 图4. mRNA/DNA疫苗技术的临床应用。mRNA和DNA疫苗已在临床试验中广泛测试，用于治疗癌症和预防传染病，如SARS-CoV-2、流感、呼吸道合胞病毒（RSV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、寨卡病毒（ZIKV）。目前涉及传染病临床试验的mRNA和DNA疫苗编码一种或少数几种蛋白（抗原），例如SARS-CoV-2的刺突蛋白、流感的血凝素（HA）、RSV的融合（F）糖蛋白、HIV的包膜（Env）蛋白、寨卡病毒的前膜和包膜（prME）蛋白以及寨卡病毒类病毒颗粒（VLP）。对于当前临床试验中的癌症疫苗，mRNA和DNA编码的蛋白包括个性化的新抗原、致癌病毒抗原（例如HPV E6和E7致癌蛋白）以及肿瘤相关抗原（TAA）。此外，mRNA和DNA已被用作遗传佐剂，编码细胞因子，如白介素-12（IL-12）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），以增强对抗原的免疫反应。 3.1.1.mRNA疫苗的临床试验 mRNA疫苗涉及的临床试验目标包括流感、疟疾、呼吸道合胞病毒（RSV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、巨细胞病毒（CMV）、结核病、狂犬病和寨卡病毒（ZIKV）（附录表3）。此外，mRNA疫苗已在临床上用于癌症治疗，如非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌、胰腺腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌等（附录表3）。 在撰写本综述时，目前有301项mRNA疫苗的临床试验正在进行，15项试验已被终止或暂停，129项已完成。它们大多数处于1期、2期或1/2期。所有24项已完成的3期或4期试验都与SARS-CoV-2有关。目前在3期试验中活跃并有积极中期结果的候选疫苗之一是Moderna的mRNA-1345（ConquerRSV），用于对抗RSV感染。该疫苗基于LNP平台，编码一种名为预融合F糖蛋白的RSV蛋白。尽管大多数以前的针对RSV的mRNA疫苗临床试验由于中和抗体产量不足而失败，Moderna最近（2023年1月）宣布了其ConquerRSV 3期关键效力试验的积极数据，涉及超过37,000名60岁及以上的成年人，声称“已经实现了主要效力终点，包括针对RSV相关的下呼吸道感染（RSV-LRTD）的疫苗效力为83.7%（95.88% CI：66.1%，92.2%；p < 0.0001），如定义的两个或更多症状。”2023年1月，美国FDA授予mRNA-1345突破性疗法认定，适用于60岁及以上的成年人。辉瑞和Moderna都已启动了基于mRNA的流感疫苗的临床研究。mRNA-1010是Moderna评估的五种流感疫苗候选之一，是一种四价疫苗，编码来自四种季节性流感病毒的血凝素（HA）蛋白，包括A/H1N1、A/H3N2、B/Yamagata和B/Victoria谱系。2023年2月，Moderna宣布了mRNA-1010 3期临床试验的中期安全性和免疫原性结果。根据新闻稿，与活性疫苗对照相比，mRNA-1010在A/H3N2和A/H1N1的血清转换率上表现出优越性，在A/H3N2的几何平均滴度（GMT）比率上表现出优越性，并且在A/H1N1的GMT比率上表现出非劣性。然而，对于流感B/Victoria和B/Yamagata谱系菌株，血清转换率或GMT比率的非劣性未达到。另一种四价流感疫苗候选是辉瑞开发的modRNA。正在进行的一项3期主动对照研究（NCT05540522）涉及53,200名参与者，旨在评估modRNA的安全性和效力，并预计将在2024年完成。 3.1.2.DNA疫苗的临床试验 DNA疫苗的临床试验针对的传染病包括SARS-CoV-2、寨卡病毒、乙型肝炎、流感、HIV等（附录表4）。值得注意的是，DNA疫苗在临床试验中用于治疗癌症已有相对较长的历史，如三阴性乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、人乳头瘤病毒（HPV）、宫颈癌和卵巢癌（附录表4）。但很少有完成和正在进行的癌症DNA疫苗试验通过了2期。 一个例子是针对晚期、erb-b2受体酪氨酸激酶2（ERBB2）阳性乳腺癌的治疗性DNA疫苗（pNGVL3-hICD）的1期试验，共有66名患者。该试验在2001年至2010年间在美国华盛顿州的Fred Hutchinson癌症中心进行，监测疫苗毒性10年。试验中使用的疫苗是一种质粒DNA，编码ERBB2的细胞内域（ICD）；它以递增剂量（10 μg、100 μg、500 μg）皮内注射，固定剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）蛋白（100 μg）作为佐剂。结果分析表明，大多数患者对ERBB2 ICD的1型免疫反应呈剂量依赖性；反应显著且持久，并与外周血液中中央记忆T细胞的增加相关。疫苗在患者中耐受性良好——大多数与疫苗相关的AEs为1级和2级。在患者的PBMCs中未检测到抗双链DNA抗体或疫苗质粒，并且没有接受者出现自身免疫疾病的症状。在根据不同剂量组的73.5-118.6周的中位随访期间，只有一名患者（在100 μg剂量组）在注册后2.2年发展为可能与疫苗接种相关的淋巴细胞性结肠炎。接种疫苗后一年以上观察到的其他AEs不被认为是与疫苗接种相关的。这些观察结果表明，用治疗性ERBB2 ICD DNA疫苗免疫具有有利的短期和长期安全档案，以及显著、持久的Th1反应水平。因此，DNA疫苗目前正在低表达ERBB2的患者中进行随机2期试验（NCT05163223）。 直接比较DNA和mRNA疫苗的试验清楚地指出，mRNA目前比DNA更受青睐——几乎所有处于第三阶段的核酸疫苗试验都是基于mRNA而非DNA，这表明了早期mRNA试验取得了更好的结果。mRNA试验通常规模更大，表明资金更容易获得，公众对mRNA疫苗的接受率更高。然而，由于RNA和DNA平台都在快速发展，未来情况可能会改变。考虑到它们的独特优势，如果DNA疫苗的效力得到提高，特别是在针对特定疾病的应用场景中，DNA疫苗可能是一个更好的选择。 3.2.疫苗改进 核酸疫苗的历史相对较短，但仍在积极开发中，以满足广泛的应用需求，并在效力、安全性和稳定性方面进行优化。还进行了大量研究，以确定mRNA和DNA疫苗的物理、化学和生物特性，以及免疫反应的分子机制。正在进行的研究将解决当前的限制，并创造一个临床应用的格局，展示针对特定疾病mRNA和DNA最合适的平台。 3.2.1.mRNA疫苗的改进 mRNA疫苗的改进主要集中在RNA及其序列修饰、LNP递送系统、抗原的选择和组合以及佐剂。多个mRNA结构元素已成为修饰的目标，包括非翻译区（UTRs）、5′端帽、开放阅读框架（ORF）和聚（A）尾。为了减少mRNA的免疫原性并增强翻译效率，通常使用诸如5-甲基胞嘧啶（m5C）和假尿苷（ψ）核苷等碱基对修饰。这些修饰的核苷酸能够避开由干扰素（IFNs）诱导的抗病毒途径，这些途径特别针对并降解入侵的mRNA。结果，核苷酸修饰的mRNA疫苗大大增加了抗原的翻译效率，并诱导较少的非期望炎症反应。 其他修饰，如密码子优化和N1-甲基假尿苷（1 mΨ）核苷替换，也已进行以改善mRNA翻译。密码子优化是必要的，因为通过不同的密码子分配编码相同蛋白的mRNA序列可能具有截然不同的蛋白表达水平。因此，用哺乳动物细胞中常用的密码子替换稀有密码子可以增加抗原产量。 还进行了大量研究以优化mRNA疫苗的另一个重要组成部分，即LNPs。除了在生理环境中保护mRNA免受核酸酶降解和克服细胞内递送障碍外，LNPs还被发现对某些mRNA疫苗表现出强烈的佐剂活性。已经设计和使用了不同的LNPs进行mRNA疫苗制备，并且正在开发更多。选择具有上述最佳功能的同时，在人体中具有低毒性的LNP是一个复杂但值得的任务。为了避免上述LNPs的不良影响，也在探索其他mRNA递送策略，如基于细胞外囊泡、类脂材料、合成聚合物和生物材料。细胞外囊泡是自然分泌的，并被哺乳动物细胞用作细胞间通信的方式，特别是癌细胞。因此它们可以很容易地被重新用作mRNA和其他治疗剂的递送工具，具有出色的生物相容性和安全性，在某些情况下还具有组织靶向效果。 将针对不同抗原的mRNA组合在一个疫苗产品中，可能对单一病原体或一系列病原体诱导更广泛的免疫反应。最近，Arevalo等人已经证明，由20种编码不同血凝素的mRNA组成的多价mRNA疫苗可以保护动物免受所有已知的甲型和乙型流感病毒亚型。除了诱导广泛的交叉反应性免疫反应外，这种通用疫苗策略还可以大大减少针对一组病原体的疫苗接种复杂性，从而节省疫苗开发和部署所需的时间、金钱和努力。 3.2.2.DNA疫苗的改进 DNA疫苗的改进可以分为四个主要类别：抗原的选择和组合、DNA构建设计、DNA递送和佐剂的结合。 第一类别中的策略对DNA疫苗来说并不独特。它们与基于RNA的疫苗相似。目标是确定最佳抗原或抗原组合以实现有效的疫苗接种。 DNA构建设计涉及优化抗原的密码子组成、不同序列的最佳组合以递送几个抗原或融合蛋白与单一载体，以及结合特定启动子、增强子和DNA核靶向序列。例如，使用结合病毒和真核元素的混合启动子，以防止纯病毒启动子可能发生的转录沉默。一个特别针对APCs的启动子允许将抗原和佐剂表达限制在特定细胞类型，如DCs，从而防止调节细胞类型如骨髓源抑制细胞（MDSCs）的耐受。 Ross等人和Bros等人已经证明了使用Fascin-1启动子在小鼠和人类中实现DCs的转录靶向的可行性，Sudowe等人在随后的研究中将Fascin-1启动子应用于DCs靶向DNA疫苗的设计。 将不同抗原通过连接子组合在一个疫苗中，可以用来诱导广泛的CD4+/CD8+ T细胞反应。 与编码不变链的序列融合可以增强抗原加载到APCs表面表达的MHC II分子上。 DNA比mRNA更难递送，因为DNA需要进入哺乳动物细胞的核以表达抗原，这对mRNA疫苗来说不是必需的。在已经开发的不同方法中，电穿孔（也称为“电转染”）迄今为止是最有效和方便的方法。它基于脉冲电场，暂时在细胞质膜中创建孔，允许小的、不透过膜的分子进入细胞质。但较大的分子，如质粒和mRNA主要通过电脉冲触发的内吞作用进入细胞。电穿孔越来越多地用于人类临床试验，以增强DNA疫苗针对不同疾病的效果，包括SARS-Cov-2、HIV和HPV。Dross等人还使用基因枪递送DNA疫苗给猕猴，并证明了与mRNA疫苗相当的免疫反应。 用于改善DNA跨细胞膜递送的其他常见方法基于由各种材料组成的纳米载体，如脂质、聚合物、蛋白质和无机材料。还开发了策略以提高DNA跨核膜递送的效率。例如，Dean等人发现将DNA核靶向序列纳入DNA载体中，使其能够与具有核定位信号（NLS）的内源性蛋白结合，通过核孔复合体（NPCs）促进DNA进入细胞核。 抑制进入细胞的DNA疫苗的溶酶体降解也是提高疫苗效力的目标。然而，截至本综述之时，上述讨论的方法尚未获得FDA批准用于改善人类DNA疫苗递送。 第四类别的策略是将佐剂纳入DNA疫苗中，以增强APC激活和T细胞吸引及极化。佐剂可以是化学药品，如氢氧化铝，或遗传物质，如免疫刺激性的2′,3′-环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）。常见的佐剂还包括促炎细胞因子，如GM-CSF。这些细胞因子可以直接作为蛋白质添加，或通过与DNA疫苗共给药的表达载体编码。探索当前佐剂的使用和设计新的强效佐剂可以显著增强DNA疫苗的效果。同时，选择临床用途的佐剂需要额外考虑，特别是在儿童、老年人和有特殊医疗状况的个体，如自身免疫疾病、糖尿病和充血性心力衰竭患者的疫苗接种中。 3.3.核酸疫苗的替代设计 除了广泛使用的mRNA-LNP和质粒DNA平台外，还有激动人心的核酸疫苗新设计正在出现。对于RNA平台，它们包括自我复制RNA（saRNA），由于其在细胞内自我复制的能力，可以在低剂量下导致更高和更长时间的抗原产生，以及与线性RNA相比具有增强稳定性的环状RNA（图5）。DNA平台的新设计包括小圈DNA（mcDNA）和纳米质粒DNA载体，由于它们的较小骨架尺寸，它们显著提高了递送效率和抗原产生水平，以及可以在不整合到基因组中的情况下实现高抗原表达水平的环状DNA载体，因为它在染色体外停留和复制。在此，我们将讨论一些有潜力开启RNA和DNA疫苗新时代的有前景的设计。 图5. 传统mRNA疫苗与自扩增RNA（saRNA）和环状RNA（circRNA）疫苗的比较。(A) 传统mRNA呈线性格式。mRNA进入宿主细胞后（1），被核糖体用于翻译蛋白抗原（2）。同时，由于mRNA的线性结构，它们容易受到核酸酶（包括内切核酸酶和外切核酸酶）的降解（3）。因此，传统mRNA在宿主细胞中的半衰期短，蛋白抗原表达有限。(B) saRNAs包含来自自复制单链RNA病毒的遗传工程复制子。saRNA进入宿主细胞后（1），通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）复合体在宿主细胞中进行自我扩增（2）。这导致宿主细胞中抗原编码mRNA的数量更多、可用时间更长，从而增加了蛋白抗原的产生并延长了其持续时间（3）。与mRNA类似，saRNA也可以被核酸酶降解（4）。(C) circRNA是共价连接的，并包含IRES序列以实现内部核糖体进入。circRNA进入宿主细胞后（1），被用于翻译蛋白抗原（2）。circRNA可以被内切核酸酶降解（3），但由于其共价闭合的环状结构，降解速度比mRNA和saRNA慢（4）。因此，circRNA更稳定，在宿主细胞中的半衰期更长。从这些RNA翻译的蛋白抗原将被转移到抗原呈递细胞（图中未显示）进行处理，并在MHC复合体上呈现以激活宿主的免疫反应。UTR，非翻译区。CDS，编码序列。IRES，内部核糖体进入位点。 3.3.1.自我复制RNA疫苗 自我复制RNA（saRNA）是一种替代非复制mRNA的RNA疫苗平台。它是为了解决传统mRNA疫苗由于mRNA在细胞内半衰期短导致的抗原产生不足的问题，需要重复接种以诱导足够的免疫原性。saRNA包含从自我复制的单链RNA病毒衍生的遗传工程复制子，通常是正链α病毒，如委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）、辛德比斯病毒（SINV）和Semliki森林病毒（SFV）。它们可以作为病毒复制子颗粒（VRPs）递送，saRNA包装在病毒颗粒中。由于缺陷的包膜结构，结果VRPs在最初感染细胞后无法形成传染性病毒颗粒；只有saRNA可以在宿主细胞中进一步扩增。saRNA的细胞内扩增是通过由正链α病毒复制酶基因编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）复合物实现的，它在原位扩增合成的转录物。为了避免病毒载体的隐患，采用了与mRNA递送中使用的非病毒制剂相似的各种非病毒制剂，如阳离子脂质、LNPs、聚合物和硫酸鱼精蛋白，以及电穿孔等物理技术，作为施用saRNA疫苗的替代方法。例如，Hekele等人已经证明了针对H7N9流感的LNP配方saRNA疫苗在小鼠中足够的免疫原性。由于自我复制能力，saRNA可以在比传统mRNA疫苗更低的剂量下施用，以达到类似的抗原表达水平。与每剂需要30和100 µg mRNA的辉瑞和Moderna COVID-19 mRNA-LNP疫苗相比，最近针对COVID-19 saRNA-LNP疫苗（COVAC1）的临床试验仅在2剂方案中每剂使用了0.1-10 µg，并在接种者中诱导了良好的（但不是100%）血清转化。在免疫后6周，接受5.0和10.0 µg疫苗的组别达到了最高的血清转化率（87%）。数据表明，saRNA疫苗在低剂量需求方面有潜力超越传统mRNA疫苗，从而允许剂量节省策略、更好的耐受性和更低的制造成本。尽管需要进一步优化以达到其全部能力，辉瑞公司开发的saRNA疫苗（PF-07852352, PF-07836391, PF-07836394, PF-07836395, PF-07836396, 和 PF-07867246）已进入I期临床试验（NCT05227001）。我们预计未来几年将有更多的saRNA疫苗被设计和临床测试。 3.3.2.小圈和纳米质粒DNA疫苗 小圈DNA（mcDNA）因其与传统质粒DNA疫苗相比的显著特点，目前正在广泛研究其在疫苗接种中的使用。mcDNA消除了质粒DNA中对细菌扩增必需但对哺乳动物细胞表达不必要的原核序列，从而产生了更小的DNA疫苗，提高了基因递送效率和编码抗原的表达。mcDNA疫苗也比质粒DNA疫苗更安全，因为它们避免了对宿主免疫系统识别的原核序列的炎症反应，并防止接受者获得由质粒DNA中包含的抗生素选择标记基因诱导的抗生素抗性。然而，复杂的生产和纯化过程以及与制造相关的高成本目前限制了mcDNA在疫苗接种中的使用。mcDNA通常通过在E. coli中通过一个重组酶如ϕC31整合酶和一个限制酶（RE）如I-SceI进行分子内重组产生，这些酶通过一个可诱导的基因表达系统激活。重组酶促进识别序列（attB和attP）的位点特异性重组，导致形成两个环状DNA分子：具有真核表达盒的mcDNA和包含细菌骨架的小质粒（MP）。然后MP被诱导的RE降解；mcDNA被提取和纯化，其程序与常规质粒DNA类似。为了改进mcDNA生产，正在探索新的方法。例如，Jiang等人开发了一个mcDNA平台，允许整个质粒DNA在体内通过Cre重组酶介导自发转化为mcDNA，并证明了mcDNA平台在保护鸡免受新城疫病毒中的效力。在另一项研究中，Kay等人构建了一个经过基因改造的E. coli菌株，可以通过稳定表达可诱导的ϕC31整合酶和I-SceI同源内切酶高效生产纯化的mcDNAs。到目前为止，mcDNA疫苗尚未在临床上进行评估。 纳米质粒载体被开发出来，旨在解决mcDNA的制造限制，同时保留其优势。纳米质粒使用RNA/RNA相互作用的非编码选择标记系统（“RNA-OUT”）来消除传统质粒骨架中对抗生素抗性标记的需求。由于其较小的骨架大小（<500 bp），纳米质粒载体已显示出在体外和体内都具有强大的转染效率，这一效率比使用传统质粒DNA高出多达十倍。由于这两个优势，它们已被用于流感[222]、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）和埃博拉病毒的疫苗的临床前研究，并与传统质粒DNA疫苗相比显示出增强的免疫反应。EG-70，一种编码视黄酸诱导基因I（RIG-I）激动剂和IL-12的纳米质粒产品，目前正在进行针对非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）患者的I/II期临床试验（NCT04752722）。 4.结论性评论 核酸疫苗是研究和开发中的一个令人兴奋的新领域，其应用范围从预防各种传染病到治疗癌症。在COVID-19大流行之前，核酸在疫苗领域的潜力在很大程度上被忽视了，但基于mRNA和DNA的COVID-19疫苗的批准代表了它们成为与传统病毒或蛋白基础疫苗相比的替代和更好的平台的革命性突破。使用核酸技术在有效性、安全性以及简单性和快速设计和制造方面提供了几个优势。 随着核酸疫苗受到广泛关注，了解哪些平台在特定应用中更合适至关重要。通过本综述中对mRNA和DNA平台的全面比较，平均来看，目前的mRNA疫苗比DNA疫苗具有更高的临床影响，特别是在COVID-19大流行期间。从技术上讲，mRNA疫苗在抗原表达和免疫系统激活方面更有效，需要的剂量更低，并且公众对插入性突变风险的担忧较少。另一方面，DNA疫苗拥有许多其他优势，包括低成本的生产、运输和储存，以及低报告的不良事件（AEs）。 目前，RNA和DNA疫苗都在经历快速的演变，两个平台上都出现了令人兴奋的新技术，这些技术将提高有效性并影响未来在预防、治疗和控制各种疾病中平台的偏好。与此同时，由于RNA和DNA疫苗在临床开发和使用中的历史相对较短，需要更多的研究来优化平台，收集长期的有效性和安全性数据，并了解抗原呈递和免疫反应的分子机制。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

近年来，随着对肿瘤免疫逃逸机制的不断了解，全球各种新型免疫疗法相继问世，其中就包括热度不断走高的肿瘤疫苗。自2010年FDA批准首个肿瘤疫苗上市以来，肿瘤疫苗显示出良好的治疗及预防效果，吸引各大药企相继投入研发。图.肿瘤免疫逃逸机制示意（A:正常条件下机体清除肿瘤细胞机制；B:肿瘤细胞免疫逃逸机制）来源：中国药科大学学报肿瘤疫苗(tumor vaccine)作为一种新兴的免疫疗法,是将肿瘤抗原、编码肿瘤抗原的基因、免疫细胞及分子等导入体内，激活非特异性免疫应答杀灭肿瘤的方法。肿瘤细胞产生的抗原可以分为肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤非特异性抗原(TAA)。抗原呈递细胞(APCs)主要是树突状细胞(DCs)和巨噬细胞,APCs通过主要组织相容性复合体MHC-Ⅱ类分子将抗原呈递到细胞膜，激活CD4+T细胞，发生体液免疫应答；或者抗原逃逸至细胞质中，被MHC-I类分子呈递给CD8+T细胞，激活细胞免疫清除肿瘤细胞。根据功能不同，肿瘤疫苗可分为治疗性疫苗和预防性疫苗，按有效成分主要有DCs疫苗、基因疫苗、多肽疫苗三大类。DCs疫苗2010年获批的全球首款治疗晚期前列腺癌的肿瘤疫苗Provenge(sipuleucel-T)，就是一种DC疫苗。上市十年以来，美国已向3万名男性开具Provenge处方。治疗时通过抽取患者的外周血单核细胞体外分离出DC细胞，扩增再加入重组融合蛋白进行培养，最后回输给患者定向激活T细胞抗肿瘤活性。该重组蛋白是由肿瘤相关抗原前列腺酸性磷酸酶(PAP)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)组合而成。基因疫苗基因疫苗主要包括DNA疫苗和mRNA疫苗。虽然两者都是使用遗传物质向人体细胞传递信息并引发免疫反应，但DNA疫苗要想发挥作用，质粒DNA必须穿过细胞膜进入细胞核内，而mRNA疫苗只需穿过细胞膜进入细胞质即可，利用细胞质中的酶转录翻译为蛋白质，因此DNA疫苗产生的免疫反应较mRNA疫苗更弱。但另一方面，DNA疫苗优势是室温下更稳定且能产生多个mRNA拷贝，所以两者各有千秋。2021年11月，BioNTech公司的mRNA肿瘤疫苗BNT111(NCT04526899)，获得FDA快速通道资格，用于治疗黑色素瘤，目前处于临床二期阶段，该治疗性疫苗被外界广泛看好。多肽疫苗2019年，复星医药斥资1亿美元引进MimiVax公司开发的新型多肽肿瘤疫苗SurVaxM，于2022年9月经CDE批准启动Ⅱ期临床试验，用于治疗初诊的胶质母细胞瘤。研究发现，接种该疫苗的人的寿命大约是预期的两倍。SurVaxM可识别表达survivin蛋白的肿瘤细胞，并通过刺激患者自身的免疫反应控制肿瘤的生长和复发。Survivin蛋白与细胞生存相关，它在正常成人组织中极少能够检测到，但却在超过95%的胶质母细胞瘤及肝癌等多种肿瘤中有表达。作为天然氨基酸合成的多肽疫苗，能在产生免疫反应时分解，所以副作用很小，该款疫苗也被寄予厚望，有望成为胶质母细胞瘤脑癌患者的福音。据cortellis数据库显示，目前全球已上市及在研的肿瘤疫苗共有1686款，其中，21款已上市，8款注册阶段，3款注册前阶段，217款处于临床Ⅰ期阶段，271款处于临床Ⅱ期阶段，48款处于临床Ⅲ期阶段，临床前期共320款。在所有肿瘤疫苗中，治疗性疫苗数量占据绝对优势,其次是预防性疫苗；就靶点而言，HER2、MUC1、NY-ESO-1、HPV E7、HPV E6、KLK3、WT1、TERT、PSMA、KRAS、CEA是研发较集中的靶点；治疗领域中，排名前列的疾病是黑色素瘤、非小细胞肺癌、实体瘤、卵巢癌、前列腺癌等；拥有较多在研项目的企业机构是美国国家癌症研究所、默沙东、GSK、Oncotherapy science、inovio pharmaceuticals等。表.全球已上市的肿瘤疫苗来源：cortellis数据库，凯莱英整理放眼全球，肿瘤疫苗已表现出较好的临床效果，科学家仍在积极探索联合治疗方法，比如配合免疫检查点抑制剂能产生更多特异性T细胞，发挥协同抗肿瘤效应；和化疗联用，能降低化疗药物的剂量和不良反应发生率；和靶向药物联用可通过减小肿瘤负荷及瘤内压获得更好疗效等。期待未来尽早涌现更多肿瘤疫苗疗法，为广大肿瘤患者带来希望与生机。参考文献：1、肿瘤免疫治疗及其药物研发进展，邢续扬，王孝春，何伟，中国药科大学学报，2021，52（1）：10-192、纳米仿生型肿瘤疫苗的研究进展，杨玥,王海燕,孙野，孙涛，蒋晨，药学学报，2022,57(4):963−9753、个性化新抗原肿瘤疫苗：道阻且长，未来可期，虞淦军，吴艳峰，曹雪涛，中国肿瘤生物治疗杂志，2022,Vol.29,No.1识别微信二维码，添加小编，符合条件者即可申请加入微信群！请注明：姓名+研究方向！声明：本文旨在传递更多信息，版权归原作者所有。原创文章转载均需经过授权并注明来源，如涉及内容、版权或其他问题请时联系小编删除！文章仅代表作者个人观点，并不代表公众号立场。本公众号拥有对此声明的最终解释权！投稿邮箱：yck19876@163.com