TCF4

表观遗传机制是真核细胞丰富基因表达层次的重要策略。组蛋白翻译后修饰可以调控下游基因转录事件，不同组蛋白位点的不同的修饰类型通常需要被特定的“阅读器”识别，进而调控下游转录事件。转录共激活因子Spindlin1 具有串联的三个Tudor结构域，其中， 第一和第二个Tudor结构域的芳香笼口袋可以识别多种组蛋白甲基化修饰类型，其中包括H3K4me3, H4K20me3, H3“K4me3-R8me2a” 和 H3“K4me3-K9me3” 等（1-4）。然而， 由于第三个Tudor结构域由于不具有完整的芳香笼口袋，其功能尚未完全知晓。2017年，得克萨斯大学安德森癌症中心Mark Bedford 课题组鉴定 SPINDOC为Spindlin1的相互作用蛋白，并可以衰减Spindlin1的转录激活的作用，但是其分子机制尚未可知（5）。近日，清华大学李海涛课题组与德克萨斯大学安德森癌症中心Mark Bedford 课题组、清华大学高军涛副研究员紧密合作，针对此问题在《J Mol Biol 》杂志在线发表了最新研究成果：“Molecular Basis for SPINDOC-Spindlin1 Engagement and Its Role in Transcriptional Attenuation”。该项工作发现SPINDOC通过一段疏水肽段与Spindlin1形成稳定的复合物，同时位于疏水肽段前的碱性肽段可以竞争性抑制Spindlin1对组蛋白的识别作用，进而减弱Spindlin1对下游基因的转录共激活作用。本论文被J Mol Biol杂志即将出版的致敬已故表观遗传学先驱C David Allis教授的“Histone and DNA modifications（2024）”专辑收录。研究人员通过解析SPINDOC-Spindlin1的复合物晶体结构发现SPINDOC 一段疏水多肽形成反向平行的β-折叠片层，并稳定地与Spindlin1第三个Tudor结构域结合， 形成一个完整的β -折叠桶。值得注意的是，位于这段疏水肽段的前面还有一段富含碱性氨基酸的区域。体外ITC技术显示，尽管SPINDOC疏水肽段的结合并不影响Spindlin1对组蛋白和其他相互作用蛋白的结合能力，但位于疏水肽段前的富含碱性氨基酸的区域可以大大削弱Spindlin1对低亲和力组蛋白和相互作用蛋白的结合，比如非修饰的组蛋白H3, H3K4me3，H3K9me3 和TCF4等。然而，SPINDOC富含碱性氨基酸区域的结合并不影响Spindlin1对高亲和力的配体H3“K4me3-K9me3”的识别作用。进一步的晶体结构解析发现SPINDOC这段富含疏水氨基酸的肽段结合在Spindlin1的第二个芳香笼口袋和其周围的酸性表面，进而竞争性抑制组蛋白和其他相互作用蛋白与Spindlin1的结合。与此同时，ChIP-Seq，ChIP-qPCR和RT-qPCR实验显示SPINDOC可以影响Spindlin1的基因组分布模式，减弱Spindlin1在某些基因启动子区域的定位，并降低这些基因的转录水平，如Spindlin1的靶基因CyclinD1，rDNA，MYC等。与体外的生化实验一致，SPINDOC并不影响Spindlin1在双修饰H3“K4me3-K9me3”基因区域的定位。值得一提的是，来自香港大学的钱程民课题组在2021年报道了Spndlin1与SPINDOC疏水肽段和组蛋白二价修饰H3“K4me3-K9me3”多肽的三元复合物结构，并提出该识别事件激活rDNA转录（6），支持了我们SPINDOC不影响Spindlin1对高亲和力配体H3“K4me3-K9me3”识别的结论。SPINDOC 选择性衰减Spindlin1对弱结合伴侣的识别作用关于Spindlin1第三个Tudor结构域的功能，李海涛课题组在今年8月份还报道了另一个Spindlin1 第三个Tudor结构域的相互作用蛋白，乙型肝炎病毒（HBV）的调节蛋白HBx。HBx同样通过疏水作用结合在Spindlin1的 第三个Tudor结构域，并促进染色质cccDNA的基因表达。Spindlin1三个串联的Tudor结构域不仅可以通过识别组蛋白修饰影响个体发育过程中基因表达，同时还可以通过影响HBV基因组的转录来维持HBV生命周期。清华大学李海涛教授，得克萨斯大学安德森癌症中心Mark Bedford 教授和清华大学高军涛副研究员为共同通讯作者，李海涛实验室已毕业博士生赵帆，2017级医学实验班邓雅方同学，Bedford实验室杨芬博士和高军涛实验室的严琰同学为本论文的共同第一作者，李海涛实验室的冯帆和彭博同学对本工作有重要贡献。同时，上海同步辐射光源和清华大学X-ray晶体学平台给予了大力协助。本项目得到山西医科大学-清华大学医学院前沿医学协同创新中心、清华-北大生命科学联合中心、分子肿瘤学全国重点实验室、北京生物结构前沿研究中心的大力支持。全文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.jmb.2023.168371本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Rainbow 导读： 作为最常见的癌基因突变，KRAS突变驱动非小细胞肺癌（NSCLC）的肿瘤发生、发展和转移。 12月1日,中国药科大学华子春、陈果共同通讯在期刊《Cell Reports》上在线发表题为“Oncogenic KRAS effector USP13 promotes metastasis in non-small cell lung cancer through deubiquitinating β-catenin”的研究论文，研究结果表明， USP13是一个新的KRAS效应因子，并且在KRAS突变的NSCLC组织中特异性上调。突变的KRAS通过转录因子RREB1促进USP13的表达。研究人员证明USP13去除β-连环蛋白的K63-链聚脲化并促进β-连环蛋白/TCF4的结合，从而导致其靶基因的转录，包括波形蛋白和癌转移。因此，靶向USP13将抑制RAS突变肿瘤的转移和进展。 https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01523-1 研究背景 01 肺癌是全球癌症发病率和死亡率最高的原因，组织学上分为两种亚型：非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），分别占肺癌病例的85%和15%。KRAS是NSCLC中最常见的RAS基因突变亚型。RAS突变经常损害其GTP酶活性，将蛋白质构象锁定在GTP结合状态，并导致下游信号的持续激活，最终导致恶性转化和转移。 KRAS突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中频繁检测到。尽管已经开发了共价结合的KRASG12C抑制剂用于治疗KRASG12C突变的癌症，但对其他KRAS突变的NSCLC仍缺乏有效的治疗方法。因此，识别赋予KRAS突变癌细胞侵袭性表型的新型可靶的KRAS效应因子，将为KRAS相关癌症的治疗提供另一种策略。 泛素化是一种常见的蛋白质修饰类型，其中在泛素激活酶（E1）、泛素连接酶（E2）和泛素连接酶酶（E3）的催化下，泛素（Ub）分子以共价键形式附着到底物蛋白的赖氨酸残基的ε-氨基基团上。去泛素化酶（DUBs）是一类酶，它们催化将泛素链从靶蛋白上移除，并在调节蛋白稳定性、亚细胞定位、酶活性等方面发挥关键作用。泛素特异性蛋白酶13（USP13）是DUBs的泛素特异性蛋白酶（USP）亚家族的成员，它参与调节多种细胞功能。 2-甲氧基雌二醇靶向USP13 有效抑制非小细胞肺癌转移 02 为筛选出有效的USP13抑制剂，研究人员采用了与泛素结合的7-酰胺基-4-甲基香豆素（AMC-Ub）作为底物，该底物可被广泛的DUB水解，如USP13，产生AMC荧光团。在重组USP13和AMC-Ub的培养基中孵育后，USP13活性与AMC荧光强度呈正相关。利用这个检测体系，筛选了一个天然化合物库，发现2-甲氧基雌二醇可以剂量依赖性地抑制USP13引起的AMC释放。2-甲氧基雌二醇对USP13的抑制效力与Spautin-1相当。研究人员使用K63-联锁四泛素（K63-Ub4）作为底物，进一步确认2-甲氧基雌二醇是否能够抑制USP13对K63-联锁多泛素化的催化活性。 研究人员检测到2-甲氧基雌二醇显著抑制了USP13介导的K63-Ub4的裂解。微量热传导（MST）结合实验显示，当2-甲氧基雌二醇与GFP-USP13共同孵育时，存在强有力的结合曲线，而与GFP单独蛋白共同孵育时则没有。然而，USP13抑制剂2-甲氧基雌二醇对于抑制KRAS突变非小细胞肺癌细胞的生长并不如全K-RAS抑制剂BAY293或G12C抑制剂Sotorasib有效，并且在抑制具有KRAS突变的NSCLC细胞的侵袭能力方面，2-甲氧基雌二醇表现更加优异。 研究人员评估了2-甲氧基雌二醇是否能够通过靶向USP13来抑制KRAS突变癌细胞的侵袭能力。转移试验显示，2-甲氧基雌二醇能够强烈地降低携带KRASG12S突变的A549细胞的侵袭能力。为了评估2-甲氧基雌二醇在体内的抗转移作用，研究人员将稳定表达荧光素酶基因（A549-Luc）的A549细胞注射到小鼠尾静脉中。小鼠接受2-甲氧基雌二醇治疗，并通过生物发光成像监测癌细胞的肺转移病灶。 研究人员在所有小鼠细胞移植后1周内没有检测到任何生物发光信号，但在6或7周后，小鼠出现了明显的生物发光信号，并且接受2-甲氧基雌二醇治疗的小鼠的生物发光信号显著减少。肺部的组织学检查也显示，2-甲氧基雌二醇剂量依赖性地减少了A549-Luc转移结节。2-甲氧基雌二醇治疗剂量依赖性地降低了转移肿瘤中的波形蛋白水平。此外，2-甲氧基雌二醇极大地抑制了表达WT但不是K508R β-连环蛋白的A549细胞的转移和波形蛋白表达。同时，在接受2-甲氧基雌二醇治疗的小鼠中没有观察到明显的毒性。 研究结果 03 综上所述，研究结果表明， USP13是一个新的KRAS效应因子，并且在KRAS突变的NSCLC组织中特异性上调。突变的KRAS通过转录因子RREB1促进USP13的表达。研究人员证明USP13去除β-连环蛋白的K63-链聚脲化并促进β-连环蛋白/TCF4的结合，从而导致其靶基因的转录，包括波形蛋白和癌转移。因此，靶向USP13将抑制RAS突变肿瘤的转移和进展。 参考资料： https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01523-1 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 北京｜12月19日-20日 ▶第四届单细胞测序技术应用研讨会暨单细胞&空间组学研讨会（日程稍后公布） 点击对应文字 查看详情

不过这个研究没有探索树突状细胞IKKα缺失诱发乳腺癌的具体机制，以及在乳腺癌患者群体中是否存在这个类型的乳腺癌。后续研究如果能解决这两个问题，对于乳腺癌的治疗和预防可能会有重大的意义。 近日，中南大学湘雅医院的陶永光研究员、刘双研究员和肖德胜教授领衔的研究团队，在著名期刊《细胞发现》上发表了一项让人意外的研究成果[1]。 他们在研究著名促癌信号通路NF-κB的时候发现，这条通路上游的一个激酶IKKα，如果在树突状细胞（DC）中特异性缺失，竟然会导致乳腺癌的发生。 据了解，这也是科学家首次发现免疫细胞的基因突变会诱发实体瘤。中南大学的赖巍巍博士是研究的第一作者。 论文首页截图 正如前文所言，IKKα是NF-κB通路上游的关键因子，它们在癌症的发生发展中发挥着重要的作用，在KRAS驱动的肺癌中就能见到这个通路的身影[2,3]。 正因为IKKα是NF-κB通路的关键一环，所以围绕IKKα的研究有很多。IKKα也是陶永光团队的研究重点，围绕这个基因他们还申请了一些专利。 在研究不同类型细胞IKKα缺失的影响时，他们意外地发现小鼠的树突状细胞特异性缺失IKKα（IKKα△Itgax）后，会导致小鼠乳腺附近自发形成肿瘤，以及脾脏变大。在≥20周龄的突变小鼠中，乳腺附近自发肿瘤的发生率约为39.6%。 这一现象吸引了他们的注意，因为之前没有研究报道过免疫细胞基因缺失会诱发实体瘤。 摆在他们面前的第一个问题是：那些自发形成的肿瘤究竟是什么肿瘤。赖巍巍博士将这一问题作为了博士后阶段的研究课题——树突状细胞特异性敲除IKKα转基因小鼠自发成瘤的肿瘤来源研究[4]。 野生小鼠和DC细胞IKKα特异性缺失小鼠的组织比较 为了确定肿瘤的细胞来源和类型，赖博士给这个未知的肿瘤做了单细胞RNA测序，并将测序结果与11种组织的RNA测序结果做了比较。分析结果表明，这个未知的肿瘤组织与正常乳腺组织具有相似的基因表达模式和相似的免疫表型。 这意味着，树突状细胞IKKα特异性缺失后形成的肿瘤可能是乳腺癌。 通过与正常乳腺细胞相比较，赖博士发现S100a8、Erbb2和Tnfrsf1b在肿瘤上皮细胞中富集。此外，肿瘤上皮细胞中的Kras通路信号和糖酵解信号上调，这表明树突状细胞IKKα缺失诱导的自发性肿瘤可能起源于乳腺上皮细胞。 肿瘤的转录组特征 在于两种常见乳腺癌模型（MMTV-neu和MMTV-PyMT）比较之后，再次证明这个自发性肿瘤具有乳腺癌的特征，例如Her2、Gata3和细胞角蛋白水平较高。 值得注意的是，与MMTV-neu小鼠相比，IKKα△Itgax小鼠和乳腺癌患者的CD8+/CD4+细胞比值更高，CD163+/CD68+细胞比值则有所下降。这一发现意味着，IKKα△Itgax小鼠更适合模拟乳腺癌的肿瘤微环境。 IKKα△Itgax小鼠肿瘤微环境特征 关于肿瘤免疫微环境进一步的研究发现，与正常乳腺的树突状细胞相比，IKKα△Itgax小鼠肿瘤中的树突状细胞发育受损，抗原处理和递呈以及T细胞活化信号转导均出现了下调。 此外，与正常乳腺组织相比，IKKα△Itgax小鼠肿瘤中T细胞中Tcf4的表达降低，T细胞的凋亡信号上调，而且活化的T细胞增殖和适应性免疫反应信号也出现下调。这表明树突状细胞IKKα的缺失会影响T细胞的活化，导致T细胞功能失调，进而促进了肿瘤的发生。 T细胞功能失调 在研究的最后，赖博士比较了IKKα△Itgax小鼠肿瘤和MMTV-neu小鼠肿瘤的肿瘤浸润免疫细胞特征。 他发现，虽然两个乳腺癌肿瘤模型具有相似的免疫特征，但在IKKα△Itgax肿瘤中观察到巨噬细胞数量减少，T细胞浸润增加。此外，在IKKα△Itgax肿瘤浸润的T细胞中，Pd1和Ctla-4的表达上调。MMTV-neu小鼠的T细胞处于晚期细胞状态，而IKKα△Itgax小鼠的巨噬细胞则表现出原始细胞分化状态。 赖博士等认为，这些结果进一步证实，与MMTV-neu小鼠相比，IKKα△Itgax肿瘤的浸润T细胞和巨噬细胞主要处于原始细胞状态，这可能有助于肿瘤免疫逃逸。 总的来说，陶永光/刘双/肖德胜团队的这个研究表明，树突状细胞中IKKα的缺失，会导致小鼠自发形成乳腺癌，并对IKKα△Itgax小鼠乳腺癌的肿瘤微环境做了初步的探索，发现其与乳腺癌患者的肿瘤微环境更接近。 不过这个研究没有探索树突状细胞IKKα缺失诱发乳腺癌的具体机制，以及在乳腺癌患者群体中是否存在这个类型的乳腺癌。后续研究如果能解决这两个问题，对于乳腺癌的治疗和预防可能会有重大的意义。 参考文献： [1].Lai W, Hu W, Liang Y, et al. New mouse genetic model of breast cancer from IKKα defects in dendritic cells revealed by single-cell RNA sequencing. Cell Discov. 2023;9(1):72. doi:10.1038/s41421-023-00553-z [2].Xiao D, Jia J, Shi Y, et al. Opposed expression of IKKα: loss in keratinizing carcinomas and gain in non-keratinizing carcinomas. Oncotarget. 2015;6(28):25499-25505. doi:10.18632/oncotarget.4548 [3].Vreka M, Lilis I, Papageorgopoulou M, et al. IκB Kinase α Is Required for Development and Progression of KRAS-Mutant Lung Adenocarcinoma. Cancer Res. 2018;78(11):2939-2951. doi:10.1158/0008-5472.CAN-17-1944 [4].https://bsh.csu.edu.cn/info/1080/4903.htm