EGFR L858R x EML4-ALK x EGFR T790M

TIS2024第四届自免疾病细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，详询：王晨 180 1628 8769 以PROTACs为代表的靶向蛋白质降解技术已经成为了一种极具前景的药物研发新策略，目前已有超过30种候选药物处于临床试验阶段。尽管PROTACs已经实现了对多种致病靶标的降解，但用于构建蛋白质降解技术的降解信号以及E3连接酶类型仍然是有限的。目前，只有VHL和CRBN两种E3连接酶被广泛应用到PROTACs的设计。因此，现阶段迫切需要探索其它蛋白质降解信号用于构建新型蛋白质降解技术。2024年8月8日，南方科技大学饶海教授团队在Journal of Medicinal Chemistry上发表了题为“Distinct Amino Acid-Based PROTACs Target Oncogenic Kinases for Degradation in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC)”的论文。该研究基于三种能够触发N-末端降解途径的氨基酸（脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸）开发了一种新型的PROTACs(也称为AATacs)，并且利用AATacs在非小细胞肺癌中成功降解了两种致癌蛋白激酶EML4-ALK和EGFR-L858R/T790M。 N-末端蛋白质降解途径是上世纪80年代发现的一种由泛素介导的蛋白质降解途径，早期的研究确立了位于N-末端的精氨酸和组氨酸等多种氨基酸能够被UBR家族E3连接酶识别，被认为是N-末端蛋白质降解途径的主要信号。最近的一些研究证实了甘氨酸和脯氨酸也可作为N-末端途径的降解信号，其分别能够被CRL2家族的E3连接酶ZYG11B或ZER1以及GID4识别介导蛋白质的降解。因此，为了构建基于N-末端途径的AATacs，作者以Brigatinib为靶蛋白配体，甘氨酸、脯氨酸以及赖氨酸为N-末端蛋白质降解信号，设计了一类靶向降解ALK和EGFR的AATacs。作者首先以脯氨酸为N-末端蛋白质降解信号，探究了合适的Linker长度，结果发现以4个PEG单元为Linker的Pro-PEG3-BA降解效率最优。随后作者固定优势Linker，将脯氨酸替换为甘氨酸和赖氨酸作为N-末端降解信号，设计了一系列AATacs。此外，作者还将脯氨酸替换为无法触发N-末端降解信号的鸟氨酸设计了Orn-PEG3-BA作为阴性对照（图1）。 图1 AATacs的设计和结构优化 随后，作者探究了基于脯氨酸构建的包含不同PEG的AATacs的降解效率，结果发现在大于1 μM浓度条件下，四个化合物都能在H3122细胞中诱导明显的EML4-ALK降解。此外，这类化合物还能在H1975细胞中实现对EGFR L858R/T790M的降解。综合比较，Pro-PEG3-BA的降解效率相对较高（图2A）。通过将脯氨酸替换为赖氨酸和甘氨酸的Lys-PEG3-BA和Gly-PEG3-BA在H3122细胞中也能不同程度地诱导EML4-ALK降解，而阴性对照Orn-PEG3-BA处理组未观察到明显的EML4-ALK降解（图2B）。作者还通过全蛋白质组学分析探究了Pro-PEG3-BA的降解谱，结果显示ALK水平是经Pro-PEG3-BA处理后H3122细胞下降最明显的蛋白质，这证明了Pro-PEG3-BA具有较好的选择性（图2C）。 图2 AATacs对EML4-ALK和EGFR L858R/T790M降解效率和选择性评估 接下来，作者进一步评估了基于三种氨基酸构建的AATacs对EML4-ALK和EGFRL858R/T790M的DC50和Dmax，结果显示Pro-PEG3-BA，Lys-PEG3-BA和Gly-PEG3-BA在H3122细胞中的DC50在0.42-1.32 μM之间，Dmax都能够达到90%以上（图3A和3B）。三个化合物对EGFRL858R/T790M的降解效果相对较差，DC50在13.5-20.2 μM之间，Dmax在43-69%之间（图3A和3B）。此外，作者通过CCK-8还评估了三个化合物对H3122和H1975细胞的增值抑制效果。结果显示三个化合物对H3122细胞的IC50在0.16-5.30 μM之间，对H1975细胞的IC50在8.80-20.74 μM之间（图3C）。 图3 基于不同氨基酸构建的AATacs的降解效率和抗增殖效率评估 为了进一步探究AATAcs诱导EML4-ALK和EGFRL858R/T790M降解的作用机制，作者分别在蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹处理的H3122和H1975探究了Pro-PEG3-BA的降解效率。可以发现MG132可以部分抑制Pro-PEG3-BA对EML4-ALK和EGFRL858R/T790M的降解，这说明ATTacs诱导蛋白质降解是基于蛋白酶体的功能实现的（图4A）。此外，在经Cycloheximide处理的细胞中，Pro-PEG3-BA能够更加快速地导致EML4-ALK和EGFRL858R/T790M水平降低（图4B）。进一步加入MG132能够抑制对EML4-ALK和EGFRL858R/T790M的周转，延长其半衰期（图4C）。加入靶蛋白配体Brigatinib会导致Pro-PEG3-BA对EML4-ALK的降解受到抑制（图4D）。这些结果表明Pro-PEG3-BA诱导了靶蛋白的降解。随后，为了证明AATacs诱导蛋白质降解是否是通过N-末端降解途径实现的，作者构建了GID4敲除的H3122和H1975细胞。可以发现GID4敲除后，Pro-PEG3-BA对EML4-ALK和EGFRL858R/T790M的降解能力丧失（图4E和4F）。同理，在ZYG11B敲除的细胞中，Gly-PEG3-BA的降解能力明显降低（图4G和4H）。最后，作者还评估了Pro-PEG3-BA对细胞周期和凋亡的影响，结果表明Pro-PEG3-BA能够以浓度依赖的方式诱导H3122和H1975细胞阻滞在G1期，并显著增加了早期和晚期凋亡细胞的比例。 图4 AATacs的作用机制探究 最后，作者还在小鼠模型中评估了Pro-PEG3-BA的PK属性，结果显示20 mg/kg静脉给药后，半衰期（T1/2）为2.9小时，最大血药浓度（Cmax）为3.7 μg/mL，曲线下面积（AUC）为6.0 h*μg/mL；50 mg/kg腹腔注射给药后，半衰期（T1/2）为5.2小时，最大血药浓度（Cmax）为33 μg/mL，曲线下面积（AUC）为81 h*μg/mL，生物利用度为53.2%（图5A和5B）。在H132异种移植模型中的PD实验显示腹腔注射给药10 mg/kg的条件下，24 h后Pro-PEG3-BA就能够显著降低肿瘤组织中ALK蛋白的水平（图5C）。 图5 Pro-PEG3-BA的PK和PD研究 综上所述，该研究利用脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸作为降解信号成功构建了一类基于N-末端降解途径的AATacs，系统地探究了这类AATacs在肿瘤细胞中对癌蛋白EML4-ALK和EGFRL858R/T790M的降解效率和降解机制，并初步评估了其对NSCLC的治疗潜力。该研究拓展了当前蛋白质降解领域有限的E3连接酶和蛋白质降解信号类型，为新型蛋白质降解技术的构建提供了一种新思路。 原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.4c00208 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 TIS2024第四届免疫细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，详询：王晨 180 1628 8769 戳“阅读原文”立即领取限量免费门票！