CTLA4 x CD40L x 4-1BB

CD137，又名4-1BB，是一类T细胞共刺激受体，属于肿瘤坏死因子受体超家族（Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily，TNFRSF）。CD137激动性抗体已被证实可以通过激活T细胞来达到抗肿瘤的作用。目前尚无CD137小分子/抗体激动剂药物被批准上市。2024年8月23日，中国科学院上海有机化学研究所丁克研究员和暨南大学陈良教授联合在Science子刊Science Advances杂志在线发表题为“Human/mouse CD137 agonist, JNU-0921, effectively shrinks tumors through enhancing the cytotoxicity of CD8+ T cells in cis and in trans”的研究性文章，共同报道了首个CD137小分子激动剂JNU-0921的开发及其在肿瘤免疫治疗中的机制研究。 CD137 免疫检查点疗法在肿瘤免疫治疗领域中使很多癌症患者大大受益，显著缓解患者病症、延长患者生存期。该法的原理是相当于“刹车”的作用，消除癌细胞对T细胞的抑制作用，激活T细胞的效应能力。根据免疫检查点的作用机制可以分为抑制性免疫检查点和共刺激性免疫检查点：前者包括PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、BTLA、TIM-3和CEACAM1等，后者包括CD137（4-1BB）、OX40、CD27、CD28、CD40L、ICOS、GITR和LIGHT等。 图1  T细胞表达的共刺激/抑制受体及其配体相互作用的示意图（图源自Immune Network, 2020） 目前，共刺激受体的激动性药物研究正成为炙手可热的研发方向之一。其中，明星分子4-1BB作为一种强大的T细胞共刺激受体备受瞩目：4-1BB信号的激活能增强NK细胞抗体依赖性的细胞毒性功能；增强效应T细胞的细胞毒性功能，促进其分化和记忆能力，上调细胞炎症因子的分泌，保护其不被凋亡，将Treg重编程为具有抗肿瘤活性的细胞毒性CD4+ T细胞并提高机体的抗肿瘤能力。因此对4-1BB这一重要靶标的生理功能以及激动剂药物进行探究是非常有必要的。4-1BB根据白细胞分化抗原簇的命名又被称之为CD137。 CD137的天然结合配体是4-1BBL，又称作CD137L，在人体中位于19p13.3染色体，是一个II型跨膜蛋白，主要表达在DC细胞、B细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞上，并随着这些细胞的激活而进一步上调。与CD137一样，CD137L可以在非造血细胞中表达，例如内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞。CD137L也可在造血干细胞、中性粒细胞和成纤维细胞上被检测到。 多款CD137单克隆抗体已进入临床研究。其中，Bristol-Myers Squibb公司的Urelumab（BMS-663513, IgG4）和Pfizer公司的Utomilumab（PF-05082566, IgG2）进展最快，均处于临床II期。临床结果发现，Urelumab具有剂量依赖的肝毒性和引起疲劳等副作用，而Utomilumab虽安全性提高，但疗效有限。 研究成果 1.     CD137小分子激动剂的先导化合物筛选和分子优化 NFAT作为免疫应答中诱导基因转录的一类重要的转录因子参与细胞功能调节，并作为关键调节点参与细胞中多条信号传导通路的调节。为了进行小分子化合物的筛选，作者首先建立了一个稳定的Jurkat克隆（人T细胞系）细胞Jurkat-CD137-NFAT-luciferase（即JC-luc），包含过表达的hCD137以及一个由NFAT结合元件控制的荧光素酶基因组成的转基因，从而刺激hCD137导致荧光素酶表达 (图2A)。并通过CRISPR/Cas9敲除Jurkat-NFAT-luciferase中的hCD137基因获得J-luc-sgCD137。用激动性抗CD137抗体 (aCD137) 处理JC-luc细胞可以诱导强大的荧光素酶活性，但在J-luc-sgCD137细胞中没有出现。因此，JC-luc细胞是评估潜在CD137小分子激动剂的理想选择。 图2小分子化合物筛选系统原理图及筛选结果 随后，作者对已上市小分子药物库进行了筛选。结果发现，Ataluren (AT，图2B) 在JC-luc细胞中以剂量和时间依赖的方式诱导了强大的荧光素酶活性。然而，在功能验证性实验中，与DMSO相比，aCD137能够显著提高WT小鼠CD4+、CD8+ T的分裂增殖能力（图3A-C）、促进原代T细胞的激活（图3D-G）以及上调IL-2、IFNG和Perforin的产生和分泌（图3H-M），而AT对CD4+和CD8+ T细胞均没有活化作用。 图3 AT未能活化小鼠脾脏原代T细胞 综上所述，AT是一种弱效、低特异性的CD137激动剂：尽管它能够激发CD137信号，但只能在JC-luc细胞中CD137高表达的情况下才会发生。因此，为了筛选出高效且特异性更高的CD137小分子激动剂，作者对AT的化学结构进行了系统的结构优化。 AT的化学结构由三个芳环串联而成，作者采用生物电子等排及骨架跃迁等经典药物设计策略，分别对三个环的类型及其取代基进行了系统的结构优化，设计并合成一系列小分子化合物，并通过JC-luc细胞实验验证改构后的化合物对细胞中luciferase活力的影响（图4C-4F）。结果表明，当1,2,4-噁二唑3-位为间位羧基取代的苯基时，活性最佳；当5-位为萘基时，化合物2-25处理后的luciferase活力值最高，相对荧光值达2.23，EC50值最低（64 nM）；噁二唑的改造对活性不利。因此，后续对2-25（即JNU-0921）的生物学功能进行了探索。 特异性实验：与DMSO相比，anti-huCD137和JNU-0921均能显著促进JC-luc细胞中luciferase活力，而在J-luc、J-luc-sgCD137细胞中均没有促进作用（图4G）。这提示我们，JNU-0921靶向CD137的特异性高，没有脱靶活性。同时，通过RT-qPCR实验发现JNU-0921能够显著促进JC-luc细胞中IFNG和GZMB的转录水平（图4H）。 小鼠原代细胞增殖、激活和细胞因子分泌实验：与DMSO相比，JNU-0921和aCD137均能够显著提高WT小鼠CD4+、CD8+ T的分裂增殖能力（图4I-J）、促进原代T细胞的激活（图4K-N）以及上调IL-2、IFNγ的产生和分泌（图4O-R）。而相比之下，在KO小鼠中并没有观察到这些实验现象。这说明，JNU-0921是以CD137依赖的方式促进T细胞的活化。 以上结果表明，JNU-0921是一种有效的特异性激动剂，能够激活人和小鼠CD137。 图4 2.     JNU-0921通过直接与CD137的胞外结构域结合激活CD137信号 确认了JNU-0921对CD137的特异性激活作用后，作者进一步探究了JNU-0921具体是如何激活CD137信号通路的。 三聚体CD137Ls结合并引起CD137的三聚化，然后招募TNFR相关因子(TRAF) 并引发下游NF-κB和MAPK信号传导。为了确定JNU-0921具体是影响了CD137信号通路中的哪个环节，作者首先考察JNU-0921是否影响CD137的寡聚化。根据荧光素酶互补实验原理构建了两个质粒，分别是pCDH-CD137-Nluc和pCDH-CD137-Cluc，当两个质粒在细胞中共表达后，如果CD137分子之间发生多聚化，则Nluc和Cluc相互靠近并正确配位，从而产生荧光素酶活性。实验发现，在Jurkat细胞中JNU-0921能够以时间和剂量依赖的方式显著增强荧光素酶活力（图5A-B）。根据激光共聚焦实验原理，进一步构建了pCDH-CD137-GFP和pCDH-CD137-mCherry两个质粒，当两个质粒在293T细胞中共表达后，如果CD137分子之间发生多聚化，则GFP和mCherry靠近或重叠，并显示出强烈的共定位信号。实验发现，JNU-0921能够显著增强CD137-GFP和CD137-mCherry的共定位（图5C-D）。同时，根据CO-IP实验原理，进一步构建了pCDH-CD137-Nluc-3xFlag和pCDH-CD137-Cluc-Myc两个质粒，当两个质粒在293T细胞中共表达后，如果CD137分子之间发生多聚化，那么通过IP拉下来的蛋白会增多（Flag拉Myc显）。实验发现，JNU-0921能够增强CD137-Flag共免疫沉淀CD137-Myc的能力（图5E）。这些结果说明，JNU-0921能够结合并促进CD137寡聚化。 那么，JNU-0921是如何直接与CD137发生相互作用的呢？作者分别构建了hCD137胞内段/胞外段的293T-Luc细胞（CD137-IN、CD137-EXtra），在过表达胞外段蛋白的293T细胞中的荧光素酶互补实验结果显示，JNU-0921能够以剂量依赖的方式显著增强荧光素酶活力（图5F）。而相比之下，JNU-0921对过表达胞内段蛋白的293T细胞中荧光素酶活力的增强程度要小的多。同时，激光共聚焦实验结果显示，JNU-0921能够显著促进CD137-Extra-TM-GFP和CD137-Extra-TM-mCherry的共定位（图5G-H）。另外，免疫共沉淀实验结果显示，JNU-0921能够明显促进CD137-Extra-TM-Nluc-Flag免疫共沉淀CD137-Extra-TM-mCherry-Myc的能力（图5I）。而相比之下，CD137-Intra-TM-GFP-Flag却未能免疫沉淀CD137-Intra-TM-mCherry-Myc。热漂移实验发现，与对照相比，在50℃-72℃范围内JNU-0921能够结合并稳定CD137胞外蛋白，使其相对不容易因高温而变性析出（图5J-K）。以上结果说明，JNU-0921通过结合CD137蛋白的胞外段从而促进CD137寡聚化。 接下来，作者将JNU-0921与CD137全长分子进行了分子模拟对接研究。对接结果显示，JNU-0921嵌合在CD137胞外段形成的一个凹槽中。JNU-0921的羧基与K69侧链、C68位主链之间形成氢键相互作用（图5L）。进一步地，作者通过定点突变的方式对关键氨基酸进行单点突变，将69位赖氨酸突变成精氨酸（Arg，R），将68位半胱氨酸突变成丝氨酸（Ser，S）。热漂移实验显示，JNU-0921并不能结合和稳定CD137-K69R蛋白，而仍然能够结合和稳定CD137-C68S蛋白（图5M-O）。同时，荧光素酶互补实验分析显示，JNU-0921对CD137-WT蛋白和CD137-C68S蛋白多聚化的影响程度相当，而对CD137-K69R的多聚化作用显著减弱。这些数据表明，在JNU-0921与CD137胞外段发生相互作用的过程中，K69与JNU-0921之间的氢键相互作用发挥了主要作用。 综上所述，JNU-0921通过与CD137胞外段的K69侧链基团发生氢键相互作用而促进CD137多聚化，而与C68位点主链之间的相互作用的存在与否对JNU-0921结合CD137胞外段的影响并不显著。 图5 3.     JNU-0921有效激活CD137的信号传导 CD137三聚化后招募下游TRAFs多聚体，包括TRAF1：(TRAF2)2、(TRAF2)3和TRAF3：(TRAF2)2，并激活ERK、MAPK和NF-κB信号通路。因此，作者首先探究CD137在对JNU-0921刺激的反应中招募了哪些TRAFs复合体。借助CRISPR/Cas9技术，构建了同时敲除了TRAF1、TRAF2和TARF3的293T细胞系。荧光素酶互补实验分析显示，JNU-0921能够以剂量依赖的方式显著促进TRAF3-Nluc和TRAF2-Cluc的多聚化，相比之下对TRAF1-Nluc和TRAF2-Cluc、TRAF2-Nluc和TRAF2-Cluc多聚化的影响程度要小的多（图6A）。激光共聚焦实验显示，JNU-0921能够显著增强TRAF3-GFP和TRAF2-mCherry的共定位信号（图6B-C）。免疫共沉淀实验分析显示，JNU-0921能够增强TRAF2-Flag免疫共沉淀TRAF3-Myc的能力。而相比之下，JNU-0921均不能增强TRAF1与TRAF2或TRAF2与TRAF2的相互作用（图6D）。这些实验结果说明，JNU-0921促进CD137寡聚化之后招募了下游的TRAF3：(TRAF2)2复合体。 P65和IκB是NF-κB信号通路中的成员，二者磷酸化增强程度能够反应出该信号通路的激活程度。WB实验显示，JNU-0921能够以剂量依赖的方式明显增强Jurkat细胞中P65和IκB的磷酸化水平（图6E）。同样，在WT小鼠激活的脾脏原代细胞中也发现，JNU-0921和aCD137均能够明显促进IκB的磷酸化水平，且是剂量依赖的。而相比之下，在CD137KO小鼠的原代细胞中并没有观察到这一趋势（图6F）。此外，RT-qPCR实验分析显示，JNU-0921和aCD137均能显著提高WT小鼠中NF-κB信号通路下游靶基因如BCL-XL、BCL-2、BFL-1和Survivin等抗凋亡因子的转录水平，而在CD137KO小鼠中则没有发现促进作用（图6G-J）。小鼠原代细胞中的实验数据进一步证明，JNU-0921是特异性靶向CD137而发挥作用的。因此，JNU-0921能够通过CD137激活NF-κB信号通路。 图6 综上表明，JNU-0921结合CD137后招募TRAF3：（TRAF2）2复合体，进而激活NF-κB信号通路并上调抗凋亡因子的表达。 4.     JNU-0921通过激活T细胞免疫从而抑制肿瘤生长 MC38是一种源于小鼠结肠癌的非免疫原性肿瘤，因其具有独特的生物学特征如免疫逃避、生长速度快、易于操控等特点而被广泛应用于肿瘤免疫治疗、药物筛选等各个方面。Rag1（Recombination activating gene 1）是参与免疫球蛋白VDJ重组的RAG复合物成分。Rag1纯合敲除（Rag1-/-）小鼠体内缺乏成熟的T细胞和B细胞，NK细胞比例略有增加。作者通过在WT和Rag1-/-小鼠皮下种植MC38移植瘤模型来探究JNU-0921在体内治疗肿瘤的能力。结果显示，JNU-0921在WT小鼠中显著抑制了MC38肿瘤的生长，而在Rag1-/-免疫缺陷小鼠中则没有抑制作用（图7A-C）。流式细胞术检测分析发现，JNU-0921治疗之后WT小鼠肿瘤中浸润的CD8+ T细胞比例显著增加（图7D）。因此，JNU-0921可能是通过激活CD8+ T细胞免疫功能而促进抗肿瘤作用。 随后，作者利用WT小鼠EG7移植瘤模型进行实验验证。将EG7种植至小鼠皮下，3天后待肿瘤成型再回输OT1 CTLs，再用JNU-0921治疗两周。实验结果显示，JNU-0921能够显著促进CTLs去杀伤EG7，抑制肿瘤生长，显示出显著的抗肿瘤作用（图7E-H）。为了探究JNU-0921治疗对肿瘤微环境中T淋巴细胞免疫功能的影响，流式检测和分析发现JNU-0921的治疗能够显著上调肿瘤浸润CD8+ T细胞中IL-2、IFNγ和GZMB的表达，提高CD8+中央记忆T细胞的比例，并且抑制TIM-3、PD-1和CTLA-4等耗竭marker的表达（图7I-O）。这提示JNU-0921能够在体内激活CD8+ T细胞、促进其记忆形成并抑制其耗竭。同时，流式分析还发现，JNU-0921的处理能促进肿瘤浸润CD4+ T细胞中IL-2和GZMB的表达，提高CD4+中央记忆T细胞的比例，并且抑制TIM-3和PD-1的表达（图7P-R）。此外，JNU-0921治疗还降低了肿瘤结节中Treg细胞的绝对数量。 综上所述，JNU-0921通过激活T细胞免疫而有效缩小肿瘤。 图7 5.     JNU-0921增强CTL的效应和记忆功能 进一步探究JNU-0921在抗肿瘤过程中对免疫系统产生的具体影响，首先，作者在小鼠原代细胞实验上探究JNU-0921对CD8+ T细胞效应功能的影响。将WT B6小鼠和CD137KO小鼠脱颈处死，取脾研磨获得原代细胞，用Recombinant Human IL-2、2-ME、anti-moCD3、anti-moCD28刺激后，加入药物处理。实验发现，JNU-0921能够显著增强WT小鼠CD8+ T细胞的分裂增殖能力（图8A-B）并促进T细胞激活，上调CD25和CD69的表达（图8C-D），而在CD137KO小鼠中则没有增强作用。 在免疫系统抗肿瘤的过程中发挥杀伤作用的主要是肿瘤浸润细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。因此，作者进行细胞杀伤实验以验证JNU-0921能否促进杀伤作用。首先构建P815-aCD3模型：向小鼠肥大细胞瘤细胞P815上过表达anti-mouse CD3 scFv，那么T细胞可以不依赖MHC呈递抗原的方式识别靶细胞P815-aCD3。杀伤实验结果显示，JNU-0921和aCD137均能显著促进WT小鼠CD8+ T细胞的杀伤作用（图8E-F），而在CD137KO小鼠中则没有增强作用。CD8+ T细胞在杀伤肿瘤细胞时会产生和分泌细胞效应因子，而细胞因子分泌实验也显示出JNU-0921处理以后能够显著促进WT小鼠CD8+ T细胞IFNγ、Perforin的表达（图8G-H）。 综上所述，JNU-0921增强CD8+T细胞的效应功能。 图8 OT1小鼠被广泛应用于多肽在CD8+ T细胞对抗原的阳性选择和应答中的作用，是用于体内研究CD8+ T细胞生物学的理想材料。OT1小鼠的脾脏原代细胞在体外用OVA257-264抗原肽进行刺激2-3天后，流式检测会发现CD8+ T细胞比例占95%及以上。因此，作者采用OT1小鼠去更有针对性地探究JNU-0921对CD8+ T细胞效应功能的影响。 细胞分裂和激活实验分析显示，与上述WT小鼠中观察到的结果一致，JNU-0921显著增强了OT1 CD8+ T细胞的分裂能力（图9I-J）并促进T细胞的激活（图9K-L），而在OT1/CD137KO小鼠中则没有增强作用。杀伤实验结果表明，JNU-0921显著增强了OT1 CD8+ T细胞的杀伤能力（图9M-N）。与杀伤作用增强对应的，JNU-0921显著提高了CD8+ T细胞IFNγ、Perforin的表达水平（图9O-P），而在OT1/CD137KO小鼠中则没有增强作用。 图9 随后，作者考察了JNU-0921对记忆性CD8+ T细胞分化的影响。采用EG7反复刺激OT1 CTL生成CD8+记忆T细胞 (图10A)。FACS数据显示，JNU-0921可诱导OT1初始CD8+ T细胞分化成CD44+CD62L+细胞 (图10B-C)，同时下调包括PD-1、CTLA-4和TIM-3在内的耗竭标志物的表达 (图10D-F)。RT-qPCR分析显示，JNU-0921处理增加了抗凋亡因子的转录水平，包括BCL-XL、BCL-2、BFL-1和Survivin (图10G-J)。 图10 此外，为了明确阐明JNU-0921对体内记忆细胞分化的影响，作者采用表达卵白蛋白 (LM-OVA) 的单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 感染CD45.1 C57BL/6J小鼠，然后在第二天通过尾静脉注射转移CD45.2 OT1 CTL。按照早期方案，在JNU-0921治疗45天后，分析脾脏和血液中中央记忆T细胞的比例 (图11A)。FACS分析显示，JNU-0921处理增加了脾脏和血液中中央记忆细胞的比例(图11B-D)。 综上所述，JNU-0921能够促进初始CD8+ T细胞向中央记忆T细胞分化并增强其效应功能。 图11 6.     JNU-0921通过增强Th1的辅助功能和抑制Treg活性来增强CTL在trans中的功能 图7数据可知，在JNU-0921治疗的小鼠中，肿瘤浸润的CD4+ T细胞表现出更高的效应和记忆功能，这表明CD4+ T细胞可能参与了JNU-0921的肿瘤缩小作用。事实上，作者也验证了CD4+ T细胞的耗竭会降低JNU-0921的治疗效果，正如CD8+ T细胞的耗竭一样 (图12A-C)。为了研究JNU-0921对CD4+ T细胞极化的影响，作者将JNU-0921作用于Th1和Th2极化条件下培养的CD4+ T细胞。有趣的是，JNU-0921促进Th1极化，抑制Th2分化 (图12D-G)，与前期报道一致。此外，JNU-0921可促进CD4+ T细胞的增殖和活化 (图12H-J)；而在CD137KO小鼠中则没有观察到这些实验现象。这表明，JNU-0921能够促进初始CD4+ T细胞向有利于细胞免疫的方向极化。 为了探索JNU-0921通过增强Th1功能促进CTLs功能的可能性，作者分离CD4+细胞并使其在体外向Th1极化。然后将这些Th1细胞分别以1:1的比例与CFSE标记的WT或CD137KO背景的OT-1 CTL混合。FACS分析显示，Th1能有效促进CTL增殖 (图12K-L)。在此基础上，JNU-0921和aCD137的处理能够进一步显著促进OT1小鼠CD8+ T细胞的增殖，而在OT1/CD137KO小鼠中则没有促进作用 (图12K-L)，无可置疑地表明JNU-0921通过促进Th1的辅助功能来增强CTL的功能。 图12 随后的Treg极化实验发现，JNU-0921和aCD137能够显著下调Treg（CD4+CD25+FOXP3+）的比例及其典型生物标志物CTLA-4和ICOS的表达，说明初始CD4+ T细胞向Treg方向的极化被抑制（图13M-R）。为验证JNU-0921在减弱Treg抑制功能的作用，作者根据Miltenyi Biotec的CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit分选了CD4+CD25-效应性T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞，分别与OT1或OT1/CD137KO脾脏原代细胞以1:1比例进行共孵育，并加入JNU-0921进行处理后流式检测CD8+ T细胞的分裂情况。流式分析显示，CD4+CD25+细胞能够显著抑制T细胞的增殖，这证明了实验体系的有效性。在此基础上，JNU-0921和aCD137的加入能够显著促进OT1 CD8+ T的分裂，而在OT1/CD137KO小鼠中没有促进作用（图13S-T）。实验结果说明，JNU-0921能够逆转Treg对效应CD8+ T细胞增殖的抑制作用。 综上所述，JNU-0921能够诱导初始CD4+ T细胞向有利于抗肿瘤免疫的方向极化，增强Th1促进CD8+ T细胞功能的能力，并逆转Treg对CD8+ T细胞的抑制作用。 图13 小结 激动型CD137抗体的应用受限于严重的肝毒性（Urelumab）和弱效性（Utomilumab）。与抗体相比，小分子激动剂具有更好的药代动力学特性和组织渗透性，且对人类的抗原性较低，更适用于临床治疗，并可能降低治疗成本和不良反应的发生率。鉴于CD137共刺激信号在免疫系统中的重要作用及其抗肿瘤活性，本文开展了CD137的小分子激动剂的开发工作。首先，通过构建针对CD137信号轴的高通量小分子药物筛选系统，成功筛选到小分子先导化合物AT，并通过结构优化获得了一个没有脱靶活性且依赖CD137共刺激信号激活T细胞的化合物JNU-0921。JNU-0921通过CD137激活NF-κB信号通路，有效增强CD4+和CD8+ T细胞的效应和记忆功能，增强Th1辅助功能，削弱Tregs的抑制作用，从而发挥显著的抗肿瘤作用。根据目前文献报道，JNU-0921是首个CD137小分子激动剂，具有显著抗肿瘤活性及低毒性。 本文的通讯作者分别为暨南大学陈良教授、中国科学院上海有机化学研究所丁克研究员和暨南大学周倩副研究员，共同第一作者分别为刘鹭（PhD，暨南大学）、陈峰华（MD，暨南大学）、李姗（PhD，中国科学院杭州医学研究所）和杨童（PhD candidate，暨南大学）。 原文链接：https://www-science-org.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1126/sciadv.adp8647 撰稿：李姗陈峰华 核对：刘鹭 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

前言肿瘤细胞采用各种策略来适应并抵抗免疫系统的攻击，这些机制统称为适应性免疫耐受(Adaptive Immune Resistance，AIR)。第一个AIR机制是在肿瘤中通过IFN-γ选择性诱导PDL1。抗PD治疗可以使部分晚期癌症患者缓解，特别是实体肿瘤患者。然而，许多临床试验联合抗PD治疗和其他抗肿瘤药物联合治疗，没有一个强有力的机制基础，未能确定协同或加性效应。此篇综述于2022年6月14日发表在Nature Reviews Drug Discovery上，这里讨论了理解AIR机制是未来指导药物开发的关键点，以及可以改善当前癌症治疗的方案。AIR的猜想众所周知，PD1在血液和肿瘤微环境（TME）中由活化的T表达，但是在T细胞激活前在TME中没有发现PDL1。并且，在一些表达PDL1的肿瘤中，没有明显的T细胞浸润（称为IV型肿瘤）。PD1-PDL1通路似乎是晚期癌症患者中占主导地位的AIR机制。AIR机制不同于一般的免疫抑制机制，如免疫检查点CTLA-4，因为在健康的个体中，CTLA-4是抑制自身反应所必须的，主要通过Treg调控。另一个是TGFβ，它可以抑制不必要的炎症和自身免疫，除了正常的稳态机制中有广泛的作用。除了PD1-PDL1通路，在TME中还存在其他的AIR机制。许多肿瘤在没有PDL1表达的情况下，可以被功能失调的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)浸润。此外，冷肿瘤没有明显的炎症和免疫反应，情况独特。总之，晚期癌症患者可以同时依靠多种AIR机制来逃避免疫攻击。AIR的分类据统计，实体瘤患者中25%的患者，和血液瘤中的40-60%患者对抗PD治疗有反应。不同肿瘤患者应答也有差异，在进行治疗前，准确判断哪些患者会有反应很重要。我们基于肿瘤免疫微环境(TIME)提出了四种不同类型的人类癌症（图1），以更好地定义免疫状态，预测肿瘤对抗PD治疗的反应和无反应或者耐药性。图1抗pd治疗的耐药性取决于肿瘤免疫微环境的类型2.1 Primary resistance我们将抗PD治疗的最初耐药定义为对II型肿瘤的抗PD治疗最初没有反应，II型肿瘤同时有PDL1表达和T细胞浸润(图1)。在黑色素瘤、肺癌和膀胱癌中，与PDL1−肿瘤相比，PDL1+肿瘤与抗PD治疗的更高应答率相关。然而，TILs的存在，尤其是CD8+ T细胞，还没有被用作预测生物标志物来选择患者。因为IV型肿瘤不存在T细胞浸润，抗PD治疗也不会产生反应，所以抗PD治疗的最初耐药不能仅根据PDL1阳性来确定。我们不知道抗PD治疗需要多少PDL1在TME中表达才能起作用。穿刺活检的肿瘤组织采样可能会漏掉PDL1+区域，但是可以通过对同一个肿瘤进行多次活检来避免。放射性同位素标记的PD1变异体或抗PDL1单抗在体内成像可能是评估PDL1在更大区域肿瘤表达的更好方法。总之，PDL1的表达可能是动态的，因为它在很大程度上是诱导的，这表明从活检开始到抗PD治疗开始，表达可能会有所不同。除了PDL1的表达，评估其他共抑制分子和共刺激分子的表达也很重要，以充分利用有效的免疫反应。这可能是抗PD治疗初期耐药性的关键。虽然TILs的存在似乎是必要的，但仍不清楚是哪些关键的细胞成分，以及TILs上的分子成分决定了初级耐药。CD8+和TME中的Th1细胞始终与较好的预后相关，这些细胞可能是预防原发性耐药的必要细胞成分。其他TIL成分包括CD4+ T细胞亚群、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、B细胞、T reg细胞、γδ T细胞以及先天淋巴细胞，在TME中的作用尚不清楚。2.2 Acquired resistance四分之一到三分之一的转移性黑色素瘤患者最初对抗PD治疗有反应，但是会随着时间的推移复发。肺癌的治疗过程中也发现了这种情况。这些患者表现出对抗PD治疗的获得性耐药性。目前还没有明确的生物标志物或临床标准来预测复发，也没有大量收集病例来论证其共同机制的报道。临床观察为获得性耐药可能的潜在机制提供了一些线索。获得性耐药患者仍然可能是PDL1和PD1表达阳性。在某些情况下，复发的患者在停药一段时间或化疗后可以恢复对抗PD治疗的反应。在这些病例中，获得性耐药性不能用肿瘤抗原突变或丢失引起的肿瘤变异来解释。肿瘤细胞可能会发生内在变化，从而降低对免疫攻击的易感性。2.3 Target-missing resistance缺乏PD1或PDL1表达的肿瘤都被归为“靶缺失”。 因此，观察到I、III和IV型TIME（tumour immune microenvironment）患者对抗PD治疗的反应较差并不奇怪。在60-85%的实体肿瘤中出现靶缺失耐药(如表1)。这就是为什么只有一小部分患者对抗PD治疗有反应的主要原因。TIME type I和type IV的一个共同特征是缺乏TILs。检测肿瘤组织中的PD1和PDL1来制定纳入排除标准很重要。TIME型肿瘤有T细胞浸润，但缺乏PDL1表达。因此，与I型和IV型肿瘤不同，III型肿瘤可以招募T细胞，但这些细胞不能正常分化成完全成熟的细胞T细胞。在III型肿瘤中缺乏PDL1表达表明这种分化过程的缺乏，如缺乏IFNγ。这表明在抑制T细胞中存在非PD1 - PDL1 AIR机制。目前的联合治疗方案在晚期黑色素瘤患者中，抗PD治疗已被证明优于抗CTLA4治疗，因为其提高了总生存期也降低了毒性，因此在探索免疫治疗联合其他药物的临床试验中，抗PD治疗是最常见的方案。3.1 Combination with anti-CTLA4联合抗CTLA4治疗(ipilimumab)在转移性黑色素瘤患者中的单药活性在很大程度上得到了增强。这种序贯方法可能有助于降低显著毒性，同时保持疗效。事实上，对抗PD治疗有耐药性的患者对抗CTLA4治疗仍然有相当的反应率。3.2 Combination with chemotherapy众所周知，标准化疗对高增殖细胞有广泛的细胞毒性作用，特别是对造血和免疫系统。因此，全身化疗是免疫治疗的天敌。一些研究表明，某些化疗药物可以通过消除Treg细胞来促进T细胞免疫，以及增加肿瘤细胞死亡时抗原释放，从而能够刺激T细胞介导的免疫。效应T细胞可以分化为记忆细胞，这对长期免疫保护至关重要。目前，尚不清楚化疗是否会对长期记忆免疫细胞的产生产生不利影响，更好地了解化疗如何影响免疫系统对未来的临床试验至关重要3.3 Combination with targeted therapy靶向细胞内信号通路负责细胞的生长或生存与小分子已被证明在快速减少肿瘤体积有效。然而，许多这样的药物并没有持久的作用，主要是由于出现其他补偿途径。这一特点似乎是对抗PD治疗的补充，抗PD治疗可以产生长期效果，但通常需要数月的时间让免疫细胞在TME中繁殖和协调它们的功能。因此，靶向治疗既能抑制肿瘤生长，又不会对免疫系统造成不利影响，是与抗帕金森病治疗相结合的潜在选择。未来的联合治疗4.1 Altering the TME locally一项晚期黑色素瘤的Ib期临床试验结果表明，TLR9激动剂与抗PD治疗联合时显示出联合效应。然而，一项对实体肿瘤或淋巴瘤患者的试验的早期结果表明，STING激动剂在单药治疗中效果甚微，并且将其与抗PD治疗相结合的价值仍不确定。为了在临床中发挥作用，这些药物必须激活先天免疫，诱导成功的炎症反应，从而吸引免疫系统的适应性，如T细胞，最后诱导活化的T细胞分布到身体的其他部位，以抑制继发性肿瘤或转移。目前，尚不清楚这些因子是否触发了先天免疫，即使这些因子成功地刺激了先天免疫，也不能保证自发地产生适应性免疫，正如在许多冷肿瘤中所显示的那样，在这些肿瘤中，中性粒细胞甚至巨噬细胞仍然可能存在于TME中。4.1.1 Local radiation辐射会对组织和细胞产生深远的影响。除了破坏细胞外，它还触发先天免疫，随后在某些情况下促进免疫渗入肿瘤。理论上，放疗应该适合TIME  I型和IV型肿瘤患者产生新生炎症。但是，在TIME type II和III型肿瘤中不应考虑或应谨慎应用，因为辐射可能损害现有的TILs。4.1.2 Local administration of oncolytic viruses.最初使用溶瘤病毒治疗癌症的理由是，有些病毒只在癌细胞中复制，而不在正常细胞中复制。除了病毒固有的溶瘤特性外，一些产品的修饰已被应用于调节免疫反应，如插入细胞因子、重组抗体、T细胞接合配体和肿瘤抗原。4.1.3 Blockade of immunosuppression许多通用的免疫抑制机制在体内运行，以控制自身反应性免疫反应和/或过度反应性炎症反应。与AIR机制相反，这些机制并不一定是由癌症甚至炎症诱导或促进的，而是维持正常的内稳态所必需的。4.2 Enhancing T cell-mediated immunity4.2.1 Adoptive T cell therapy对于TIME I型和IV型肿瘤，CAR-T细胞和体外扩增的抗原特异性T细胞或TILs，是增加肿瘤部位T细胞浸润的一种有吸引力的方法。这种方法存在一些障碍，首先，转移的T细胞激活后应保持迁移到肿瘤组织的能力；其次，回输T细胞在TME中仍然可能遇到除PD途径外未知的AIR机制。这目前很难预测，也可能是T细胞治疗实体肿瘤的临床试验失败的主要原因。选择性地培养或对T细胞改造有望抵抗各种AIR机制。4.2.2 T cell co-stimulation与T细胞过继疗法相似，共刺激可以极大地促进T细胞的扩增和活化。CD80-CD28在肿瘤免疫的刺激中有望增加癌症患者免疫力。CD137能够促进T细胞扩增，和细胞毒性，还能够增加细胞因子效应。并且CD137与抗PD治疗的单药与联合治疗有很好的效果。OX40和OX40L激动剂单抗也在临床试验中。CD40和CD40L向树突状细胞传递强烈的信号，可以增强T细胞的启动和激活，也在进行临床试验。结语肿瘤诱导的AIR机制的发现和选择性阻断它们的治疗方法，已被证明对癌症患者有效，如抗PD治疗。通过对人类TME的解剖、分析和分类，我们发现了其他具有复杂性质和高度异质性的AIR机制的存在，我们很可能只是观察到冰山一角。尽管如此，仍有可能确定在TME中起作用的一些主要的AIR机制，从而使设计更具体的治疗方法成为可能。了解并针对这些新的AIR机制，将能在不久的将来有效治疗更多的癌症患者。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

国内创新药企业正在放弃在红海扎堆，转而挑战创新药的地狱模式。比如说CD40激动剂。在近20年的研发中，包括罗氏、艾伯维、诺华在内的大药企都在CD40这一靶点上栽过跟头，单抗、ADC、联合用药统统不灵。可以说，与免疫抑制剂相比，CD40激动剂的研发难度是地狱级别的，往前看并没有成功的经验可以借鉴，往后看能否成药也有诸多不确定。不过，面对种种风险国内药企却是不惧失败，已有恒瑞医药、百奥赛图、礼进生物等药企入局开发CD40。国内药企之所以“头铁”硬刚这一难以攻克的靶点，既可以说是不断攀登创新药高峰，也可以说是，为形势所迫。随着创新药领域低垂的果实被摘完，国内创新药企不能永远停留在避风港，去挑战难度更高的创新药研发，是它们避不开也逃不掉的未来。/ 01 /CD40之困，难以平衡的药效与安全性PD-1、CTLA-4等免疫检查点抑制剂的出现，开启了肿瘤的免疫治疗时代。然而，令医患双方苦恼的是，不少患者体内的肿瘤压根对免疫治疗“不理不睬”。主要原因是这些患者的免疫系统不能被激活，也就是我们所说的“冷肿瘤”。如何“加热”冷肿瘤，让更多患者都能从免疫治疗中获益呢？研发免疫激动剂是一种可行的思路。在众多免疫共刺激因子中，CD40受到了最多的关注，其能够作为免疫系统的开关，将无法产生足够的免疫反应的冷肿瘤，转化为可以产生免疫反应的热肿瘤。CD40属于肿瘤坏死因子受体家族中的一员。CD40能够与其配体CD40L结合激活树突状细胞，通过上调其他的共刺激分子的表达，下调免疫抑制分子的表达来提高抗原呈递能力。  具体来说，CD40激动剂能通过两种不同的机制来触发对抗肿瘤的作用：一种是间接法，通过激活特异性免疫杀伤肿瘤；另一种是直接法，通过细胞凋亡、抗体依赖性细胞毒性直接杀伤肿瘤。因为作用较为明确，所以入局CD40激动剂研发的药企不在少数，比如罗氏、强生、百时美施贵宝等等。作用机制明确、大药企入局，看起来是不是感觉CD40靶点还是很有前途的？但理想很丰满，现实很骨感。在对CD40近20年的研究中，至今没有一个药物成功进入到临床三期。把CD40研发困在原地的是难以平衡的药效和安全性，在多个临床试验中均观察到严重的剂量限制毒性。这不难理解。与免疫抑制剂给免疫系统“踩刹车”的作用正相反，免疫激动剂的作用是“踩油门”，加大免疫系统的作用强度。抑制剂只要能与特异性受体结合，就离成功不远，而对激动剂来说，与受体结合只是第一步，后续还需要考虑二者的结合力、是否完全阻断天然配体与受体结合、受体占有率等多种因素。简单来说，在激动剂“踩油门”的机制下，如果油门踩得太猛，很容易出现误伤，但踩得太轻则有可能发挥不出效果。因此，激动剂的效果总是和毒性相伴而行，随着效果的提升毒性也增加，反之当毒性降低时，药物则会因剂量不足难以起效。这就导致，大部分的激动剂治疗窗较窄。CD40激动剂的研发就像一个跷跷板，左边是药效，右边是毒性，想要让这个跷跷板保持平衡并不简单。/ 02 /ADC、单抗、联合疗法通通折戟面对这些问题，药企尝试了多种解题思路。从单抗到联合疗法，再到如今大火的ADC，但目前仍没有药企成功突破CD40的桎梏。先来看单药。CD40单药抗体的临床活性并不算高，想要靠CD40单药问世希望并不大。不过，单药疗效不够，可以联合用药来凑。不少成功的靶点都是单药作用不强，但通过与PD-1联用救回来的。更何况，激动剂能够把肿瘤由冷变热，是PD-1天生的好帮手。这让探索CD40单抗联合PD-1变成一条看上去可行的路，其中Apexigen的APX005M单抗也曾一度被寄予厚望。因为，在多个临床研究中都发现抑制性IgG受体（FcγRIIB）介导的交联反应，对CD40激动剂抗体的抗肿瘤活性非常重要。而相比老一代CD40激动剂，APX005M通过提高FcγRIIB亲和力，增强了交联反应。此前不少人认为，APX005M或许能够成为首个问世的CD40单抗。不过，人们还是过于乐观了。2020年12月，Apexigen先是终止了APX005M联合O药治疗NSCLC和黑色素瘤的临床试验。随后，APX005M联合O药及化疗治疗胰腺癌的临床试验同样以失败告终。在APX005M联合O药及化疗治疗一线转移性胰腺癌的临床二期临床试验中，APX005M联合PD-1与化疗的效果，还不及PD-1与化疗的效果。具体来看，O药联合化疗的实验组中，患者一年总生存率为57.7%，中位总生存期为16.7个月，客观缓解率为50%；而APX005M联合O药及化疗的实验组中，患者一年总生存率为41.3%，中位总生存期为11.4个月，客观缓解率只有33%。 不难看出，CD40激动剂的加入反而起到了反作用，不仅没能延长生存期反而使得患者获益减少。除了联合疗法，如今风头正盛的ADC药物，面对CD40也栽了跟头。早在2015年8月，强生就和Alligator合作开发了以激动型CD40单抗作为弹头的ADC药物，ADC-1013。理论上，ADC-1013对CD40 的激活能使树突状细胞有效刺激免疫反应的武器T细胞，允许免疫系统选择性攻击癌症。但是，同样较窄的安全窗限制了ADC-1013发挥作用。在2019年ASCO年会上，Alligator公布了ADC-1013临床一期研究的部分数据，在纳入研究的95例实体瘤患者中，仅在一例肾细胞癌患者中观察到了部分缓解。看上去，这一效果还不及APX005M。或许是因为ADC-1013的表现不佳，不到四年时间强生就与Alligator分手，2019年7月强生退还了ADC-1013的权益。不少药企尝试不同疗法，却无一成功，这让CD40靶点的未来陷入黑暗。虽然已经进入临床研究20多年，但CD40靶点的前途反而愈发扑朔迷离。去年9月由于效果不佳，诺华终止了CD40激动剂CFZ533用于肾移植患者的II期研究。此外，还有渤健、罗氏、百时美施贵宝、安斯泰来等多个大药企先后放弃CD40的研发。CD40激动剂还有没有未来，谁也不敢给出一个肯定的答案。/ 03 /国内药企“头铁”背后，形势比人强虽然CD40的前路成迷，但这并没有影响国内药企的开发热情，仍有不少药企“头铁”地布局了CD40激动剂。比如恒瑞医药、天广实、礼进生物都布局了CD40激动剂，百奥赛图则同时研发了CD40激动剂和抑制剂，对应肿瘤、“自免”治疗。其中，礼进生物更是部署了PD-1+4-1BB+CD40+VEGF+环磷酰胺五连疗法。除了单抗，不少药企还在研发CD40的双抗，比如天广实开发PD-L1/CD40双抗，百奥赛图开发PD-1/CD40双抗。不过，国内药企的研发均处于临床早期，能否走到最后仍是一个未知数。那么，面对海外药企的频频失利，国内药企为何还能如此“头铁”？原因或许在于，创新药低垂的果实被摘完后，药企的选择并不多了。近些年来，随着行业的不断发展，创新药低垂的果实已经越来越少，新药研发难度越来越高。根据PhRMA 数据，美国2013年研发支出510亿美元，到了2021年这一数字翻了近一番，达到800亿美元。而与此相反的是，研发支出的增加并没能带来更多的新药。低垂的果实已经被摘完了，摆在国内药企面前的无非两条路，要么扎入确定性高的红海拼个你死我活，要么找个难度高对手少的领域，不成功便成仁。所以，挑战难度更高的创新药，势必会成为国内创新药企未来难以避开的路。而在众多难以搞定的靶点中，CD40或许还算容易的那个。经过20多年的探索，CD40激动剂研发之路虽然艰难，但好在有前人的经验可以借鉴。创新药的发展必然不会一蹴而就，而是需要时间沉淀与验证。在这个过程中，总还是需要一些”头铁”的人去探路。话又说回来，也正是这些“头铁”的人去挑战地狱模式的创新药，中国创新药才能不断向前，拥有更好的未来。文／方涛之版权声明/免责声明本文为授权转载文章，版权归拥有者。仅供感兴趣的个人谨慎参考，非商用，非医用、非投资用。欢迎朋友们批评指正！衷心感谢！文中图片、视频为授权正版作品，或来自微信公共图片库，或取自公司官网/网络根据CC0协议使用，版权归拥有者。任何问题，请与我们联系（电话：13651980212。微信：27674131。邮箱：contact@drugtimes.cn）。衷心感谢！推荐阅读艰难的决定！撤掉「肿瘤部门」，关闭全资子公司，卫材在下一盘大棋？首款国产新冠中和抗体，不仅是抗疫的新助力，更是新药研发成功的经典案例...热烈祝贺「中国肝病新药联盟」成立！新一届组委会诞生！智慧芽创始人、CEO张济徽：生物医药，智慧芽笃定的未来黎健博士 | 生子当如布鲁斯！——诺贝尔奖得主Bruce Beutler教授的故事热烈祝贺《中国药理学报》「NASH专刊」出版！十多位专家分享真知灼见，中国NASH新药联盟和药时代全力协助PD-1出海接力赛：FDA官网更新了「7月12日批准」的药物名单，没有百济神州...Moderna突破Moderna！变革从新品牌、新Logo开始。。。沙利文发布《眼科药物市场发展现状与未来趋势研究报告》（内附完整报告获取方式）如何解读反弹后稳住的恒瑞医药当出海已经关乎药企的「生与死」，我们还能如何寻求助力？| 药时代出海系列阿尔茨海默病：何以解忧，唯有新药集采第七轮来临，恒瑞业绩拐点究竟何在？2100万美元收购！Portage Biotech全力以赴地投身于腺苷通路艾伯维放弃了2.25亿美元的药物！阿尔兹海默病领域再度遇挫...2022年上半年中国新药出海成绩单！国产PD-1再次奋勇出海，百济神州和君实谁能率先成功上岸？。。。| 药时代出海系列点击这里，欢聚药时代！