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近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，经改进后，也被用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和心脏病等疾病，具有更广阔的应用空间。基于此，针对CAR-T 细胞疗法取得的最新进展，小编进行一番盘点，以飨读者。1. Science子刊：新型CD229 CAR-T细胞疗法有望更安全地治疗多发性骨髓瘤doi:10.1126/scitranslmed.add7900在一项新的研究中，来自美国马里兰大学医学院的研究人员设计出了一种新型 CAR-T 细胞疗法，在临床前研究中，这种细胞疗法能选择性地攻击癌细胞，同时保护健康细胞，从而降低了这种创新癌症疗法产生毒副作用的可能性。这些CAR-T 细胞专为攻击多发性骨髓瘤而设计，多发性骨髓瘤是一种存在于人体骨髓中的浆细胞癌症。相关研究结果发表在2023年7月19日的Science Translational Medicine期刊上，论文标题为“Systematic single amino acid affinity tuning of CD229 CAR T cells retains efficacy against multiple myeloma and eliminates on-target off-tumor toxicity”。CD229在CAR-T细胞中的表达。在CAR-T细胞生产第9天，通过流式细胞术检测CD229在CAR-T细胞产品表面上的表达，以及来自两名健康人类供体的未刺激T细胞的表达。图片来自Science Translational Medicine, 2023, doi:10.1126/scitranslmed.add7900。论文通讯作者、马里兰大学医学院微生物学与免疫学助理教授Tim Luetkens博士说，“我们在临床前研究中清楚地看到，这种新疗法能有效地消灭肿瘤细胞，而不会攻击健康细胞。我们非常看好它作为一种更安全的新型癌症疗法的潜力。”在此前发表在Nature Communications期刊上的一项研究中，Luetkens 博士、马里兰大学医学院医学教授 Djordje Atanackovic 博士和威斯康星医学院助理教授 Sabarinath Radhakrishnan 博士开发了一种新的 CAR T 细胞疗法，它靶向攻击的蛋白与目前的 CAR-T 细胞疗法不同（Nature Communications, 2020, doi:10.1038/s41467-020-14619-z）。他们决定把重点放在一种名为 CD229 的蛋白上，这种蛋白在多发性骨髓瘤癌细胞中非常普遍，而在健康细胞中则不常见。然而，他们证实，CD229 CAR-T 细胞仍然会攻击一些健康的血细胞，这是一种潜在的严重毒副作用。在这项新的研究中，Luetkens 博士和他的同事们旨在利用一种称为亲和力调整（affinity tuning）的复杂方法，设计出只攻击恶性肿瘤细胞而不攻击健康细胞的 CD229 CAR-T 细胞。他们交换了单个氨基酸，测试了305种不同的变体，煞费苦心地确定了最佳的CAR-T细胞序列，以达到最佳效果：容易识别癌细胞，同时忽略健康细胞。最初，这些作者失望地发现，他们设计出的优化 CAR受体显然会导致 CAR-T 细胞生长得更慢。从理论上讲，这种缓慢的生长可能会导致这种细胞疗法对患者的疗效不佳。他们采用了斯坦福大学研究人员之前开发的一种新方法（Nature, 2019, doi:10.1038/s41586-019-1805-z），从而克服了这一障碍。2. Cell：一种疫苗增强的工程化T细胞反应或能帮助清除人类的实体瘤doi:10.1016/j.cell.2023.06.002利用工程化的T细胞来破坏癌细胞目前在治疗某些类型的癌症上已经表现出了成功，比如白血病和淋巴瘤，然而，其对于实体瘤的治疗效果并不理想。而缺乏成功的原因之一在于T细胞仅能靶向作用一种抗原（肿瘤上发现的靶向性蛋白），如果某些肿瘤细胞不表达这种抗原的话，其就会逃避T细胞的攻击。近日，一篇发表在国际杂志Cell上题为“Vaccine-boosted CAR T crosstalk with host immunity to reject tumors with antigen heterogeneity”的研究报告中，来自MIT等机构的科学家们通过研究发现了一种克服这一障碍的方法，其能利用一种疫苗来增强名为嵌合抗原受体（CAR）T细胞的工程化T细胞的反应，同时还能帮助免疫系统产生新的T细胞从而靶向作用其它的肿瘤抗原；在对小鼠进行的研究中，研究人员发现，这种方法或许会使得肿瘤更有可能被根除。一种疫苗增强的工程化T细胞反应或能帮助清除人类的实体瘤。图片来源：Cell (2023). DOI:10.1016/j.cell.2023.06.002研究者Darrell Irvine教授说道，这种疫苗的增强似乎能驱动一种名为抗原扩散（antigen spreading）的过程，在该过程中，机体自身的免疫系统就能与工程化的CAR T细胞合作从而拒绝那些并非所有细胞都表达被CAR T细胞所靶向作用的抗原的肿瘤。目前FDA批准了多种T细胞疗法来治疗血液癌症，这些疗法都是基于CAR-T细胞，其能被工程化改造来展示受体从而识别癌细胞上存在的特殊抗原。为了尝试将这种疗法应用到胶质母细胞瘤（一类脑癌）中，研究人员设计了CAR-T细胞来靶向作用EGFR受体的一个突变版本，然而，并非所有的胶质母细胞瘤细胞都会表达这种抗原，而且当其被CAR-T细胞攻击时，有些胶质母细胞瘤细胞就会通过停止靶向性抗原的产生来产生反应。在2019年的一项研究中，研究者Irvine及其同事通过在使用工程化T细胞后不久将疫苗直接输注到小鼠体内来增强CAR-T细胞抵御胶质母细胞瘤的疗效，这种携带被CAR-T细胞靶向作用的相同抗原的疫苗就会被淋巴结中的免疫细胞所摄取，而CAR-T细胞则会在淋巴结中接触到它。这项研究中，研究人员发现，这种疫苗的提升不仅能帮助工程化的CAR-T细胞攻击肿瘤，还会产生另一种意想不到的效应，其或许还有助于产生靶向作用其它肿瘤抗原的宿主T细胞。这种被称之为“抗原扩散”（antigen spreading）的现象是可取的，因为其能产生一类特殊的T细胞群，当其在一起发挥作用时就能完全根除肿瘤病预防肿瘤再生。研究者Irvine表示，这或许正是能帮助你处理实体瘤中抗原异质性的东西，因为如果让宿主T细胞来攻击其它抗原，其就能够进来并杀灭CAR-T细胞无法杀灭的肿瘤细胞。3. Lancet：临床试验表明CAR- T细胞疗法liso-cel有望治疗难复发性的慢性淋巴细胞白血病和小淋巴细胞淋巴瘤doi:10.1016/S0140-6736(23)01052-8一项新的临床试验表明单次输注嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法可诱导复发或难治性慢性淋巴细胞白血病（CLL）或小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）患者完全缓解。相关研究结果近期发表在Lancet期刊上，论文标题为“Lisocabtagene maraleucel in chronic lymphocytic leukaemia and small lymphocytic lymphoma (TRANSCEND CLL 004): a multicentre, open-label, single-arm, phase 1–2 study”。论文共同作者、美国西北大学医学教授Shuo Ma博士说，“CAR-T细胞疗法利用患者自身的免疫细胞来对抗癌症。这种新型细胞免疫疗法是治疗复发性B细胞淋巴瘤的一大进步。我们在这项临床试验中报告了CAR-T细胞疗法Liso-cel治疗CLL/SLL的首个多中心研究。”在这项新的临床研究中，这些作者旨在评估CAR- T细胞疗法---特别是lisocabtagene maraleucel（liso-cel）---的疗效和安全性，该疗法用于治疗117例复发或难治性CLL或SLL成人患者，这些患者此前平均接受过5种疗法。CAR-T细胞疗法利用经过基因增强的T细胞更有效地定位和消灭癌细胞。在这项临床试验中，所有患者都接受了两种剂量水平之一的liso-cel一次性静脉输注。Ma说，在49名接受高剂量治疗的双重难治性CLL/SLL患者中，总反应率为47%，完全缓解率为18%，与0～5%的历史反应率相比，明显更高。这些作者说，缓解时间约为一个月，而且在获得完全缓解的患者中，没有人在20个月的随访中复发，这表明这种缓解具有持久性。4. Lancet Neurol：小型临床试验表明一种改良的CAR-T细胞有望治疗重症肌无力doi:10.1016/S1474-4422(23)00194-1来自一项小规模临床试验的证据表明，一种称为CAR-T细胞的先进血癌免疫疗法的改进形式经调整后可能能够用于治疗重症肌无力（myasthenia gravis），即一种神经系统的自身免疫性疾病。这项临床试验使用的改良型CAR-T疗法提供了更持久地减少重症肌无力症状的潜力，而且耐受性良好，没有明显的不良反应。相关研究结果发表在2023年7月的Lancet Neurology期刊上，论文标题为“Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study”。美国国家神经病与中风研究所小型企业项目主任Emily Caporello博士说，“重新利用CAR-T这样的突破性疗法来治疗一种神经系统疾病，显示了免疫疗法在治疗方案有限甚至没有的情况下的多功能性。”在这项新的研究中，14名全身性重症肌无力患者接受了不同剂量的称为Descartes-08的改良型CAR-T细胞疗法，这种细胞疗法靶向负责产生导致重症肌无力的抗体的细胞。理想的剂量被确定为每周一次，为期六周。关于这种细胞疗法有效性的早期数据是有希望的，但还需要更多的临床研究来评估该疗法的疗效。接受Descartes-08治疗的三名患者显示他们的症状完全或接近完全消除，这种情形在治疗后持续了六个月。另外两名患者不再需要接受目前针对一些严重的重症肌无力病例的长期静脉注射免疫球蛋白。5.NEJM：新研究表明经过碱基编辑的供者CAR-T细胞有望治疗T细胞白血病doi:10.1056/NEJMoa2300709作为英国伦敦大学学院（UCL）和大奥蒙德街儿童医院（GOSH）之间“从实验室到临床”合作的一部分，三名患有复发T细胞白血病的年轻患者如今接受了经过碱基编辑的CAR-T细胞的治疗。这项初步的临床试验的数据表明供者CAR-T细胞如何利用前沿的基因编辑技术进行基因改造从而改变它们的DNA代码中的单个碱基，以便它们能够对抗白血病。相关研究结果于2023年6月14日在线发表在NEJM期刊上，论文标题为“Base-Edited CAR7 T Cells for Relapsed T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia”。作为这三名患者中的一员，来自英国莱斯特市的13岁的Alyssa是去年世界上第一个因患有T细胞急性淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL）而参与这项临床试验的人。T-ALL是一种白细胞癌症，通常用化疗来治疗，但如果它复发，就很难清除。在接受这种经过碱基编辑的CAR-T细胞治疗后的四周内，Alyssa的白血病就检测不出来了，她接着成功地进行了骨髓移植，在将近一年后，她仍然健康在家。第二位参加这项临床试验的青少年在类似的时间段内清除了体内的白血病，如今他们在接受这种经过碱基编辑的CAR-T细胞移植后正在家里康复。遗憾的是，虽然第三名参加这项临床试验的孩子对这种经过碱基编辑的CAR-T细胞疗法有反应，但其病程因严重感染而变得复杂，这名孩子的家人与临床团队达成一致，转为缓和照顾（palliative care）。6.NOA：靶向HER2的CAR-T细胞有望治疗DIPG脑瘤doi:10.1093/noajnl/vdad024弥漫内生型脑桥胶质瘤（Diffuse Intrinsic Pontine Glioma, DIPG）通常发生在5至7岁的儿童身上，是一种侵袭性的脑瘤，每年影响澳大利亚的20名儿童。这种快速生长的肿瘤形成于儿童大脑中负责呼吸、吞咽和运动等重要功能的部分，这意味着它无法通过手术切除。被诊断为DIPG的儿童不可能在诊断后存活一年，目前没有治疗这种毁灭性疾病的方法。图片来自Neuro-Oncology Advances, 2023, doi:10.1093/noajnl/vdad024。在一项新的研究中，来自澳大利亚沃尔特和伊丽莎-霍尔医学研究所（WEHI）等研究机构的研究人员发现，用一种创新的新型免疫疗法---CAR-T细胞疗法---来治疗DIPG是有希望的。他们指出CAR-T细胞疗法对DIPG肿瘤具有有效的靶向作用。相关研究结果于2023年5月4日发表在Neuro-Oncology Advances期刊上，论文标题为“HER2 chimeric antigen receptor T cell immunotherapy is an effective treatment for diffuse intrinsic pontine glioma”。在WEHI实验室负责人Misty Jenkins副教授的领导下，这些作者发现在临床前模型中，这些经过特别设计的CAR-T细胞能够进入大脑，并通过减少肿瘤负荷而产生抗癌效果。Jenkins说，“与放疗不同，放疗既能杀死癌细胞，也能杀死健康的脑组织，而CAR-T细胞疗法使用患者自身的免疫细胞，并对它们进行基因改造以识别和杀死肿瘤。CAR-T细胞提供了一种治愈的可能性，没有长期的副作用。这些经过基因修饰的CAR-T细胞作为一种‘活的药物’起作用，这意味着患者将在体内保留抗肿瘤反应的活记忆，如果肿瘤再次复发，也可能起到杀死肿瘤的作用。这些细胞可以完全消除肿瘤，并在未来持续存在于体内，这是CAR-T细胞疗法令人兴奋的地方，也是免疫疗法是精准医学未来的原因。”7.Nat Med：在1期临床试验中 CAR-自然杀伤性T细胞疗法或有望表现出潜在的治疗结局doi:10.1038/s41591-023-02363-yVα24突变的自然杀伤性T细胞（NKTs）具有一定的抗肿瘤特性，其能通过嵌合抗原受体（CARs）来增强；近日，一篇发表在国际杂志Nature Medicine上题为“Anti-GD2 CAR-NKT cells in relapsed or refractory neuroblastoma: updated phase 1 trial interim results”的研究报告中，来自贝勒医学院等机构的科学家们通过研究报告了首个人类1期临床试验的中期结果，该试验中，研究人员评估了一种遗传工程化的自然杀伤性T细胞（NKT）免疫疗法在治疗成神经细胞瘤（neuroblastoma）上的安全性、抗肿瘤活性和免疫特征，成神经细胞瘤是一种儿童肿瘤，其最常会发生在机体肾上腺部位，相关研究结果表明，这种疗法耐受性良好，且研究人员观察到了其能产生强大的抗肿瘤活性的早期证据。在1期临床试验中 CAR-自然杀伤性T细胞疗法或有望表现出潜在的治疗结局。图片来源：Nature Medicine (2023). DOI:10.1038/s41591-023-02363-y自然杀伤性T细胞能被修饰从而表达GD2特异性嵌合抗原受体（GD2 CAR），该受体能促使免疫细胞靶向作用成神经细胞瘤细胞表面的特殊分子以及白介素-15（IL-15），IL-15是一种能支持自然杀伤性T细胞生存的天然蛋白，在此前的研究中，研究人员报道了该试验中所招募的前三名儿童的中期研究结果。这篇研究中，研究人员描述了在对其它疗法耐受的12名处于4期复发性成神经细胞瘤患者机体中的研究结果，他们发现，该疗法在四个剂量的水平下对所有12名患者都是安全的，且关于剂量限制毒性上并没有相关报道，3名患者会对疗法表现出客观反映，包括一组完全的反应和两个部分反应。另外两名患者也表现出了具有抗肿瘤活性的重要证据，比如清除骨髓受累并减少转移性肿瘤的负担，但目前尚未达到部分反应标准。研究者Andras Heczey说道，我们对在几名患者机体中所观察到的抗肿瘤活性结果感到鼓舞，尤其是因为这项临床试验还处于剂量递增阶段。此前研究结果表明，自然杀伤性T细胞在临床前模型中能定位到肿瘤位点，这一试验在人类机体中也呢狗验证安置额观察性结果，此外，研究人员还发现较高的抗肿瘤活性和所输注的CAR-自然杀伤性T细胞在体内增殖之间的关联。Leonid Metelitsa说道，我们并不能总是预测书诸侯自然杀伤性T细胞扩张的程度，在这项研究中，我们发现，在临床前工作中所识别出的输注自然杀伤性T细胞所表达的CD62L生物标志物或许能预测更高的自然杀伤性T细胞在体内扩张以及患者机体更高的抗肿瘤活性。8. Molecular Therapy Nucleic Acids: 一种先进治疗药物慢病毒载体在CAR-T细胞中的应用doi:10.1016/j.omtn.2023.03.018基因疗法已经被证明是一种真正的替代疗法，可以用来治疗几种没有适当治疗的疾病。然而，一些基因治疗策略的治疗效果并不是最好的，因为传递不充分或缺乏对转基因的控制。在基因治疗药物中，随着6种CAR-T药物的批准，嵌合抗原受体(CAR)-T细胞已成为治疗血液病最有前途的药物之一。然而，目前的CAR-T细胞经常出现严重的副作用(有时会导致致命的后果)，而且它们对实体瘤的治疗并不有效。这两个限制都可以通过产生智能CAR-T细胞来部分解决，这些细胞可以在外部进行控制，以决定何时何地活跃，或者分泌有效的生物分子。LOPIs2 LV是一种通用的工具，可以产生表达不同转基因的无反式激活子诱导细胞系。图片来源：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.omtn.2023.03.018近日，来自格拉纳达大学的研究者们在Molecular Therapy Nucleic Acids杂志上发表了题为“Lentiviral vectors for inducible, transactivator-free advanced therapy medicinal products: Application to CAR-T cells”的文章，该研究描述了第一个无反式激活剂的、能够产生Dox诱导的ATMP的一体化系统。通过外用诱导剂控制转基因表达被认为是提高基因治疗方法安全性和有效性的有效策略。一般来说，可诱导的ON系统需要一个嵌合的转录因子(反式激活因子)，该因子被诱导剂激活，由于其毒性，这对临床翻译并不是最佳的。研究者之前成功构建了第一个一体化、无反式激活剂、多西环素(Dox)反应(Lent-on-Plus或LOP)的慢病毒载体(LV)，能够控制转基因在人类干细胞中的表达。在本研究中，研究者已经产生了新版本的LOP LV，并分析了它们在产生可诱导的高级治疗药物(ATMP)方面的适用性，特别是对原代人类T细胞的关注。研究者已经证明，与所分析的所有其他细胞类型相反，为了控制人类原代T细胞中的转基因表达，必须在LOP LV的30个末端重复序列中插入Is2绝缘体。重要的是，由LOPIs2 LV产生的可诱导原代T细胞对超低剂量的Dox有反应，与未转导的T细胞相比，在表型或功能上没有变化。通过产生可诱导的CAR-T细胞来验证LOPIs2系统，该细胞在Dox存在的情况下选择性地杀伤CD19+细胞。9.Sci Adv：科学家开发出新型CAR-T细胞疗法治疗人类骨转移性前列腺癌doi:10.1126/sciadv.adf0108前列腺癌经常会发生骨转移且是无法治愈的，近日，一篇发表在国际杂志Science Advances上题为“γδ-Enriched CAR-T cell therapy for bone metastatic castrate-resistant prostate cancer”的研究报告中，来自H. Lee Moffitt癌症研究中心等机构的科学家们通过研究有望开发出治疗前列腺癌骨转移的患者。文章中，研究者表示，嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T细胞疗法）或许在前列腺癌骨转移的小鼠模型中作为一种有效的抗肿瘤方法。科学家开发出新型CAR-T细胞疗法治疗人类骨转移性前列腺癌。图片来源：Science Advances (2023). DOI:10.1126/sciadv.adf0108研究者Conor Lynch博士说道，骨转移的前列腺癌是一种无法治愈的疾病，其会通过极度的骨痛来明显影响患者的生存，诸如唑来膦酸盐（zoledronate）等双磷酸盐（Bisphosphonates）能减缓患者的问题并减少其病理性的骨折，但对于患者的生存影响不大；因此，研究人员就迫切需要开发出新型的治疗手段。文章中，研究人员想通过研究调查利用CAR-T细胞疗法治疗骨转移性前列腺癌的可能性，以及这种疗法的治疗效果是否能通过与唑来膦酸盐的结合而被增强；CAR-T细胞疗法是一种相对交心的癌症疗法，这种形式的细胞免疫疗法2017年首次获批用于治疗特定类型的血液癌症，对于这种疗法而言，研究人员首先从患者体内分离到其T细胞，对其进行遗传工程化修饰来靶向作用肿瘤特异性的标志物，随后T细胞会在培养物中进行扩增并重新输注回患者体内，在患者体内其就能靶向摧毁患者机体的肿瘤细胞了。研究者Abate-Daga指出，与传统的α/β T细胞相比，我们对这些细胞的研究相对较少，但其近些年来却吸引了很多生物技术部门的关注和极大兴趣。研究人员创造了对肿瘤生物标志物前列腺干细胞抗原（PSCA，prostate stem cell antigen）具有特异性的CAR-T细胞，这类抗原在骨转移性前列腺癌中会高度表达；研究者认为，CAR-T细胞能杀灭细胞培养物中的前列腺癌细胞，并能刺激增强免疫细胞活性的化学信使分子的产生。接下来研究人员开始对小鼠模型进行研究，结果发现，CAR-T细胞能明显减少肿瘤的尺寸并改善小鼠的生存且毒性非常有限；此外，利用唑来膦酸盐预先处理小鼠或能通过一种CAR非依赖性的机制来帮助激活CAR-T细胞，并能提高其识别和破坏肿瘤的能力；重要的是，除了能消除肿瘤外，这种疗法还能保护骨骼的健康。10.Nat Commun：T细胞研究的新发现或能帮助改善对人类实体瘤的治疗doi:10.1038/s41467-023-36160-5瞬时表达肿瘤靶向受体的工程化T细胞或能作为一种有吸引力的工程化T细胞疗法形式，因为其并不会引入插入突变或长期不良副作用的风险，然而，患者往往需要进行多轮治疗，而这往往增加了患者的不适和治疗费用。近日，一篇发表在国际杂志Nature Communications上题为“G9a/GLP inhibition during ex vivo lymphocyte expansion increases in vivo cytotoxicity of engineered T cells against hepatocellular carcinoma”的研究报告中，来自新加坡A*STAR研究所等机构的科学家们通过研究发现，在细胞治疗生产过程中，抑制G9a和GLP两种蛋白的功能后，免疫细胞或许就能更加有效地抵御癌症了，相关研究结果或有望帮助开发让癌症患者获益的新型创新性疗法，并能让研究人员更加接近开发出针对实体瘤的更为有效的靶向性疗法。T细胞研究的新发现或能帮助改善对人类实体瘤的治疗。图片来源：Nature Communications (2023). DOI:10.1038/s41467-023-36160-5实体瘤是全球范围为内癌症相关死亡的主要原因，诸如化疗、放疗和外科手术等传统疗法是可行的，但其在治疗人类实体瘤上的疗效并不同，尤其是对于癌症晚期患者；T细胞疗法就在治疗诸如血液癌症等液体肿瘤方面非常成功，但在治疗诸如乳腺癌、肝癌或脑癌方面却并未观察到同样的治疗效果。作为治疗的一部分，工程化的T细胞通常会被引入到患者的血液中，其与液体肿瘤一样处于相同的环境中，这或许就能促使其定位并更加容易地靶向作用液体肿瘤，然而，在实体瘤存在的情况下，工程化的T细胞就会面临物理和分子障碍，比如在体内通过致密组织结构来进行迁移，且遇到可能负面影响其功能的其它细胞或分子。文章中，研究人员通过联合研究揭示了一种能改善T细胞疗效的新方法，T细胞是一种能识别并消除癌细胞的特殊免疫细胞。研究者Andrea Pavesi表示，我们对特殊的表观遗传学药物进行了全面的分析，这些药物能影响工程化T细胞在增加机体抗肿瘤活性上的疗效。我们使用了2D和新型3D分析方法来模拟T细胞所遭遇的物理环境，从而发现并靶向作用人类机体中的癌细胞。在实验室所进行的细胞疗法的细胞扩增过程中，研究人员对免疫细胞施用了一种能靶向作用G9a和GLP蛋白的特殊药物，随后将这些药物洗掉，然后再将工程化的免疫细胞重新输注到患者体内并消除药物所产生的副作用，相关研究结果表明，这种药物或呢过帮助增加工程化免疫细胞的抗肿瘤功能，其会增加颗粒酶的产生，而颗粒酶是一种能帮助定位和消除目标肿瘤细胞的蛋白质。研究人员利用其对免疫细胞的分析能力以及杜克大学-新加坡国立大学的研究人员提供的患者样本进行研究，相关研究结果或能利用成熟的细胞系和患者机体所衍生的免疫细胞来进行验证，从而确认阻断G9a和GLP活性在改善T细胞疗法治疗效率方面的功效。会议推荐会议详情会议名称：2023（第14届）细胞与基因治疗国际研讨会暨抗体工程与创新免疫治疗技术论坛暨2023细胞免疫治疗专业委员会年会主办单位：生物谷、梅斯医学、同济大学附属同济医院、南京可缘大会时间：9月22-23日大会地点：上海 大会规模：1500人2010年至今，生物谷联合各合作单位已经顺利召开了13届细胞与基因治疗国际研讨会，与全球致力于细胞治疗行业同仁们一同成长沉淀，在提供行业信息交流平台的同时，也为基础研究提供了技术/产品等产业化的孵化平台。基于此，本届会议将继续以转化医学为切入点，以基础研究与临床应用相结合，针对细胞治疗的临床前沿研究、临床监管、治疗规范、细胞治疗安全性，免疫细胞新型疗法、实体瘤治疗、干细胞与癌症、抗体药物、核酸药物、基因编辑、肿瘤免疫治疗等热门议题进行讨论，诚邀国内外产学研医专家共聚，共绘产业发展新蓝图！长按识别二维码立即报名参会

在一项新的研究中，来自美国马里兰大学医学院的研究人员设计出了一种新型 CAR-T 细胞疗法，在临床前研究中，这种细胞疗法能选择性地攻击癌细胞，同时保护健康细胞，从而降低了这种创新癌症疗法产生毒副作用的 在一项新的研究中，来自美国马里兰大学医学院的研究人员设计出了一种新型 CAR-T 细胞疗法，在临床前研究中，这种细胞疗法能选择性地攻击癌细胞，同时保护健康细胞，从而降低了这种创新癌症疗法产生毒副作用的可能性。这些CAR-T 细胞专为攻击多发性骨髓瘤而设计，多发性骨髓瘤是一种存在于人体骨髓中的浆细胞癌症。相关研究结果发表在2023年7月19日的Science Translational Medicine期刊上，论文标题为“Systematic single amino acid affinity tuning of CD229 CAR T cells retains efficacy against multiple myeloma and eliminates on-target off-tumor toxicity”。 论文通讯作者、马里兰大学医学院微生物学与免疫学助理教授Tim Luetkens博士说，“我们在临床前研究中清楚地看到，这种新疗法能有效地消灭肿瘤细胞，而不会攻击健康细胞。我们非常看好它作为一种更安全的新型癌症疗法的潜力。” 根据美国国家癌症研究所的说法，每年约有3.5万美国人被诊断出患有多发性骨髓瘤，约40%的患者在五年内死亡。目前市场上有两种治疗多发性骨髓瘤的CAR-T细胞疗法，平均可控制病情三年。这两种细胞疗法利用患者自身的免疫细胞在经过基因改造后特异性结合癌细胞表面上的特定靶蛋白。尽管目前CAR-T细胞疗法治疗多发性骨髓瘤的效果非常令人鼓舞，但仍有许多患者复发，这表明需要新的疗法。 在此前发表在Nature Communications期刊上的一项研究中，Luetkens 博士、马里兰大学医学院医学教授 Djordje Atanackovic 博士和威斯康星医学院助理教授 Sabarinath Radhakrishnan 博士开发了一种新的 CAR T 细胞疗法，它靶向攻击的蛋白与目前的 CAR-T 细胞疗法不同（Nature Communications, 2020, doi:10.1038/s41467-020-14619-z）。他们决定把重点放在一种名为 CD229 的蛋白上，这种蛋白在多发性骨髓瘤癌细胞中非常普遍，而在健康细胞中则不常见。然而，他们证实，CD229 CAR-T 细胞仍然会攻击一些健康的血细胞，这是一种潜在的严重毒副作用。 在这项新的研究中，Luetkens 博士和他的同事们旨在利用一种称为亲和力调整（affinity tuning）的复杂方法，设计出只攻击恶性肿瘤细胞而不攻击健康细胞的 CD229 CAR-T 细胞。他们交换了单个氨基酸，测试了305种不同的变体，煞费苦心地确定了最佳的CAR-T细胞序列，以达到最佳效果：容易识别癌细胞，同时忽略健康细胞。 最初，这些作者失望地发现，他们设计出的优化 CAR受体显然会导致 CAR-T 细胞生长得更慢。从理论上讲，这种缓慢的生长可能会导致这种细胞疗法对患者的疗效不佳。他们采用了斯坦福大学研究人员之前开发的一种新方法（Nature, 2019, doi:10.1038/s41586-019-1805-z），从而克服了这一障碍。 论文第一作者、Luetkens 博士实验室研究员Erica Vander Mause 博士说，“为我们的 CAR-T 细胞中天然存在的一种名为 c-Jun 的蛋白提供额外的拷贝，可以让它们正常生长，并长期攻击癌细胞。” Luetkens博士和Atanackovic博士都是马里兰大学马琳与斯图尔特-格林鲍姆综合癌症中心（UMGCCC）免疫学和免疫疗法研究项目的成员，该中心在用CAR T细胞疗法治疗病人方面处于地区和全国领先地位。自2017年美国食品药品管理局（FDA）批准首个CAR-T细胞疗法以来，该中心已治疗了300多名血癌患者，如大B细胞淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。 CD229在CAR-T细胞中的表达。在CAR-T细胞生产第9天，通过流式细胞术检测CD229在CAR-T细胞产品表面上的表达，以及来自两名健康人类供体的未刺激T细胞的表达。图片来自Science Translational Medicine, 2023, doi:10.1126/scitranslmed.add7900。 Atanackovic博士说，“目前，UMGCCC和合作机构正在启动临床研究，第一步是研究靶向CD229的CAR-T细胞治疗多发性骨髓瘤以及其他可能的恶性肿瘤的安全性和有效性。” UMGCCC 是马里兰州、弗吉尼亚州和华盛顿特区首家获得认证的癌症中心，可以为侵袭性淋巴瘤患者提供 CAR-T 细胞疗法。这些患者中很多都是复发性和难治性血癌，没有其他可行的治疗方案。半数以上接受过这种细胞疗法的患者都存活了下来，其中一些患者已经存活了五年，并得到了有效治愈。 马里兰大学巴尔的摩分校医疗事务副校长Mark T. Gladwin博士说，“在CAR-T细胞领域，最佳的CAR-T细胞结合强度仍然是一个悬而未决的问题，低亲和力的CAR-T细胞通常表现出更好的长期有效性和安全性。这项研究提供了一个灵活的平台，可以利用现有的 CAR并优化其结合强度，从而有可能使这类细胞疗法对不同类型的癌症更安全、更有效。”（生物谷 Bioon.com） 参考资料： 1. Erica R. Vander Mause et al. Systematic single amino acid affinity tuning of CD229 CAR T cells retains efficacy against multiple myeloma and eliminates on-target off-tumor toxicity. Science Translational Medicine, 2023, doi:10.1126/scitranslmed.add7900. 2. New Innovation in CAR T-Cells Paves Way for Less Toxic Therapy Against Multiple Myelomahttps://www.medschool.umaryland.edu/news/2023/New-Innovation-in-CAR-T-Cells-Paves-Way-for-Less-Toxic-Therapy-Against-Multiple-Myeloma.html

摘要Abstract在过去几十年，随着新型治疗药物的出现，如蛋白酶抑制剂、免疫调节药物、抗CD38单克隆抗体、选择性核输出抑制剂（SINEs）和T细胞重定向双特异性抗体，多发性骨髓瘤（MM）患者的生存结果已有大幅度提升。然而，MM仍是一种不可治疗的带瘤血浆细胞失调，几乎全部MM患者不可避免地因耐药性而旧病复发。令人鼓舞人心的是，近几年B细胞成熟抗原（BCMA）-靶向嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法在治疗复发性/难治性（R/R）MM方面已经获得了令人印象深刻的成功，这给R/R MM患者带来了新的希望。由于抗原逃逸、CAR-T细胞的持久性弱和复杂的肿瘤微环境，相当数量的MM患者在接受抗BCMA CAR-T细胞疗法后仍经历复发。另一方面，高昂的生产成本和因个性化生产步骤而费时的生产工艺也限制扩大CAR-T细胞疗法的临床应用。因此，在这篇综述中我们讨论了CAR-T细胞疗法在MM的当今局限性，如CAR-T细胞疗法的阻力和CAR-T细胞疗法受限的可行性，以及总结了一些优化策略去克服这些挑战，包括优化CAR结构如利用重定向/多定向CAR-T细胞和装甲CAR-T细胞、优化生产工艺、联合CAR-T细胞疗法和现有的或新兴的治疗方法、以及在CAR-T细胞疗法后进行抗骨髓瘤疗法来抢救治疗或维持/巩固治疗。01引言多发性骨髓瘤（MM）是一种血浆细胞肿瘤化，恶性的血浆细胞在骨髓里无性增殖，伴随着单克隆免疫球蛋白（称M蛋白）的过表达，随后终末器官损伤，这占了血液学恶性血液病的10%。随着对MM发病原理的了解越来越多，以及新颖治疗药物的应用如蛋白酶抑制剂（硼替佐米、伊沙佐米和卡非佐米）、免疫调节药物（沙丽度胺、来那度胺和泊马度胺）、单克隆抗体（达雷木单抗、 伊莎妥昔单抗和艾洛珠单抗），还有选择性核输出抑制剂（塞利尼索），MM患者的生存结果已有很大的改善。然而，几乎所有MM患者最终会复发，尤其是那些复发性或难治性（R/R）患者携带髓外疾病（EMD）或高风险细胞遗传学的异常情况如t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)、gain(1q)、del(17p)和TP53突变，还有双/三重打击，通常有不良预后。另外，MM细胞在选择性的压力处理下频繁出现克隆演变，这导致疾病恶化和对常规疗法免疫。因此，急切需要治疗R/R MM的新型治疗方法。近年来，嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法已成为一种非常有前景的免疫疗法，它极大的改变了血液学恶性血液病的治疗蓝图。为了产生能特异性识别肿瘤表面抗原的CAR-T细胞，患者或健康捐赠者的T细胞含有特异性肿瘤靶点受体的基因修饰，这就是嵌合抗原受体(CAR)。CAR的结构含有单链可变区片段(svFv)，这使在没有MHC限制性抗原表达的条件下特异性识别肿瘤表面抗原。与效应T细胞类似，CAR-T细胞也可以通过几种方式介导肿瘤死亡，包括分泌含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒素颗粒、产生促炎症细胞因子如IFN-γ和TNF-α、以及激活Fas/Fas配体（Fas/FasL）通路。目前，B细胞成熟抗原（BCMA）是MM CAR-T细胞疗法最为成功的靶点，抗BCMA CAR-T细胞疗法已在R/R患者中获得前所未有的响应，给这些R/R MM患者带来了新的希望。另外，带EMD的R/R MM患者也可以从抗BCMA CAR-T细胞疗法中获益，但相对与非EMD患者来说，这些患者通常有短暂的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。到目前为止，两种抗BCMA CAR-T细胞产品，idecabtagene vicleucel (ide-cel) 和 ciltacabtagene autoleucel (ciltacel)，已被美国食品药品管理局（FDA）批准用于治疗R/R MM。随着近年来开展越来越多的CAR-T细胞临床试验，CAR-T相关副作用已逐渐被识别和控制，如细胞因子释放综合征、CAR-T细胞相关脑病症候群、血细胞减少和感染。尤其是因MM患者体液免疫缺陷随后淋巴细胞清除和抗BCMA CAR-T细胞疗法介导B细胞发育不全，这些患者对感染特别是细菌感染高度敏感。因此，这些免疫缺乏患者极度需要免疫球蛋白补充剂和预防性抗感染治疗。然而，仍有几个重大挑战，如抗BCMA CAR-T细胞疗法的阻力、CAR-T细胞疗法受限的可行性。因此，为开发出有效的策略在进行许多研究工作。02抗BCMA CAR-T细胞疗法在多发性骨髓瘤的阻力和潜在策略尽管抗BCMA CAR-T细胞疗法在R/R MM有着振奋人心的成果，但它的效力较短，许多MM患者仍遭遇肿瘤复发或恶化。这种阻力机制与抗BCMA CAR-T细胞、肿瘤细胞和复杂的肿瘤微环境之间的相互作用密切相关，设计抗原逃逸和CAR-T细胞衰竭。有几种潜在策略可以克服CAR-T细胞疗法的困难，包括利用双靶点CAR-T细胞和装甲CAR-T细胞，通过小分子药物和基因修饰抑制细胞内部衰竭香港的信号，和利用桥接疗法，还有在疾病早期收集选择性T细胞用于生产CAR-T细胞。2.1 克服抗原逃逸的困难目前BCMA是治疗MM最广泛研究的靶点，包括抗BCMA CAR-T细胞疗法和靶向BCMA和CD3的双特异性抗体，如teclistamab。然而，大部分MM患者在接受抗BCMA CAR-T细胞疗法后仍遭遇肿瘤复发。主要机制之一为在治疗压力下抗原下调或抗原损失。因此，靶向不同表面抗原是预防不良抗原逃逸的一种有效策略，现在多种可选择的靶点正持续被识别，包括CD138、CD38、CD19、GPRC5D、SLAMF7(CS1)、APRIL、TACI、CD229、CD56、MUCI、NKG2D配体、整合蛋白β7、Kappa轻链、FcRH5、CCR10和CD44v6 （图1）。以上大部分靶点仍在临床前阶段 (NCT03778346). 其中，GPRC5D是目前R/R MM患者CAR-T细胞疗法最有潜质的靶点。现在抗GPRC5D CAR-T细胞疗法有两个临床1期试验已发布了令人振奋人心的功效。在临床1期剂量爬坡试验种，17名R/R MM患者接受了4个剂量水平的抗GPRC5D CAR-T细胞输注，71%的患者获得了临床应答。在另一个临床1期试验独立中心，10名R/R MM患者接受了抗GPRC5D CAR-T细胞治疗(OriCAR-017), 100%患者显示临床应答，60%患者达到严格的完全应答（sCR）。更重要的是，这些抗GPRC5D CAR-T细胞对先前抗BCMA CAR-T细胞疗法难治的R/R MM患者也有效果。然而，由于中间跟进时间相对较短，R/R MM采用抗GPRC5D CAR-T细胞疗法的有效性和安全性仍需要在大规模多中心试验评价。另外，在2022美国血液学会（ASH）的年会上展示了一个关于GPRC5D靶点CAR-T细胞产品BMS-986393在R/R MM患者的1期临床试验结果(NCT04674813)。在该临床试验中，10名没有接受过先前抗BCMA疗法的患者全部达到缓解，7名在先前抗BCMA疗法中失败的患者也在抗GPRC5D CAR-T细胞疗法中获益。此外，BCMA/GPRC5D 双特异性CAR-T细胞疗法正积极进行临床研究(NCT05431608)。另外，SLAMF7靶向和整合素β7靶向的CAR-T细胞临床试验也正在进行中(NCT03778346)。然而，SLAMF7和CCR10也在活化T细胞中表达，可能会杀害CAR-T细胞。在临床前和临床研究中也有双靶点CAR-T细胞疗法，他们可以有多种形式，包括2种单靶点CAR-T细胞联合输注，还有同时整合单独两个不同scFvs至两种CARs或单CAR结构的双特异性CAR-T细胞，后者也称为串联CAR-T细胞。在几种临床试验中，CD38和CD19被应用于整合BCMA来开发双靶点CAR-T细胞，用于治疗R/R MM (表1)。在1期临床试验中，23名 R/R MM患者接受BCMA/CD38双特异性CAR-T细胞，87%的患者获得临床应答，52%的患者获得有随后中位数9.0个月的完全应答（CR）。在另一个临床试验中，16名R/R MM患者接受BCMA/CD38双特异性CAR-T细胞疗法，其中14名患者有临床应答，13名患者获得随后中位数11.5个月的CR。除了BCMA/CD38双特异性CAR-T细胞以外，也进行了整合抗CD38和抗BCMA CAR-T细胞疗法。在一项2期单臂单中心临床试验中，22名R/R MM患者接受了人源化抗BCMA细胞于鼠源抗CD38 CART细胞的联合输注。在另一项单臂2期临床试验中，21名患者接受抗BCMA和抗CD19 CAR-T细胞的联合输注，20名患者获得了临床响应，其中3名患者获得随后中位数179天的CR。这次试验随着患者数量陆续增多，62名R/R MM患者获得了抗BCMA和抗CD19 CAR-T细胞的联合输注。在这次临床试验中，92%的患者获得临床应答，60%的患者获得随后中位数21.3个月的CR。另外，近来研究已经发现抗CD19和抗BCMA CAR-T细胞疗法联合输注在10名最新诊断的高风险MM患者中的有效性和安全性，全部患者获得了临床应答。在临床前研究中，BCMA/GPRC5D和BCMA/CS1双特异性CAR-T细胞显示大量对抗MM细胞的抗肿瘤活动，他们可以克服BCMA负面抗原逃逸。同样的，BCMA/CS1双特异性CAR-T细胞在R//R MM患者中也有效果，可以预防BCMA负面释放。有趣的是，一些自然配体可以结合两个或多个MM细胞的表面抗原，所以生产携带这些配体抗原识别区域的CAR-T细胞可以识别几个在恶性细胞上的目标靶点，从而获得重抗原或多抗原靶点。在临床前研究已测试几种配体相关的CAR-T细胞，目前获得了令人满意的结果。例如，APRIL相关CAR-T细胞能靶向MM细胞的BCMA和TACI，BAFF配体相关的CAR-T细胞能特异性识别MM细胞上的三种不同受体，包括BAFF-R、BCMA和TACI。除了靶向不同抗原以外，提高MM细胞的目标抗原密度也是一种吸引人的策略。一些研究已证实γ-分泌酶抑制剂和全反式维甲酸（ATRA）可以上调MM细胞的BCMA表达，促使被抗BCMA CAR-T细胞识别。另外，ATRA可以促使MM细胞表达CD38。图1 多发性骨髓瘤的潜在治疗靶点，包括 BCMA、CD138、CD38、CD19、GPRC5D、SLAMF7、APRIL、TACI、CD229、CD56、CD44v6、整合蛋白β7、MUCI、FcRH5、Kappa轻链、CCR10和NKG2D配体表1 MM双靶向CAR-T细胞疗法的临床试验 2.2 预防CAR-T细胞衰竭R/R MM患者在接受抗BCMA CAR-T细胞疗法后得到短期临床缓解部分归因于CAR-T细胞衰竭，表现出CAR-T细胞不良的持久性和功能紊乱。目前，被认为涉及CAR-T细胞衰竭的多个因素包括持续性抗原刺激、免疫抑制肿瘤微环境和先前抗骨髓瘤治疗引起的T细胞的受损功能。改善CAR-T细胞功能障碍有几种潜在策略，如优化CAR-T细胞结构、利用早期记忆T细胞和通过基因修饰或抑制剂来抑制细胞内衰竭相关的信号。另外，考虑到在多线抗骨髓瘤治疗后T细胞受损的细胞毒性，在病程早期收集T细胞来生产CAR-T细胞可能也是一种有效策略。2.2.1 优化CAR-T细胞结构目前，CD28、4-1BB、ICOS和OX40是在CAR-T细胞生产中最常使用的协同刺激分子。CD28协同刺激引起大量T细胞的激活，因此它能加速CAR-T细胞衰竭。相比之下，4-1BB协同刺激可以促使干细胞记忆T细胞扩展，改善CAR-T细胞衰竭。ICOS是CD28家族中的一个成员，ICOS和4-1BB组合协同刺激可以显著提高CAR-T细胞的持久性。作为TNF-R超家族中的一员，OX40显示可以促进T细胞增殖和产生记忆。最新的研究已证实在重复刺激BCMA条件下，相对于4-1BB介导的BCMA靶向CAR-T细胞，OX40介导的BCMA靶向CAR-T细胞展示出强烈的增殖能力和更持久的抗肿瘤活性。另外，全人源CAR结构可减少抗BCMA CAR-T细胞的免疫原性，避免宿主免疫系统的免疫介导排斥。更重要的是，一项1期临床试验已证实R/R MM在接受先前鼠源抗BCMA CAR-T细胞疗法后复发的患者也可以在全人源抗BCMA CAR-T细胞中获得临床应答。2.2.2 利用记忆表型CAR-T细胞早期记忆T细胞展现出更强的扩张和持久性。相似的，一项最新的研究报道在CAR-T生产工艺中利用原始的或中心记忆T细胞不仅可以改善CAR-T细胞衰竭，也可以减少严重细胞因子释放综合征的风险。另外，最近已被证实JQ1， bromodomain and extra-terminal motif (BET)家族的一种抑制剂，可以维持带中心记忆T细胞特性的效应T细胞，也可以提高采用的CAR-T细胞的持久性和功能性。2.2.3 抑制衰竭相关信号BATF是涉及上调CAR-T细胞衰竭相关基因组的一个关键因子，已证实BATF的损耗可以提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性，提高中心记忆CAR-T细胞。相似的，CAR-T细胞内源性TGF-β受体II （TGFBR2）不仅可以预防CAR-T细胞衰竭，也可以促使中心记忆CAR-T细胞的增殖。抑制细胞内钙信号和PD-1信号也显示出可有效防止CAR-T细胞衰竭。另外，PI3K/AKT通路参与T细胞增殖和分化，是CAR-T细胞衰竭的重要角色。目前，体内实验已证实PI3K抑制剂可调节CAR-T细胞分化，提高CAR-T细胞的持久。有趣的是，一项最新研究发现第二代酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼可以通过提高记忆相关基因的表达逆转CAR-T细胞的衰竭表型，如TCF7和CCR7，减少免疫检查点分子PD1和衰竭相关调节因子的表达，如NR4A1、BATF3, ATF4, 和FOS。相似的，panobinosta也可能可以上调记忆相关基因和下调衰竭相关基因。此外，一项最新研究证实SOX4和ID3是关键的衰减相关调节因子，因此抑制SOX4和ID3表达也可以防止CAR-T细胞衰竭。2.2.4 改善CAR-T细胞效应器功能CART细胞的衰竭表型表现出抗肿瘤功能受损。CAR-T细胞抗肿瘤活性可通过基因修饰改善，包括增加免疫刺激受体和特异性敲除介导CAR-T细胞失能的基因。目前，多种研究证实分泌细胞因子或表达促炎症配体的装甲CAR-T细胞，如IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和CD40L，可以改造肿瘤微环境。另外，多个研究已证实额外嵌合的协同刺激受体（CCRs）可持续提高CAR-T细胞的杀伤作用和持久性。另外，另一个研究证实敲除CAR-T细胞中介导混合物亚单位12和周期蛋白C可以改善CAR-T细胞的抗肿瘤活性。为了改善CAR-T细胞抗肿瘤活性，CAR-T细胞和小分子药物尤其是抗骨髓瘤物质的联合治疗可能也是一种有前景的策略。在临床试验中，来那度胺在很长一段时间被用于治疗MM。有趣的是，来那度胺和CAR-T细胞的联合治疗可以获得良好的效果，改善CAR-T细胞的细胞毒性，一个案例显示抗BCMA CAR-T细胞联合来那度胺在先前抗BCMA CAR-T细胞疗法中难治的MM患者中也有效。另外，阻断PD-1 已被证实也可提高CAR-T细胞对MM细胞的杀伤活性。然而，CAR-T细胞疗法联合小分子药物仍在初步阶段，许多联合疗法仍在研究中。2.2.5 克服免疫抑制肿瘤微环境的困难MM的骨髓微环境很复杂，涉及促肿瘤生长、免疫逃逸和药物阻力。MM骨髓微环境中有多个免疫抑制细胞的累积，有着支持肿瘤的特性，如破骨细胞（OCs）、骨髓源抑制剂细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞、调节T细胞（Tregs）、调节B细胞（Bregs）、肿瘤相关中性粒细胞（TANs）还有骨髓基质细胞（BMSCs）。另一方面，这些细胞串扰MM细胞可促进MM细胞的存活和增殖（图2）。另一方面，他们通过直接细胞间联系或释放可溶性因子来损害效应T细胞的细胞毒性，然而促使MM细胞从免疫监视中逃脱。OCs是造血干细胞衍生的多核细胞，负责骨吸收，在骨髓瘤发生和进展中会显著性的提高OCs和分泌RANKL。而且，他们释放APRIL、BAFF和IL-6，促使MM细胞的增殖和存活。更重要的是，OCs也作为抗原呈递细胞（APCs）驻留在骨髓中，通过上调免疫检查点分子如PD-L1、CD38和半乳凝素9的表达展现免疫抑制功能。反过来，MM细胞产生IL-6和RANKL，可提高OCs骨再吸收活性。在MM患者中，表现M2相似特性的TAMs明显渗入骨髓，大量激活BAFF促增殖信号，参与促血管新生和肿瘤抵抗。而且，大规模MDSCs在MM患者的骨髓微环境中累积。他们可产生免疫抑制分子IL-10和TGF-β，然后促使Treg细胞的产生和MM细胞的免疫逃逸，还有血管新生。中性粒细胞在骨髓中是一种重要的细胞亚型，是预防病原体的第一线。他们可以产生中性粒细胞胞外综合征（NETs），在预防病原体中有着重要的角色。然而，源于TANs的NETs在MM骨髓微环境中起免疫抑制的作用。一项最新的研究中显示MM细胞以依赖PAD4的方式诱导NET的形成，促使肿瘤相关血栓形成和肿瘤转移。而且，在MM微环境中随着NF-kB信号的激活，BMSCs显示出一种炎症性表型。他们不仅分泌几种细胞因子，如APRIL、BAFF、IL-6和RANKL，在促MM细胞增殖中有着重要角色，也引发MM细胞中抗凋亡蛋白的表达，包括生存素和Mcl-1。免疫抑制的Tregs和Bregs在MM骨髓瘤微环境中也有显著的提高，通过分泌免疫抑制的细胞因子如TGF-β和IL-10还有表达免疫抑制分子如PD1、TIM3和CD38来维持免疫耐受。而且，NK细胞表现出衰竭的表型，主要被证实通过下调多个活化受体和细胞溶解分子如NKG2D、SLAMF7、CD69和GZMA来减少的抗骨髓瘤活性，类浆细胞树突细胞（pDCs）功能失调会上调PD-L1的表达。此外，NKT细胞在R/R MM患者中会减少。更多的是，包括MM细胞、免疫抑制细胞和BMSCs的MM微环境，还有多个与CAR-T细胞互动的可溶性细胞因子，可导致CAR-T细胞功能失调，抑制CAR-T细胞转移，最终在CAR-T细胞输注后促进MM细胞的抵抗力（图3）。在一方面，骨髓微环境中的肿瘤细胞和免疫抑制细胞通过直接细胞间作用引起CAR-T细胞衰竭，如PD-1/PDL-1通路和Fas/FasL通路。在另一方面，免疫抑制的细胞也可以释放免疫抑制因子IL-10和TGF-β去损伤CAR-T细胞的细胞毒性，促进Treg细胞生成。另外，BMSCs可通过在MM细胞里上调抗细胞凋亡蛋白保护MM细胞对抗CAR-T细胞。因此，克服免疫抑制肿瘤微环境的困难可能是一种有前景的治疗策略。现在，可原位释放免疫激活的细胞因子的装甲CAR-T细胞被发现可以克服敌对的免疫抑制肿瘤微环境。因CD38在MM骨髓微环境多种免疫调节细胞中表达，如Tregs、MDSCs，抗CD38 CAR-T细胞也对CD38阳性免疫调节细胞有轻微细胞毒性。CAR-T细胞疗法联合溶瘤细胞病毒也是一种克服免疫抑制肿瘤微环境的潜在策略。另外，CAR-T细胞疗法联合抗凋亡蛋白抑制剂FL118也被证实可以克服BMSCs引起的阻力。 图3  CAR-T细胞、肿瘤细胞和免疫抑制肿瘤微环境的相互作用。一方面，骨髓微环境的肿瘤细胞和免疫抑制细胞通过直接细胞间作用引起CAR-T细胞衰竭，如PD-1/PDL-1通路和Fas/FasL通路。免疫抑制细胞也能释放免疫抑制细胞因子如IL-10和TGF-β来影响CAR-T细胞的细胞毒性，促使Treg细胞的生成。另外，BMSCs能通过在MM细胞中上调抗凋亡蛋白来保护MM细胞对抗CAR-T细胞。03改善CAR-T细胞疗法可行性的策略3.1 开发通用的CAR-T细胞产品目前，所有商业化CAR-T细胞产品采用自身T淋巴细胞生产。个性化的生产工艺需要近3~4周，也导致生产费用昂贵。尤其是，一部分R/R MM患者在CAR-T细胞生产期间疾病急速恶化，所以他们不能接受时下的自身CAR-T细胞疗法，甚至失去了接受CAR-T细胞疗法的机会。自身CAR-T细胞产品相对较长的生产时间和昂贵的生产费用限制了他们的可行性，因此现在正开发容易获得的“下架”自身CAR-T细胞产品来克服这些限制，如通用的CAR-T（UCAR-T）细胞和CAR-γδT细胞。因为UCAR-T细胞源于健康的捐赠者，他们有多种优势，如更强的细胞毒性和没有恶性肿瘤细胞污染。更多的是，由于这些UCAR-T细胞大规模生产，生产费用可显著性降低。不幸的是，这些同种异体的UCAR-T细胞也许会导致移植物抗宿主病（GVHD），被宿主免疫系统排斥。在一项最新的1期临床试验种，43名R/R MM患者接受同种异体的抗BCMA CAR-T细胞疗法，55.8%的患者出现临床应答，其中25%获得随后中位数为10.2个月的sCR。更重要的是，这些同种异体的CAR-T细胞从病人招募到CAR-T细胞输注成功输注时间的中位数为5天，这显著缩短了CAR-T细胞输注的等待时间。然而，这些同种异体的CAR-T细胞完全应答率（ORR）显著低于两个FDA批准的抗BCMA CAR-T细胞产品。另外，γδT细胞可用于生产UCAR-T细胞。他们是少量含有T细胞受体和自然杀伤细胞受体表达的效应T细胞。尤其是，γδT细胞表达的NKRs在MHC依赖的方式介导肿瘤识别。因此，CAR-γδT细胞可通过NKRs和CARs持续介导固有的和适配的抗肿瘤免疫应答。更重要的是，γδT细胞在同种异体的造血干细胞移植中不会引起GVHD。而且，与CAR-T细胞相比，CAR-γδT细胞显著减少细胞因子的生成，显示出更好的有效性。目前，由于NK细胞的广泛来源和不会引发GVHD，CAR-NK细胞疗法已被认为是有前景的采用性细胞疗法，在临床前被开发用于治疗R/R MM。3.2 搭桥疗法为了预防在生产期间疾病急速恶化，减少基准肿瘤负荷，在CAR-T细胞疗法前的搭桥疗法很关键。搭桥疗法通常根据每位患者治疗前和疾病特点进行个性化治疗。一般来说，搭桥疗法考虑先前有效治疗药物联用，如地塞米松、达雷木单抗、卡非佐米、硼替佐米和泊马度胺。搭桥疗法选项有多种，如化学疗法、靶向治疗、自身造血干细胞移植（auto-HSCT）和局部放射治疗、还有局部冷冻疗法。使用BCMA靶向药物可能引起BCMA表达减少，然后影响抗BCMA CAR-T细胞疗法的有效性，一般在搭桥疗法中排除他们。Auto-HSCT是适合移植MM患者的标准疗法，可在CAR-T细胞疗法前作为一种有效的搭桥疗法。一项最新的研究证实相对于单独的CAR-T细胞疗法，auto-HSCT联合CAR-T细胞疗法获得较高的ORR、PFS和OS，说明搭桥auto-HSCT可促进持久的和深度的缓解。另一项临床试验已比较auto-HSCT联合CAR-T细胞疗法和单独auto-HSCT的有效性，结果显示联合疗法组的CR率较高、有3年PFS，而auto-HSCT组较低的3年释放率以上研究指明auto-HSCT联合CAR-T细胞疗法在缓解方面有协同作用。另外，局部放射疗法和冷冻疗法是对R/R MM患者来说有效的搭桥疗法。局部放射疗法和冷冻疗法联合抗BCMA CAR-T细胞疗法可能会产生协同的抗肿瘤效果。另一方面，放射疗法和冷冻疗法可直接杀死肿瘤细胞，另一方面，他们可以使CAR-T细胞敏感，通过远位效应激活内源性效应T细胞，这可能与上调肿瘤内趋化因子和细胞因子有关，并释放新抗原尤其是，放射疗法也可以通过免疫原性的细胞死亡激活CAR-T细胞。3.3 应用快速的CAR-T细胞生产平台快速的CAR-T细胞生产也可以缩短患者招募到CAR-T细胞输注期间的间隔。令人振奋人心的是，有报道，第二天生产并含近7天的质量控制测试的FasT Car-T细胞在B细胞急性的淋巴母细胞白血病临床前和临床研究有良好的有效性。因其显著缩短了生产时间，他们更适合疾病进展的患者，可以减少患者的临床住院日，最终改善CAR-T细胞治疗的可行性。另外，因其在体外试验中短时间培养，FasT CAR-T细胞相对于传统CAR-T细胞有着较少的衰竭表型和更强的杀伤活性。在2022 ASH年会中宣布一项BCMA/CD19双靶点FasT CAR-T细胞(GC012F)在NDMM患者中的1期临床试验s(NCT04935580)，这些FasT CAR-T细胞准备需要22~26小时。另外，在2022 ASH年会中也提到另一个正在进行的关于BCMA Nex T CAR-T细胞疗法BMS-986354在R/R MM患者的研究(NCT04394650)。在这个1期临床试验中，这些CAR-T细胞采用NEX-T工艺生产需要5-6天，有着强大的杀伤活性。然而，这些CAR-T细胞的有效性仍在多个研究中进行确认。3.4 采用非病毒载体转染另外，非病毒载体转染也能减少生产成本，提高CAR-T细胞疗法的可行性。转染CAR基因至T细胞是在CAR-T细胞生产工艺中一项至关重要的步骤。目前，采用病毒载体可频繁获得CAR转染，如伽马逆转录和慢病毒载体。然而，病毒载体的生产通常需要2到3周，需要良好的生产规范（cGMP）级别的厂房设施和培训过的操作人员，这使得CAR-T细胞生产耗费时间和成本。而且，通过病毒载体转导的序列是受限的。因此，正积极开发无病毒的基因修饰方法。现在，包括piggyBac(PB)和Sleeping Beauty(PB)系统的转位子系统已经证明在临床前和临床研究的CAR-T细胞生产中基因转换效率的稳定性。因生产工艺的复杂性降低和货物容量较好，转位子系统减少了生产成本，比病毒转染更适合于多靶点CAR-T细胞生产。而且，转位子系统可用于自动的工艺平台去生产CAR-T细胞临床治疗剂量，这将会促使CAR-T细胞生产的放大，提高R/R患者接受CAR-T细胞疗法的可行性。另外，基于转位子的CAR-T细胞显示出早期记忆T细胞表型。令人振奋人心的是，一项最新研究证实CRISPR-Cas9介导的非病毒特异性靶向CAR-T细胞在R/R 非霍奇金淋巴瘤（NHL）的安全性和有效性，指明CRISPR-Cas9是一个CAR-T细胞生产中精确基因编辑的新工具，促使未来更多特定基因靶向CAR-T细胞的发展。3.5 高风险MM患者在早一线治疗开始CAR-T细胞疗法高风险新诊断的MM（NDMM）患者通常有着较差的标准一线治疗预后，因此对于高风险MM患者非常需要额外治疗选项。CAR-T细胞疗法也许可以提供一个潜在解决方式，作为这些高风险NDMM患者的一线疗法。在2022 ASH年会中发表了一项正在进行的关于NDMM患者BCMA/CD19双靶向FasT CAR-T细胞的多中心研究(NCT04935580)。在这次临床试验中，13名高风险NDMM患者接受BCMA/CD19双靶点FasT CAR-T细胞疗法，100%的患者获得临床应答，69%的患者获得随后中位数是5.3个月的sCR。这些结果揭示了CAR-T细胞疗法在早期治疗的安全性，可能在高风险MM患者中获得较深的应答，最终为高风险MM患者提高可行性。04CAR-T疗法后的抗骨髓瘤疗法目前，抗BCMA CAR-T细胞疗法后尤其是高风险MM患者频繁出现复发。然而，现在对于R/R MM患者在CAR-T细胞疗法中复发后缺少推荐的救援方法。因此，抗BCMA CAR-T细胞疗法难治性的R/R MM患者急切需要开发合适的后续治疗。除了优化的CAR-T疗法和先前化疗方案还有auto-HSCT以外，新型的抗骨髓瘤药物为抗BCMA CAR-T细胞疗法后复发的R/R MM患者提供了额外的救援选择，包括塞利尼索、卡非佐米、泊马度胺、单克隆抗体和T细胞重定向双特异性抗体。而且，几项研究表明经历抗BCMA CAR-T疗法后复发的R/R MM患者也可以在卡非佐米疗法、维奈托克疗法和塞利尼索疗法中获益。另外，T细胞重定向双特异性抗体如Cevostamab和Talquetamab也被证明是在抗BCMA CAR-T细胞疗法后可行的救援治疗，可以引起持久的应答。而且，磷脂药物混合Iopofosine I-131可以在先前抗BCMA疗法中失败的R/R MM患者中获得临床应答。而且，在CAR-T细胞输注后有几项维持/巩固疗法的建议措施，但CAR-T疗法后的维持治疗可能可以为高风险MM患者提供潜在的临床获益。最近研究证实采用来那度胺和泊马度胺的维持疗法可以促使高风险MM患者的CAR-T细胞重复扩张。此外，在1期临床试验，塞利尼索在EMD R/R MM患者接受全人源抗BCMA CAR-T疗法后的有效性和安全性正在测试中(NCT05201118)。结论近年来，抗BCMA CAR-T细胞疗法已在R/R患者获得给人印象深刻的效果，其副作用一般可控，但仍存在几个需要解决的挑战。例如，在抗BCMA CAR-T细胞疗法后继续出现复发，自身CAR-T细胞产品昂贵的生产费用和长时间的生产周期限制了他们的可行性。因此，未来需要改进。目前，正在探索潜在的机制和治疗策略，如新型治疗靶点的鉴别、优化CAR结构和基因修饰方法、双靶向CAR-T细胞疗法的应用和CAR-T细胞疗法与其他方法的联合。然而，由于CAR-T细胞疗法的阻力和反复出现的高风险因素，后续抗骨髓瘤治疗也是一个巨大的临床意义。来源：Zhang, X., Zhang, H., Lan, H., Wu, J., & Xiao, Y. (2023). CAR-T cell therapy in multiple myeloma: Current limitations and potential strategies. Frontiers in Immunology, 14, 1101495.END