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注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表平台立场。任何文章转载需要得到授权。 非小细胞肺癌（NSCLC）作为肺癌中最常见的类型，其发病率和死亡率在全球范围内均居高不下，对人类的生命健康构成了严重威胁。随着医学科技的飞速发展，尤其是在精准医疗和免疫疗法领域的突破性进展，NSCLC的治疗策略正经历着前所未有的变革。 本文基于摩熵咨询发布的《市场研究专题报告——非小细胞肺癌药物》部分内容，旨在全面梳理NSCLC治疗领域的最新进展，特别是PD-(L)1抑制剂和VEGF抑制剂等关键药物在NSCLC中的应用与市场表现，以期为临床医生、研究者及政策制定者提供有价值的参考信息。 01 PD-(L)1抑制剂 在NSCLC中的应用与市场表现 1.无驱动基因的NSCLC治疗：免疫疗法成为首选 NSCLC按病理分型可分为鳞状和非鳞状，有确切驱动基因时优先使用靶向治疗药物。针对无驱动基因，首推免疫疗法。诊疗指南推荐的一线疗法单药为帕博利珠单抗和阿替利珠单抗（非鳞和鳞癌都适用）、PD-(L)1联合化疗、贝伐珠单抗联合化疗+贝伐珠维持治疗。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 IV期无驱动基因突变的非鳞NSCLC（2024版CSCO）诊疗指南： （1）将“纳武利尤单抗+伊匹木单抗（限PD-L1≥1%）”、“纳武利尤单抗+伊匹木单抗和2周期培美曲塞+铂类”降级为晚期一线治疗Ⅲ级推荐； （2）新增“特瑞普利单抗+含铂化疗新辅助+辅助治疗”为围手术期治疗Ⅰ级推荐； （3）新增“帕博利珠单抗、替雷利珠单抗或卡瑞利珠单抗+含铂化疗新辅助治疗+辅助治疗”为围手术期治疗Ⅱ级推荐； （4）新增“度伐利尤单抗或纳武利尤单抗+含铂化疗新辅助+辅助治疗”为围手术期治疗Ⅲ级推荐 鳞癌多为中央型，易于出血，因此抗血管生成药物贝伐珠单抗是禁忌，化疗药物也不推荐使用培美曲塞。鳞癌治疗选择有限，整体预后劣于非鳞癌。但鳞癌患者的 PD-L1 阳性比例显著高于非鳞癌，鳞癌患者接受免疫治疗可能具有更好的获益。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 IV期无驱动基因突变的鳞状NSCLC（2024版CSCO）诊疗指南： 在一线治疗方面，如果患者的一般状况较好（PS=0-1），I级推荐有（1）帕博利珠单抗单药(限 PD-L1 TPS ≥50%，PD-LI TPS 1%~49%)；（2）阿替利珠单抗（限 PD-L1 TC≥50% 或IC>10%）；（3）紫杉醇+铂类联合帕博利珠/卡瑞利珠/舒格利/派安普利单抗；（4）紫杉醇/白蛋白紫杉醇+铂类联合替雷利珠单抗；（5）白蛋白紫杉醇+铂类联合斯鲁利单抗；（6）吉西他滨+铂类联合信迪利单抗；（7）含顺铂或卡铂双药方案:顺铂/卡铂联合吉西他滨或多西他赛或紫杉醇或脂质体紫杉醇或紫杉醇聚合物胶束；（8）含奈达铂双药方案:奈达铂+多西他赛。如果患者的一般状况较差（PS=2），推荐单药化疗，可以包括吉西他滨、紫杉醇、长春瑞滨或多西他赛等药物。  在二线治疗方面，如果患者的一般状况较好（PS=0-2），首选纳武利尤单抗和替雷利珠单抗这两种免疫治疗药物。多西他赛也是一个可选的治疗方案。作为二线治疗的备选方案，可以考虑帕博利珠单抗，但其使用受限于PD-L1的表达水平（TPS≥1%），以及阿替利珠单抗。其他可选药物包括吉西他滨、长春瑞滨和阿法替尼（特别是不适合化疗及免疫治疗的患者）。 在三线治疗方面，对于PS=0-2的患者，可以考虑纳武利尤单抗和多西他赛这两种药物。另外，对于外周型鳞癌的患者，安罗替尼也是一个可选的治疗方案。 2.PD-(L)1国内整体销售额突破210亿元，百济神州和信达生物名列前茅 摩熵医药数据库显示，自2018年首款PD-(L)1在国内上市以来，截止2023年底，已有15款PD-(L)1相继获批上市，销售额一路高歌猛进，从2019年57亿元增长至2023年211亿元。增长的主要原因在于：1）显著的临床疗效；2）广泛的适应症范围，肺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤等多种肿瘤适应症都已获批上市。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 从2023年国内销售额竞争格局来看，在激烈的市场竞争中，百济神州的替雷利珠单抗以45亿元的销售成绩市占率第一（21%），信达生物的信迪利单抗以40亿元的销售额排名第二，市占率为19%，排名第三的为默沙东的帕博利珠单抗，32亿元（15%），未纳入医保能有这么好的成绩在于帕博利珠单抗先发优势，广泛获批的适应症和默沙东超强的销售能力。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 值得一提的是，PD-1四小龙中最晚上市的替雷利珠单抗一路逆袭，进入医保后更是“以价换量”成效突出。目前，替雷利珠单抗三大NSCLC适应症已全面纳入医保，成为唯一实现晚期NSCLC医保全程覆盖的PD-(L)1抗体。 02 VEGF抑制剂 在NSCLC中的应用与市场前景 （1）贝伐珠单抗12个厂家竞争，齐鲁制药拔得头筹 血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂是一类通过阻断肿瘤血管生成进而抑制肿瘤发展的药物。代表药物为贝伐珠单抗和安罗替尼。 贝伐珠单抗（Avastin）是罗氏旗下基因泰克开发的VEGF单抗，是全球第一款抗肿瘤血管生成药物，2010年首次在国内上市，目前已获批结直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌等多个实体瘤适应症。其国内的专利于2018年到期。由于大量生物类似药的上市，整体贝伐珠单抗的销售额近几年仍在快速增长，从2019年42亿元增长到2023年111亿元。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 从2023年国内销售额竞争格局来看，在激烈的市场竞争中，百济神州的替雷利珠单抗以45亿元的销售成绩市占率第一（21%），信达生物的信迪利单抗以40亿元的销售额排名第二，市占率为19%，排名第三的为默沙东的帕博利珠单抗，32亿元（15%），未纳入医保能有这么好的成绩在于帕博利珠单抗先发优势，广泛获批的适应症和默沙东超强的销售能力。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 贝伐珠单抗的原研药为罗氏的安维汀（Avastin），于2004年获FDA批准上市，用于治疗晚期结直肠癌，之后不断拓展多个实体瘤适应症，在全球上百个国家和地区获得批准。安维汀自上市以来经常进入全球畅销药品TOP10榜单，销售额一直保持稳定，体量在68亿美元左右。 不过，随着专利悬崖的到来（中国、欧洲和美国的专利于2018年-2019年到期），以及各国药企的贝伐珠单抗类似药围猎下，安维汀的全球销售额从2019年的74.9亿美元下滑至2022年的22亿美元，销量一下子跌回到十几年前。众多玩家的生物类似药轮番上阵，导致罗氏的市场份额被逐渐瓜分，从辉煌走向衰落。 齐鲁制药摘得国产首个贝伐珠单抗生物类似药，并在2023年实现销售额54亿元，市场占比近50%，大幅超越罗氏（17%），取得榜首。齐鲁制药之所以能取胜，一方面在于抢占了市场先发优势；另一方面，还要归功于价格优势，凭借不到原研80%的价格优势，让齐鲁制药的安可达得以快速入院，实现放量增长。 （2）安罗替尼多靶点抗肿瘤血管生成，销售峰值达46亿，2023年销售额仍有38亿元 安罗替尼是正大天晴研发的一款小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI），它能有效抑制VEGFR、PDGFR、FGFR、c-Kit等激酶，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。于2018年在国内获批上市，目前已获批三个适应症：三线晚期非小细胞肺癌、晚期软组织肉瘤、三线晚期小细胞肺癌。 凭借正大天晴优秀的销售能力，以及安罗替尼在2018年即被纳入国家医保目录，加之其治疗无需基因检测，相较于需伴随诊断的同类药物，使用上更显便捷等多重优势，使得安罗替尼在市场上备受青睐，并取得了不俗的销售成绩。2019年销售额达25.63亿元，2019年达到峰值45.87亿元，2022年由于医保谈判降价42%使得销售额下滑。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 结语 随着精准医疗技术的不断进步和临床实践的深入探索，NSCLC的治疗方案日益丰富和完善。PD-(L)1抑制剂和VEGF抑制剂作为NSCLC治疗中的两大重要药物类别，其市场表现和竞争格局均呈现出积极的发展态势。未来，随着更多创新药物的研发与上市以及治疗指南的不断更新与完善，NSCLC患者将拥有更多个性化、精准化的治疗选择。 肺癌市场研究完整报告领取方式 识别二维码领取下载 END 本文为原创文章，转载请留言获取授权  联系我们，体验摩熵医药更多专业服务 会议 合作 园区 服务 数据库 咨询 定制 服务 媒体 合作 点击阅读原文，了解更多品牌升级详情！

摘要：疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病负担方面发挥着重要作用。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限的资源下迅速设计和生产出安全有效的疫苗。在这里，我们关注从传统的预防性疫苗到针对慢性疾病和癌症的治疗性疫苗的广泛领域的疫苗开发，提供了八种不同疫苗形式（减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗）以及针对五种实体瘤（肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和胃癌）、三种传染病（人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒引起的疾病）和三种常见慢性疾病（高血压、糖尿病和血脂异常）的治疗性疫苗的最新进展的全面概述。我们旨在提供有关疫苗技术、平台、应用和潜在下一代预防性和治疗性疫苗技术的新的见解，为未来疫苗设计铺平道路。 1.引言 疫苗接种是保护易感人群和控制传染病最经济有效的手段。因此，疫苗被认为是20世纪十大公共卫生成就之一。疫苗的使用使人类能够在全世界范围内根除天花，消除大多数国家的脊髓灰质炎，并控制白喉、百日咳、破伤风、腮腺炎、麻疹、风疹、流感嗜血杆菌B型等传染病，在世界部分地区显著降低了发病率和死亡率。然而，由SARS-CoV-2引起的当前COVID-19大流行已导致超过5亿确诊病例和超过600万人死亡。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限资源下迅速开发安全有效的疫苗。此外，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV）和Epstein-Barr病毒（EBV）在内的几种由传染性病原体引起的严重疾病尚未开发出疫苗，需要新的疫苗开发策略。总的来说，疫苗使人们能够过上更健康、更长寿的生活。然而，随着预期寿命的增加，非传染性疾病（NCDs）的负担，如癌症、自身免疫疾病、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病等，已经增加。NCDs，也称为慢性疾病，是由遗传疾病以及生理、环境和生活方式因素的组合引起的，并且可以持续很长时间。根据世界卫生组织报告，每年有4100万人死于NCDs，占全球死亡人数的71%。这种疾病负担的转变加剧了治疗NCDs的疗法的迫切需求。传统的预防性疫苗通过向健康个体接种抗原来预防疾病，从而建立特异性免疫，这主要发生在传染病上。治疗性疫苗用作暴露后治疗，以增强免疫系统对抗诸如慢性感染、癌前病变或癌症等先前存在的疾病。治疗性疫苗旨在调节人体免疫系统，并诱导细胞介导的免疫反应，以针对与NCDs相关的细胞或分子，而不是病原体或病原体感染的细胞。治疗性疫苗与预防性疫苗在一些重要方面有所不同。由于预防性疫苗通常给予健康人，这些人对不良事件的容忍度很低。相比之下，治疗性疫苗通常是暴露后治疗，并且患者高度耐受。成熟的传统疫苗和快速增长的新型疫苗技术促进了全球预防性和治疗性疫苗的开发。近年来，免疫学、分子生物学和基因组学的进步导致了更有效的疫苗成功。mRNA疫苗（Comirnaty、Spikevax、AWcorna）和病毒载体疫苗（Convidecia、AZD1222、Ad26.COV2.S）针对COVID-19大流行，是有史以来开发最快的疫苗。肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗（Prevnar13、Prevnar 20）基于蛋白结合疫苗技术。人乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Gardasil、Gardasil 9、Cervarix、Cecolin和Wozehui），基于基因工程技术设计，通过表达病毒样颗粒（VLP）预防与HPV相关的癌症。脑膜炎球菌B型疫苗（Trumenba、Bexsero）代表了从基因组到疫苗的“反向疫苗学”策略。最后，新型佐剂重组带状疱疹疫苗，Shingrix，扩大了免疫功能低下人群的免疫力。疫苗的不断发展提高了我们对免疫学和免疫基础的理解，针对NCDs的疫苗成为研究的新“热点”。目前，有前列腺癌疫苗（Provenge）、膀胱癌疫苗（TheraCys）、结肠癌疫苗（OncoVAX）、黑色素瘤疫苗（M-VAX和Melacine）、肾细胞癌疫苗（Oncophage）、肺癌疫苗（Racotumomab和CIMAvaxEGF）等。此外，治疗性疫苗在高血压、慢性乙型肝炎等疾病领域也取得了巨大进展。本综述旨在提供我们对最新疫苗技术、平台、应用和潜在下一代疫苗技术的当前进展和理解的概述。本综述将讨论预防性疫苗和治疗性疫苗。根据疫苗的成分，预防性疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、多肽疫苗、DNA和mRNA疫苗。此外，根据疾病分类，治疗性疫苗可分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性疾病的疫苗。我们相信，本综述将为疫苗技术和开发提供见解。 2.预防性疫苗开发的进展 2.1.减毒活疫苗 减毒活疫苗是通过保留抗原性但通过化学或其他方法遗传工程改造或减毒（减弱）的有机体创建的。通常，这些疫苗能够诱导具有长期持久性的体液和细胞免疫反应；然而，仍然存在毒力逆转的风险，这使得疫苗不适合对抗高度致病性变体。此外，减毒疫苗的有效期较短，热稳定性差，对储存和运输有严格的要求；这在大流行情况下会导致响应缓慢。由于减毒疫苗可能恢复到有毒形式，它们也可能在免疫功能低下的人中引起严重疾病。尽管存在这些问题，并且因为好处大于风险，减毒活疫苗仍然是疫苗开发中一个宝贵的平台。目前许可的减毒疫苗列表包括天花（牛痘）（ACAM2000）、麻疹、腮腺炎和风疹病毒（M-M-RII）、结核病（卡介苗（BCG））、霍乱（Vaxchora）、流感（FluMist）、登革热（Dengvaxia；四价）、轮状病毒（Rotarix）、水痘病毒、伤寒（Vivotif）、黄热病（YF-Vax）等等（表1）。 表1 中国目前许可的疫苗类型 根据世界卫生组织发布的一份文件（https://www-who-int.libproxy1.nus.edu.sg/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines），有两种减毒活COVID-19疫苗正在进行临床试验：由Codaenixin与印度血清研究所合作开发的COVI-VAC，以及由Meissa Vaccines，Inc.开发的MV-014-212。正在进行研究以提高减毒活疫苗的安全性并进一步减少其毒力；这通过增加复制保真度、通过密码子去优化以及通过病毒基因组的工程改造进行了测试。Vignuzzi等人试图利用通过增加复制保真度限制病毒种群多样性的观察，这可以显著降低组织嗜性和病毒致病性。结果表明，在动物感染模型中，具有减少遗传多样性的脊髓灰质炎病毒变种激发了保护性免疫反应。这种限制病毒准种群多样性为RNA病毒的稳定减毒疫苗工程提供了一种新方法。密码子对去优化（CPD）是另一种有效的病毒减毒策略，它利用次优密码子对来减毒重编码病毒。Groenke等人通过改变同步密码子的位置，在重编码基因组中增加了次优密码子对和CpG二核苷酸的数量。他们在流感A病毒上的研究显示，次优密码子对引起了减毒，而CpG二核苷酸比例的增加没有效果。此外，他们表明次优密码子对可以降低去优化密码子对mRNA的稳定性和翻译效率。因此，蛋白质产量的减少直接导致病毒减毒。最近，Trimpert等人构建了一个COVID-19候选减毒活疫苗，名为sCPD9，通过大规模编码SARS-CoV-2基因组（通过CPD方法修改），并在罗布罗夫斯基矮仓鼠中评估了疫苗的免疫原性和保护效果。作者表明，sCPD9的单次鼻内接种激发了针对当前四个SARS-CoV-2变体的交叉中和抗体反应：B.1.1.7（阿尔法）、B.1.351（贝塔）、B.1.1.28.1（伽马）和B.1.617.2（德尔塔），保护免受类似COVID-19的疾病。一种减毒活COVID-19疫苗，COVI-VAC，通过使用同义次优密码子对编码病毒刺突蛋白的一部分而开发。作者发现，该疫苗在仓鼠模型中刺激了高水平的中和抗体，高度减毒的COVI-VAC在单次鼻内剂量下具有保护性。该疫苗现在正在进行III期临床试验（ISRCTN15779782）。安伯（amb）突变是使减毒活疫苗更安全、更有效的一种新策略。这种方法通过将遗传密码扩展到流感病毒基因组中，显示出在产生活体但复制无能力的病毒疫苗方面的前景。研究人员通过含有正交翻译机制的转基因细胞系扩展了流感A病毒基因组的遗传密码。这种方法在转基因细胞系中创建了早终止密码子（PTCs）——携带病毒足够具有感染力但在常规细胞中无法复制，同时在转基因细胞系中产生高繁殖力和遗传稳定的后代病毒。在小鼠、雪貂和豚鼠模型中，这种活疫苗激发了对亲本和抗原性不同的菌株的强大免疫反应。另一种有前景的基因工程减毒病毒的方法是工程化病毒基因组。研究人员报告了一种脊髓灰质炎病毒2型疫苗株（nOPV2）的开发，他们在其中引入了对Sabin2基因组的50个非翻译区域的修改，以稳定减毒决定因素。在这种方法中，2C编码区域防止重组，3D聚合酶限制了病毒的适应性。这种菌株在遗传上比原始的Sabin2菌株更稳定，不太可能恢复毒力。在临床前和临床研究中，nOPV2具有免疫原性，并可能导致脊髓灰质炎病毒的完全根除。另一组合理设计了一种减毒水痘疫苗候选物，v7D，其中删除了毒力因子ORF7。该病毒在MRC-5成纤维细胞和人类PBMC（VZV传播载体）中的复制类似于野生型病毒，但在感染人类皮肤和神经细胞时严重受损。然而，v7D在体外和各种小动物中具有与vOka相当的免疫原性。最后，v7D在非人类灵长类动物中耐受性良好且具有免疫原性。这种疫苗目前正在中国进行II期试验（ChiCTR1900022284）。未来减毒疫苗的开发应该专注于选择更稳定的病毒株，并采用基因编辑策略来稳定减毒因素。 2.2.灭活疫苗 灭活疫苗是从病原体（如病毒或细菌）的灭活形式中提取的，这些病原体经过培养后，通过物理或化学方法灭活，使其不再具有传染性或毒性。灭活疫苗包括全灭活疫苗或部分灭活疫苗（Toxoid疫苗）。Toxoid疫苗使用细菌产生的灭活毒素，这些毒素的毒性已被抑制，但保留了免疫原性。与减毒疫苗和基因工程疫苗相比，灭活疫苗具有开发周期短、生产工艺相对成熟、非传染性、高安全性等优点。灭活疫苗的生产成本通常较低，并且由于它们耐温，可以长时间储存。灭活疫苗通常诱导体液免疫反应，而细胞免疫较弱。通常需要多次接种才能产生保护性免疫，从而降低疫苗依从性。在灭活过程中，病毒抗原可能在结构上受损，导致抗原性降低，疫苗的免疫原性降低。有许多批准的灭活疫苗：代表性的例子包括甲型肝炎病毒疫苗（HAVRIX和VAQTA）、脊髓灰质炎病毒疫苗（IPOL）、日本脑炎病毒（IXIARO）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳（INFANRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳吸附和灭活脊髓灰质炎病毒疫苗（KINRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗吸附（DAPTACEL）疫苗、流感疫苗（Fluarix四价）、人类狂犬病疫苗（RabAvert和Imovax）、肠道病毒71型（Inlive）、肾综合征出血热疫苗、蜱传脑炎疫苗（FSME-Immun），以及COVID-19疫苗（CoronaVac、WIBP-CorV、BBIBP-Cor）（表1）。在撰写本文时，全球已有11种针对COVID-19疾病的灭活疫苗获得有条件或紧急使用批准（包括中国5种疫苗）。从其他病原体研究中，已开发出一种寨卡病毒灭活疫苗候选物（PIZV）。在两次免疫剂量后，含铝佐剂的候选PIZV在CD-1和AG129小鼠中显示出高度免疫原性，从而支持PIZV候选物进入临床开发（NCT03343626）。历史上，手足口病（HFMD）的爆发主要由肠道病毒71和柯萨奇病毒A16引起。最近，柯萨奇病毒A6和A10与全球散发HFMD病例和爆发的增加有关。在一项研究中，柯萨奇病毒A6、A10和A16（CA6、CA10和CA16）在不同条件下通过甲醛或b-丙内酯（BPL）灭活，并检查了免疫效果。作者发现，CA10和CA16在BPL灭活（BI）后的免疫效果优于甲醛处理。此外，双三价治疗诱导了足够的中和抗体和细胞介导的免疫反应，表明BI-CA6、CA10和CA16作为潜在的多价疫苗候选物。灭活疫苗平台相对成熟，高度安全，可用于快速应对新出现的病原体，因此对于应对爆发至关重要。 2.3.多糖和多糖-蛋白结合疫苗 多糖疫苗是由基于碳水化合物的聚合物制成的，如来自细菌病原体的荚膜结构的壁酸或肽聚糖。一些针对细菌荚膜多糖的疫苗，例如脑膜炎球菌A/C/Y/W-135疫苗（Meningune-A/C/Y/W-135）、肺炎球菌疫苗（Pneumovax 23）和伤寒Vi多糖疫苗（Typhim Vi）（表1），已被批准用于预防侵袭性脑膜炎和伤寒疾病。然而，由于多糖不像蛋白质那样在主要组织相容性复合体（MHC）分子上被处理和展示，多糖疫苗通常显示出较弱的免疫原性、持久性差，并且只产生T细胞非依赖性免疫反应。没有T细胞的参与，这些疫苗不会引起记忆免疫反应或亲和力成熟，并且诱导的抗体——主要是IgM和IgG2——不适合激活补体，导致免疫保护无效且短暂。 多糖结合疫苗可以克服多糖疫苗的缺点。多糖结合疫苗是通过将病原体的荚膜多糖共价连接到蛋白载体上制备的，例如白喉类毒素（DT）、破伤风类毒素（TT）、改良的白喉毒素称为CRM197、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物（OMPC）或H. influenzae蛋白D HiD。蛋白载体和多糖同时出现在MHC-II上，导致T细胞受体（TCR）识别并激活Th反应。Th与B细胞之间的相互作用将改善和塑造抗体的滴度和质量以及B细胞记忆反应。共价结合方法包括标准化学交联和生物结合技术。目前批准的多糖结合疫苗通常是通过化学方法生产的，包括肺炎球菌13价、15价和20价结合疫苗（Prevnar 13, Vaxneuvance, Prevnar 20）、B型流感嗜血杆菌结合疫苗（Liquid PedvaxHIB, HIBERIX, ActHIB）和两种脑膜炎球菌结合疫苗（A, C, Y, W, MenQuadfi；A, C, Y和W-135, MENVEO, Menactra）（表1），等等。最近，Enotarpi等人报告了使用MenA，一种稳定的糖模拟结合疫苗，诱导针对A群脑膜炎奈瑟菌的保护性抗体。该团队生成了一系列未乙酰化的carbaMenA寡聚体，这些寡聚体被证明比荚膜多糖（CPS）更稳定，并表明八聚体（DP8）的随机O-乙酰化改善了抗MenA CPS抗体结合的抑制，并在与CRM197结合后诱导了抗MenA保护性小鼠抗体。这种方法可用于生成稳定的新糖结合疫苗。 生物结合技术允许多糖和载体蛋白在微生物内生物合成，通常是大肠杆菌。然后通过来自N-连接蛋白糖基化系统的特定寡糖转移酶在体内偶联蛋白质。近年来，生物合成因其经济性、快速性和效率而受到青睐。由这项技术生产的第一种多糖结合疫苗候选物是志贺氏菌多糖结合疫苗（GVXN SD133），由瑞士GlycoVaxyn AG开发，已完成I期临床试验（NCT01069471）。研究证明了GVXN SD133疫苗的良好安全性，所有测试剂量均能引起对志贺氏菌O1多糖的显著体液反应。蛋白载体也产生了功能性抗体，证明了这种新技术在保持碳水化合物和结合蛋白表位方面的优势。另一种针对志贺氏菌flexneri 2a（Flexyn2a）的生物结合疫苗在I期研究（NCT02388009）的所有时间点和所有组别中，接种后均引起了统计学上显著的S. flexneri 2a脂多糖（LPS）特异性体液反应。结果表明Flexyn2a具有令人满意的安全性，产生了强大的体液反应。这种疫苗目前正在进行IIb期（NCT02646371）。总体而言，多糖结合疫苗平台比其他平台显示出更多的潜力，并提供了解决细菌疫苗紧迫问题和挑战的解决方案，通过逐步使用生物合成技术。 2.4.重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗采用基因工程方法，在合适的宿主细胞中表达病原体特异性基因，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞等。重组亚单位疫苗通常具有良好的安全性和稳定性。然而，由于外源蛋白通常显示MHC II类反应，通常不会产生强烈的T细胞反应，因此需要佐剂刺激和多次接种以增强免疫原性，这可能不适用于呼吸道黏膜免疫。目前批准的人类重组亚单位蛋白疫苗包括流感疫苗（FluBlok）、带状疱疹疫苗（Shingrix）、脑膜炎球菌B群疫苗（Trumenba、Bexsero）和COVID-19疫苗（ZF2001、Nuvaxovid）（表1）。近年来，随着反向疫苗学、结构生物学、基因组学和蛋白质组学理论和技术的进步，重组亚单位疫苗免疫原逐渐进入理性设计的新时代。反向疫苗学的过程是利用自下而上的方法从基因组到疫苗开发疫苗。2013年批准的Bexsero脑膜炎B群疫苗是反向疫苗学的经典案例。它基于对致病微生物的关键保护或毒力抗原的全基因组预测和筛选，然后开发新疫苗；这样的例子包括三个抗原：淋病奈瑟菌肝素结合抗原（NHBA）、因子H结合蛋白（fHbp）和淋病奈瑟菌粘附素A（NadA）。Shingrix是葛兰素史克开发的重组亚单位佐剂疫苗，由水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白gE重组蛋白组成，并补充了新的佐剂AS01B。对带状疱疹的整体疫苗效力在老年人（≥50岁）中为97.2%。Shingrix的成功强调了佐剂在疫苗开发中的关键作用。NVXCoV2373（Nuvaxovid）是一种含有昆虫细胞表达的S-三聚体和Matrix-M佐剂的重组蛋白疫苗。最近的临床结果显示，该疫苗对任何关注或感兴趣的变体的疫苗效力为92.6%。结核病亚单位疫苗M72/AS01E（葛兰素史克）包含两个M72重组融合免疫原（MTB32A和MTB39A）与佐剂系统AS01E结合，并为M. tuberculosis感染、HIV阴性成年人提供约50%的疾病进展到活动性肺结核的保护约3年。此外，另一种重组亚单位结核病疫苗（GamTBvac）被证明由两个结核分枝杆菌抗原融合（Ag85A和ESAT6-CFP10）组成，与明胶结合域固定在明胶上，并与由DEAE-明胶核心和CpG寡脱氧核苷酸（TLR9激动剂）组成的佐剂混合。II期的结果显示出有希望的安全性和耐受性，诱导了抗原特异性干扰素-γ反应、表达Th1细胞因子的CD4+ T细胞和IgG反应。结构生物学也有助于疫苗的理性设计。RSV表面融合（F）蛋白存在于两种构象中：前融合（pre-F）和后融合（post-F）构象。基于前F和抗体的高分辨率复合物结构，F蛋白被修改以在前融合状态下稳定（DS-Cav1）。I期临床显示，针对前融合特异性表面RSV F的血清抗体的中和活性增加了10倍以上。其他人设计并获得了一种基于结构探究的稳定RBD-sc-dimer疫苗分子。RBD的C末端的N602残基与另一个RBD的N末端串联设计，提高了RBD二聚体的稳定性和中和抗体反应。根据官方报告，疫苗的III期临床数据显示，该疫苗对18岁及以上人群的任何严重程度的COVID-19的保护效力为81.43%（NCT04646590）。这些结果代表了基于结构的疫苗设计的临床证据，预示着精准疫苗学的新时代的曙光。重组亚单位疫苗平台具有技术优势，如安全性和效率，以及良好的稳定性和成熟的产业。然而，安全有效的佐剂对提高疫苗效力至关重要。结构生物学、反向疫苗学和新型佐剂的新技术将促进重组蛋白疫苗的设计。 2.5.病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗 病毒样颗粒（VLPs）是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米尺寸（20-200纳米）颗粒，它们的结构和免疫原性与天然病毒相似。VLPs不包含病毒遗传物质，因此可以模拟病毒抗原性而不具致病性。VLPs具有高度重复的抗原表位阵列，有利于被树突状细胞（DCs）吞噬并呈现给MHC I类和II类分子。它们可以激活身体，诱导强烈的细胞和体液免疫反应，使其成为疫苗开发的理想平台。目前批准的VLPs疫苗包括乙型肝炎疫苗（Hepavax-B、Engerix-B、Recombivax HB、HBVaxPro、Heplisav-B、Fendrix、Hepavax-Gene）、HPV疫苗（Cervarix、Gardasil、Gardasil 9、Cecolin和Wozehui）、乙型肝炎E疫苗（Hecolin）、疟疾疫苗（Mosquirix）和COVID-19疫苗（Covifenz）（表1）。此外，多种基于VLPs的预防性疫苗已进入临床试验阶段，主要针对诺如病毒、轮状病毒、BK多瘤病毒、狂犬病、RSV、HIV、流感病毒等。疟疾疫苗的研发仍然是一个巨大的挑战。GSK的科学家使用截短的环孢子蛋白（CSP）结合乙型肝炎表面抗原（HBsAg）生成名为RTS的蛋白质。然后，RTS与另一个游离的HBsAg在酵母细胞中共表达，生成RTS,S VLPs。然而，尽管RTS,S/AS01的三剂疫苗最初对临床疟疾具有一定的保护作用，但疫苗的效力随时间减弱，在高于平均水平的疟疾寄生虫暴露中效果较差。然而，RTS,S疫苗的开发大大提高了我们实现开发有效安全疟疾疫苗的长期目标的机会。最近，提出了VLPs的嵌合设计，以保护免受多型病原体的侵害。作者用系统发育上密切相关的环区域替换了HPV L1环区域。HPV33/58/52 VLPs的三型嵌合体在小鼠和非人灵长类动物中诱导的中和滴度与三种野生型VLPs混合物相当。作者目前正在开发基于这一策略的七种交叉疫苗，针对20种HPV变体。Medicago Inc.开发的一种基于植物的VLPs COVID-19疫苗最近在加拿大获得授权使用。该疫苗含有SARS-CoV-2刺突（S）蛋白（原始菌株）的VLPs以及AS03佐剂，显示出71%的效力，保护18至64岁的试验参与者（https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines/medicago.html）。 纳米颗粒疫苗（NPVs）使用纳米材料作为载体、链接器或免疫调节剂，通过物理或化学方法将特定抗原和佐剂连接起来。这种基于纳米载体的传递系统可以保护疫苗免于过早降解，提高其稳定性，并促进免疫原传递到抗原呈递细胞（APCs），特别是DCs。此外，纳米颗粒提供了合适的疫苗给药途径，并增强了具有缓慢释放特性的抗原摄取，从而产生强烈的体液、细胞和粘膜免疫反应。纳米颗粒可以来自脂质体、VLPs以及金属或非金属无机、聚合物和脂质。但与其他疫苗候选物一样，NPVs的生产充满了许多困难和挑战。例如，一些NPVs可能会引发系统性或局部炎症反应，而一些纳米材料会在细胞中积累，导致其在体内长期保留，可能导致血管血栓形成。此外，在生产和储存成本方面仍存在一些限制。 自组装蛋白支架也在疫苗开发中得到广泛应用；例如I53-50、铁蛋白、mi3和IMX313颗粒。I53-50是通过计算工程设计的双组分蛋白，可自组装成二十面体纳米颗粒。该系统已用于RSV、流感病毒和HIV疫苗的开发，这些I53-50疫苗候选物在动物模型中诱导了强烈的抗体反应。在COVID-19疫苗开发中，一种多价SARS-CoV-2刺突受体结合域纳米颗粒（RBD-NP）疫苗在小鼠中显示出保护作用，仅需一次免疫。这种RBD-NP疫苗在非人灵长类动物中引发了多样化的多克隆抗体反应，目前正在进行临床试验（NCT04742738，NCT05007951）。另一项研究展示了一种疫苗，该疫苗显示了SARS-CoV-2刺突蛋白的多个副本，以诱导强烈的中和抗体反应，从而提供对高剂量SARS-CoV-2挑战的保护。铁蛋白是一种天然蛋白笼，由24聚体结构组成，具有八个三重轴，可用于展示三聚体抗原，如流感血凝素（HA）或HIV Env蛋白。一种基于铁蛋白的疫苗候选物目前正在进行针对EBV（传染性单核细胞增多症、各种癌症和自身免疫疾病的原因）的I期临床试验（NCT04645147）。一些COVID-19疫苗也被设计为使用铁蛋白来展示RBD或刺突三聚体，形成纳米颗粒，这两种疫苗候选物在临床前研究中都显示出了提高的抗体反应。最后，mi3 NP是理性设计的i301纳米笼的突变形式，显示出比原始形式更高的产量、均匀性和稳定性。基于RBD的mi3疫苗可以诱导针对SARS-CoV-2变体和SARS-CoV的中和抗体。mi3已被用于开发流感、典型猪瘟和疟疾疫苗。通过遗传融合、标签/捕手组装或化学交联可以实现抗原到支架的展示。与基于蛋白质的纳米颗粒疫苗相关的主要挑战是在融合到或展示在支架上时保持抗原的结构构象。纳米颗粒疫苗是一个激动人心的平台，用于灵活的抗原展示，在疫苗开发中具有巨大的潜力。 2.6.病毒载体疫苗 病毒载体疫苗使用减毒病毒疫苗株或非复制病毒作为载体，有效地将抗原基因代码传递到宿主细胞核中以诱导免疫反应。病毒基因组可以稳定地接受大基因片段的插入并表达特定抗原，从而可以使用病毒载体技术开发多种疫苗。抗原可以精确合成、修改并针对宿主中的特定细胞。病毒载体诱导的身体反应类似于对自然感染的反应，导致强烈的体液和细胞免疫反应。病毒基础疫苗的主要关注点是针对载体的预先存在的免疫力，这削弱了疫苗引起的抗体诱导和T细胞反应。目前，许多病毒载体，如人类和黑猩猩腺病毒（Ad和ChAd）、水泡性口炎病毒（VSV）、改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）、麻疹病毒（MV）、痘病毒、新城疫病毒（NDV）和其他病毒已被用作疫苗开发的载体。批准的病毒载体疫苗包括埃博拉病毒疫苗和COVID-19疫苗。由CanSino Biotechnology, Inc.开发的首个获得许可的埃博拉病毒疫苗基于腺病毒（Ad5）载体，已获得国家药品监督管理局（NMPA）的批准（表1）。其他包括由Merck开发并由食品药品监督管理局（FDA）批准的复制能力VSV基础埃博拉疫苗ERVEBO；由Janssen Cilag International N.V.（Janssen）开发的编码扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白的腺病毒Ad26，Zabdeno；Mvabea，一种MVA，编码扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒和马尔堡病毒的糖蛋白，以及由Janssen开发的Tai Forest埃博拉病毒的核蛋白。迄今为止，已有五种批准的病毒载体COVID-19疫苗：由CanSino开发的基于腺病毒载体的Ad5；基于重组ChAdOx1腺病毒载体（ChAd）平台的AZD1222（Vaxzevria），由AstraZeneca开发；由印度血清研究所有限公司开发的Covishield（ChAdOx1_nCoV-19）；由Janssen开发的Ad26.CoV2.S疫苗；以及基于Ad26和Ad5载体的Sputnik V，由俄罗斯加马利亚研究所开发。 中国疾病预防控制中心（中国疾控中心）已开发出一种基于DNA疫苗与复制能力天坛牛痘（rTV）疫苗结合的HIV疫苗（DNA/rTV），该疫苗包含gag、pol和env基因。这种疫苗在恒河猴中对同源和异源挑战后的病毒获取具有保护作用。DNA/rTV疫苗在I期（ChiCTR-PRC-10001287）中安全并诱导免疫反应。2021年11月，使用DNA/rTV疫苗的II期临床试验（ChiCTR1900021422）已完成。研究人员还构建了一种包含刺突蛋白的复制能力重组病毒（rVSV-SARS-CoV-2）的COVID-19疫苗。结果显示，通过鼻内（i.n.）给药的rVSV-SARS-CoV-2疫苗在猕猴中诱发的中和抗体水平是肌肉注射（i.m.）途径的8倍。同样，基于NS1-del基础的减毒流感病毒载体的结核病疫苗也已进入I期临床试验（NCT03017378）。厦门大学、香港大学和北京万泰生物药业开发了一种基于减毒流感病毒的COVID-19疫苗，DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1（鼻内流感基础-RBD），目前正在进行III期临床试验（ChiCTR2100051391）。 由于其制造平台的多功能性和在流行病或大流行期间的响应时间，病毒载体疫苗越来越多地用于预防性疫苗的生产。然而，罕见的风险事件仍然是一个需要解决的重要问题，以充分利用这一平台在未来的潜力，这在传染病和癌症中具有重要意义。 2.7.肽疫苗 免疫系统对抗原作出反应，通常集中在少数氨基酸（aa）或肽段上，主要是B细胞和T细胞表位。肽疫苗旨在识别病原体上的肽序列，这些序列能够诱导保护性免疫反应，然后使用这些肽序列来全合成疫苗物质。由于它们是合成的，没有突变或逆转的风险，肽抗原可以快速修改以产生特定的反应。然而，这种方法在实践和理论上仍然存在困难。肽疫苗本身通常免疫原性不足，需要多次免疫才能有效。免疫原性可以通过将表位肽与载体蛋白融合、将表位肽与载体蛋白化学链接或人工合成相关肽的重复序列来增强。表位通常不是简单的氨基酸序列；然而，结构表位——具有精确构象——有时可能是抗体结合所必需和充分的。因此，以构象依赖的方式呈现肽是肽疫苗设计的重要考虑因素。先进的肽疫苗目前正在临床试验中，包括针对流感病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1、疟疾和阿尔茨海默病的疫苗。 最近，图宾根大学医院开发了一种基于肽的COVID-19疫苗候选物，名为CoVac-1，由来自SARS-CoV-2的多个病毒蛋白（刺突、核衣壳、膜、包膜和开放阅读框8（ORF8））的T细胞表位组成。这与Toll样受体1/2激动剂XS15结合，在Montanide ISA51 VG中乳化。在I期，开放标签试验（NCT04546841）中，CoVac-1显示出有利的安全性，并且在所有参与者中诱导了针对多种疫苗肽的SARS-CoV-2特异性T细胞反应，由多功能Th1 CD4+和CD8+ T细胞介导。这些发现表明CoVac-1诱导了一种广泛、强大且与关注变体无关的T细胞反应。 一种疟疾疫苗PEV3B含有来自恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）和环孢子蛋白（CSP）的两个多肽。临床试验Ia（NCT00400101）和Ib（NCT00513669）阶段证明了病毒体配方的PEV3B的安全性和免疫原性。事实上，在大多数时间点上，AMA-1和CSP肽抗原特异性IgG滴度显著高于对照组。这些发现为进一步开发针对疟疾的多价病毒肽疫苗提供了坚实的基础。 一种新型通用流感疫苗Multimeric-001（M-001），由BiondVax Pharmaceuticals Ltd.开发，包含来自A型和B型流感病毒的HA、NP和M1蛋白的保守表位，旨在保护免受多株和多季节流感病毒株的侵害。七个已完成的临床试验表明，该疫苗安全、耐受性好，并对广泛的流感毒株具有免疫原性。然而，在2020年10月，M-001的III期临床试验（NCT03450915）并未显示安慰剂组和接种组在减少流感疾病方面有显著差异。在HIV疫苗研究中，一种融合肽（FP）共价链接到关键孔虫血蓝蛋白（KLH）的赖氨酸残基上，命名为FP-KLH，被设计为在Env三聚体初次免疫后作为增强剂。这种组合免疫方案在小鼠中诱发了单克隆抗体，中和了高达31%的208种HIV-1跨亚型菌株。对豚鼠和猕猴的免疫诱导了类似的广泛的融合肽导向的中和反应，表明HIV-1融合肽是疫苗诱导广泛中和抗体的靶标。 肽疫苗的开发作为一种方法吸引了各种治疗领域的关注，包括癌症、阿尔茨海默病和丙型肝炎病毒。尽管如此，肽疫苗仍然存在挑战，包括较弱的免疫原性和不一致的免疫反应，这应该通过表位设计、载体优化和新佐剂的结合进一步改进和发展。 2.8.DNA和mRNA疫苗 核酸疫苗由DNA疫苗和mRNA疫苗组成。DNA疫苗使用编码蛋白质的细菌质粒，在哺乳动物启动子下，然后驱动宿主细胞中的抗原表达。DNA疫苗可以诱导体液和细胞免疫，具有长期免疫反应，并且易于制造和扩大规模。针对流感、乙型肝炎、HIV、疟疾、SARS-CoV-2和癌症等传染性和非传染性疾病的DNA疫苗已在数百项人类临床试验中进行了测试。最近，印度在2022年批准了第一种用于人类紧急使用的DNA疫苗。由Zydus Cadila开发的ZyCoV-D疫苗采用了非复制和非整合的质粒DNA，携带SARS-CoV-2的基因。ZyCoV-D使用无针系统，将免疫以狭窄的流体流形式传递到皮肤中，显著减少了副作用。在III期临床试验的中期报告中，ZyCoV-D疫苗的有效性达到了约66.6%。治疗组中诱发的不良事件的发生相似。总的来说，ZyCoV-D疫苗在III期试验中被验证为有效、安全和具有免疫原性。然而，许多DNA疫苗的免疫原性低于其他疫苗平台，并且与在其他哺乳动物中看到的临床结果相比，临床结果令人失望。此外，安全性问题，如质粒DNA整合到基因组DNA中。过去对DNA疫苗整合进行了广泛研究，但没有证据表明发生了整合。DNA疫苗受到其较弱的免疫原性的限制，需要施用更大的剂量。此外，它们有效的递送仍然是未来研究的问题。 mRNA疫苗通过将与病原体特定蛋白相对应的信使RNA（mRNA）引入宿主细胞而发挥作用。mRNA疫苗主要包括传统的非复制型mRNA和自复制mRNA（SAM）。获得许可的COVID-19疫苗BNT162b2和mRNA-1273都是非复制型mRNA疫苗。自复制RNA（SAM）具有编码RNA复制因子的完整基因。与传统mRNA相比，SAM具有更持久和更高水平的抗原表达。SAM疫苗所需的剂量也远低于传统mRNA疫苗。非复制型和SAM疫苗在引入细胞质时表达高水平的异源基因。mRNA疫苗可以激活先天免疫系统并发挥固有的佐剂效应。mRNA疫苗具有免疫原性；被模式识别受体（PRRs）如TLR3和TLR7/8识别；在接种部位产生细胞因子；并招募和驱动先天免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）的激活和成熟。对于适应性免疫，mRNA的翻译过程在细胞质中完成以产生目标抗原，然后被有效加工成多肽并呈现给MHC-I分子，引发细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。翻译后的抗原随后被分泌并在MHC-II蛋白上呈现给辅助T细胞（Th），以引发CD4+ T细胞反应，这通过炎症细胞因子刺激B细胞产生中和抗体并激活吞噬细胞。与传统疫苗类似，为了克服脂质双层并将mRNA疫苗转移到细胞质中，已开发了各种mRNA疫苗的递送方法，包括基因枪、电穿孔、脂质纳米颗粒（LNPs）等。 COVID-19 mRNA疫苗Comirnaty（BioNTech/Pfizer）是FDA于2021年8月首次批准用于人类的mRNA药物；Spikevax（Moderna）疫苗也于2022年1月在美国获得授权，并随后在其他国家使用（表1）。Comirnaty和SpikeVax是LNP配方的、修饰核苷的mRNA疫苗，编码SARS-CoV-2的S蛋白的前融合稳定形式。在一项涉及43,548名参与者的研究中，接种两剂疫苗后BNT162b2预防COVID-19的有效性为95%。严重不良事件的发生率很低，疫苗组和安慰剂组之间相似。在涉及30,420名志愿者的III期临床试验中，mRNA-1273疫苗预防COVID-19的有效性为94.1%，同样，严重不良事件很少见。另一种mRNA疫苗（CVnCoV），由CureVac开发，已进入IIb/III期临床试验。然而，CVnCoV对有症状的COVID-19的有效性为48.2%，随着SARS-CoV-2变种的出现，该试验被暂停。另一种mRNA疫苗ARCoV，由中国的Walvax Biotechnology开发，已于2022年9月获得印尼药品机构的紧急使用授权。ARCoV热稳定，可在室温下至少存放一周。ARCoV在I期临床研究中被证明是安全且耐受性良好，并能诱导强大的体液和细胞免疫反应，支持进一步的大规模临床研究和人类使用。 目前，有超过25种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗候选物正在进行临床试验。此外，还有许多针对其他传染病的mRNA疫苗的临床试验，包括寨卡病毒（NCT04064905）、流感病毒（NCT03345043, NCT03345043）、巨细胞病毒（NCT04232280, NCT03382405, NCT03382405）、RSV（NCT04528719）、基孔肯雅病毒（NCT03829384, NCT03325075）和狂犬病（NCT02241135, NCT04062669）。 环状mRNA（circRNA）是一种非编码单链RNA，通过添加内部核糖体进入位点（IRES）和/或通过在5′UTR中纳入特定的核苷修饰，可以实现蛋白表达。这一新平台已被证明由于转录本的延长半衰期，在真核细胞中产生强大且稳定的翻译。最近，Qu等人报告了一种SARS-CoV-2 Omicron circRNA疫苗，该疫苗在小鼠和猴子中诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并有效抵抗SARS-CoV-2。 与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有类似活病毒的免疫反应机制，没有感染或整合到宿主基因组的风险，更稳定，能够有效表达抗原蛋白，并且通过快速且成本效益高的大型生产过程生产。从理论上讲，mRNA疫苗的开发只需要在成熟的技术平台上替换抗原序列；因此，在预防和控制新出现的传染病方面提供了相当大的优势。然而，mRNA疫苗在翻译效率和稳定性方面仍然存在一些挑战。此外，了解安全性和抗体反应的持续时间需要更长期的数据。总体而言，mRNA技术为疫苗、治疗以及更多领域提供了一个令人兴奋和有希望的途径。 2.9.当前和未来的中国预防性疫苗市场 中国是目前少数几个能够通过其工业基础设施提供足够疫苗供应能力的国家之一。近年来，中国在疫苗研发方面做出了巨大努力，并取得了显著进展，其疫苗市场正逐渐繁荣起来。根据NMPA批准的药品信息，中国市场上有94种预防性疫苗，可以预防38种疾病（表2）。其中，80种疫苗是国内生产的，11种来自国外；国产疫苗作为市场的主力，而一些战略性疫苗的供应，如白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌联合疫苗（DTwP/Hib）、五价轮状病毒疫苗、四价和九价HPV疫苗以及带状疱疹疫苗仍然依赖外部制造商。最近，国产HPV疫苗和肺炎球菌疫苗的批准展示了中国在疫苗开发和制造领域的巨大潜力。中国还开发了手足口病疫苗（EV71）、戊型肝炎疫苗和埃博拉疫苗等新型疫苗。这些成就为SARS-CoV-2出现后多技术疫苗突破的快速部署奠定了坚实的基础。目前中国市场上的传染病疫苗包括流感、水痘、脑膜炎球菌性脑膜炎、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、狂犬病、白喉、百日咳、破伤风、b型流感嗜血杆菌、脊髓灰质炎、结核病、霍乱、轮状病毒、脓疱疮、气管炎、手足口病、破伤风、伤寒、副伤寒、黄热病、钩端螺旋体病、蜱传脑炎、日本脑炎、麻疹、腮腺炎、风疹、鼠疫、肺炎球菌肺炎、炭疽、布鲁氏菌病、COVID-19、宫颈癌、细菌性痢疾、埃博拉出血热、肾综合征出血热、带状疱疹。然而，与全球市场相比，中国仍然缺乏一些疾病的疫苗，如登革热、B群脑膜炎球菌和疟疾。同时，值得注意的是，中国大多数疫苗目前基于传统疫苗平台，如灭活或减毒活疫苗、基因工程疫苗。第三代疫苗技术如病毒载体和核酸疫苗的开发才刚刚开始，中国市场上还没有核酸疫苗。 表2 中国当前许可的疫苗市场 对于重要疾病，如HIV、RSV、寨卡病毒和巨细胞病毒疫苗，尚未在全球成功开发和上市。此外，主要传染病病原体的其他亚型或突变逃逸株也在不断演变。因此，带来了许多挑战，如现有疫苗覆盖不足，如COVID-19、流感、结核病等疫苗。此外，一些现有的传染病疫苗对某些特定类型预防效果较差，如B群脑膜炎球菌疫苗、人类乳头瘤病毒疫苗、肠道病毒EVD68、超级细菌疫苗等。此外，中国无法独立满足高风险或特殊人群的疫苗需求，如老年人的带状疱疹疫苗。最后，联合疫苗是一线可以预防多种疾病并让人们通过较少的注射获得保护的疫苗。未来，应加强新一代疫苗技术的开发，如病毒载体疫苗和核酸疫苗。 3.治疗性疫苗的发展进展 与预防性疫苗不同，治疗性疫苗是指在已经感染病原体或患有特定疾病的患者中诱导特异性或非特异性免疫反应以治疗疾病进展的生物制品。因此，治疗性疫苗的主要目标是诱导肿瘤消退、根除微小残留病、建立持久的抗肿瘤记忆以及避免非特异性或不良反应。治疗性疫苗主要分为四类：基于肽/蛋白的疫苗、基于细胞的疫苗、基于DNA或RNA的疫苗和基于病毒载体的疫苗。根据疾病分类，治疗性疫苗可以分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性病的疫苗。首个获得FDA批准的癌症疫苗，Sipuleucel-T（Provenge，由Dendreon公司商业化），目前用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌。Provenge是一种自体的、基于树突状细胞的疫苗，装载有与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）融合的前列腺酸性磷酸酶（PAP）抗原；这种疫苗首次实现了利用患者的自身免疫细胞攻击癌细胞的理念。迄今为止，已有超过30,000名男性患者接受了Provenge治疗，临床上已证明可以延长晚期疾病男性患者的生命。Provenge的批准在治疗性疫苗领域内具有重要意义，并强调了抗癌疫苗可以发挥作用的事实，从而为进一步投资癌症疫苗开发提供了动力。 3.1.治疗性疫苗在癌症方面的应用 3.1.1.治疗性疫苗在肺癌方面的应用 肺癌（LC）是最常被诊断出的癌症，也是导致癌症相关死亡的主要原因，由于预后不佳和临床结果差，给全球公共卫生带来了沉重负担，5年生存率为19%；实际上，肺癌占癌症总病例的11.4%，占全球癌症总死亡人数的18.0%。LC分为两个主要组织类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。传统的抗癌疗法（手术、放疗和化疗）在遏制进展方面的有效性有限，因此，全球范围内正在积极开展针对LC的治疗性疫苗设计研究（表3）。2008年，古巴开发了世界上第一个有效的治疗性疫苗CIMAvax EGF用于NSCLC，后来在古巴、秘鲁和委内瑞拉批准用于一线化疗后的晚期（IIIB和IV期）NSCLC治疗。CIMAvax EGF由人重组表皮生长因子（EGF）与脑膜炎奈瑟菌重组P64K蛋白共价结合而成。EGF调节细胞生长和分裂，NSCLC患者中EGF的过度表达与细胞生长和分裂失控有关。CIMAvax EGF通过刺激免疫系统产生特异性针对EGF的抗体，抑制其与癌细胞上的相应受体结合，从而减缓癌细胞的无控制生长。II期和III期临床试验表明，CIMAvax EGF耐受性良好，并延长患者生存期，特别是60岁以下患者的中位总生存期（OS）分别为18.53个月和7.55个月。另一种疫苗Vaxira是一种免疫治疗剂，由小鼠γ型抗异型单克隆抗体Racotumomab和氢氧化铝组成。Racotumomab特异性诱导针对在多种实体瘤中过度表达的Neu-糖基化GM3神经节苷脂（NeuGcGM3）的抗体反应。目前正在评估多种癌症适应症，包括黑色素瘤、乳腺癌和肺癌。Vaxira治疗NSCLC的临床试验结果显示，中位生存时间为8.23个月，略高于对照组的6.8个月；Vaxira治疗组的中位无进展生存时间为5.33个月，对照组为3.9个月，证明了Vaxira优于安慰剂。基于II/III期研究的有希望的结果，Racotumomab于2013年在古巴和阿根廷推出，作为晚期NSCLC患者的皮下注射治疗。Tedopi是一种基于新表位的疫苗，具有针对HLA-A2+的限制性修饰新表位，针对肺癌中经常表达的五种肿瘤相关抗原：CEA、HER2、MAGE2、MAGE3和P53。在II期试验中，Tedopi在预处理的晚期NSCLC患者中显示出17.3个月的OS，并具有可管理的安全性。ATALANTE-1——一项随机、开放标签、两步、III期研究——比较了Tedopi与标准治疗（SoC）在HLA-A2+ NSCLC患者中的疗效，这些患者在ICI治疗后疾病进展的第二或第三线治疗。Tedopi通过刺激杀手T细胞，使它们能够发现并消除癌细胞，这是治疗疾病的关键过程。结果显示，在63名Tedopi组患者中，有29名患者至少存活了12个月，12个月生存率为46%，远高于预定的25%。一名54岁的晚期LC患者，在接受了五次Tedopi注射后，肿瘤迅速缩小（从39毫米缩小到23毫米）。在本报告发布时，患者的生存期已超过20.6个月，仍在观察中。现在，由于其出色的临床数据，Tedopi已获得美国FDA的孤儿药指定，用于治疗HLA-A2阳性NSCLC。 表3 市场上或处于临床开发阶段的针对不同疾病的治疗性疫苗 3.1.2.治疗性疫苗在乳腺癌方面的应用 乳腺癌（BC）是全球第二常见的恶性肿瘤，每年有超过226万例新病例。它也是女性癌症相关死亡的主要原因。迄今为止，截至2021年6月23日，共有44项正在进行的（即活跃的、不招募；招募；尚未招募）临床试验正在研究BC的治疗性疫苗。就疫苗平台而言，大多数BC疫苗是基于肽的（N=20，45.5%），而大约有10项（22.7%）的临床试验正在测试基于细胞的BC疫苗；新技术开发的病毒载体疫苗占6项（13.6%），而基于基因的BC疫苗正在8项（18.2%）临床试验中进行评估。 人表皮生长因子受体-2（HER2）是乳腺癌疫苗的理想靶点，是一种细胞表面受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性，在高达75%的BC中表达。HER2在细胞生长、存活和分化中发挥着极其重要的作用。针对HER2的基于肽的疫苗能够诱导持久的特异性细胞和体液免疫反应，以抑制HER2阳性肿瘤细胞的生长，显示出高免疫原性、强特异性和良好的安全性。在II期临床试验（NCT00524277）中，HER2衍生的肽疫苗GP2，即HER2跨膜域（TMD）的亚优势表位，与GM-CSF（一种FDA批准的免疫佐剂）结合使用。这种组合刺激了抗原呈递细胞（如DC等）的增殖，并进一步诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别和摧毁表达HER2/neu的癌细胞。此外，GP2疫苗耐受性良好，没有严重的不良反应，接受GP2疫苗治疗的BC患者在手术后以及Herceptin治疗后5年的无病生存率达到100%。此外，与单独接受GM-CSF治疗的患者相比，BC复发率为0%，而后者为89.4%。基于E75（HER2/neu 369-377，KIFGS LAFL）的疫苗是治疗BC患者最广泛研究的策略。然而，目前的结果表明，E75疫苗仅对三阴性BC患者并且在治疗与曲妥珠单抗联合使用时对表达HLA-A24的患者提供了显著的临床益处；需要进一步评估这些效果。其他基于肽的疫苗也在临床试验中（表3）：AE37（HER2/Neu 776-790，GVGSPYVSRLLGICL；II期临床试验中），TPIV100（一种使用sargramostim作为佐剂的多表位疫苗，针对HER2；II期临床试验中），MVFHER-2（aa597-626；I期临床试验中）和MVF-HER-2（aa266-296；I期临床试验中）（MVF-HER2是两种嵌合型曲妥珠单抗样（MVF-HER2，aa597-626）和小扰素样（MVF-HER2，aa266-296）HER2 B细胞肽基疫苗的组合）。此外，基于细胞的治疗性疫苗是患者特定的，需要一种安全的方法进行个性化疫苗开发（Arab等人，2020年）。目前有多种针对HER2的基于细胞的疫苗正在开发中（表3）：DC细胞（NCT02061423，NCT04348747），PBMC细胞（APC8024），以及同种异体细胞（NCT00847171）已被用作免疫原进行免疫。初步结果表明，这些疫苗耐受性良好，并提供了特异性抗HER2细胞免疫反应。目前，正在考虑用于提高BC治疗性疫苗效果的各种方法：包括选择合适的细胞亚群、佐剂的选择以及不同的工程方法（如基于VLP或基于基因的疫苗）。然而，这些优化的临床益处仍有待验证。 3.1.3.治疗性疫苗在结直肠癌方面的应用 结直肠癌（CRC）是世界上第三常见的癌症，仅次于LC和BC，发病率为10.0%，死亡率为9.4%。CRC的标准治疗是手术、化疗和放疗，这些治疗可能结合使用。然而，这些治疗有许多副作用，许多患者在一系列治疗后仍然会复发。因此，为这一患者群体开发替代的有效治疗方法至关重要。尽管，目前还没有FDA批准的CRC疫苗，但已评估了多种疫苗用于治疗CRC，包括自体、DC、肽和基于病毒载体的疫苗。OncoVAX是一种自体结肠癌疫苗，与活的卡介苗（BCG）混合，用作CRC切除术后患者的辅助治疗。III期临床试验（NCT02448173）结果表明，OncoVAX对III期结肠癌患者没有显著影响，但在平均5.8年的随访期间。OncoVAX显著延长了II期结直肠癌患者的无复发期，并降低了总体复发风险和死亡风险。作为一种主动特异性免疫治疗（ASI），OncoVAX在免疫调节佐剂（BCG）的帮助下增强了患者肿瘤细胞的免疫原性，以刺激患者对自体（患者特定）肿瘤细胞的免疫反应。基于ASI的治疗程序通常假定患者肿瘤细胞上存在不同的肿瘤抗原，并且这些抗原在正常细胞中不存在或浓度较低。 最近的研究报告了一种基于腺病毒的疫苗，用于治疗结直肠癌（CRC），并在I期临床试验（NCT01972737）中取得了积极结果。研究发现，CRC抗原鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）能够在小鼠中引发针对肿瘤的抗原特异性CD8+ T细胞反应，而不是CD4+ T细胞，从而在不引起自身免疫的情况下提供抗肿瘤免疫。由人类5型腺病毒（Ad5）（作为载体）、PADRE（在大多数人类HLA分子背景下活跃的CD4+ T细胞表位）和GUCY2C组成的Ad5-GUCY2C-PADRE疫苗也经过了测试：在I/II期临床试验中，10名CRC患者接受了疫苗接种，并在6个月内进行了随访。作者发现Ad5-GUCY2C-PADRE安全地产生了针对抗原的细胞毒性CD8+细胞，但没有产生自身免疫性CD4+ T细胞，且没有严重的不良反应。 在2020年美国临床肿瘤学会（ASCO）大会上，梅奥诊所报告了一种新的治疗方法疫苗PolyPEPI1018，专门为MSS型CRC设计，可以有效延缓肿瘤进展。PolyPEPI1018是一种多肽疫苗，由六种合成肽组成。这些肽段包括来自7种保守的癌症睾丸抗原（CTAs）（TSP50、EpCAM、Survivin、CAGE1、SPAG9、MAGE-A8、FBXO39）的12个独特的免疫原性表位，这些抗原在mCRC中经常表达。这种疫苗经过优化，以诱导持久的CRC特异性T细胞反应。在OBERTO临床I/II期试验（NCT03391232）中，共有11名患者接受了PolyPEPI1018疫苗接种：3名患者进一步肿瘤进展，5名患者病情稳定，3名患者部分肿瘤缓解，2名患者的肿瘤缩小到可以接受手术的程度。值得注意的是，在手术后原发肿瘤中没有发现存活的肿瘤细胞，表明肿瘤细胞被杀死了。因此，这些初步发现表明PolyPEPI1018对MSS mCRC肿瘤具有早期临床活性，可以有效延缓肿瘤进展。因此，需要进一步研究以调查PolyPEPI1018的疗效。此外，还有多项旨在寻找正确的抗原刺激物的试验正在进行中。 3.1.4.治疗性疫苗在肝癌方面的应用 肝癌是全球最常见的癌症之一，发病率为4.7%，死亡率为8.3%。肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，通常发生在由酗酒、代谢综合征或乙型肝炎（HBV）或丙型肝炎（HCV）病毒感染引起的慢性肝病背景下。事实上，HBV和HCV感染被认为是HCC的主要风险因素。尽管HCC有各种治疗方法，包括预防性疫苗，包括HBV疫苗，已被报告可以降低HCC的发病率；尽管如此，患者总体生存率的变化仍然远未令人满意，对于更有效的治疗方法存在巨大的未满足需求。癌胚抗原糖蛋白-3（GPC3）在80%的HCC中特异性高表达，但不在正常组织中表达，因此被认为是抗原特异性免疫治疗的理想靶点。事实上，Nobuhiro等人已经发现GPC3肽可以在小鼠中诱导免疫反应，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和抗肿瘤活性，而不会引发自身免疫现象。因此，大多数基于肽的HCC疫苗主要针对GPC3抗原。 在一项II期临床病例对照研究（UMIN-CTR，UMIN000002614）中，比较了接种和未接种GPC3肽疫苗的患者的无病生存（DFS）、总生存（OS）和CTL诱导。研究证实，无论是否接种GPC3肽疫苗，80%的患者都会复发。然而，术后辅助疫苗接种可能会使1年复发率降低约15%，5年和8年生存率分别提高约10%和30%。此外，GPC3 IHC染色阳性的患者更有可能诱导CTLs，60%的患者生存超过5年。另外两种肽鸡尾酒疫苗（ONO-7268MX1 [JapicCTI-121933]和ONO-7268MX2 [JapicCTI-142477]），包含GPC3、在HCC中上调的含有WD重复的蛋白（WDRPUH）和类似内切核酸酶VIII的三个表位（NEIL3），在两项I期研究中评估了晚期HCC。除了GPC3，WDRPUH和NEIL3也被确定为HCC中的潜在免疫治疗靶点。其中，WDRPUH具有促进生长的活性，抑制WDRPUH可以延缓癌细胞的生长，而NEIL3作为一种肿瘤抗原，其编码基因在HCC中表现出高频的杂合性丧失，表明它可能是一个潜在的肿瘤抑制基因，在DNA修复中发挥作用。接种ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的HCC患者显示出良好的耐受性，并诱导了CTL反应。一些患者还表现出长期疾病控制，ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的疾病控制率分别为52.9%和35.7%，报告了9名和5名患者的病情稳定。这些结果暗示了这些疫苗在治疗HCC方面的潜在用途。 IMA970A是一种由16种新发现的在HCC患者肿瘤组织中过度表达的肿瘤相关肽（TUMAPs）组成的基于肽的HCC疫苗。IMA970A与免疫刺激剂CV8102一起给药，可以诱导平衡的Th1/Th2免疫反应。在这些TUMAPs中，有7种限制在HLA-A02上，5种限制在HLA-A24上，4种限制在HLA-II类上。处于非常早期、早期和中期HCC的患者被纳入接受单次低剂量环磷酰胺的预疫苗输注，然后是9次皮内疫苗接种。初步结果显示疫苗具有良好的安全性，但免疫原性数据尚未公布（NCT03203005）。此外，甲胎蛋白（AFP）作为HCC最广泛使用的血清标志物，可以改善预后并用于监测治疗反应；AFP衍生肽疫苗的安全性和有效性也在临床试验中得到了验证。 另一种HCC的治疗性疫苗是基于个性化肽疫苗。2017年，一项I/II期研究评估了一种新的治疗方法对晚期HCC的疗效和安全性：基于个性化肽疫苗（PPV-DC-CTL）的细胞免疫治疗与放疗相结合。结果显示疫苗耐受性良好，未引起严重副作用，研究中的9名患者病情控制良好，有效率（RR）为33%，疾病控制率（DCR）为66%。治疗效果明显优于单独报告的经导管动脉化疗栓塞（TACE）、索拉非尼和化疗。另一种个性化肽疫苗是使用仅来自恶性肿瘤细胞的非同义突变表位肽作为抗原（称为新抗原）；这些肽与MHC一起在肿瘤中表达，因此被T细胞特异性识别，引发强烈的抗肿瘤免疫反应。最近，刘团队发现个性化新抗原疫苗策略在预防HCC术后复发方面安全、可行且有效，并且通过ctDNA中的相应新抗原突变监测HCC进展也很有用；实际上，这为HCC患者的个性化医疗提供了可靠信息。在一项I期临床试验（ChiCTR1900020990）中，10名有血管侵犯的HCC患者在接受HCC诊断后2个月内进行了根治性手术切除和预防性TACE。通过肿瘤和周围组织全外显子测序鉴定非同义体细胞单核苷酸变异。对于疫苗，使用了6-20个体细胞点突变或RNA编辑新抗原长肽（27aa），并与ploy:IC佐剂混合作为抗HCC复发治疗。结果显示没有明显的治疗相关不良事件：新抗原疫苗可以有效地诱导和激活HCC患者的特异性免疫反应，并相应地延长这些患者的无复发生存期。患者的中位RFS为7.4个月，证实了个性化新抗原疫苗预防HCC患者术后复发的安全性和可行性。总之，我们讨论了几个涵盖癌症治疗肽疫苗的积极结果的例子，表明在人类中诱导CTLs是有希望的。但到目前为止，还没有观察到完全和明确的康复病例。需要进一步设计和筛选具有高免疫原性的有效的肽序列，辅以高效佐剂，或与其他免疫疗法结合，以实现更好的肿瘤消退。 3.1.5.治疗性疫苗在胃癌方面的应用 人们一直在推动研究癌症疫苗在各种肿瘤组中的作用，包括胃肠道癌症。胃癌（GC）是世界第五大癌症，2020年的发病率为5.6%，死亡率为7.7%。大多数GC患者在晚期被发现，局部晚期疾病或转移性扩散导致的不可切除病变的5年OS率仅为5%至15%。近年来，在免疫检查点抑制剂的治疗下，GC取得了巨大进展，但GC的治疗性疫苗仍处于临床阶段（表3）。因此，许多研究正在探索将免疫检查点抑制剂与化疗和其他药物或疫苗结合使用的潜力。例如，在之前的一项研究中，晚期GC患者接受了人类白细胞抗原（HLA）-A24限制性的人类血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）-1084和VEGFR2-169多肽疫苗与S-1加顺铂的组合治疗，中位生存时间达到14.2个月。另一种选择，胃泌素-17-白喉毒素免疫原（G17DT；Gastrimmune），一种抗胃泌素17免疫原，已确认可以提高针对胃泌素17的高亲和力中和抗体，可以阻断胃泌素刺激的生长并抑制胃泌素与CCK-2受体的相互作用。G17DT现在已经在许多肿瘤治疗中用于被动和主动免疫治疗，包括原发性和转移性疾病。实际上，作者证实，当与5-氟尿嘧啶加顺铂结合使用时，G17DT可以刺激体内的免疫反应，并且有免疫反应的患者生存时间更长。 如上所述，肿瘤特异性抗原是免疫治疗的潜在靶点。通过比较GC样本和正常组织之间的差异蛋白表达研究，已经鉴定出四种癌症特异性抗原——FOXM1、DEPDC1、KIF20A和URLC10；这四种抗原在肺癌、食管癌、膀胱癌和其他癌症中也上调。 血管生成是肿瘤进展的关键机制，血管内皮生长因子（VEGF）是已知最有效和特异性最强的血管生成促进因子，因此，它被用作许多疫苗的靶点。OTSGC-A24是一种针对FOXM1、DEPDC1、KIF20A、URLC10和VEGFR1的HLA-A24:02结合肽疫苗混合物。在I/Ib期临床试验（NCT01227772）中，观察到24名携带HLA-A24:02单倍型的晚期胃癌患者的显著CTL反应，患者的总生存期为5.7个月（Sundar等人，2018年）。 除了肿瘤抗原，新抗原或识别新抗原的T细胞存在于大多数癌症中，为个性化疫苗设计提供了特异性和高度免疫原性的目标。I/II期临床试验（NCT03480152）评估了一种名为mRNA-4650的mRNA疫苗，该疫苗由多达20种不同的mRNA组成，编码定义的新抗原、驱动基因的突变和HLA-I预测的表位。在转移性胃肠道癌症患者中，疫苗被证明是安全的，并诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，这些反应在疫苗接种前未被检测到。然而，尚未观察到客观的临床反应，疫苗可能只与其他免疫疗法结合使用以增强治疗效果。 最近，Ursula Wiedermann团队开发了一种治疗性B细胞表位疫苗（IMU-131/HER-Vaxx），并在Ib期临床试验（NCT02795988）中验证了其在HER2/neu过度表达的胃食管腺癌（GEA）患者中的免疫原性和有效性。IMU-131/HER-Vaxx由来自HER2/neu细胞外域的三个融合B细胞表位（P4、P6和P7）组成，与CRM197偶联，并用Montanide佐剂。针对IMU-131肽的抗体通过结合HER2受体的三个不同区域并参与二聚体环，阻止两个HER2受体的二聚体化，从而抑制细胞内信号传导。这种阻断HER2信号通路被认为比单独使用曲妥珠单抗更有效。相比之下，CRM197（CRM；交联材料），一种酶失活的非类毒素白喉毒素形式，已被成功用作各种疫苗的伴侣，可以快速激活具有异质性Th1和Th2细胞因子谱的CD4+ T细胞，用于激活B细胞和调节诱导抗体的数量。在大多数14名接种GEA患者中，检测到针对HER2的特异性抗体和T细胞反应，IMU-131显示出良好的耐受性和安全性。 3.2.治疗性疫苗在病毒性传染病方面的应用 3.2.1.治疗性疫苗在乙型肝炎病毒方面的应用 乙型肝炎病毒（HBV）属于Hepadnaviridae家族，是一种部分双链的包膜DNA病毒。如上所述，HBV感染是导致HCC的重要因素之一，但并非所有HBV感染都会发展成癌症。相反，由HBV引起的慢性乙型肝炎（CHB）对公共卫生的影响更大。尽管经过数十年的积极疫苗接种，全球有20亿人的乙型肝炎血清学特征，其中2.5亿人患有慢性乙型肝炎。目前，只有两种批准用于CHB的药物：核苷类似物和聚乙二醇干扰素（IFN），这两种药物在抑制病毒复制方面有效，但无法清除病毒基因组或从感染肝细胞的血清中清除HBV表面抗原（HBsAg）。因此，迫切需要探索新的治疗途径。目前，有2种治疗性疫苗（NASVAC和YIC）已完成III期临床试验。此外，还有3种疫苗已完成II期临床试验，其中2种（GS-4774和HB02 VAC-ADN）未达到主要终点，1种（εPA-44）达到了治疗终点并进入III期临床试验。还有3种治疗性疫苗（CVI-HBV-002、VBI-2601和HepTcell）处于II期临床试验中，许多处于I期临床试验中（表3）。 乙型肝炎病毒（HBV）衣壳主要由乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和HbxAg组成。目前，大多数HBV治疗性疫苗侧重于HBsAg和HBcAg作为主要免疫原。在一项III期临床试验中，对CHB的初治患者使用NASVAC进行治疗，NASVAC是一种包含HBsAg和HBcAg的治疗性疫苗。作者发现，在80名接受NASVAC疫苗接种的患者中，有85%的患者丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高，并清除了HBeAg。另一项III期临床试验评估了一种含铝佐剂的治疗性乙型肝炎疫苗（YIC），由抗原（HBsAg）-抗体（HBIG[乙型肝炎免疫球蛋白]）免疫复合物组成。本研究旨在通过改变患者体内HBV抗原的过程和存在来消除免疫耐受。不幸的是，疫苗的III期结果未能达到临床终点，即在患者中实现HBeAg血清转换。 一项II期试验（NCT02174276）评估了GS-4774疫苗的疗效，该疫苗由HBs、HBc和HBx融合抗原组成。结果显示，尽管GS-4774安全并对CD8+ T细胞有强烈的免疫刺激作用，但它未能降低患者体内的HBsAg水平。计划探索该药物与其他抗病毒药物联合使用的疗效。 最近的一项研究报告了HBxAg单独作为主要免疫原的潜力。HBxAg在携带HBV的小鼠中诱导了全身HBx特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，并显示出明显的HBs和HBV-DNA耗竭，保护作用至少持续30天。尽管这项研究仅处于临床前阶段，疫苗展示的HBV清除效果使其未来的发展充满希望。另一种目前有前景的疫苗是基于脂质体的纳米脂肽疫苗εPA-44（NCT00869778）。在HLA-A2阳性的进展性CHB患者中，900微克的εPA-44有限浓度导致HBeAg血清转换率显著高于安慰剂组，并具有持续的停药后效果。正在进行一项III期临床试验（ChiCTR2100043708）。 基于病毒载体或基因组的其他CHB治疗性疫苗也在进行中。一项I期临床试验（NCT02431312）评估了INO-1800（编码HBsAg和HBcAg的DNA质粒）单独或与INO-9112（编码人类白细胞介素12的DNA质粒）疫苗联合使用的安全性、耐受性和免疫原性。初步免疫学数据显示，接受INO-1800治疗的患者可以产生识别HBV核心成分的T细胞，并通过干扰素γ释放的方式从肝脏清除HBV。此外，INO-1800可以激活和扩增CD8+杀手T细胞；尽管其他临床数据尚未公布（https://clinicaltrials.gov）。 在另一项I/II期临床试验中，一种名为ANRS HB02 VAC-AND的基于DNA的疫苗，编码HBsAg，在用NAs治疗的CHB患者中诱导了持久的HBV特异性CD4+ T细胞反应，但大多数患者在停用NAs后经历了病毒学反弹。 3.2.2.人乳头瘤病毒治疗性疫苗 宫颈癌是女性中第四常见的癌症，主要由持续感染高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）引起。根据世界卫生组织的数据，2020年全球约有604,127名女性新诊断为宫颈癌，死亡341,831人。尽管有多种预防性疫苗可用，宫颈癌的发病率和死亡率仍然很高，没有批准的非手术治疗方法。因此，研究HPV治疗性疫苗是必要的。与专注于HPV L1蛋白的预防性疫苗不同，治疗性疫苗主要针对在肿瘤细胞中高度表达的HPV早期蛋白E5、E6和E7。基于E6/E7蛋白的疫苗有多种不同形式已进入临床试验（表3），数据显示具有良好的开发潜力。实际上，五种不同的DNA治疗性疫苗（GX-188E、VGX-3100、pNGVL4a-CRT/E7（解毒）、pNGVL4a-Sig/E7（解毒）/HSP70、MEDI0457）被证明耐受性良好且临床有效。其中，VGX-3100疫苗已进入III期临床试验。 VGX-3100是第一种针对与HPV相关的宫颈癌前病变的免疫疗法。它包含HPV16和18的E6和E7 DNA，并使用CELLECTRA 5PSP电穿孔技术进行肌肉注射。结果显示，VGX-3100可以引发全身免疫反应，在三剂疫苗接种者中有49.5%的组织病理学退行，HPV清除率为40.2%，高于安慰剂接种者（30.6%和15.4%）。目前正在进行一项III期试验（REVEAL），以确认VGX-3100在HPV16/18阳性高度鳞状病变（CIN2/3）女性中的疗效、安全性和耐受性。 考虑到与宫颈癌完全缓解相关的疫苗单药治疗结果有限，使用疫苗和免疫疗法药物的联合治疗可能提供更强大的免疫反应。另一种基于DNA的疫苗pgDE7h（编码与1型单纯疱疹病毒（HSV-1）糖蛋白D（gD）融合的HPV16 E7）被发现与吉西他滨（Gem）联合具有协同抗肿瘤效果，吉西他滨是一种在临床上用于多种肿瘤的核苷类似物。这种组合诱导了肿瘤特异性细胞毒性CD8+ T细胞并根除了现有肿瘤。此外，一项研究发现，pembrolizumab与GX-188E（一种设计用于表达HPV16和HPV18的E6和E7蛋白，与Flt3L的细胞外域和组织型纤溶酶原激活剂的信号序列融合的基于DNA的疫苗）联合使用为CIN3患者提供了一种新的可能方案。 蛋白基疫苗由抗原呈递细胞（APCs）处理，导致通过HLA I类和II类呈现抗原，用于产生无类型限制的CD8+和CD4+ T细胞反应。TVGV1是一种融合蛋白基疫苗，由两种抗原组成，铜绿假单胞菌外毒素和KDEL内质网保留信号，与HPV16 E7融合，并用CpG ODN或GPI-0100佐剂。这种疫苗已被证明可以诱导T细胞反应，并为HPV16转化的B6肿瘤提供强大的抑制。目前正在进行一项IIa期临床试验，针对高危HPV宫颈感染的女性（NCT02576561）。 还有几种基于多肽的疫苗使用非E6/E7蛋白作为免疫原。PDS0101是一种基于肿瘤相关抗原MUC1的非MHC限制性疫苗，该抗原在肿瘤中高度表达。这种疫苗使用R-1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（R-DOTAP）（一种激活TLR7的脂质体载体）作为佐剂。在I期剂量递增试验（NCT02065973）中，发现PDS0101安全且耐受性良好。疫苗接种以非MHC限制性方式在所有患者中解决了CIN。已启动几项将PDS0101与其他免疫调节疗法结合使用的II期试验（表3）。 3.2.3.治疗性疫苗在人类免疫缺陷病毒方面的应用 自20世纪80年代初首次临床观察到艾滋病并随后分离出病因性逆转录病毒HIV以来，尽管进行了40年的深入研究，HIV/AIDS疫情仍然是对人类构成重大全球健康威胁的疾病。实际上，截至2020年，仍有3800万人感染HIV。目前的治疗策略包括使用抗逆转录病毒疗法（ART），这已帮助将艾滋病从一种危及生命的疾病转变为一种可管理的慢性病，并显著延长了HIV感染者的预期寿命。然而，由于存在由潜伏感染细胞形成的病毒库，患者需要接受终身维持治疗。在缺乏有效的HIV-1根除策略的情况下，HIV研究工作集中在开发治疗方法上。 SARS-CoV-2大流行向世界介绍了一种有效的基于mRNA的疫苗，该疫苗封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中。ICVAX是一种基于PD1的HIV-1 DNA疫苗，编码由人类可溶性PD1结构域与两个马赛克Gag-p41抗原融合的重组抗原，可以诱导针对不同HIV-1亚型的广泛和多功能T细胞反应；这些发现突出了将基于PD1的DNA疫苗方法转化为临床使用的巨大潜力。一项II期临床试验（NCT01492985）评估了基于DNA的疫苗（GTU-MultiHIV B clade）与基于多肽的疫苗（HIV-LIPO-5）联合治疗的疗效，并发现DNA和LIPO-5疫苗的主要-增强免疫接种比单独疫苗诱导了更广泛的多功能T细胞，但在中断抗逆转录病毒治疗后未能控制病毒血症，表明将疫苗策略与其他基于免疫的干预措施结合的重要性。其他疫苗形式，如AGS-004，由成熟的自体树突状细胞和体外转录的自体HIV抗原编码RNA组成，正在IIb期临床试验中进行验证。与安慰剂组相比，AGS-004诱导了强烈和多功能的HIV特异性T细胞反应。然而，未检测到抗病毒效果。另一项研究将单核细胞衍生的树突状细胞（MD-DC）基疫苗（装载大量HIV-1热灭活自体抗原）与聚乙二醇化干扰素α-2a（IFNα-2a）结合使用，在慢性HIV-1患者中取得了次优结果。总的来说，开发针对HIV的疫苗还有很长的路要走。 3.3.治疗性疫苗在慢性病方面的应用 心血管疾病（CVD）是全球主要的慢性疾病死因，高血压、血脂异常和糖尿病是CVD的主要原因。高血压、血脂异常和糖尿病的疫苗研究已有60多年的历史。随着各种疫苗构建模型的逐步改进，目前许多治疗性疫苗正在进行临床试验，但由于治疗依从性差，还没有疫苗上市。 3.3.1.治疗性疫苗在高血压方面的应用 肾素-血管紧张素系统（RAS），包括肾素、血管紧张素I（Ang I）、血管紧张素II（Ang II）和AT1R，是高血压治疗性疫苗的主要靶点。最早的高血压疫苗针对肾素。然而，由于对肾脏的损害，它们最终被终止。随后，针对AngI的高血压疫苗的疗效，如PMD2850和PMD3117，也在许多临床试验中得到验证，但都以失败告终。Ang II是许多高血压疫苗的另一个主要靶点，如瑞士Cytos公司在2007年开发的CYT006-AngQb（由Ang II结合噬菌体Qβ（AngQb）VLP组成的疫苗）。该疫苗耐受性良好，并在所有受试者中诱导了抗Ang II抗体，半衰期约为4个月。同样基于Ang II，Koriyama等人构建了编码Ang II和HBcAg融合蛋白的Ang II DNA疫苗，可以有效降低血压至少6个月。2022年，进行了一项安慰剂对照剂量递增研究，以调查针对改良Ang II DNA疫苗（AGMG0201）的安全性、耐受性和免疫反应。结果显示AGMG0201耐受性良好，也可以诱导抗血管紧张素II抗体。 除了针对RAS的疫苗外，廖团队还开发了一种针对交感神经系统α1D-肾上腺素受体的降压疫苗（ADRQβ-004），在大鼠中显示出良好的降血压效果，并且能够有效预防高血压动物的血管结构重塑、心肌肥大和纤维化以及肾脏损伤。吴等人设计了来自人类L型钙通道（CaV 1.2）的表位CE12，并分别将其结合到Qβ VLPs和HBcAg VLPs上，以测试该表位在高血压动物中的疗效。Qβ-CE12和HBcAg-CE12-CQ10疫苗都能有效地降低高血压啮齿动物的血压，HBcAg-CE12-CQ10还改善了L-NAME诱导的肾脏损伤。戴等人开发了一种针对内皮素-1（ET-1）类型A受体（ETAR）的疫苗ETRQβ-002，并证实该疫苗可以显著减少由单羧胺（MCT）和Sugen/低氧引起的大鼠肺动脉高压；它还改善了肺动脉的任何病理重塑。总之，针对RAS的Ang II和AT1R、SNS的α1DAR肾脏和LCaCd、ETAR的疫苗构成了一系列高血压治疗性疫苗的候选物，并为高血压疫苗的联合治疗奠定了基础。 3.3.2.治疗性疫苗在糖尿病方面的应用 糖尿病（DM）是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，是全球成人中高度流行的慢性疾病。全球估计有3.82亿人患有DM，预计到2035年这一数字将接近6亿。DM可以根据疾病的发病机制分为1型和2型。1型DM是一种自身免疫性疾病，自身免疫T细胞攻击产生胰岛素的β细胞。谷氨酸脱羧酶（GAD）是1型DM自身免疫反应的主要靶点；尽管几项基于GAD的疫苗临床试验产生了矛盾的结果。令人惊讶的是，卡介苗（BCG）疫苗被用于1型DM患者。一项为期8年的随访临床试验显示，BCG疫苗提供了长期效果：它被良好地耐受，并且在DM患者中导致血糖和Treg特征基因的表观遗传变化稳定减少。2017年，李等人设计的D41-IA2(5)-P2-1疫苗被认为是1型DM的一种有希望的治疗方法。D41-IA2(5)-P2-1由DPP4的肽段、胰岛素瘤抗原-2（IA-2）的抗糖尿病B表位和来自人类热休克蛋白60（HSP60）的P277肽的Th2表位（P2：IPALDSLTPANED）组成，可以显著控制高血糖。与D41-IA2(5)-P2-1类似，由李Z等人设计的U-IA-2(5)-P2-1（UIP-1）嵌合疫苗也能在免疫后成功增加小鼠的胰岛素水平并降低血糖水平。 尽管2型DM的病理机制尚不清楚，但已知有4个靶点：脂肪组织抗原、生长抑素、依赖葡萄糖的胰岛素变性多肽（GIP）和胃饥饿素。白细胞介素-1β（IL-1β）是2型DM发病机制中的主要促炎底物，有证据表明减少IL-1β活性可能成为2型DM的新治疗策略。由全长重组IL-1β与Qβ VLPs偶联组成的疫苗hIL1bQb，在2型DM患者的临床前和临床、随机、安慰剂对照、双盲研究中进行了测试。结果显示，针对IL-1β的Hil1bQb疫苗安全且耐受性良好，在这些患者中，接种6剂900微克剂量后可检测到中和IL-1β特异性抗体反应。目前，DM的发病机制和葡萄糖代谢的关键靶点仍然不清楚。在糖尿病疫苗领域的进一步探索预计将提供新的解决方案。 3.3.3.治疗性疫苗在血脂异常方面的应用 血脂异常是CVD的关键风险因素，通常以高低密度脂蛋白（LDL）胆固醇、低高密度脂蛋白（HDL）胆固醇或高甘油三酯血症为特征。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶9型（PCSK9）通过受体内化和随后的溶酶体降解调节LDL受体表达，是已知的抗高脂血症药物或疫苗靶点。迄今为止，抑制PCSK9最先进的方法是单克隆抗体（mAbs），如众所周知的alirocumab和evolocumab，它们于2015年获得FDA批准，并为PCSK9疫苗的开发提供了坚实的临床证据。AT04A和AT06A是两种AFFITOPE肽疫苗候选物，通过诱导PCSK9特异性抗体治疗高胆固醇血症。I期临床试验（NCT02508896）的结果显示，AT04A和AT06都是安全和免疫原性的，但只有AT04A表现出显著的LDLc降低活性。还有其他针对PCSK9的疫苗；例如，基于Qβ VLP的疫苗PCSK9Qβ-003。这种疫苗可以显著降低Balb/c小鼠和LDLR+/−小鼠的总胆固醇和PCSK9表达，并上调肝脏LDLR、SREBP-2、肝细胞核因子-1α（HNF-1α）和HMG CoA还原酶水平。此外，由PCSK-9短肽与KLH融合组成的疫苗在男性载脂蛋白E（ApoE）缺乏小鼠中引起了针对PCSK9的显著长期抗体反应。一个免疫原性肽段，称为免疫原性融合PCSK9-破伤风（IFPT），使用DSPE-PEG-马来酰亚胺脂质（L-IFPT）结合到纳米脂质体表面，并吸附到Alhydrogel上（L-IFPTA+）；这种疫苗候选物在高胆固醇血症小鼠中诱导了针对PCSK9肽段的高IgG抗体反应，并降低了高达58.5%的血浆浓度。 最近，血管生成素样蛋白（ANGPTL）3作为降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和甘油三酯（TG）水平的新靶点受到了关注。针对ANGPTL3的抗体、反义寡核苷酸和小干扰RNA作为靶向ANGPTL3抑制剂已经开发出来，并正在进行临床试验（NCT03409744、NCT03452228、NCT03747224）。Fukami等人设计了3种针对ANGPTL3的表位肽基疫苗（E1-E3），其中E3（32EPKSRFAMLD41）肽段没有引起细胞毒性，并显著降低了ob/ob小鼠循环中的甘油三酯、LDL-C和小而密的LDL-C（sd-LDL-C）水平；它还减少了肥胖引起的脂肪肝病。除了PCSK9和ANGPTL3的靶点外，还需要研究其他与胆固醇和甘油三酯代谢相关的靶点疫苗，如ApoB-100，以加速推广有效抑制血脂异常的疫苗。 4.结论和未来展望 疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病的负担方面发挥着重要作用。在过去20年中，可以有效预防的疾病类型持续增加到40多种。实际上，HPV疫苗对相关恶性肿瘤的预防效果的出现以及前列腺癌治疗性疫苗的推出，标志着疫苗的效用从传统的预防进一步扩展到治疗。然而，许多重大传染病的病原体因素和潜在干预措施仍然不明确，特别是那些由复杂病原体感染（如艾滋病和结核病）和以肿瘤和代谢性疾病为代表的慢性疾病引起的疾病。这些疾病的疫苗开发是世界级的。对于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2等突发重大传染病，弱免疫反应或意外的免疫反应（如抗体介导的感染增强、ADE）是创新疫苗研究中难以解决的问题。 因此，新一代更有效疫苗的开发需要在以下四个方向上做出努力。 (i) 佐剂：与佐剂相关的有几个重要因素需要考虑。需要控制和改进佐剂的物理化学性质，优化生产流程，并深入研究分析佐剂的作用机制，以充分了解它们对免疫系统的影响。我们还需要继续探索佐剂和肿瘤抗原的最佳组合，以增强疫苗的免疫原性，并致力于设计针对不同病原体的亚单位抗原、蛋白质或肽的新复杂佐剂；这将得到化学和新材料合成技术的帮助，以增强抗原向免疫细胞的靶向传递（下一点），并克服肿瘤免疫抑制微环境对抗原呈递的抑制。这也可能有助于激活肿瘤特异性T细胞在免疫耗竭和衰老状态下，并促进记忆T细胞的形成。 (ii) 传递系统：药物/疫苗传递系统的最终目标是将货物传递到目标部位，并具有预定的释放动力学和作用持续时间。没有单一的工具适合所有形式的治疗，不同的疫苗形式各有优势和劣势，需要优化以实现传递和治疗。实际上，需要了解人与人之间、人与动物之间在药物吸收、分布、代谢和消除方面的差异，并探索不同疫苗抗原或药物与传递系统的最佳组合。COVID-19大流行提醒我们，未来是不确定的，我们需要不断发展新的传递系统，以适应多样化和精确疫苗发展的趋势。还应注意传递系统的效率和靶向性，更多关注传递系统本身的安全性和临床转化可行性。 (iii) 新抗原的发现和筛选：结合临床和实验室研究成果，全面运用和评估多组学数据和其他自动化高通量功能筛选工具，积极发展新的理论和技术，用于各个领域独特或通用疫苗靶点的筛选和发现。此外，通过下一代测序和生物信息技术，需要设计更有效的预测算法，提高发现有效的肿瘤抗原作为疫苗靶点的几率。 (iv) 联合治疗：由于肿瘤的异质性和复杂的免疫抑制微环境，单一免疫治疗往往无法提供良好的结果，通常导致低反应率或继发性耐药。因此，免疫治疗通常倾向于与不同的治疗方法联合使用。免疫疗法，如免疫检查点抑制剂（ICI）和过继细胞疗法（ACT），已经彻底改变了癌症治疗，特别是对于转移性癌症。实际上，这已经通过在设计肿瘤疫苗时结合多个肿瘤靶点，以及在补充使用免疫疗法来多样化肿瘤治疗中看到。的确，发挥这些优势并避免弱点可以显著改善癌症患者的治疗。 疫苗在历史上已经证明可以提供健康和福祉，新技术为应对传统方法失败的挑战提供了新的可能性。然而，关于新技术的安全性的数据有限，需要考虑疫苗生产和转化的可行性，以及人类免疫反应的复杂性。新技术和策略将有助于解决现在或未来人类面临的复杂或严重疾病，这些知识对于设计有效的疫苗将非常重要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：腺相关病毒（AAV）是治疗遗传性疾病的新兴方法中的领先载体。为了更广泛的临床应用，需要更高的转导效率和细胞特异性，这激发了对病毒-宿主分子在细胞进入过程中相互作用的调查。高通量方法更全面地鉴定宿主蛋白，随后的分子研究揭示了意想不到的复杂性和血清型特异性。冷冻电子显微镜（cryo-EM）为这些有时是不均匀的病毒-宿主复合物的结构细节提供了一条途径，并且有望更充分地阐明进入的步骤。这里介绍的，是理解糖基附加和受体介导的进入/运输的不同步骤的进展。与抗体复合物的结构比较为免疫中和提供了新的见解，这对改进基因治疗载体的设计具有重要意义。 亮点 高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构详细说明了腺相关病毒（AAV）受体蛋白的结合相互作用。AAV的糖基“主要受体”被重新定义为“附着因子”。AAV5类病毒与受体的不同结构域相互作用，其结合位点与其他AAV不同。许多AAV中和抗体的表位与衣壳上的受体结合位点重叠。未来的结构研究重点将放在AAV受体非依赖途径以及进入和运输的其他步骤上。 1.病毒-宿主相互作用：改进基因治疗载体的基础 AAV（见术语表）是一种小的单链DNA病毒，属于细小病毒科，其三个病毒衣壳蛋白（VP1、VP2和VP3）构成了一个二十面体对称的非包膜壳。由于野生型（wt）AAV具有广泛的组织趋向性和低致病性（作为复制缺陷的依赖性细小病毒），重组生产的AAV载体（rAAV）现在已成为治疗性基因传递的杰出载体，临床有效载荷取代了约4.7 kb的天然基因组。在过去的3年中，FDA批准了两种AAV疗法，LUXTURNA™（rAAV2用于RPE65相关视网膜营养不良）和ZOLGENSMA®（rAAV9用于脊髓性肌肉萎缩症）。尽管取得了成功，但目标特异性载体优化和更高的转导效率仍然是更广泛临床应用的关键。我们发现，每个被发现、工程化或衍生的AAV衣壳变体，都可以通过其独特的序列编码表型，揭示改善靶向、转导和免疫逃逸的线索。特别是AAV衣壳与宿主细胞进入因子的相互作用，一直是最近研究的焦点，并取得了令人兴奋的成果。 高通量筛选和结构测定的进步正在被AAV界用来识别和可视化对细胞转导至关重要的AAV-宿主分子相互作用。日益高分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）结构有助于阐明受体、抗体和细胞表面糖基相互作用的分子决定因素。在这里，我们总结了当前对AAV进入因子及其鉴定的理解，以及高分辨率结构对未来载体设计的潜在影响。Riyad和Weber最近的一项综述提供了关于AAV进入和运输细胞过程的极好视角，而这里则强调了生物物理化学和分子相互作用的详细表征。 2.AAV细胞进入：事件序列 AAVs对细胞表面糖基的广泛附着被认为增加了通过增加与介导进入的跨膜受体蛋白的接触来内化的可能性。正如后面所详述的，特定糖基类型的表达可能会以血清型特异性的方式影响结合和内化，这可能会对趋向性产生潜在的影响。当我们考虑各种病毒-宿主细胞的相遇时，我们将需要区分成功的感染或转导所需的有效进入和运输，以及即使在非许可受体敲除突变体中也可能被检测到的背景“死路”内化。AAV病毒通过受体介导的内吞作用穿过质膜。特定的机制仍然是讨论的话题，但在识别AAV宿主附着因子和受体，并物理表征它们与衣壳的相互作用方面已经取得了实质性进展。附着因子和受体的术语被谨慎选择，以反映我们的新理解，混淆的潜力最好通过提供一些历史文献的背景来解决。 早期研究集中在血清型2上，将其作为模型AAV。在其中，硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）被证明对细胞结合和转导是必要的，并被认为是第一个已知的受体。不同的糖基随后被确定为其他血清型的特异性，例如，AAV5、-1、-6和-4的唾液酸（SIA）的组分，以及AAV9的半乳糖。这些蛋白多糖被称为“主要受体”，因为它们是细胞趋向性的决定因素，但也被认为需要其他蛋白质“核心受体”来进行内化。AAV-核心受体关联在覆盖层分析中最直接地被证实，但与其他已知病毒-受体对的结合亲和力从未建立，AAV-核心受体复合物仍有待分离。 正如在历史文献中使用的，“主要受体”可能适当地暗示了一个早期的相互作用，其中一个糖基的作用是低亲和力、广泛的附着，隔离和浓缩AAV在宿主细胞质膜上。通过类比其他病毒，我们将这些糖基（具体来说，蛋白多糖的糖胺聚糖部分）称为附着因子，这是现在需要与历史AAV文献不同的称呼。进一步复杂化的情况是，越来越多的证据表明，AAV2对HSPG的强结合可能是一种适应细胞培养中病毒传播的方式。根据最近的筛选结果，报道的核心受体也需要在功能上重新考虑。 3.AAV与细胞糖基的相互作用 到2014年，已确定了13种血清型中有8种使用的糖基。除了半乳糖（AAV9）[7]外，糖基带有负电荷：硫酸肝素（HS）用于AAV2、3B、6和13[6,8-10]，唾液酸（SIA）用于AAV1、5和6（α2-3和α2-6 N-连接）以及AAV4（α2-3 O-连接）。通常通过调节细胞表面糖基和/或糖胺类似物的竞争抑制后的转导测定来识别。 通过晶体学/电镜分析糖基复合物（表1）以及定点突变来确定AAV糖基结合位点。AAV2的晶体结构[1]允许Kleinschmidt和Muzyczka小组通过突变分析来表征位于Arg585和Arg588之间的RXXR基序作为肝素结合域（HBD）。在分辨率上，冷冻电镜开始时很难验证与结合肝素的微妙差异。一项研究似乎显示肝素在RXXR外某处结合，这与可能引起它们结合并触发病毒解壳的构象变化相合理化。另一项研究表明肝素片段缠绕在每个三重相邻的突起周围，由带正电荷的AAV2残基结合，包括前述的Arg585/Arg588。这种配置，没有提议的构象变化，将通过更高分辨率的冷冻电镜得到验证，其中可识别的硫酸根团确认了糖基与HBD紧密接触的位置。 表1. 带有附着因子、受体或抗体结构域的AAV结构 表1列出了与糖基附着因子模拟物（第一区块）、受体（AAVR）域（中央区块）以及针对这些衣壳的抗体结合的AAV复合物。b衣壳类型：wt，野生型；rAAV，重组腺相关病毒；VLP，病毒样颗粒。 3.1.结构生物学 - 中分辨率的挑战 由于技术进步（见下文）推动的冷冻电镜“分辨率革命”，自2010年以来EMDB数据库沉积物增加了十倍，对AAV结构病毒学的日益增长的影响引起了极大的兴奋。越来越多地，冷冻电镜可以在比晶体学更好的分辨率下进行，但并不总是能够实现，且分辨率并不总是在整个给定图中均匀的，后者对于解释即使是最新的结构也有影响。 当我们从原子模型分析生物学推断时，我们应该强调原子模型不是主要的可观察现象，而是在晶体学中从实验推导出的电子密度图，或在冷冻电镜中的电势图的解释。验证模型和估计准确性的方法对晶体学来说已经发展了多年，对冷冻电镜来说还没有成熟。通常未声明的是，准确性在冷冻电镜模型之间和内部有显著变化，因此对机械推断的信心也有所变化。即使在最高分辨率下，原子很少单独解决，通过识别化学基团并执行已知的立体化学（键长、角度等）来实现精度。因此，地图显示化学基团的独特特征的地方精度更高。蛋白质主链通常比更灵活的（模糊的）侧链和可能不那么牢固锚定的配体更可靠。冷冻电镜结构的部分可能有模糊的解释，有时很难区分真实特征和实验噪声。 在实践中，电子显微镜模型通常仅通过与理想立体化学的一致性来验证。然而，这只有在模型也适合独特地图特征时才有意义，因为仅优化立体化学是非常容易的。此外，由于空间限制，论文可能只展示最令人印象深刻的区域，因此建议下载地图和模型，检查对生物学结论重要区域的良好立体化学和适应独特地图特征，在差异图中检查一致性的敏感度。 3.2.糖基相互作用的细节 得益于更高分辨率的数据，AAV-糖基结合复合物的后续结构较少引起争议。对于AAV3B，与硫酸化蔗糖（SOS）的共晶体揭示了一个由三重轴上的三个Arg594副本独特形成的位点。AAV5与唾液酸（SIA）的晶体在3.5 Å分辨率下揭示了两个结合位点（A和B）。A位点也在三重轴上，当突变时显示SIA介导的转导减少，而B位点突变，位于五重轴附近，揭示了SIA独立的作用在转导中。对于AAV1，三糖浸泡的晶体揭示了三重轴突起底部的五重轴上的SIA位点，相应位点在同源AAV6中的突变证实了其作用。 一个重要的警告是，高分辨率结构使用生物相关多糖的短模拟物。单糖官能团、异构体和连接的多样性使均匀试剂的合成复杂化，并且糖基的添加通常对病毒晶体具有破坏性。高分辨率冷冻电镜需要均匀的糖基，因为重建需要平均许多颗粒。然而，在体内，这种多样性肯定占主导地位，并且可能是功能性的。通过表面等离子共振（SPR），肝素类的亲和力随着链长增加而增加，直到n = 5，可能对应于单个结合位点，然后在n = 16时再次增加，足够长以与AAV2上的第二个与对称性相关的结合位点结合。使用小模拟物的高分辨率结构显示了每个位点的核心相互作用，但没有显示更长聚合物如何可能在多个位点结合。 通过将配体结合结构（和突变位点）叠加到AAV1上，比较了不同的血清型。代表性的糖基位点稍后在AAVR蛋白受体结合分析中进行了说明（见图2）。结合位点围绕AAV表面突起，特别是在它们之间的三重凹陷处。从这里，一条山谷通向两重轴，由于地形的原因，它在免疫监视下受到一些保护，也许受到的选择压力较小。虽然不同血清型的糖基结合位点看起来在类似的位置，但它们没有在系统发育上对齐的氨基酸。例如，HBD的Arg585/Arg588，特别是高肝素亲和力是AAV2独有的。血清型特异性的糖基结合为重新定位基因治疗载体带来了希望，而广泛的相互作用多样性引发了一个问题，即糖基结合机制是冗余的还是累加的。 我们发现，AAV2和/或AAV3样肝素位点的糖基结合和转导都可以在嵌合体中调节。通过将类似AAV9的半乳糖结合位点移植到AAV2中，也可以增加转导效率。人们强调了对载体工程的影响，但也有助于对AAV的糖基相互作用是大量、累加和非特异性特征的日益认识。糖基阵列已经测量了不同类型的SIA的结合差异，Linhardt和Chapman小组测量了AAV2和AAV-DJ对合成肝素类的文库的亲和力。令人惊讶的是，几种肝素类比涉及细胞感染的HS具有更强的结合力。Heilbronn小组对AAV1、4、5和6的SIA亚型特异性，以及AAV3和AAV2的肝素特异性的阵列分析也发现了类似的结果。不同的糖基偏好可能对组织和宿主范围很重要，如流感病毒，可能对载体工程有影响，但另一个不可避免的结论是：糖基特异性很低。 还需要改进的冷冻电镜来解决化学均匀的小合成糖基模拟物。我们在4.8 Å分辨率下看到的AAV-DJ与SOS的复合物，以及在2.8 Å分辨率下看到的五糖fondaparinux，证实了直接在HBD处的结合，并揭示了能够适应不同糖基序列的硫酸的侧链相互作用。低特异性因此得到了结构上的合理化。 3.3.变革的种子 如果没有糖基，那么报道的核心受体（如FGFR1、HGFR、EGFR、PDGFR、LamR和alphaVbeta5整合素）是主要的特异性介导者吗？我们尝试将核心受体外细胞结构构建与AAV2体外结合，并通过siRNA敲除进行转导抑制，但未成功。实验并不全面，对负面结果的原因也不明确，但对这些核心受体的角色越来越担忧。后来，CRISPR-Cas9敲除表明核心受体对转导的影响远小于糖基附着因子或AAVR。核心受体可能在进入中起辅助作用，但也有可能它们的调节通过改变信号影响转导。 我们担心AAV进入的主要决定因素尚未被识别：（i）糖基相互作用的特异性低于预期的经典受体， （ii）核心受体-AAV复合物的生物物理表征证明是难以处理的。使用新兴技术进行无偏见的重新检查是必要的，用于全基因组筛选。 4.AAV受体的鉴定 4.1.与新兴的全基因组筛选的共识 多种技术进步已经增进了我们对AAV感染（或载体转导）的理解。siRNA敲减筛选是首先识别出多种宿主因子的方法，包括干扰素反应、DNA修复、细胞检查点、RNA剪接和SUMOylation。令人惊讶的是，siRNA敲减对转导只有适度的影响，筛选也没有突出当时的候选细胞核心受体。 敲除筛选更具决定性。这首先在一种近乎单倍体的人类细胞系（Hap1）和一种衍生的基因陷阱库中成为可能，该库具有随机位置的单基因敲除，已证明在鉴定流感病毒和埃博拉病毒的受体。通过选择表现出抗性的突变细胞，然后进行深度测序，鉴定了感染所需的宿主基因。对于AAV，Carette和Chapman小组使用编码荧光的rAAV载体，并迭代使用荧光激活细胞分选（FACS），选择转导抗性。深度测序富含AAV抗性引起的突变的细胞，鉴定了进一步通过CRISPR-Cas9和其他方法表征的基因。现在，使用CRISPR-Cas9库的类似筛选已经证实了这些结果，并鉴定了额外的宿主因子。虽然预计结果会因不同的库技术和选择方法而有所不同，但Meisen等人已经通过针对八种AAV血清型的双重筛选测试，证实了KIAA0319L、GPR108、TM9SF2和其他几个顶级命中的重要性（表2）。 Table 2. 与AAV进入相关的细胞蛋白 a人类基因，这些基因编码跨膜蛋白、糖基生物合成或内质网/高尔基体运输，它们通过全基因组筛选被认为与AAV2转导有关，根据每个筛选中结果的统计显著性进行排名。b缩写：不适用。*在Meisen等人的筛选中，只在一个筛选中被识别，而不是两个筛选都被识别。 值得注意的是，GPR108也作为另一个筛选中的下游因子出现，该筛选使用了在AAVRKO背景下准备的GeCKO库，使用AAVR非依赖性载体AAVrh32.33进行探测，试图表征AAVR非依赖性途径。Pillay等人和Meisen等人研究之间的一致性为结果提供了信心。在Pillay等人的前50个筛选命中中，有37个与膜相关（高尔基体或内体）或参与糖基合成（表2）。 应该注意到敲除筛选的警告。首先，细胞库不包含是致命的突变或在细胞复制所需的基因中。其次，选择是通过降低转导来进行的，所以通过突变AAV限制因子（如核DNA损伤反应元件）增强转导没有被记录。最后，最重要的敲除比siRNA抑制报告的影响更大，而且可能在一组具有冗余功能的基因中发生突变不会被认为是显著影响。这种考虑与在核中与载体基因组的宿主分子相互作用有关，这些内容在其他地方进行了综述。 4.2.  AAVR作为进入/运输因子 基因陷阱产生了50多个基因，在为AAV抗性选择的细胞中具有很高的敲除频率（表2列出了一个子集）。排名第一的是KIAA0319L，它编码一个特性较差的膜蛋白，该蛋白似乎短暂出现在细胞表面，但主要位于核周的跨高尔基体。它可能作为回收受体本地功能，用于未知配体，而AAV可能已经进化到利用逆行KIAA0319L受体运输。 通过CRISPR-Cas9敲除和在HeLa细胞中的补充，以及在八个细胞系中，验证了七个AAV血清型对KIAA0319L的需求。AAV2的转导被抗KIAA0319L抗体或竞争KIAA0319L外细胞结构域抑制，而在体内，KIAA0319L KOs在转基因小鼠中废除了载体转导。因此，KIAA0319L具有以前从未为AAV建立的病毒进入受体的特征。由于没有经过充分表征的功能，KIAA0319L被命名为AAVR，即AAV受体。 5.AAVR的特性及其与AAV的相互作用 5.1.域结构与作用 AAVR具有单个跨膜区域和短的C末端细胞质域，该域需要逆行运输至跨高尔基体网络（TGN）。其外细胞结构域，与AAV的衣壳结合，包括五个串联的Ig样PKD（多囊肾病）域、一个MANEC域和一个N末端信号肽。在Hap1 AAVRKO细胞中表达PKD缺失突变体显示，进入决定因素位于N末端PKD域1-3，并且通过ELISA检测到AAV2结合位点。高亲和力，通过SPR估计的KD约为~150 nM，表明强结合特异性。复合物的稳定性和涉及域的鉴定允许进行结构分析，这对于之前报道的核心受体已经证明是难以处理的。 5.2.冷冻电镜下的高分辨率AAV结构 得益于冷冻电镜技术的戏剧性进步，现在可以对病毒-宿主相互作用进行结构表征。改进包括直接电子探测器、帧收集和束流诱导运动校正、更稳定的透镜以及用于对异质复合物进行对齐和分类的算法。第一个AAV结构，AAV2在~3 Å分辨率，来自2002年的X射线衍射。多年来，冷冻电镜为难以结晶的复合物提供了低分辨率结构，但现在冷冻电镜经常等于或超过X射线分辨率。病毒组装的体型大和对称性使它们特别容易处理。偶尔，实现了异常分辨率，AAV-DJ在1.56 Å下，是分辨率最高的生物分子冷冻电镜结构之一。冷冻电镜现在也在为与蛋白质受体的复合物提供原子结构的路径，这些受体的结晶将非常困难或不可能。 5.3.AAV2-AAVR结构 冷冻电镜已经定义了受体结合足迹，这对血清型特异性和宿主免疫有影响（表1）。2019年发表了两项研究。Zhang等人使用包含所有五个PKD域的构建，在他们的2.8 Å EM图中看到了其中之一。Meyer等人结合了类似复合物的较低分辨率冷冻电子断层扫描（cryo-ET），揭示了更灵活的域，并从2.4 Å的冷冻电镜中获得了细节，来自两个域复合物（PKD1-2）。两个高分辨率图（2.4和2.8 Å）都只显示每个三重轴周围的突起上紧密结合的一个AAVR域。独特的侧链识别它为PKD2。其他域只通过低分辨率冷冻ET看到，它不假设二十面体对称性，从而揭示了AAVR的低分辨率轮廓，未结合域以几种配置连接。PKD1-2复合物中PKD2的精炼占据率为0.59，反映了部分结合和更高的无序性（比病毒），但它足够高，可以排除PKD1-2结合到对称病毒表面上邻近位点的冲突。 AAV2-AAVR结构相似，两者都得到定点突变的支持。Zhang等人报告了针对观察到的界面的突变，而Meyer等人分析了Colosi实验室的98个替代在64个表面位点上的数据。Muzyczka实验室的数据添加在图1D中。虽然不是完全隔离的，但影响转导的突变（红色）在PKD2接触界面内更为普遍。不足为奇的是，一些结合位点残基的保守突变影响很小（绿色）。值得注意的是，当比较不同实验室的结果或在同一位点分析多个替代时，测量转导的变化很大（橙色），提醒我们，需要冗余数据才能进行稳健的表型推断。 图 1. 腺相关病毒（AAV）与AAV受体（AAVR）的相互作用位点。(A) AAV2衣壳结构具有五个、三个和两重对称轴（箭头），共有60个与AAVR PKD2（青色）等效的结合位点。这些与AAV5上的PKD1位点在映射到AAV2时（黄色）有所不同。红色框架勾勒出后续面板的视图。(B,C) 在AAV2和AAV5复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构上，显示了AAVR PKD2和PKD1（及其对称等价物）的青色和黄色主链轨迹。每个实验结构仅显示一个域，但在这里通过叠加结构添加了另一个域。在AAV5复合物中，可以看到AAVR PKD1，残基S392–K399（PKD1），在AAV2复合物中，残基N405–V499（PKD2）可以被看到。对于AAV2（而不是AAV5），PKD1和PKD2都有助于结合，尽管只有单个域在高分辨率下被解析。尽管将两个叠加的结构连接起来很诱人，但这将需要移动域以便连接链能够到达。(D) AAV2的表面根据氨基酸对细胞转导的影响着色。单点突变从多个来源综合而来，按照从红色（转导消除）到绿色（中性/增强）的规模着色。对于不同作者或同一位点的不同替代，增加了黄色调。（通过结构比对添加了AAV1的突变数据。）(E) AAV5的表面使用可用的突变数据进行类似的着色。另见在线补充信息中的图S1–S5，对应于A–E面板。 5.4.AAVs展示不同的AAVR结合模式 在AAV2-AAVR复合物的结构之后，报道了AAV5与AAVR PKD1-5的复合物在3.2 Å分辨率下。同样，只看到一个域，但现在是PKD1，与之前的结合、转导和覆盖一致。PKD1的图特征较弱，平均约为AAV-5内类似特征强度的40%。如果图的弱点主要是由于未饱和结合，PKD1应该均匀地弱。然而，PKD1在与AAV5的三重轴突起结合界面附近显得强大，并逐渐减弱，向域的N末端，靠近五重轴。这与由于旋转无序而增加的模糊一致。对于最靠近五重轴的三分之一域，主链特征低于1σ显著性，在该区域，除了定位同源模型（如PDBid：2E7M）之外，不应解释为超出范围。即使在PKD1-2 AAV5复合物的更高（2.5 Å）分辨率结构中，只有在域的结合端才能看到预期的这种分辨率的细节。如果PKD1的C末端端被AAV5强相互作用锚定，旋转这个支点导致远离结合位点的逐渐无序，那么两个结构都可以合理化。 最值得注意的是PKD1在AAV5上和PKD2在AAV2上的近乎独特的足迹，它们仅在V708AAV2/Q697AAV5处相交（图1B,C）。PKD1的N末端接近AAV5的五重轴，然后该域横跨峡谷，其C末端锚定在三重突起的二重侧[靠近AAV5的Y542、N546、F698和R710以及可变区（VR）VII和IX环，图1C]。如果将AAV2和AAV5复合物叠加，PKD2（来自AAV2）从Asn405开始，距离AAV5中PKD1的C末端Lys399 19 Å，爬上另一个突起的肩部（通过五重对称性相关）其C末端靠近顶部。对于AAV2，尽管只有PKD2紧密结合到足以进行高分辨率可视化，PKD1也增加了相互作用。然而，看到的域与AAV5和AAV2不能通过看不见的五残基域连接子以立体化学上合理的配置连接。人们只能推测，PKD1和PKD2与类似AAV2的病毒的相互作用在进入的不同时间点，这些域来自不同的AAVR亚基，或者涉及构象重排。 来自一些AAV5丙氨酸替代突变体的低转导表型的证据支持了不同的AAVR足迹（红色，图1E），但并非全部（绿色），注意到突变数据并不像AAV2那样全面（图1E）。与早期的推测相关，AAV2表面，对应于AAV5上的PKD1足迹，包含一些突变会引起对转导的显著影响的残基，以及一些突变影响微不足道的残基（图1E）。 两种结构中PKD1之间的差异（2.3 Å rms）大于3 Å分辨率下预期的误差，尽管基本相似。统计数据被扩大了，因为域的N末端附近差异高达10 Å，相邻环（334-336和386-387）的背骨差异为2 Å，该区域的图很弱，以及Gly361附近的路径不清晰时差异为6 Å。 Zhang等人的原子模型有AAVR Val305与AAV5 Ser319相互作用，但是N末端区域在两个图中都不清楚。当低通滤波到10 Å时，在这个分辨率下主链无法解析，PKD1的包络清晰，并认为结构可能与同源物相似，没有差异允许N末端区域与AAV5在Zhang等人的模型中相互作用。的确，很可能缺少这样的相互作用允许域围绕其C末端旋转，解释了图中观察到的无序。 在其C末端，PKD1通过其与AAV5的相互作用被锁定到位。与2.1 Å未结合结构比较，AAV5诱导的变化很小。在2.5 Å分辨率下可视化复合物可以识别推定的氢键和盐桥。特别值得注意的是AAV5表面上的两个负电荷口袋，AAVR Arg353和His351（PKD1的）插入其中。 AAV-1与AAVR的复合物结构与AAV2非常相似。这与早期的域敲除结果一致，对于AAV1和AAV8，像AAV2一样，关键的要求是PKD2，但PKD1比AAV2有更大的影响。类似AAV4的病毒不与AAVR结合，AAV5（和很可能类似的病毒）仅与PKD1结合，但是考虑到AAV1、2和8代表了AAVs最大分支的系统发育多样性，很可能，除了已知的例外，AAV2代表了其他AAVs。然而，足迹内序列变异如何更微妙地调节相互作用还有待确定。 5.5.AAVR受体结合与糖基附着 在分析了AAV2、AAV5和AAV1之后，Zhang等人得出结论，AAVR结合与糖基附着无关。虽然对AAV5来说可能正确，但对于大多数AAVs来说，以AAV1和AAV2为例，考虑到病毒的对称性，PKD2足迹与糖基附着位点重叠（图2）。在图2中，与AAVR结合的冲突被低估了，因为小模拟物在结构中是生物相关多糖的替代品。在类似AAV2的病毒上，AAVR结合似乎与糖基附着竞争。因此，如果糖基和AAVR同时参与，它必须是在AAV2的不同对称等位点上。图1还显示，PKD2糖基化位点远离病毒，表明是其他细胞表面糖基介导附着。 图 2. 腺相关病毒受体（AAVR）结合位点与糖基附加位点的比较。AAV2（棕色）和AAVR（青色PKD2）如主文本图2B所示。叠加上的是fondaparinux（空间填充，灰色碳原子），一种肝素类似物，来自AAV2复合物，以及唾液酸（SIA，绿色碳原子）来自AAV1复合物，以及它们的对称等价物。还指出了来自与AAV3B的低分辨率复合物的蔗糖八硫酸盐（SOS）的位点，AAV3B是一种使用精氨酸（R594）在三重表面上结合肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）的血清型。AAV5的SIA 'A'位点映射到相同的SOS区域，而涉及AAV4和AAV6糖基附加的残基也接近三重凹陷。AAVR的糖基化位点，Asn472和Asn487向外，远离AAV，表明AAV附着到其他细胞外糖基，这与AAVR的结合不依赖于其糖基化一致。AAV上的糖基附加位点是通过使用比细胞外糖基小得多的类似物揭示的。可以想象，结合的多糖与AAVR PKD2之间存在广泛的冲突，这意味着，如果两者都结合在类似AAV2的复合物中，那么必须是结合在病毒上不同的对称等价位点上。对于较小的AAV5样病毒组，三重位点上的'A'位点，涉及SIA依赖的转导，与AAVR的PKD1结合位点相距较远。另见在线补充信息中图S6的相应立体图。 5.6.抗体和AAVR足迹的重叠 尽管结构相似，但两篇论文在评估AAVR结合位点与强烈中和单抗A20[61,62]表位的重叠程度上有所不同。当考虑到二十面体病毒对称性，在叠加结合蛋白的结构时，AAVR与Fab′ A20表位的核心重叠（图3A）。Meyer等人报告了与AAV2中和抗体和其他表位的重叠，并提出AAVR结合的竞争性抑制，因此病毒进入，可能是AAVR依赖血清型中和的几种可能机制之一。 图 3. 腺相关病毒受体（AAVR）与抗体足迹的比较。视图方向和颜色方案与主文本图1中的相似。(A) AAV2与AAVR（青色）和单克隆抗体（mAb）A20（红色）的复合物结构被叠加，突出显示了重叠，暗示进入抑制可能是中和机制。(B) PKD1的足迹与AAV5中和抗体（NAb）ADK5b （蓝色）的接触面有广泛的重叠，但与NAb HL2476（白色/绿色）没有重叠。(C) 突出显示了被认为是非中和性的抗-AAV5单克隆抗体的接触面：3C5为蓝色，ADK5a为洋红色，两者均为紫色。AAVR与ADK5a之间的重叠之前没有预料到，但在高ADK5a浓度下现在已经报道了竞争性结合抑制。另见在线补充信息中图S7-S9的相应立体图。 对于AAV5，PKD1结合位点与中和抗体ADK5b的重叠程度令人惊叹（图3B）。对AAV5的重叠评估更加困难，因为相关抗体结构没有存放在公共数据库中（表1）。PKD1和NAb HL2476（图3B）的AAV5接触残基是不同的，但复合物的插图表明在AAV5表面以上几埃的地方可能存在冲突。对于mAb 3C5和ADK5a（图3C），可以提出类似的论点，据报道它们是非中和性的。的确，ADK5a和AAVR之间的竞争现在已经通过实验确定，这引发了ADK5a可能在比以前测试的更高滴度下具有中和性的可能性。 空间重叠只是决定抗体能否在体内保护免受AAVR介导进入的几种决定因素之一。每个衣壳上有60个对称等价的结合位点，抑制程度将取决于抗体结合强度和饱和度。抗体可能通过多种机制中和AAV。然而，随着我们最近认识到基于糖基的附着和AAVR介导的进入是不同的，细胞结合不能再被假定为感染性的代理。是时候重新评估中和机制了，进入抑制可能比之前认为的更常见。 6.超越AAVR，一个并非完全普遍的受体 多项研究表明，40多个宿主基因影响AAV转导（表2）。虽然AAVR最初是研究的焦点，但其他基因可能在进入和运输中发挥作用。它们可能是AAVR的合作伙伴，或者在AAVR介导的途径上与AAV在不同步骤发生相互作用。有些可能还在AAVR非依赖性进入中发挥作用，稍后将讨论。需要注意的是，涉及的基因产物并不一定直接与AAV相互作用，但可能调节所需的细胞功能，特别是糖基合成和内体运输。注释潜在角色，并充分表征最感兴趣的角色是一项艰巨的任务，才刚刚开始（见未解决问题）。 正如前面提到的，Dudek等人揭示了AAVR非依赖性AAV菌株。他们在转导野生型和AAVRKO A549、HeLa和Huh7细胞中测试了18种自然分离株，以及定向进化变体和假定的祖先构建物。AAV4（源自非洲绿猴）和相关的猕猴衍生嵌合体AAVrh32.33在AAVRKO细胞中以野生型水平转导，表明存在替代的进入途径/受体。有趣的是，对于AAVR依赖性AAV6.2和AAV3，加入辅助病毒Ad5在AAVRKO细胞中产生了一些转导，这表明进入机制的复杂性需要进一步考虑。 6.1.探索其他候选宿主因子 AAVR非依赖性AAV4样类群的发现，重新聚焦了对G蛋白偶联受体GPR108的关注，它在基因陷阱筛选中突变频率排名第三，并且在AAVRKO背景下筛选CRISPR敲除库时变得突出。事实证明，它不仅对AAVR非依赖性AAVrh32.33很重要，而且是许多AAVR依赖性血清型（除了AAV5）的第二个要求。然而，对于这些血清型，GPR108的过度表达并不能补偿AAVR的缺失。Dudek等人将GPR108依赖性定位于VP1u区域，该区域在内体逃逸之前的构象变化中被隐藏在AAV衣壳内。这和GPR108在TGN的位置暗示了它在运输到核周区域或内体释放中的下游作用。GPR108也最近被Meisen等人的CRISPR筛选所涉及。它的确切作用机制、与AAV的关联表征以及分子相互作用的映射仍是优先事项。 在基因陷阱和CRISPR筛选中被涉及的是ATP2C1（表2），编码SPCA1钙泵。ATP2C1的敲除降低了多种AAV血清型的转导，但可以通过细胞内Ca2+螯合剂来挽救。影响可能主要是间接的：低Ca2+似乎需要触发VP1u的暴露，但可能存在多效性效应。TM9SF2在基因陷阱列表中排名第四，并被CRISPR筛选所涉及。Meisen等人验证了它的重要性，并提出它可能通过适当定位NDST1来支持用作附着因子的糖基合成，而不是与AAV直接关联。反过来，NDST1与其他筛选命中的EXT2和SLC35B2在HS合成中起作用，可能是以MOI依赖的方式。已经对GPR108、ATP2C1、TM9SF2和NDST1（表2）进行了部分表征的工作强调了完成我们对AAV附着、进入、运输和解壳的理解所需的工作。 7.AAV库筛选将功能映射到衣壳结构 对受体介导进入的理解进展（前面讨论）始于对宿主细胞基因组的系统探测，但也可以查询病毒基因组。Nakai实验室开发的丙氨酸扫描突变体的条形码库，例如，允许在Illumina条形码测序后，使用KIAA0319L敲除突变体特异性非编码标签，将可选择表型映射到衣壳结构。这为开发改进载体的库筛选设计提供了信息，并有助于定位参与受体结合、中和抗体逃逸和血液清除等表型的相互作用位点，补充了结构研究。 Church实验室的一个令人兴奋的发展是对所有单密码子替代、插入和删除的病毒库的表型进行了分类。一个新的开放阅读框（ORF）被涉及在衣壳组装中，并且为高效选择所需的衣壳特性指明了路径。通过成功比较中和逃逸突变体的分布与之前AAV2与单抗（mAb）A20结合的结构，证明了研究病毒相互作用的潜力。 未解决问题： AAV2样和AAV5样组内AAVR足迹的血清型变异程度有多大？ AAV血清型和载体变体的宿主特异性（或组织特异性）能否通过AAVR相互作用合理化？ AAV在细胞进入时必须与哪些其他宿主因子相互作用？ 在AAVRKO背景下使用敲除库，GPR108被确定为AAV-4样AAVR非依赖性病毒所必需，但也增强了许多AAVR依赖性病毒的转导。 能否通过在双重敲除中准备的库对AAVR和GPR108依赖性血清型进行额外筛选来识别替代途径？ 使用敲除库涉及的约40个宿主基因产物中，哪些与AAV有直接相互作用，哪些只是支持AAV所需的细胞过程？ 有证据表明更高阶的相互作用吗，即AAV与一个宿主蛋白的相互作用是否取决于其他宿主因子的存在？ 关键宿主因子在细胞进入、运输和解壳的哪些阶段参与？ 有任何必需的宿主因子介导AAV所需的构象转变吗？ 受体能通过差异表达、亚型、翻译后修饰等，调节AAV的组织特异性吗？ AAV对细胞的转导能否通过受体结合界面的突变在上调和下调中调节？ 中和抗体的表位在多大程度上也是受体相互作用的关键？能在保持细胞转导效率的同时设计出免疫逃逸载体吗？ 8.结论 虽然AAV已成为许多新批准的临床基因治疗的首选载体，但在传递效率和特异性以及对所需高剂量的免疫反应方面仍存在挑战。为了工程化解决方案，我们应该解决我们对AAV-宿主相互作用基本分子理解上的空白。最重要的是AAV进入细胞的机制。 我们可以很容易地想象受体相互作用作为AAV细胞特异性的决定因素。在调节细胞趋向性方面将面临许多挑战，包括现在明显的关键受体AAVR的高度保守性。在短期内可能对AAV载体进行修改以减少免疫中和，并且至关重要的是要了解病毒的哪些部分参与了对进入至关重要的相互作用，并且在免疫调节方面是禁区。 我们的理解在5年内发生了多么大的变化是令人惊讶的。糖基已从“主要受体”降级为低特异性附着因子。全基因组筛选已经鉴定出几个对转导影响更大的宿主蛋白，而不是糖基或之前报道的核心受体。其中最重要的是AAVR，它在运输中很重要，GPR108在下游过程中很重要，这些过程尚待阐明。 到目前为止，只有AAVR的相互作用通过最近的冷冻电镜进展进行了详细表征。它产生了自己的惊喜。我们仍然需要解释AAV2和AAV5的相互作用为何如此不同。我们还看到AAVR与抗体结合之间的干扰比预期的细胞结合试验要多，促使我们重新评估我们对中和机制的了解。可以预期，AAV与其他宿主分子的相互作用的表征将提供对转导至关重要的过程的见解，我们可能现在还无法想象，这将为改进载体的设计提供更加坚实的基础。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。