TNF-α x IL-2

关注并星标CPHI制药在线 JAK-STAT通路与银屑病的发生、发展密切相关，作为银屑病治疗的补充疗法和替代药物， 当代中医药的应用研究证明了其治疗银屑病的有效性。研究发现，中药单体、中药有效成分、中药复方和针灸对银屑病治疗中 JAK-STAT 通路均有明显调节作用。 1、中药单体、有效成分通过 JAK-STAT 通路调控治疗银屑病 多种中药单体或有效成分可通过调节JAK-STAT通路参与银屑病的发生发展，主要为苷类、生物碱类，它们通过调节JAK-STAT 通路而纠正银屑病免疫失调，减轻炎症反应，进而控制病情。 厚朴酚为木脂素类化合物，提取自厚朴，具有抗炎、抗菌、抗过敏等作用。研究发现，厚朴酚能抑制咪喹莫特诱导银屑病小鼠血清IL-17、IL-23水平，从而降低TNF-α、JAK/STAT ( JAK2/STAT3) 、NF-κB 等蛋白表达，进而对小鼠银屑病皮损具有良好的改善作用。 麻黄具有抗炎、抗菌、抗过敏等作用，可应用于多种临床疾病的治疗。麻黄的主要成分为盐酸麻黄 碱、盐酸伪麻黄 碱、盐酸甲基麻黄 碱等生物碱。应用麻黄单味药物的水煎剂灌胃咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型，发现麻黄可以改善银屑病皮损组织病理下的角化过度和炎性浸润，降低银屑病病理评分系统（Baker）和银屑病皮损面积及严重程度指数（PASI）的分值，其机制与降低血清中 IL-6 的含量，抑制皮损中 IL-6、IL-17A、IL-17C mRNA 的表达，降低皮损中 STAT3、p-STAT3蛋白含量相关。 雷公藤多苷提取自雷公藤，具有抗炎、免疫抑制、调节免疫等作用。研究报道，雷公藤多苷可降低银屑病小鼠血清 TNF-α、IL-17、IL-23 水平及银屑病皮损组织 JAK1、STAT3 蛋白表达，抑制 JAKs-STAT 信号通路的活化，进而改善皮损炎症。 人参皂苷是人参中提取的天然化合物，具有抗炎、调节免疫作用。研究发现，人参皂苷可降低咪喹莫特诱导银屑病小鼠血清 p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 表达，降低炎症因子IL-23、IL-17水平，抑制JAK1/2STAT3活化。 氧化苦参碱是提取自苦参、山豆根等的活性生物碱，具有抗病毒、抗炎、免疫调节等作用。研究表明，氧化苦参碱可通过降低炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8 水平，升高SOCS1 表达来抑制JAK1、STAT3 表达，阻碍JAK/STAT 信号通路激活，进而抑制KC 增殖，调节T淋巴细胞活化、平衡，从而达到治疗银屑病的目的。 丹皮酚是牡丹皮、徐长卿的主要有效成分，具有抗炎、抗肿瘤、代谢调节、镇痛等作用。丹皮酚可降低咪喹莫特诱导的银屑病小鼠皮损 microRNA-155、STAT3、IL-17、IL-23、IFN-γ 水平，升高SOCS1 表达，从而干预 JAK/STAT 及其下游 IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 等细胞因子来发挥免疫效应。 紫草素为萘醌类化合物，提取自紫草，具有抗菌、抗炎等作用。紫草素能够通过STAT3 信号通路抑制IFN-γ 诱导的IL-17过度分泌，并阻断 JAK2/STAT3信号通路，抑制银屑病小鼠模型皮损部位VEGF 表达，也可抑制树突状细胞分泌细胞因子 IL-23，抑制Th17特异性免疫应答，从而发挥治疗银屑病的作用。 此外，研究发现商陆皂苷甲能有效降低银屑病模型小鼠外周血 IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α 水平。白芍总苷可降低银屑病患者外周血IL-17、IL-22、IL-23 水平。土大黄提取物能调节咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型IL-23/IL-17轴。洋金花提取物可抑制银屑病小鼠 IL-17、TNF-α、NF-κB 等细胞因子水平，从而降低 IL-23、IL-8、IL-6 水平，还可升高 IL-10 水平。落新妇苷能抑制咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的Th17细胞分化，减少IL-17 释放， 削弱Th17 细胞的JAK/STAT3 信号转导。 2、中药复方通过JAK-STAT 通路调控治疗银屑病 清热利湿饮、加味凉血消风散、蜈蚣败毒饮等可通过 JAK-STAT 通路参与银屑病的发生、发展，其功效主要包括清热、利湿、凉血、解毒、祛风、止痒等。 清热利湿饮为中医经方龙胆泻肝汤的变方，由龙胆草、黄芩、柴胡、牡丹皮、当归、金银花、土茯苓、泽泻、栀子、生地黄、车前子、甘草等组成，研究表明，该中药方剂可以从动物学和细胞学2个角度抑制IL-6的表达及其介导的JAK1/STAT3信号通路的激活，并可以影响下游IL-17A 的分泌水平，改善动物模型中银屑病样的炎症反应。此外，研究发现该方剂对于IL-22、JAK1、TYK2、p-STAT3、STAT3等参与该通路中诱导、调控、磷酸化、信号终端的多个因子均具有干预作用。 消银解毒颗粒由水牛角、生地黄、牡丹皮、赤芍、忍冬藤、大青叶、紫草、甘草等组成，作用于体外经植物血凝素（PHA）和 IL-6 共同诱导的人T淋巴细胞瘤细胞（Jurkat），结果发现，经IL-6刺激后Jurkat细胞的增殖能力显著提升，以10 μg·L-1质量浓度时的增殖作用最为明显，中药方剂及其拆方均能够显著影响 JAK1、STAT3、gp130共3个指标的基因及蛋白表达量，该实验较为精确的描绘出 IL-6/JAK1/STAT3 信号通路从诱导刺激、到受体结合、再到信号激活的整体过程，也体现出中医药凉血解毒法作用的核心机制。 凉血消银颗粒剂由紫草、赤芍、白花蛇舌草、丹参、槐花、生地、白茅根、水牛角、鸡血藤、丹皮、熟地黄组成，具有清热凉血、活血化瘀的功效。研究表明，凉血消银颗粒剂可以降低银屑病模型小鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-23水平，升高SOCS1表达，从而缓解银屑病症状。 加味凉血消风散由水牛角、生地黄、牡丹皮、连翘、僵蚕、地骨皮、紫荆皮、冬桑叶、白花蛇舌草、玄参、女贞子、旱莲草、炙甘草等组成，研究证实，该方剂可以通过下调 JAK3/STAT3信号通路，下调抑凋亡基因，上调促凋亡基因，从而诱导细胞凋亡来达到缓解银屑病的目的。中药复方制剂加味凉血消风散在 JAK/STAT 信号通路的 3 个家族亚型中均发挥调节作用，包括IL-21介导的 JAK3/STAT3 环节、IL-22及IFN-γ 分别介导的 JAK/STAT 环节，该方剂的配伍体现中医学在血分症疾治疗中的“入血就恐耗血动血，直须凉血散血”的辨证理念和“治风先治血，血行风自灭”的治疗先机，以凉血为核心，用养阴之妙法，散血热，祛风盛，以其治疗急性进展期银屑病，将中医理论围绕 JAK/STAT 信号通路家族进行了系统融合，也为同类方剂的微观机制系列研究提供了较好的借鉴和思路。 楮芍凉血汤由楮桃叶、白芍、连翘、黄连、金银花、黄芩、生地黄、威灵仙、白花蛇舌草、细辛等组成，对血热证银屑病患者进行了机制研究，结果显示其可以通过调控 JAK3/STAT3 信号通路，改善银屑病的 PASI 分值及灼热、瘙痒、心烦等一系列血热症状。 养血解毒汤由土茯苓、生地黄、板蓝根、丹参、当归、麦冬、玄参、鸡血藤、草河车、车前子组成，对银屑病模型鼠皮损组织中 JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3的表达及 Th17 相关因子 IL-17A、IL-17C、IL-22、维甲酸受体相关孤儿受体 γ（t RORγt）进行对照研究，发现以凉血养血活血、祛湿解毒的名家验方可以抑制 STAT3 的磷酸化，减少Th17 细胞相关因子的分泌，由此改善模型的银屑病样皮损。 丹参白疕消丸由丹参、乌梢蛇、全蝎、土鳖虫、大黄、蝉蜕、徐长卿、山楂、板蓝根、红花、防风、苦参、黄柏、蜈蚣、甘草等组成，其主要功效为养血活血。在干预银屑病鼠模型中发现其药物提取液能够分别降低外周血中IL-23、IL-17、IL-22、IL-6的浓度及皮损中上述因子的mRNA 表达水平，并下调皮损中STAT3的蛋白表达量，进一步提取鉴定发现，该方剂的有效成分为丹酚酸B、丹参酮Ⅱ A、盐酸小檗碱、升麻素苷、苦参碱、甘草酸铵等。 蜈蚣败毒饮由蜈蚣、紫草、土茯苓、鬼箭羽、乌梢蛇、甘草等组成，对银屑病小鼠模型血清、皮损组织中SOCS1、JAK2、STAT3，及其上游微小核糖核酸-155（microRNA-155）和下游Treg 细胞主导通路 IL-2-叉头框蛋白 P3（FoxP3）-IL-10/转化生长因子-β（TGF-β）进行研究，发现该方剂可以调控以 microRNA-155 介导的 SOCS1-JAK2/STAT3 信号通路从而影响 Treg 细胞功能，改善银屑病模型的皮损指数评分。 3、中医外治法通过JAK-STAT 通路调控治疗银屑病 体内外实验结果表明，针灸、艾灸、火针、热敏灸可通过JAK-STAT 通路参与银屑病的发生、发展，其主要具有抗炎、调节免疫的作用。 艾灸能够刺激人体的免疫系统，其温热功效能影响免疫细胞、免疫因子， 改善免疫功能。研究发现，艾灸可以降低咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠血清 IL-17A水平，抑制皮损组织 TNF-α、IL-1β、IL-6 mＲNA 表达，提示艾灸可降低炎性因子水平，抑制炎性反应，调节免疫功能，进而促进银屑病皮损的改善。 火针具有激发经气、扶正祛瘀、通经活络的作用。研究发现，火针可降低咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损组织 IL-17、IL-22、TNF-α mRNA 表达，抑制 pSTAT3 表达，进而抑制 STAT3通路活化，减轻炎性细胞浸润，改善银屑病皮损。 此外，研究发现，热敏灸可降低咪喹莫特诱导的银屑病模型大鼠外关穴筋膜 JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3 蛋白表达。针灸可改善寻常型银屑病患者皮损 PASI 评分， 降低血清IL-6、TNF-α水平。 参考资料 [1]胡怡,武思仙,刘栋,等.中医药调控JAK-STAT通路治疗银屑病的研究进展[J].中成药,2024,46(02):531-536. [2]吴咚咚,曹珣,安月鹏.中医药调控JAK/STAT经典信号通路辨治银屑病的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(01):258-269. 作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。 END 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

摘要：追求有效的登革热疫苗已经取得了两个获批疫苗和另一个完成了第三阶段临床试验的成果。然而，每个疫苗都存在不足，这表明用于开发这些疫苗的登革热免疫知识是不完整的。疫苗试验的发现可能会完善我们对登革热免疫的理解，因为这些数据是通过实验得出的，并且是安慰剂对照的。这些试验的结果表明，仅靠中和抗体滴度不足以说明对症状性感染的保护，这暗示了细胞免疫在保护中的作用。这些发现对今后登革热疫苗的开发和应用现有疫苗以实现最大的公共卫生效益具有相关性。 1.引言 登革热是一种急性病毒性疾病，普遍存在于热带地区。据估计，每年约有1亿人受到感染。这种疾病是由四种不同的登革热病毒（DENV-1至DENV-4）中的任何一种引起的，这些病毒主要但并非仅由埃及伊蚊（Aedes aegypti）传播。这种蚊子高度适应城市环境，人类人口密度通常很高。这种与人类的密切接触和对人类血液的专一性使其成为DENV的高效传播媒介。随着A. aegypti的地理分布从热带扩展到亚热带，预计未来几十年全球登革热的负担将加剧。这种负担可能被低估了，因为除了急性疾病外，部分登革热患者还会出现长期后遗症，如疲劳、记忆力减退和注意力受损。因此，减少全球登革热的负担是一个紧迫的公共卫生优先事项。 迄今为止，A. aegypti种群的抑制是预防登革热的唯一方法。这种方法在泛美伊蚊根除计划以及古巴和新加坡的国家病媒控制计划中取得了显著的成功。然而，维持这些成功已被证明是具有挑战性的，不仅仅是因为涉及的高成本。在新加坡，长期减少DENV传播导致了一个群体免疫力低的人口，现在更容易受到流行病的影响，尽管病媒种群密度持续较低。因此，通过疫苗接种提高和维持群体水平的免疫力必须是任何成功的登革热预防计划的基石。 开发登革热疫苗的努力始于A. Sabin的基础工作。开发安全有效的疫苗的一个主要挑战是登革热病理学的复杂性。一次DENV感染后发展起来的持久适应性免疫反应是针对该DENV的；对其余三种异质DENV的保护是短暂的。此外，一次DENV感染后发展的抗体可以增强第二次异质DENV感染，增加严重登革热的风险。这种抗体依赖性增强（ADE）的DENV感染的生物学将在后面的章节中进一步阐述。为了充分保护所有四种DENV并防止ADE的风险，疫苗开发工作集中在选择能够引起对所有四种DENV类型平衡中和抗体反应的疫苗候选物上。 自Sabin的工作以来的半个多世纪后，我们现在有两种获批的活减毒四价登革热疫苗；第三种疫苗已完成第三阶段临床试验。 尽管登革热现在技术上是一种可通过疫苗预防的疾病，但仍有空间开发更多疫苗，这些疫苗在提供更好的适应性免疫反应的同时，引起的副作用更少。然而，这篇综述并不专注于已经使用或可以用于开发登革热疫苗候选物的不同疫苗平台。它也不打算为登革热流行国家的公共卫生机构提供当前疫苗的头对头比较。这篇综述的目的是通过对已完成的第三阶段临床试验的疫苗效力结果，从疫苗效力结果中提炼出对登革热免疫的更细致的理解；完善我们对登革热免疫学的知识，可以进一步巩固下一代登革热疫苗开发的基础。 2.登革热疫苗 已完成第三阶段临床试验的登革热疫苗的发展历史和不同构建已经在其他地方进行了回顾。总之，第一种获批的登革热疫苗CYD-TDV是一种基于黄热病病毒17D（YF17D）骨架的嵌合疫苗，其中YF17D的前膜（PrM）和包膜（E）基因已被DENVs的基因所取代（图1）。然而，由于在没有先前DENV感染的情况下接种疫苗会增加严重登革热的风险，可能由于ADE，其使用仅限于那些有先前DENV感染的人。第二种疫苗TAK003，使用减毒DENV-2骨架，其PrM和E基因被野生型DENV-1、DENV-3和DENV-4的基因所取代（图1）。这种疫苗最近获得了欧盟的批准，用于4岁及以上人群，即使在没有先前DENV感染的人中也可以使用。第三种疫苗TV003最近完成了第三阶段临床试验，并取得了有希望的结果。这种四价疫苗是通过在DENV-4和DENV-1的3'非翻译区删除30个核苷酸（rDEN4∆30和rDEN1∆30），以及从DENV-3删除30和31个核苷酸（rDEN4∆30/31）构建的。DENV-2组分是通过将DENV-2 PrM和E基因拼接到rDEN4∆30骨架中构建的（图1）。 由于上述疫苗是活的，尽管是减毒的，并且是四价的，疫苗接种应该理想地导致四种同时的DENV感染，从而推动所有四种DENV的E蛋白的B细胞反应（图1）；将PrM基因拼接到嵌合构建中是确保适当的E蛋白折叠和病毒粒子成熟所必需的。随着病毒血症感染，更有可能发展出高结合亲和力和类型特异性的中和抗体。疫苗病毒血症的持续时间是与相关黄热病疫苗的中和抗体滴度的直接相关性，可以说是世界上最强大的疫苗。因此，由于CYD-TDV疫苗接种主要产生嵌合YF17D-DENV-4病毒血症，CYD-TDV疫苗接种主要产生DENV-4特异性中和抗体；对DENV-1至DENV-3的中和主要是由于交叉中和抗体。同样，TAK003疫苗接种仅产生可检测的DENV-2病毒血症，导致相应的DENV-2特异性中和抗体的富集。 图1. 登革热病毒(DENV)的主要免疫原性蛋白和三种活减毒四价登革热疫苗的分子结构。 登革热病毒(DENV)是一种单股正链RNA病毒，包括三种结构蛋白[衣壳(C)、前膜(PrM)和包膜(E)]和七种非结构蛋白(NS1至NS5)。针对DENV的抗体反应主要针对PrM、E和NS1蛋白。DENV特异性CD4+ T细胞反应主要针对C蛋白，其次是E、NS3、NS2A/B和NS5，而CD8+ T细胞反应主要针对NS3，其次是C、NS5和NS4A/B。 CYD-TDV是基于减毒黄热病(YFV)骨架，其PrM和E基因被替换为四种DENV血清型各自的基因。 TAK003使用减毒DENV-2骨架，其PrM和E基因被野生型DENV-1、DENV-3和DENV-4株的基因所取代。 TV003是通过在DENV-4和DENV-1的3'非翻译区删除30个核苷酸(rDEN4∆30和rDEN1∆30)以及从DENV-3删除30和31个核苷酸(rDEN4∆30/31)构建的。DENV-2组分是通过将DENV-2 PrM和E基因拼接到rDEN4∆30骨架中构建的。 这张图展示了DENV病毒的主要免疫原性蛋白和三种不同疫苗的分子设计。了解这些疫苗的构造有助于我们理解它们如何诱发免疫反应，以及为何它们可能在效力和安全性方面存在差异。 TV003疫苗接种可以产生所有四种DENV组分的病毒血症。相应地，TV003疫苗接种后产生了针对四种DENV的特异性中和抗体。然而，在进入第三阶段临床试验的TV003配方中，也称为Butantan DV，每个参与者最多只能检测到四种DENV组分中的两种病毒血症。值得注意的是，MSD（美国默克公司）的TV003专有配方V181的第一阶段临床试验，在大多数接种疫苗的个体中产生了四价病毒血症。将V181的未来疫苗效力研究结果与Butantan DV观察到的结果进行比较，可能会进一步揭示疫苗病毒血症如何塑造登革热免疫。尽管如此，这篇综述将关注从Butantan DV配方的TV003中可以得出的登革热免疫学课程，因为它已完成了第三阶段临床试验。 非中和抗体可以触发保护性Fc效应功能，如补体激活和抗体依赖性细胞毒性（抗体依赖性吞噬作用将在后面的章节中更详细地介绍）。针对非结构蛋白1（NS1）的抗体，其在登革热病理学中的作用将在后面的章节中更详细地讨论，也从疫苗接种中产生；然而，这些抗体将针对用作疫苗遗传骨架的病毒（图1）。同样，尽管在E蛋白中发现了CD4+ T细胞表位，但大多数T细胞表位，特别是CD8+ T细胞表位，位于衣壳（C）和NS蛋白中（图1）。因此，大多数疫苗诱导的细胞免疫反应将针对用作遗传骨架的病毒的NS蛋白，因此可能不会在所有四种DENV中平衡。 对症状性DENV感染的疫苗效力在四种DENV类型之间有所不同。此外，所有三种疫苗在有先前DENV感染（基线时血清阳性）的人群中显示出比那些没有感染过至少一种DENV（基线时血清阴性）的人更高的效力。CYD-TDV、TAK003和TV003临床试验的效力终点总结在表1中。关于保护的持久性和加强剂量的需求仍然存在问题。免疫减弱在多大程度上会影响登革热病理学，以及DENV的类型，仍然不确定。 3.理解登革热免疫的挑战 对登革热免疫的了解不得不依赖于流行病学观察的描述性数据。这些数据的质量取决于用于检测和分型登革热病例的研究或监测方法的灵敏度。鉴于临床表现的广泛范围，可能受到诸如DENV株、种族和年龄等因素的修改，再加上在感染期间在一致的时间点获得人类样本的困难，因此数据中存在相当大的异质性也就不足为奇了。这种异质性阻碍了识别登革热保护的免疫相关性。 除了从流行病学研究中得出明确的免疫保护相关性的困难外，对登革热免疫的理解也受到缺乏一个能够密切再现人类DENV感染和疾病病理学的动物模型的限制。产生疾病的小鼠模型大多是免疫缺陷的，特别是通过敲除干扰素（IFN）信号通路中的基因，这是人类对DENV感染免疫反应的关键部分。因此，不能直接将小鼠研究的结论外推到人类登革热。非人灵长类动物（NHPs）可以被DENV感染，尽管大多数在可检测的病毒血症情况下并不发展成类似登革热的疾病。因此，将动物中的登革热免疫研究近似于人类免疫是不确定的。 获得实验性和适当控制的数据的方法之一是应用控制人类感染模型（CHIM）。Sabin的登革热疫苗开发工作依赖于在人类志愿者中进行的这种实验性感染研究。尽管现在以类似的方式进行这种挑战性研究在道德上是不合理的，但值得注意的是，Sabin使用了未传代的野生型DENVs，并没有在任何感染的志愿者中观察到严重的登革热。人类感染研究的最新方法使用了部分减毒的DENVs，以获得更大的安全边际。这种挑战性感染的临床表型范围从无热病毒疹（55）到轻微的类似登革热的自限性急性疾病。然而，使用部分或自然减毒的DENV株可能会低估保护野生型DENVs引起的症状性感染所需的免疫力程度。例如，TV003疫苗接种在未暴露于DENV感染的个体中，在用部分减毒的DENV-2（rDEN2Δ30 Tonga/74）株挑战时，对病毒血症结果提供了100%的保护。然而，rDEN2Δ30 Tonga/74感染仅产生最大病毒血症2.9 log10斑块形成单位（PFU）/ml。另一种引起自限性发热疾病的人类感染模型使用了部分减毒的DENV-1株，其峰值病毒血症范围为4.1至4.8 log10 PFU/ml；这些个体中相应的病毒RNA血症为5.9至7.9 log10 RNA拷贝/ml。相比之下，登革热患者的RNA血症通常在诊断时为6至9 log10病毒RNA拷贝/ml。尽管实验性和自然获得的DENV感染结果之间的接种剂量和感染途径（皮下注射与通过蚊子叮咬的皮内接种）不同，但更大的病毒负担可能需要更强大的适应性免疫反应，以防止疫苗接种后出现症状性结果。在基线时血清阴性的个体中，TV003在预防症状性感染的效力点估计，尽管是在接种后2年而不是在接种后6个月的挑战感染时测量的，为57.9%。总体而言，我们认为CHIM是一种极其有用的方式来筛选不太可能实现理想程度效力的疫苗候选物，以避免进一步昂贵的临床开发，但它还没有达到我们可以准确外推真正疫苗效力的阶段。 临床试验提供了假设驱动的、安慰剂对照的实验数据，这些数据来自大样本量；这四项登革热疫苗的第三阶段试验每项都招募了超过15,000名参与者。它们在登革热流行地区进行，野生型DENVs通过自然的伊蚊-人类周期传播。这些试验还普遍使用主动病例检测来确定疫苗效力；所有发热病例都使用最敏感的诊断工具，即逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测DENV感染。因此，第三阶段试验结果和长期随访观察是完善我们对登革热免疫知识的良机。 4.体液免疫 在20世纪40年代和50年代，登革热血清学被开发并用于测试恢复期血清样本，以寻找DENV感染的证据。从血清学检测和恢复期血清研究中获得的经验表明，病毒中和试验，如斑块减少中和试验（PRNT）和焦点减少中和试验，提供了最大的特异性，以确定初次DENV感染的历史。鉴于大多数二次登革热病例是由与初次感染不同的DENV异型引起的，以及在NHPs中的实验研究，人们认为中和抗体对于登革热免疫是绝对必要的。 4.1.中和抗体和PRNT 首先使用在玻璃处方瓶中生长的细胞单层开发了一种用于DENV中和抗体的斑块减少试验。这种“宏观”试验使用0.4 ml的血清与固定接种量的DENV反应，起始血清稀释度为1:10。这种方法最终被“微观”PRNT所取代，后者需要更少的血清体积和在12孔或24孔组织培养板中生长的细胞单层。由于“宏观”试验被用作“微观”PRNT开发的参考点，大多数人继续使用相同的起始稀释度1:10。因此，在起始稀释度1:10时，病毒接种量的50%或更多被中和（PRNT50）被广泛解释为恢复期血清中的阳性发现。 鉴于DENV感染产生对引起感染的DENV的持久免疫力的假设，恢复期登革热患者中和同型DENV的PRNT50滴度为10或更高通常被假定为免疫的指标。然而，最近的研究表明，对于四种DENVs没有单一的保护性中和抗体阈值。一项队列研究表明，与配对的感染前血清相比，恢复期血清中中和抗体滴度下降不到四倍的个体容易再次感染同株DENV；因此，单独可检测的中和抗体滴度不足以防止同型再次感染。此外，似乎保护免受症状性感染所需的中和抗体阈值在所有四种DENVs中并不一致。CYD-TDV第三阶段临床试验的血清学数据分析后表明，与其他三种DENVs相比，需要更高的中和抗体滴度来保护免受症状性DENV-2感染（表2）；即使比较仅限于DENV-1至DENV-3，其中抗体大多不是针对这三种DENVs的特异性，抗体滴度的差异仍然惊人。同样，一项基于登革热群集的调查发现，与病例有密切接触的人由于病例受到DENV-1和DENV-4感染的保护，当他们的PRNT滴度分别为11和16时，有类似的高概率暴露于传染性蚊子叮咬；相比之下，保护免受DENV-2感染需要PRNT滴度为323。这些发现共同表明，不仅没有单一的中和抗体滴度阈值来保护所有四种DENVs，而且与其它DENVs相比，保护免受DENV-2感染需要更高的中和抗体滴度。 4.2.DENV中和的化学计量 四种DENV病毒颗粒共享一个共同的结构：内核壳被病毒E和膜（M）蛋白包围，这些蛋白显示在来源于内质网的脂质膜上。冷冻电子显微镜图像显示，外层脂质膜上装饰着180个E蛋白和180个M蛋白，并排列成60个不对称的二十面体单元。当足够的E蛋白与抗体结合时，DENV会被中和，而化学计量取决于抗体如何以及在哪里结合E蛋白。 DENV中和的化学计量可能会受到病毒成熟程度的影响。由于DENV从其复制位点通过转高尔基网络进行细胞排出，M蛋白的pr肽的不完全蛋白水解可能会影响病毒的成熟程度。在培养中，未成熟的病毒颗粒更可能被产生，而在人类感染中则可能低估中和DENV所需的抗体量。然而，目前没有证据表明DENV-2产生的成熟病毒颗粒比其他DENV更多，因此不太可能解释保护所需的更高中和抗体阈值之间的差异。 DENV中和的化学计量要求理论上会偏向于结合由两个或更多E蛋白组成的四聚体表位的抗体；中和每个病毒颗粒所需的抗体会更少。许多从恢复期个体中分离出的DENV特异性单克隆抗体结合了这样的四聚体表位。由于对同型DENV再次感染的保护被认为是持久的，因此这种特异性四聚体表位结合的中和抗体的存在可以逻辑上推断出特异性免疫。 来自第三阶段临床试验的效力结果对这一逻辑提供了混合支持。尽管来自CYD-TDV和TAK003疫苗接种的特异性抗体的存在与各自的特异性疫苗效力相一致，但TV003试验的初步报告则建议更细致的解释。在CYD-TDV和TAK003中，接种后产生的主要特异性抗体分别是针对DENV-4和DENV-2。相应地，这两种不同疫苗提供的最高保护分别是针对DENV-4和DENV-2的症状性感染。相比之下，TV003疫苗接种发现对所有四种DENV产生了可比的特异性抗体滴度，尤其是针对DENV-1和DENV-2。尽管如此，在没有先前DENV感染的个体中，Butantan DV（与TV003类似）对症状性DENV-2的效力低于对DENV-1感染的效力（57.9%对85.5%）。在撰写本综述时，尚不清楚这一差异是否具有统计学意义，因为这些点估计的95%置信区间尚未报告。因此，尽管每种DENV特异性中和抗体提供了一定程度的保护，但保护每种DENV所需的滴度是不同的。 4.3.特异性DENV中和的差异阈值可能反映抗体依赖性感染的倾向 DENV感染髓源性细胞，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。除了通过相应受体介导的内吞作用进入外，抗体装饰的DENV还可能通过激活Fcγ受体（FcγRs）被这些抗原呈递细胞摄取。由于DENVs共享相当大比例的结构抗原，感染一种DENV类型会诱导与其他DENV血清型交叉反应的抗体。因此，亚中和浓度的交叉反应抗体可能通过提供DENV一种替代的激活FcγR介导的进入途径来促进感染。通过激活FcγRs的进入似乎也是一种比相应受体介导的内吞作用更有效的病毒进入途径。这种进入途径与在二次感染中增加严重疾病的风险相关，该二次感染是由与引起初次感染的DENV异型引起的。同样，母体中和抗体浓度的减少到增强感染的浓度也与严重登革热风险的增加相关。这一过程被称为DENV感染的ADE。 在人体中，预防DENV-2感染所需的更高抗体浓度可能反映了四种DENV之间ADE风险的差异。尽管ADE被广泛认为是严重二次登革热的致病机制，但这一过程比人们所理解的要复杂得多。来自尼加拉瓜的一项队列研究观察到，只有在基线感染前抗体滴度处于限制范围内时，严重登革热的最大风险才会出现。泰国的另一项研究使用不同的血清学检测也得出了相同的结论。实验上，活减毒黄热病毒（DENV所属的黄病毒属的原型病毒）感染仅在具有由日本脑炎疫苗接种产生的特定范围的交叉反应抗体滴度的人群中增强。 适合ADE的抗体滴度的限制范围可能是由于对适当大小的病毒-抗体免疫复合物的需求，以便最佳共同结合适当的免疫受体。高抗体浓度会聚集DENV形成大的免疫复合物，这些复合物共同结合了较少的但具有抑制作用的FcγRIIB。FcγRIIB含有一个细胞质免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM），其信号传导阻止病毒进入，从而抑制ADE（图2A）。激活FcγRs，如FcγRIIA，含有一个细胞质免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM），促进DENV-抗体复合物的摄取。它还迅速诱导抗病毒功能的干扰素刺激基因（ISGs）的表达，并限制病毒复制（图2B）。 图2. 抗体依赖性增强（ADE）需要抗体与DENV的最佳比例以适当地结合细胞受体。 A) 较高的抗体：DENV比例导致DENV聚集并共同结合抑制性Fcγ受体IIb（FcγRIIB），该受体通过其免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）细胞质尾部发出信号，以抑制免疫复合物的摄取。 B) 在中等抗体：DENV比例下，免疫复合物的大小足以共同结合激活FcγR，此处描绘为FcγRIIA，它具有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）细胞质尾部。在这种情况下，DENV感染仍然受到抑制，要么是通过抗体结合足够数量的表位以防止DENV与内体膜融合，从而将RNA释放到细胞质中（左），要么是通过ITAM介导的信号传导上调干扰素刺激基因（ISGs），在髓源性细胞中诱导抗病毒状态（右）。 C) 在亚中和抗体：DENV比例下，DENV与白细胞免疫球蛋白样受体B1（LILRB1）之间的额外相互作用，该受体具有ITIM信号传导细胞质尾部，抑制ISG的诱导，从而促进一个更有利于增强DENV感染的细胞质环境。 这张图说明了ADE过程中抗体与DENV相互作用的复杂性。不同比例的抗体与病毒结合可能导致截然不同的结果，从抑制感染到促进感染。这种理解对于开发能够有效预防DENV感染和ADE的疫苗至关重要。 为了使ADE发生，DENV必须在不触发ISG表达的情况下，通过激活FcγR介导的摄取。它通过结合白细胞免疫球蛋白样受体B1（LILRB1）实现这一点，该受体发出信号以抑制宿主髓源性细胞中ISGs的上调（图2C）。抗体-DENV复合物在进入髓样细胞时的相互作用使病毒能够逃避宿主抗病毒反应，这是仅通过非ADE进入途径无法实现的。鉴于这些相互作用的需求，四种DENV可能具有不同的固有ADE倾向。 长期以来，人们一直怀疑四种DENV以不同的方式利用FcγR介导的进入途径。在DENV-2流行的时期进行的研究发现，在母体抗体减弱时，婴儿患严重登革热的风险增加。相比之下，当主要流行病毒为DENV-3时进行的研究没有显示出类似的风险增加。在泰国Khampaeng Phet进行的研究发现DENV-1和DENV-3是症状性初次登革热的主要原因。相比之下，通过母体抗体增强，婴儿中DENV-2感染的症状性感染率增加，二次感染中DENV-2感染也是如此；症状性二次感染与初次感染的比例在DENV-4中也更高，尽管在这个队列中症状性DENV-4感染的总体比例最小。对1994年至2006年在曼谷报告的登革热病例进行的纵向分析也发现了类似的趋势：DENV-1和DENV-3更常与初次登革热相关，而二次感染的DENV-2更常与登革热出血热相关。DENV-2也更常与登革热休克综合征相关。最后，对越南6年报告的登革热病例进行的建模也发现DENV-2是二次感染中症状性登革热的最大风险因素。 来自最近一项研究，该研究涉及超过5600例登革热病例，发现高血浆病毒血症、二次感染和DENV-2感染是与严重登革热风险增加相关的因素。此外，在疾病早期发热阶段通常检测到的病毒血症范围内（血浆6至9 log10病毒RNA拷贝/ml），血浆渗漏（图3A）和严重登革热（图3B）的风险在二次感染DENV-2的患者中最高。总的来说，这些发现表明DENV-2对感染的保护免疫学要求最高。 图3. 二次DENV-2感染与血管渗漏和严重登革热风险最高相关。 A) 显示了经历二次DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4感染的登革热患者的血浆渗漏概率。 B) 显示了经历二次DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4感染的患者的严重登革热概率。每个图表中虚线之间的区域代表了在疾病发热阶段通常在登革热患者中检测到的病毒血症量。 这些图表说明了在二次感染时，DENV-2感染与血浆渗漏和严重登革热风险之间的关联性。虚线区域表示在登革热患者发热期间通常检测到的病毒血症水平，这强调了在这一阶段控制病毒血症的重要性，以减少严重并发症的风险。 4.4.抗NS1抗体 尽管主要针对DENV的PrM和E蛋白的中和抗体在疫苗效力中起着重要作用，但一些人提出有效的登革热疫苗也应该引发针对NS1的抗体。NS1是DENV在急性感染期间唯一从细胞分泌的蛋白，在DENV病理学的实验模型中被认为是内皮功能障碍和血管渗漏的直接原因，也是从免疫细胞释放促炎细胞因子的驱动因素。相应地，抗登革热NS1抗体似乎在小鼠感染模型中发挥保护作用。接种NS1疫苗的小鼠受到致命病毒挑战的保护，最近，两种针对黄病毒NS1的单克隆抗体被证明可以减少病毒血症、内皮功能障碍和血管渗漏，从而提高DENV感染小鼠的存活率。重要的是，与E蛋白的交叉反应或亚中和抗体不同，抗NS1抗体不能诱导ADE。 尽管一些研究发现NS1抗原血症与严重疾病之间存在关联，但其他研究显示了相互矛盾的结果。二次感染DENV-2的患者比初次感染的患者更可能有不可检测的NS1浓度，尽管同一研究也发现高NS1浓度与血小板减少的低谷相关。尽管NS1的致病作用和抗NS1抗体的保护功能尚未在临床上得到证明，但登革热疫苗引发抗NS1抗体可能对潜在调节突破性症状性感染的疾病严重程度有一些益处。 5.细胞免疫 迄今为止，登革热疫苗的开发主要集中在诱导高滴度和平衡的中和抗体，以预防DENV引起的症状性疾病。然而，中和抗体只是适应性免疫反应的一个组成部分。由CD4+和CD8+ T细胞驱动的细胞免疫在病毒控制和预防疾病方面也起着重要作用。辅助CD4+ T细胞通过分泌如IFN-γ、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子，支持免疫系统的其他部分，如B细胞和巨噬细胞，而细胞毒性CD8+ T细胞直接杀死病毒感染的细胞。因此，中和抗体和细胞免疫反应在控制感染和减轻疾病严重程度方面发挥互补作用。 T细胞在DENV感染中的角色一直存在争议，既有病理学作用也有保护作用。以前认为，初次DENV感染期间诱导的抗原特异性T细胞会在二次异型感染期间导致低亲和力、交叉反应记忆T细胞的扩增，由于清除病毒的能力较低和分泌炎症细胞因子，导致免疫病理学增加，这一现象被称为原始抗原罪。在泰国儿童登革热住院治疗的研究中发现，二次感染中DENV特异性T细胞对感染血清型的亲和力较低，对可能负责先前感染的其他血清型有更强的亲和力。这些T细胞研究是在患有严重登革热的儿童的感染急性阶段进行的。因此，这种“原始抗原罪”解释可能只代表一部分二次登革热患者。与疾病急性期不同，在从登革热中恢复的人中进行的研究发现了强烈的交叉反应T细胞反应。现在越来越认为T细胞在登革热中可能发挥保护作用，DENV特异性T细胞反应与保护效力相关。在与减少严重疾病易感性相关的人类白细胞抗原（HLA）等位基因的个体中，发现了更强大和多功能的抗原特异性CD8+ T细胞反应。同样，DENV感染诱导细胞溶解性DENV特异性CD4+ T细胞，与保护性HLA DR等位基因相关。在泰国学龄儿童的巢式病例对照研究中，具有更高频率的分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的DENV特异性T细胞的儿童更有可能发展为无症状而不是症状性DENV感染。这些观察结果表明T细胞在登革热中具有保护作用。 CD8+ T细胞对DENV的反应主要针对NS3蛋白，其次是C、NS5和NS4A/B，而CD4+反应主要针对C，其次是E、NS3、NS2A/B和NS5。这些DENV反应性T细胞的细胞免疫可能在中和抗体滴度不足以灭菌感染时迅速清除感染方面尤为重要。T细胞的功能作用在异体肾移植受者中得到了证明，他们接受了T细胞抑制治疗以预防移植排斥。由于T细胞计数低，这些患者的DENV感染过程延长，最终只有在T细胞计数恢复到接近正常值下限时才清除感染。 5.1.登革热疫苗接种引发的T细胞反应 CYD-TDV使用黄热病（YF17D）骨架，因此缺乏包含大部分CD8+ T细胞表位的DENV NS蛋白（图1）。尽管YF17D疫苗接种诱导的T细胞对DENV有一定程度的交叉反应，但这些反应往往有限且幅度小得多。例如，尽管基线时对登革热不了解的个体接种CYD-TDV后对YF17D NS3产生了强烈的CD8+ T细胞反应，但对DENV NS3的交叉反应性CD8+反应却很弱。这种缺乏强烈的DENV特异性T细胞反应可能是CYD-TDV对DENV-1和DENV-2效力不佳的原因之一。 TAK003则使用减毒DENV-2病毒PDK53作为DENV-1、DENV-3和DENV-4构建的骨架。在对TAK003接种的登革热不了解和接触过登革热的青少年中，针对DENV-2 NS1的IFN-γ分泌CD4+和CD8+ T细胞的频率最高，对DENV-1、DENV-3和DENV-4 NS蛋白也观察到可检测的，尽管较低的交叉反应性反应。在黄病毒不了解的成年人中也报告了类似的发现。TAK003诱导的T细胞反应反映了其效力概况，对DENV-2的临床效力最高，与其他三种血清型相比：DENV-2为97.7%，DENV-1为73.7%，DENV-3为62.6%；由于病例不足，DENV-4的效力结果不确定。 TV003诱导了一种广泛且多功能的CD8+ T细胞反应，反映了自然二次DENV感染的情况；超过90%的反应针对保守的DENV序列，表明TV003诱导的T细胞反应应该能够识别所有四种血清型。这种四价疫苗接种后的T细胞反应与单价疫苗接种后的反应形成对比；保守序列在DENV1∆30中只占46%，在DEN2/4∆30中占16%，在DEN3∆30/31中占54%，在DEN4∆30中占7%。此外，单价疫苗诱导的T细胞既针对结构蛋白也针对NS蛋白，尽管四种DENVs的CD8+ T细胞免疫优势模式存在差异。例如，51%的CD8+ T细胞反应在DENV-3感染后针对结构蛋白，而在DENV-2感染后只有19%针对结构蛋白。这些差异可能是由于不同DENVs感染期间抗原处理和呈现的差异所致。因此，尽管几乎所有由四价疫苗诱导的CD8+ T细胞反应都被观察到针对NS蛋白（主要是NS3和NS5），类似于二次感染后的反应，但目前尚不清楚仅针对保守表位的T细胞是否在不同血清型中同样具有保护作用。 5.2.常规测量细胞免疫 现在很清楚，有效的登革热疫苗应能够诱导DENV特异性细胞免疫，但目前尚不清楚这一最小阈值需要是多少。细胞免疫很少作为DENV疫苗开发的保护相关因素进行评估，疫苗开发商和监管机构几乎完全依赖于抗体滴度来识别疫苗候选物。一个促成因素是缺乏标准化的T细胞检测，这些检测既简单易行又易于解释。DENV特异性T细胞只占体内所有T细胞的一小部分，通常需要复杂的功能性检测才能被检测到。目前使用的检测方法，如IFN-γ酶联免疫斑点（ELISpot）和基于流式细胞术的检测，劳动强度大，耗时长，需要高度专业化的技术专长和设备。此外，这些检测通常在需要大量血液的外周血单核细胞上进行；这使它们不适合大规模部署，特别是在儿童人群中。幸运的是，现在有了更用户友好的T细胞检测方法。例如，最近开发的一种快速细胞因子释放检测只需要少量的全血（<1 ml），在评估严重急性呼吸综合征冠状病毒2特异性T细胞反应方面显示出良好的敏感性和特异性。这种标准化检测的使用可以扩展到DENV疫苗开发，并能够定义结合抗体和T细胞测量的保护相关因素。 6.登革热疫苗的未来 从第三阶段临床试验中可以学到的教训是，登革热疫苗需要引发全面的适应性免疫反应。中和抗体可以提供保护，但可能需要在没有先前DENV感染的人群中达到过高的滴度。此外，尽管中和抗体可以预防感染，但维持这种抗体的持续滴度可能需要反复接触DENVs。引发针对NS1蛋白的体液反应，以及针对C和NS蛋白的CD8+ T细胞反应，可能会产生预防登革热和严重登革热所需的多层次免疫反应。缺乏这种多层次反应可能解释了在没有先前DENV感染的CYD-TDV疫苗接种者中观察到的住院和严重登革热风险增加。相比之下，至少部分是由于这种多层次的DENV导向反应，尽管在没有先前DENV感染的TAK003疫苗接种者中缺乏对症状性DENV-3感染的效力，但避免了登革热住院人数的增加。TAK003的第四阶段临床研究应该能够进一步阐明这些适应性免疫反应在预防登革热和严重登革热中的作用，特别是在没有先前DENV感染的情况下由DENV-3引起的登革热。 理想的登革热疫苗应该能够预防症状性感染和DENV传播。这样的疫苗需要强有力地引发中和抗体和T细胞的反应，鉴于它们在免疫中的互补作用。然而，即使登革热疫苗不能在所有四种血清型中实现高滴度的中和抗体，能够诱导广泛和持久的T细胞反应的疫苗仍然可能在预防登革热住院和严重疾病方面非常有效。从我们对2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗的经验中可以得出类似的教训；尽管目前的COVID-19 mRNA疫苗由于抗体逃逸突变而无法持续保护免受Omicron变体的感染，但通过保留病毒特异性T细胞反应，仍然维持了对严重疾病的保护。此外，疫苗接种在群体水平上也带来好处：在世界卫生组织建议进行预接种以确保只对有先前DENV感染的人进行疫苗接种之前进行的CYD-TDV疫苗接种的建模表明，如果这种疫苗定价有竞争力，对于高登革热流行国家，这种疫苗具有成本效益。因此，TAK003和TV003疫苗接种的改善总体结果可能会为流行国家带来更大的成本效益。因此，一种疫苗即使不能完全保护免受症状性感染或传播，但能预防住院和严重登革热，可能不是完美的，但仍然是群体水平登革热控制的有用解决方案。 最后，我们建议，在一种能够完全保护免受所有四种DENV疾病侵害的单剂量疫苗可用之前，异源初免-加强策略可以利用每种疫苗的优势，同时克服它们的局限性。临床观察表明，在两次感染后，第三次和第四次DENV感染大多是无症状的。因此，例如，先用TAK003进行一次剂量的初免，然后用CYD-TDV进行加强，可以模拟连续感染，因为疫苗病毒血症研究表明这些疫苗的感染类型不同；TAK003显示可测量的DENV-2疫苗病毒血症，而疫苗病毒血症主要从CYD-TDV的DENV-4其次是DENV-3组分中检测到。也可以设想与TV003的类似组合。因此，异源初免-加强策略可以消除多年疫苗开发的需求，使登革热不再仅仅是理论上的，而是真正可以通过疫苗预防的疾病。

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。