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Researchers discover that the phosphorylation of a newly identified protein kinase substrate downstream of the dopamine signaling pathway regulates the brain reward behavior. The nucleus accumbens, part of the basal ganglia in the brain, is composed of neurons controlled by glutamate and dopamine. Dopamine regulates memory and learning, motor functions, and emotional behavior for motivation and reward. Researchers from Japan have now discovered that dopamine increases neuronal excitability via the phosphorylation of a voltage-gated potassium channel subfamily member (KCNQ2), promoting reward behavior in mice. Thus, KCNQ2 is a potential therapeutic target for the treatment of several psychiatric disorders. One part of the basal ganglia, known as the nucleus accumbens (NAc), is composed of medium spiny neurons (MSNs). The MSNs, in which the dopamine D1 receptor (D1R) and dopamine D2 receptor (D2R) express, are controlled by neurotransmitters -- glutamate and dopamine. Dopamine is an organic chemical that regulates memory and learning, motor functions, and emotional behavior for motivation and reward. On increasing the excitability of D1R-MSNs, dopamine promotes glutamate-induced responses, leading to a reward behavior, i.e., feelings of accomplishment and pleasure associated with completion of certain tasks. It is known that the molecular mechanism underlying this reward behavior involves a signaling cascade that increases the "phosphorylation" (the attachment of a phosphate group) of protein kinase A (PKA) substrates. Subsequently, the extracellular signal-regulated kinase (ERK), such as a downstream effector of PKA, modulates the excitability of D1R MSNs and in turn, the reward behavior. Recently, a team of researchers, including Assistant Professor Daisuke Tsuboi and Professor Kozo Kaibuchi of the Fujita Health University, and Dr. Nambu Atsushi and Dr. Hiromi Sano of the National Institute of Physiological Sciences in Japan, identified an ERK phospsho-substrate known as potassium voltage-gated channel subfamily Q member 2 (KCNQ2). Although certain studies have highlighted the role of KCNQ2 channels in MSN excitability, the details of the mechanism are still unclear. Now, Dr. Tsuboi and his team have investigated the mechanism through which ERK regulates KCNQ2 activity and affects dopamine signaling. "Dysfunctional dopamine signaling is implicated in several neuropsychological disorders, including Parkinson's disease, drug addiction, and schizophrenia. Therefore, understanding the underlying pathway is crucial for treating several psychiatric diseases," Dr. Tsuboi remarks while discussing the motivation behind the study, which was published in Volume 40, Issue 10 of Cell Reports on September 6, 2022. The team conducted experiments and mice and observed that the activation of D1R receptors with an agonist inhibited KCNQ-dependent currents and led to increased D1R-MSN firing rates in NAc slices of mice brains. Interestingly, MSN firing was halted on inhibiting ERK, suggesting its involvement in the process. Further analyses confirmed that the direct phosphorylation of KCNQ2 by ERK occurs through the activation of the dopamine signaling pathway in the NAc of mice. Next, the team noted that ERK-mediated phosphorylation of KCNQ2 decreased its channel activity. Moreover, the conditional deletion of the Kcnq2 gene in the D1R-MSNs of mice reduced the inhibitory effect of dopamine on the KCNQ current, enhancing neuronal excitability and reward behavior. These effects were rescued when the Kcnq2 gene was re-introduced, but not when its phospho-deficient mutant gene was introduced. This implies that dopamine signaling negatively regulates the currents via KNCQ phosphorylation. Based on these findings, the team proposed the following mechanism: Dopamine acts on D1R-MSNs to activate the ERK pathway that induces the phosphorylation of KCNQ2. This decreases the channel activity of KCNQ, which increases cell excitability and promotes reward behavior in the presence of glutamate. So, what are the long-term applications of these findings? Dr. Kaibuchi explains, "Mood disorders such as depression show signs associated with dysfunction of the reward system circuits in the brain. Hence, drugs modulating the dopamine-KCNQ2 pathway can be potential therapeutic targets for drug addiction and mood disorders. This study has highlighted KCNQ2 as a potential target for such psychiatric diseases." Here's hoping that these findings improve our understanding of the dopamine signaling pathway and its association with diverse emotional states.

DUBLIN, June 14, 2022 /PRNewswire/ -- The "Middle East Respiratory Syndrome coronavirus S Protein Drugs in Development by Therapy Areas and Indications, Stages, MoA, RoA, Molecule Type and Key Players" report has been added to ResearchAndMarkets.com's offering. Middle East Respiratory Syndrome coronavirus S Protein (Spike Protein) Drugs in Development by Therapy Areas and Indications, Stages, MoA, RoA, Molecule Type and Key Players report provides in depth analysis on Middle East Respiratory Syndrome coronavirus S Protein (Spike Protein) targeted pipeline therapeutics. The report provides comprehensive information complete with Analysis by Indications, Stage of Development, Mechanism of Action (MoA), Route of Administration (RoA) and Molecule Type. The report also covers the descriptive pharmacological action of the therapeutics, its complete research and development history and latest news and press releases. Additionally, the report analyses the pipeline products across relevant therapy areas under development and provides an overview of key players involved in Middle East Respiratory Syndrome coronavirus S Protein (Spike Protein) targeted therapeutics development and features dormant and discontinued projects. The report helps in identifying and tracking emerging players in the market and their portfolios, enhances decision making capabilities and helps to create effective counter strategies to gain competitive advantage. Scope The report provides a snapshot of the Global therapeutic landscape for Middle East Respiratory Syndrome coronavirus S Protein (Spike Protein) The report reviews Middle East Respiratory Syndrome coronavirus S Protein (Spike Protein) targeted therapeutics under development by companies and universities/research institutes based on information derived from company and industry-specific sources The report covers pipeline products based on various stages of development ranging from pre-registration till discovery and undisclosed stages The report features descriptive drug profiles for the pipeline products which includes, Product Description, Descriptive Mechanism of Action (MoA), Research and Development (R&D) brief, Licensing and Collaboration details & Other Developmental Activities The report reviews key players involved in Middle East Respiratory Syndrome coronavirus S Protein (Spike Protein) targeted therapeutics and enlists all their major and minor projects The report assesses Middle East Respiratory Syndrome coronavirus S Protein (Spike Protein) targeted therapeutics based on Mechanism of Action (MoA), Route of Administration (RoA) and Molecule Type The report summarizes all the dormant and discontinued pipeline projects The report reviews latest news and deals related to Middle East Respiratory Syndrome coronavirus S Protein (Spike Protein) targeted therapeutics Key Topics Covered: Introduction Report Coverage Target - Overview Target - Therapeutics Development Products under Development by Stage of Development Products under Development by Therapy Area Products under Development by Indication Products under Development by Companies Products under Development by Universities/Institutes Target - Therapeutics Assessment Assessment by Mechanism of Action Assessment by Route of Administration Assessment by Molecule Type Target - Companies Involved in Therapeutics Development Target - Dormant Products Target - Discontinued Products Target - Product Development Milestones Featured News & Press Releases Appendix For more information about this report visit Media Contact: Research and Markets Laura Wood, Senior Manager [email protected] For E.S.T Office Hours Call +1-917-300-0470 For U.S./CAN Toll Free Call +1-800-526-8630 For GMT Office Hours Call +353-1-416-8900 U.S. Fax: 646-607-1904 Fax (outside U.S.): +353-1-481-1716 SOURCE Research and Markets

摘要：核酸疫苗是一种免疫方法，旨在引起类似于减毒活疫苗的免疫应答。在这种方法中，DNA或信使RNA（mRNA）序列被递送到体内生成蛋白质，模拟疾病抗原刺激免疫应答。核酸疫苗的优势包括刺激细胞介导的免疫和体液免疫、易于设计、快速适应不断变化的致病株，以及可定制的多抗原疫苗。为了对抗SARS-CoV-2大流行和许多其他疾病，核酸疫苗似乎是一种很有前景的方法。然而，需要帮助递送脆弱的DNA/mRNA有效载荷。已经开发了许多递送策略以引起有效的免疫刺激，但FDA尚未批准核酸疫苗用于人体。纳米粒（NPs）由于其独特的性质，包括处方、保护能力、同时装载和递送多种DNA/mRNA疫苗潜力的无限可能性，是介导DNA/mRNA疫苗成功递送的顶级候选物之一。这篇综述将概述用于DNA和mRNA疫苗递送的各种新型NP制剂以及向读者简要介绍NP疫苗的临床试验。最后，将探索NP介导核酸疫苗的未来展望和挑战。1.引言自疫苗概念形成及其在政府规模实施以来，减毒活病毒或基于灭活完整生物体的疫苗已经消灭或几乎消灭了许多曾经的人类大杀手，包括天花、小儿麻痹症、麻疹、腮腺炎、风疹、白喉、百日咳和破伤风。然而，SARS-CoV-2、H1N1等疾病的快速出现以及埃博拉等致命疾病的快速演变对传统疫苗如减毒活病毒疫苗（LAV）和失活/灭活病毒疫苗提出了挑战，这些疫苗通过传统的疫苗开发途径平均需要10年以上才能开发，或埃博拉病毒疫苗需要5年加速开发，甚至需要更多的时间来放大生产和大型国家储备。因此，在疫苗开发、放大和实施过程中，许多人生病并失去生命。备受热议的最新和相关的事件是正在进行的SARS-CoV-2大流行，它被认为是本世纪最关键的全球健康灾难之一。根据世界卫生组织（WHO截至2020年12月6日）的报告，SARS-CoV-2的当前爆发已导致全球200多个国家超过154万人死亡，以及许多国家的全球经济停滞，导致混乱蔓延、大陆封锁和金融不确定性。鉴于未来大流行肯定会再次出现，必须发展现代化的疫苗接种系统，以确保在生命损失最小和经济破坏最小的情况下迅速控制未来的大流行。由于病毒株的抗原漂移，每年传统的季节性疫苗制剂通常不能与流行中的毒株相匹配，特别是当它们发生在流感季节晚期时。研发和分配针对像SARS-CoV-2这样新病毒株的疫苗非常耗时；鉴定病毒、开发、测试、获得监管机构的批准和批量生产至少需要几个月至几年的时间，2009 H1N1大流行以及2014-2016年埃博拉爆发就证明了这一点。很明显，应该出现一种新的疫苗生产模式来解决这一紧迫问题。在过去的几十年里，人们试图通过开发现代疫苗技术来替代灭活疫苗或减毒活疫苗，如病毒样颗粒、基于肽的疫苗以及基于核酸的疫苗。这些新进展旨在改善疫苗的稳定性、安全性和成本。尤其核酸疫苗是生物医学领域最新和成本效益好的进展，引起了人们的极大关注。DNA和mRNA疫苗旨在利用宿主细胞机制生产编码的蛋白抗原，通过产生中和抗体和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）刺激体液和细胞介导的免疫。因此，核酸疫苗可能是有效疫苗的关键，因为其可利用通用的DNA/mRNA生产工艺快速转变，易于进行序列修饰以适应不断变化的致病株，并且能够引起抗体和细胞毒性T淋巴细胞应答。DNA/mRNA疫苗的其他优点包括疫苗中没有活的或灭活的生物体，并且能够特异性地只对疫苗中编码的抗原产生免疫应答。此外，接种核酸疫苗可产生具有翻译后修饰天然构象的内源性蛋白，一如在自然病原体感染中发现的一样。尽管质粒DNA和mRNA疫苗显示出这些巨大的优势，并在临床试验中得到了广泛的评估，但到目前为止，还没有一种被许可用于人类，并且目前的治疗方案似乎无法充分利用这种有前景的治疗策略的全部潜力。这在很大程度上是因为对细胞的有效递送仍不明确。在人体内，核酸是脆弱的，且被内源性核酸酶迅速降解。DNA/mRNA还必须穿过许多细胞屏障才能到达细胞质（对于mRNA疫苗）和细胞核（对于DNA疫苗）。因此，开发的核酸疫苗的免疫原性较低。最后，由于这些原因，DNA和mRNA疫苗的递送尚待通过III期临床试验在人体中进行临床验证。由于病毒载体递送存在增加公共卫生问题的风险，这可能阻碍其被广泛采用，因此越来越多地探索非病毒基因递送方法。纳米粒介导的递送就是这样一种非病毒递送方法，它为核酸的高效递送带来了巨大的希望，并可能代表下一代疫苗的未来。纳米粒具有许多优点，可以促进疫苗的递送；它们可以保护核酸有效载荷不被降解，并且具有多种生物材料选择的通用处方策略，以克服细胞内化的障碍，通过表面修饰提高特异性免疫细胞靶向性，并且可以利用pH敏感的材料来增强内涵体逃逸。NPs提高了疫苗的稳定性以及有效性，并可作为一种稳健的佐剂策略。NPs的另一个主要优势是能够在一个颗粒内构建鸡尾酒疫苗；NPs能够将多种核酸疫苗共递送至相同的靶细胞，这可能激活协同效应，进一步增强免疫。与传统疫苗鸡尾酒疗法相比，这是一个明显的优势，前者不能确保每个细胞接受组合剂量。这篇综述将为读者概述用于在体内高效递送DNA和mRNA疫苗的不同有前景和前沿的NP策略，包括脂质体、聚合物、无机物和肽类。此外，将对当前临床试验进行列举和总结。并将讨论基于NP的DNA和mRNA疫苗的未来开发前景。2.DNA和mRNA在疫苗开发方面展现出许多优势DNA是位于细胞核内的遗传物质，而mRNA是将信息从细胞核DNA运送到细胞质中翻译为功能性蛋白的中间体。它们都参与细胞蛋白质翻译途径。双链DNA代表基因本身，它位于细胞核中；而单链mRNA是基因的转录版本，它与核糖体结合，翻译密码子以产生蛋白质。核酸疫苗有许多优点：它们可以避免与重组蛋白疫苗相关的问题，如蛋白折叠不当或高蛋白纯化成本，还不存在与产生自活的感染性生物体的减毒或灭活疫苗相关的感染风险，并且可激活体液和细胞免疫应答，从而极大增强保护性免疫应答。此外，通过各种化学修饰可以提高mRNA的转染效率和稳定性，从而增强免疫。质粒DNA（pDNA）序列包含启动子区、内含子、抗原序列和polyA 信号。mRNA通常由cDNA模板（如pDNA）与RNA聚合酶体外转录产生。合成的mRNA由编码蛋白的开放阅读框（ORF）和5'帽子及3'poly(A)尾组成。ORF两侧的5′和3′非翻译区（UTRs）可增加翻译和稳定性。可以对DNA和mRNA进行化学修饰以改善转染和稳定性，包括密码子优化、融合前稳定突变和支持形成三聚体的添加剂。此外，对于DNA，启动子选择和质粒骨架修饰（即去除细菌元素）可以在提高基因表达中发挥很大作用。最后，对于mRNA，5'-和3'-UTRs的优化被用来提高翻译效率，并且已证实掺入修饰的核苷如假尿嘧啶核苷（Ψ）和5-甲基胞苷（5 mC）可降低mRNA的免疫识别。自扩增mRNA最近被开发为另一种基于核酸的疫苗技术。自扩增mRNA被称为复制子，来源于RNA病毒，其结构病毒蛋白被替换为编码抗原和RNA聚合酶的mRNA。净效应是mRNA可延长蛋白表达并提高免疫原性，从而增加剂量的有效性。自扩增mRNA编码目标抗原以及用于复制子扩增的RNA依赖性聚合酶。2.1核酸疫苗的作用机制DNA疫苗是在哺乳动物启动子控制下编码目标抗原的简单质粒DNA。对于DNA疫苗，体内给药后（通过肌肉、皮内或皮下注射），DNA必须内化进入细胞核并翻译成蛋白质抗原产物（图1）。mRNA疫苗与DNA疫苗相似，然而mRNA疫苗不必进入细胞核产生抗原蛋白，消除了DNA疫苗中存在的核膜屏障。因此，将mRNA导入细胞质足以使其进行核糖体翻译和抗原生成。由于mRNA不涉及进入细胞核产生蛋白质，因此mRNA疫苗的功能是在不穿过额外核屏障的情况下产生免疫，这增加了每剂的有效性。对于mRNA，抗原蛋白的产生是短暂的，然后mRNA将在细胞中自然降解。经修饰的核苷同样可以使mRNA的免疫原性降低，并提高翻译效率。这些是mRNA的一些主要优点，然而，DNA是一种更稳定的分子，可能提供更耐用的疫苗和更长的有效期。不管怎样，编码抗原的DNA/mRNA基因构建体的生产比灭活病毒或重组蛋白更简单和更快，并避免了处理活病毒/病原体的风险。此外，在这两种情况下，设计的疫苗构建体仅编码关键抗原，并剔除活/减毒病毒中可能存在的其他有害蛋白。图1.详细说明纳米粒疫苗免疫策略一般步骤的图示。pDNA/mRNA包封后，接种核酸-纳米粒疫苗，并由局部细胞或APCs摄取，在那里释放并处置核酸有效载荷以产生抗原，然后进一步处置以递呈MHCI和MHCII。这导致CD8 + 细胞毒性T细胞或CD4 + 辅助性T细胞活化和细胞介导的免疫。B细胞的进一步活化介导了体液免疫。DC：树突状细胞，TCR：T细胞受体。在DNA/mRNA疫苗的机制方面，有人提出i）DNA质粒/mRNA由注射部位的体细胞表达，并通过MHC I类复合物递呈给CD8+细胞，ii）注射部位的抗原递呈细胞（APC）如树突状细胞（DCs）由质粒DNA直接转染，而T细胞抗原递呈通过MHC I类和II类复合物进行，或iii）APCs吞噬DNA/mRNA转染的体细胞以触发交叉致敏并将抗原递呈给CD4+和CD8+ T细胞。DCs在免疫应答中至关重要，因为其从给药部位（例如肌肉组织注射）进入淋巴结，在那里表达共刺激因子，并将装载在MHCI和MHCII分子上的抗原肽片段递呈给初始CD4+和CD8+ T细胞。CD4+ T细胞还有助于细胞毒性CD8+ T细胞和B细胞的活化。活化的B细胞将产生体液免疫应答。DNA/mRNA疫苗直接转染DC将通过MHCI和MHCII以及过共刺激受体同时激活CD8+ T细胞和CD4+ 辅助性T细胞。因此，核酸疫苗可引起细胞介导的和体液免疫。2.2核酸递送的挑战和局限性尽管DNA和mRNA在基因治疗和疫苗开发中显示出良好的潜力，但临床转化受到多种药物递送障碍的限制，包括吞噬作用、酶降解、蛋白质吸收、非特异性免疫以及细胞内化障碍。DNA疫苗自20世纪90年代以来让人们非常激动，但在更大的动物模型中表现不佳阻碍了他们的进展。然而，在过去几十年中，DNA疫苗平台得到了改进，特别是新设计的抗原和表达载体、新型疫苗佐剂的开发、mRNA疫苗的开发以及新的基因递送方法。即使有了这些新的进展，核酸疫苗仍然面临免疫原性差的强烈挑战。裸露DNA的细胞摄取是非常不充分的，已经证实绝大多数注射的DNA停留在细胞外，95-98%的肌内注射质粒DNA滞留在毛细血管间隙。因此，必须使用佐剂来增强这些核酸疫苗的免疫应答。两大类佐剂可分为免疫刺激分子（如Toll样受体配体、细菌毒素、皂苷和细胞因子）以及递送系统（如粒子轰击、高压递送、皮肤贴片、电穿孔和纳米粒）。在这里，我们将重点关注后者，纳米粒作为一种可行且快速开发的递送系统，用于增加核酸疫苗的有效性。为实现成功的DNA和mRNA疫苗开发，安全有效的基因递送系统是最重要的因素之一，可以说是可行的核酸疫苗产品的限速步骤。由于体内递送和转染效率较高，早期尝试使用病毒载体作为基因递送的递送方法，然而，病毒载体的主要问题如宿主的免疫应答、可能激活引起恶性肿瘤的致癌基因以及炎症反应的并发症显著阻碍了其发展 。其他基因递送方法，如电穿孔和显微注射已得到一定的应用，但它们也存在细胞损伤和例如给药疼痛等缺点。另一方面，非病毒载体与病毒载体相比具有安全性提高、致病性降低、插入突变能力降低、大规模制备方便等诸多优点。基因有效载荷从载体中持续释放对于成功的疫苗接种很重要，因为它提高了抗原表达的窗口，同时保护了被包封核酸的功能并减少了接种次数。纳米粒是一个典型的模型和一类非病毒载体，这将是这篇综述的重点。3.纳米粒是递送核酸疫苗的一种有优势的方法由于将裸露的DNA/mRNA注射到体内会导致被核酸内切酶很快降解，因此需要特殊的方法以改善核酸疫苗的递送。载体是使基因能够递送到细胞中、提供降解保护并促进细胞中基因转录的系统。正在使用的两种载体是病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒载体；以及非病毒载体，如由脂质、聚合物和无机分子合成的纳米粒。具有高转染效率的病毒和使用的病毒载体通过病毒复制、组装或感染基因敲除进行构建。另一方面，非病毒载体具有安全性更高、几乎无限制的转基因大小和重复给药能力等优势。由于这些优势，人们的注意力持续地从病毒核酸递送转移到合成载体上来，因为非病毒载体的优势远远超过了病毒递送的固有感知风险。NPs是一种突出且有前景的非病毒载体，用于各种各样的应用场景，最显著的是诊断成像和药物递送。NPs的直径通常小于200 nm，其纳米尺寸有利于细胞内摄取。由于纳米粒和病毒以相同的尺寸规模存在，纳米技术可以对疫苗开发产生强大和新颖的影响。NPs可以包封治疗药物，并能够受控地递送至靶病变细胞，而且NPs包封治疗药物也可以提高治疗药物的溶解度。NPs具有很大的体积与表面积比、可修饰的外壳、可生物降解性、低细胞毒性、有效载荷递送系统的优势特性。用靶向基团功能化NP表面的能力不仅提高了药物疗效，而且同时降低了剂量，以优化治疗药代动力学。此外，为了达到内涵体逃逸释放DNA/mRNA有效载荷的目标，已经设计并研究了对内溶酶体环境敏感的纳米材料。NP的设计还探索了NPs向淋巴结（LNs）的递送，因为LNs中存在大量的B细胞、T细胞、滤泡树突状细胞和被膜下窦巨噬细胞。这可以通过将NP递送至APCs，进而迁移至LNs，也可以通过将大小为10-100 nm的小NPs引流至LNs来实现。最后，可将载有DNA/mRNA组合物的NP鸡尾酒疫苗设计为以预定比例向每个单一靶细胞同时递送疫苗，以产生协同免疫效应。如前所述，将核酸递送到细胞内是很难的，因为核酸对内源性核酸酶敏感，而核酸密集的负电荷阻碍了细胞内化，并且由于细胞质中存在外源性核酸而触发的非特异性干扰素应答也是临床转化的主要障碍。因此，NP核酸递送系统应高效地包封带负电荷的核酸，使其免受内源性酶的降解，并促进细胞摄取和细胞内释放（图2）。如果纳米粒优先靶向APCs或LNs，这将是一项额外的优势。在这里，我们概述了一个事实，即纳米粒提供了一个稳健的核酸递送平台，能够对核酸疫苗进行无止境的定制和快速的临床转化。例如，将阳离子聚合物/脂质掺入带负电荷的核酸复合物中，可保护DNA/mRNA免受核酸内切酶降解以及免疫识别，含有功能化核酸以及其他设计特性如对纳米粒组分进行多价靶向基团修饰的无机NPs可能维持治疗剂量很长时间，并靶向特定的免疫细胞及LNs，提高疫苗有效性。穿膜肽可以与核酸络合以提高递送效力。此外，对DNA和mRNA进行直接修饰可用于提高制剂的有效性。图2.核酸疫苗的挑战以及通过基于NP递送的解决办法。如果静脉注射，必须保护DNA/mRNA疫苗免受许多障碍的影响，从而成功翻译编码的抗原/表位。首先，NPs可以保护核酸不被核酸内切酶降解，并且不被网状内皮系统的常规吞噬清除。其次，裸露的核酸将面临进入带负电荷细胞膜的障碍。NPs可以通过与特定细胞受体相匹配的表面配体递呈靶向细胞，并通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞。在细胞内，NP疫苗必须从内涵体逃逸以递送有效载荷。NPs被设计成对内涵体的酸性pH作出响应，触发内涵体逃逸和细胞内有效载荷释放。一旦进入胞质，DNA疫苗必须进一步转位到细胞核才能被转录。以下章节将简要概述纳米粒用于核酸递送的最新进展，并侧重于新开发的纳米粒平台、临床和非临床试验。克服核酸疫苗递送所需的纳米载体有前景的特征同样将被着重强调。3.1脂质体纳米粒脂质体是微小的人工囊泡，具有至少一个脂质双层。在核酸的脂质体制剂中，自组装成球形或无定形结构最常见，脂质和核酸散布在整个双层中。大多数脂质体基因递送方法采用阳离子脂质促进带负电荷核酸的包封；另一方面，中性脂质可用于提高稳定性和转染效率。用于基因传递的阳离子脂质具有相似的特征：带有正电荷的亲水性头部与带负电荷的核酸结合，而疏水性脂质尾部变成了在它们之间的连接子。转染效率取决于几何形状、每个分子的带电基团数量、脂质锚点和连接键的性质。使用阳离子脂质存在一些问题，因为已证明正电荷产生的细胞毒性。LNPs的最新进展包括淋巴结、抗原提呈细胞的靶向和对不断变化的细胞微环境（肿瘤、内涵体）的货物响应释放。Oberli等人制备了一种脂质纳米粒，递送mRNA疫苗用于癌症免疫治疗。从广义上讲，癌症免疫疗法涉及利用机体免疫系统对抗癌症。NPs可以被改造成对它们的环境（例如实体瘤内或细胞内涵体内的酸性环境）作出响应释放它们的货物。目的是降低靶区域外的毒性，同时增加向目标癌细胞的递送。作者的处方结合了可电离脂质、磷脂、胆固醇、含聚乙二醇（PEG) 的脂质以及用于递送mRNA疫苗的添加剂（图3）。实验人员用脂多糖（LPS，一种强效的TLR4激动剂）替代了优化LNP处方中1%摩尔组成的PEG。此外，用可电离脂质修饰NP，因为其在低pH下带正电荷，有助于与带负电荷的mRNA络合，并将有助于细胞摄取和内涵体逃逸。LNP制剂B-11在Ai14D报告小鼠不同的免疫细胞群（包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和B细胞）中显示转染。此外，编码肿瘤相关自身抗原、TRP2和gp100的mRNA在B16F10肿瘤模型中显示出疗效，并延长了小鼠的总体生存期。在LNP处方中添加LPS增加了LNPs递送的mRNA疫苗的有效性，并将鼓励其他小组未来在各自的脂质体-核酸制剂中进行调整。图3.用于细胞摄取和内涵体逃逸的脂质纳米粒设计。左图：在低pH下，可电离脂质与带负电荷的mRNA络合。这有利于内吞和内涵体逃逸。磷脂为双层提供结构完整性，同时支持mRNA从内涵体逃逸至细胞质。胆固醇有助于稳定LNPs，促进膜融合。脂质锚定的PEG可防止LNP聚集并减少非特异性相互作用。右图：具有多层结构的球形LNPs的低温透射电子显微镜图像。经许可复制。版权所有2017 美国化学学会。由于DCs是CD4+和CD8+ T细胞活化的主要抗原提呈细胞，它们是转染的天然靶点。不幸的是，DCs是出了名的难转染，因此利用靶向其内在受体的纳米粒方法正在开发中。由于甘露糖受体（MR）在DCs表面表达，Voshavar及其同事使用模拟甘露糖的莽草酰化阳离子两亲化合物（头基区域含有6-氨基己酸间隔基团）设计了脂质体DNA疫苗载体，与编码黑色素瘤抗原（MART1）的DNA疫苗络合，称为（pCMV-MART1）。该小组发现，该制剂可通过小鼠体外免疫诱导持久的抗黑色素瘤免疫应答。[68]他们还进行了结构-活性研究，证明甘露糖受体选择性阳离子两亲化合物在疏水尾和模拟甘露糖的莽草酰基和喹啉头基（脂质5和10）之间的间隔臂中含有五个亚甲基单位，对于体外DC-DNA免疫最有用。此外，在B16F10细胞激发的小鼠中，发现pCMV-MART1的脂质复合物和设计的脂质5体外DC转染对有效的抗黑色素瘤免疫应答效率最高。Fan等人探索了使用阳离子脂质辅助纳米粒（CLAN）装载和递送mRNA疫苗。CLAN是由聚（乙二醇）-嵌段-聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（PEG-b-PLGA）和阳离子脂质的共聚物构建的，用于核酸的递送，该处方在前期被证明在运载CRISPR/Cas9质粒中是成功的。研究发现，包封编码抗原的mRNA的CLAN成功地引起了DCs的成熟以及抗原特异性T细胞的活化和增殖，增强淋巴组织中CD11c+ 细胞的成熟和CD8+ T细胞的增殖。在侵袭性E.G7-OVA淋巴瘤模型中，小鼠静脉注射编码卵清蛋白（OVA）的CLAN/mRNA显示出明显的OVA特异性T细胞应答和肿瘤发展减少。如前所述，5′和3′ UTRs的优化可以通过提高蛋白质产量来改善核酸疫苗的性能。Dong及其同事最近开发了5′和3′ UTR的最佳组合，称为NASAR mRNA，其效率是受试内源性UTR的5-10倍。此外，Dong等人先前通过正交阵列设计构建并优化了N1,N3,N5-三（2-氨基乙基）苯基-1,3,5-三甲酰胺脂质衍生（TT3）纳米粒，被证明在体外将编码荧光素酶的mRNA递送效率提高了350倍以上。在最近的一项工作中，他们利用合理设计的NASAR mRNA与TT3 NPs的组合来递送SARS-CoV-2的mRNA疫苗。NASAR mRNA通过严格的全球基因表达生物信息学扫描过程产生，包括分析产生的拷贝/mRNA分子、产生的氨基酸/mRNA分子以及许多其他因素，如内源性/从头UTR选择、核苷酸长度/组成优化、miRNA靶位的去除和有益RNA基序的整合。TT3制备的SARS-CoV-2 NASAR mRNA疫苗诱导的抗S1抗体是MC3（FDA批准的脂质载体）的300倍，此外，肌肉注射诱导的抗原特异性抗体是皮下注射的5倍。研究人员发现了开发核酸递送UTRs的几个关键细节。他们发现，5′ UTR的最佳长度为70nt，并且不应包含TOP基序、二级结构、上游开放阅读框和microRNA结合位点等特定调控元件。结果还表明，在3′ UTR中，R3U等二级结构可增强mRNA表达。NASAR mRNA是mRNA疗法工程潜力的一个例子。也许最令人兴奋的是，Moderna Therapeutics的脂质纳米粒正在SARS-CoV-2病毒的人体临床试验中。刺突（S）蛋白是中和抗体的主要靶点，因为它是SARS-CoV-2病毒的主要表面蛋白，并且蛋白编码的修饰可提高稳定性并增加mRNA疫苗的有效性。该小组此前表明，保留中和敏感表位的融合前稳定蛋白免疫原可有效用作抗呼吸道合胞病毒（RSV）的疫苗策略。该小组还在中央螺旋和七肽重复序列1的顶点发现了2个脯氨酸取代（2P）使中东呼吸综合征（MERS-CoV）、SARS-CoV以及人CoV-HKU1 S蛋白稳定在融合前构象，该2P蛋白可转移至其他β-CoV刺突蛋白，并被整合进入未来的设计如mRNA-1273中。mRNA-1273疫苗编码S-2P抗原，由SARS-CoV-2糖蛋白组成，具有跨膜锚和完整的S1-S2裂解位点。mRNA-1273是一种LNP分散体，由4种脂质（1种专利和3种商业化）制备而成：专利可电离脂质SM-102；胆固醇；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）；和1种单甲氧基聚乙二醇-2,3-二肉豆蔻酰甘油和平均分子量为2000的聚乙二醇（PEG2000-DMG）。Corbett等人表明使用该LNP制剂，1µg mRNA-1273足以在小鼠中诱导强大的假病毒中和活性和CD8 T细胞应答、均衡的Th1/Th2抗体同种型应答以及维持预防病毒复制超过3个月。此外，单剂给药后诱导了保护性免疫。该项研究连同非人灵长类动物以及早期I期临床试验中受试者的免疫原性数据被用在人体临床疗效试验中评估mRNA-1273的给药剂量和方案。今年早些时候，Moderna进行了一项I期、剂量递增、开放标签试验，纳入了45例18-55岁的健康成人，他们间隔28天接受两次疫苗接种。[83]首次接种后，抗体应答随剂量增加而增加（第29天酶联免疫吸附试验抗S-2P抗体几何平均滴度[GMT]）。第二次接种后，滴度增加（第57天GMT分别为299751、782719和1192154）。第二次接种后，通过两种方法在接受评价的所有参与者中检测血清中和活性。mRNA-1273目前正在同时进行II期和III期临床试验。最近，Moderna发布了其初步III期临床试验的数据，该试验已入组超过30000例受试者，表明其SARS-CoV-2疫苗在预防Covid-19方面的有效率为95%。辉瑞/BioNTech也发布了III期试验的数据，表明其疫苗也具有95%的效力，且未引起安全性问题。如果成功，这将是全球mRNA疫苗开发的一个非常快速（< 1年）和前所未有的胜利。自扩增RNA（saRNA）最近也被McKay及其同事使用，他们将编码SARS-CoV-2刺突蛋白的saRNA包封在LNP疫苗中。该研究中使用的LNPs由可电离阳离子脂质（Acuitas专利）/磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-脂质组成。可电离的氨基脂质通过与聚阴离子核酸的静电相互作用促进自组装成包裹saRNA的纳米粒。靶细胞对LNPs进行内吞后，该制剂使saRNA能够逃逸内涵体进行细胞质递送。[84,85]作者观察到小鼠血清中较高且呈剂量依赖性的SARS-CoV-2特异性抗体滴度，因此可以中和假型和野生型病毒。SARS-CoV-2 saRNA LNP疫苗的免疫原性与COVID-19恢复患者自然感染的比较表明，中和与特异性IgG的量成正比，且程度高于COVID-19恢复患者。作者得出结论，强效LNP制剂在诱导其疫苗如此强烈的细胞应答中发挥作用，并在实际上，LNP制剂saRNA显示出比电穿孔pDNA更高的抗体滴度、病毒中和（IC50）和细胞应答。该方法显示出巨大的转化潜力，因为强效的LNP制剂saRNA疫苗适合针头注射，这可能有助于在没有电穿孔的情况下广泛使用。阳离子纳米乳（CNE）利用纳米乳与阳离子脂质结合。通过亲脂性和亲水性表面活性剂（在水相中稳定油内核），纳米乳剂可通过剧烈搅拌、超声和微流控生成颗粒。Brito及其同事使用由阳离子脂质（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）（DOTAP）和MF59（一种成熟的乳剂佐剂）组成的CNE递送自扩增mRNA，其在小鼠、大鼠、兔和非人灵长类动物中对呼吸道合胞病毒（RSV）、人巨细胞病毒（hCMV）和人免疫缺陷病毒（HIV）产生强效免疫应答。这些结果与佐剂亚单位疫苗或病毒复制子颗粒递送水平相当，剂量低于pDNA疫苗所需的剂量。此外，Samsa等人利用saRNA和CNE制备了两种新型委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）候选疫苗。这种工程化的复制缺陷型VEEV疫苗在小鼠中对VEEV气溶胶刺激表现出100%的保护作用。这些研究表明，saRNA平台可能使临床前研究的开发现代化，并为更多的人类临床研究奠定基础。LNPs与DC靶向、脂质聚合物设计、UTR优化、可电离脂质和针对核酸疫苗的自扩增RNA的结合在过去几年中推动了该领域的发展，可能超过任何其他类型的NP。然而，人们担心阳离子LNP组分的潜在毒性以及没有适当修饰的LNPs与内涵体膜的相互作用减少可能会阻碍内涵体逃逸。这对未来的LNP制剂提出了挑战，因为毒性源于膜结构的破坏，这可能引起细胞质空泡化、细胞裂解和坏死。阳离子脂质也会以不良方式影响多个基因的表达。然而，尝试通过减少LNPs中的阳离子电荷来减轻毒性会降低核酸包封率和转染效率。因此，在其持续开发过程中，必须在毒性和疗效之间进行仔细平衡。然而，LNPs代表了NP介导的核酸疫苗递送的最大部分，并在治疗多种疾病中发现了许多临床前用途。LNPs在人体临床试验中的进展也最远，候选药物最多。3.2聚合物纳米粒系统尽管LNPs是迄今为止NP疫苗最流行的载体，聚合物纳米粒代表了一个极佳的制剂选择。最近，人们对聚合物进行了广泛的研究，以用于核酸递送。聚合物纳米粒（PNPs）通常由生物相容和生物可降解的聚合物制备，其中药物被溶解、包裹、封装或粘附在纳米粒基质上。使用生物可降解聚合物纳米粒用于受控的药物递送已显示出显著的治疗潜力。它们具有各不相同的化学和物理特性，可以保护有效载荷不被降解，能够控制基因物质的释放，并且能够进行结构修饰以改变其理化性质以及表现出生物相容性和生物可降解性。用于核酸递送的最丰富的聚合物类型是阳离子聚合物，用于通过带正电荷的聚合物和带负电荷的核酸磷酸基团之间的静电相互作用结合和压缩核酸，形成聚合物-核酸复合物，可保护核酸免受核酸酶降解。此类聚合物中被广泛使用的例子包括聚酰胺树状高分子（PAMAM）和聚乙烯亚胺（PEI）。由于带负电荷的核酸磷酸基团和带正电荷的PEI胺基之间的静电作用，PEI聚合物容易与核酸形成复合物。这样就形成了纳米粒，可以保护核酸并促进其进入细胞。PEI还具有有助于核酸络合的其他显著特征，包括在较宽的pH值范围内具有较高的缓冲能力，并且在低pH值下胺基的质子化比在高pH值下增加。PAMAM树状大分子是亲水性、生物相容、高度支化的阳离子聚合物，具有独特的3D结构，可实现功能化并结合/包埋治疗药物和核酸。PAMAM支链以丙烯酸甲酯和乙二胺为基础，以胺基和羧基末端基团结尾。同样值得一提的是聚酸酐，它是FDA批准的生物相容性聚合物，通过表面侵蚀降解；另外还有含有硫胺键（R2N-SR）的聚砜酰胺，易于在室温下合成，同样被用于以微粒和纳米粒形式递送核酸疫苗。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），一种FDA批准的生物材料，被用于递送CpG以及多柔比星，用于癌症联合免疫治疗。此外，已经证实PLGA–PEG嵌段聚合物与阳离子聚合物PBAE的组合可以展现独特的颗粒内包裹颗粒的形态，并且递送核酸具有高转染效率和长达8天的持续释放。如上所述，高度支化的阳离子聚合物如PAMAM树状高分子已被用于递送核酸。Chahal等人修饰了PAMAM树状高分子并使用微流控制备经修饰的树状高分子NP（MDNP）saRNA疫苗，保护小鼠免受H1N1流感病毒或埃博拉病毒的致死性病毒感染。此外，携带多个复制子的多重疫苗保护小鼠免受致死性弓形虫攻击。作者能够证明，在一系列疾病模型中，MDNP在小鼠中产生多种抗原并诱导保护性免疫应答。此外，值得注意的是，从获得DNA序列到毫克规模、随时可以注射的MDNP疫苗，生产时程仅为7d。多肽病毒、灭活病毒和DNA疫苗的皮内给药表明，微针（MN）递送系统显示出比肌内注射更强的免疫原性。Seok及其同事使用含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物/聚乙烯亚胺（PLGA/PEI）的阳离子复合物纳米粒包被的不锈钢MNs开发了皮内pH1N1 DNA疫苗递送平台。包被的复合物在5 min内溶解在猪皮中，与肌内复合物递送或干包被MN递送的裸pH1N1 DNA疫苗相比，引起了更大的体液免疫应答。这项研究有可能为其他皮内DNA疫苗提供一个平台。然而，作者注意到该制剂的外源性基因表达水平较低，且产生的免疫原性较弱，因此可以使用NP制剂和MN成分进行改进。Dhakal及其同事开发了一种基于聚酸酐纳米粒的灭活鼻内猪流感疫苗（称为KAg+CpG-纳米疫苗），该疫苗可包封失活/灭活可溶性抗原（KAg）和Toll样受体（TLR）-9激动剂（CpG-ODN）。CpG寡聚脱氧核苷酸结合并激活Toll样受体9（TLR9），从而触发先天性免疫应答，支持随后的获得性免疫发展，并增强抗原递呈以及细胞和体液免疫应答。NP疫苗20:80 CPTEG:CPH共聚物通过熔融缩聚反应研发，在猪中，与单独接种KAg相比，KAg+CpG-纳米疫苗的初免和加强免疫显著增强了鼻腔中抗原特异性IgA抗体应答水平、外周血单核细胞（PBMCs）中较高的淋巴细胞增殖反应以及PBMCs和气管支气管淋巴结细胞中抗原诱导的回忆应答期间较高的IFN-γ分泌。病毒性发热、病毒脱落和肺病毒滴度也有所降低。鼻内给药以与自然感染相似的方式递呈抗原，表面积大、血管化程度高、酶和化学降解低于经口途径。这与NP疫苗在更大动物模型中的成功示范相结合，表明NP疫苗治疗领域正在大大改善。许多疫苗需要在极低温冰箱中保存，这对于在没有广泛可用低温储存条件的发展中国家存在的埃博拉等疾病来说，这是一个重大的缺点。此外，由于产生的材料废物和使用的利器盒更少，生物可降解的MNs更有优势。为了追求这两个目标，Yang小组提出了一种新的埃博拉疫苗接种方法，使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚赖氨酸/聚-γ-谷氨酸（PLGA-PLL/γPGA）纳米粒包被的DNA疫苗，通过可溶解在皮肤中的PVA微针（MN）贴片给药（图4）。这种制剂依赖于PLGA-PLL纳米粒的阳离子性质来结合埃博拉DNA（EboDNA）疫苗。该制剂可诱导小鼠免疫应答，并且MN在37 ℃下可稳定储存至少2周。MN贴片递送系统使培训最少的人员能够接种疫苗，而疫苗的稳定性无需冷藏，所有成本均较低。这些研究表明，MN-NP领域的焦点应转移到微针制剂体内转染效率和MN-NP系统的优化上来。图4.A) PLGA-PLL/γPGA-EboDNA的制备工艺示意图。B) 溶解MN贴片制造示意图。C) MN贴片的明场图像，PLGA-PLL-SRB（红色）包裹在MNs中。经许可复制。[114]版权所有2017 Wiley-VCH GmbH。3.2.1天然聚合物天然聚合物，如壳聚糖和海藻酸，是由活生物体细胞产生的聚合物。[115]基于天然聚合物的纳米粒因其生物相容性、生物降解性和低免疫原性等多种特性，适合临床应用。如前所述，传统DNA疫苗在体内本质上不稳定，可能需要多次加强剂量，且免疫原性较低。壳聚糖是一种阳离子多糖和天然生物聚合物，已被用作佐剂和疫苗递送系统。它无毒，具有生物相容性，可以穿透上皮细胞的黏膜表面和紧密的细胞间连接。壳聚糖具有黏膜粘附特性，可增强黏膜表面对疫苗和药物的吸收，这是病原体进入体内的主要途径之一。Zhao等人制备了NDV F基因质粒DNA和C3d6分子佐剂（pVAX I-F(o)-C3d6）包封在N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（N-2-HACC）N,O-羧甲基壳聚糖（CMC）中的纳米粒（N-2-HACC-CMC/pFDNA-C3d6 NPs）。用N-2-HACC-CMC/pFDNA-C3d6 NPs对鸡进行鼻内接种，产生的抗NDV IgG和sIgA抗体比其他组鸡更强，并且可以很好地刺激淋巴细胞增殖，进而触发更高水平的IL-2、IL-4和IFN-γ。这项工作表明，季铵化壳聚糖纳米粒可能是DNA疫苗的高效黏膜免疫载体。透明质酸（HA是一种免疫中性的多糖，自然存在于所有活生物体中。自组装HA纳米粒（HA-NPs）由于其生物相容性和受体结合特性，已被广泛研究用于生物医学和制药应用。基于天然阴离子多糖透明质酸（HA）的NPs已被研究作为递送系统靶向过表达CD44（HA的受体）的肿瘤细胞。至于向巨噬细胞的递送，CD44受体在腹膜巨噬细胞中也过表达，使得HA NPs成为靶向递送疫苗的天然选择。由于DNA/mRNA也带负电荷，因此使用阳离子聚合物如聚（乙烯亚胺）（PEI）对HA进行修饰，以帮助与核酸形成复合物。PEI还可以通过“质子海绵效应”促进内涵体逃逸，以帮助内化到细胞中的有效载荷逃逸。Tran及其同事合成了HA-PEI偶联NPs，用于包封表达IL4和IL10基因的质粒DNA（称为HA-PEI/pDNA）并靶向递送至巨噬细胞，调节其对C57BL/6小鼠J774A.1巨噬细胞和腹膜巨噬细胞的抗炎性M2a和M2c表型的功能极性。HA-PEI/pDNA NPs被证明是自组装并由过表达CD44受体的J774A.1巨噬细胞内化的。HA-PEI/pDNA-IL4和HA-PEI/pDNA-IL10转染的巨噬细胞在巨噬细胞中显示高水平的IL4和IL10基因。C57BL/6小鼠腹腔注射并转染HA-PEI/pDNA-IL4和HA-PEI/pDNA-IL10后，腹膜巨噬细胞内IL4和IL10基因出现上调，腹膜的和血清IL10水平上升，将LPS和IFN-γ刺激的腹膜巨噬细胞转化为M2表型。HA-PEI/pDNA-IL10 NPs腹腔给药也减少了LPS诱导的局部炎症。总的来说，研究表明，用HA-NPs靶向CD-44过表达的巨噬细胞是另一种有前景的基因递送方法。聚合物纳米粒显示出生物相容性、稳定性和化学结构的易于修饰性。聚合物（如PA-MAM树状大分子）能够同时递送多个表达抗原的复制子，赋予多方面的免疫，微针装载聚合物纳米粒子进一步增加稳定性、减少锐器废物、能够由不熟练的医务人员给药，而天然聚合物（如壳聚糖和HA）能够增强黏膜吸收，并分别显示出靶向肿瘤和巨噬细胞的能力。HA-PEI的进一步修饰显示质子海绵效应改变了内涵体的渗透压，导致其破裂和有效载荷逃逸。由于这些巨大的材料优点，由于可定制性和有利的天然特性，聚合物NPs长期以来一直是脂质体递送核酸的主力。聚合物纳米粒核酸递送的挑战包括相对较低的转染效率和潜在的细胞毒性，以及目前对蛋白冠与聚合物载体相互作用的了解有限。此外，必须优化侧链基团以获得有利的电荷密度和定制亲水性/疏水性，因为这些因素会影响复合物-细胞膜相互作用的强度、NP稳定性和核酸的细胞内释放。最后，新一代聚合物纳米粒的制备涉及更复杂的合成工艺，如官能团的保护-去保护和原位聚合，这为扩大规模提出了潜在的问题。3.3无机纳米粒无机纳米粒已被广泛研究用于核酸递送。无机纳米粒通常比聚合物/脂质纳米粒的粒径更小、粒度分布更窄、表面化学适合配体偶联。金纳米粒（AuNPs）是一种非常稳定的无机纳米粒子，它们表现出广泛的电磁特性，引起了人们对其在核酸递送生物医学应用中的关注。AuNPs因其固有的光学性质和易被多种类型配体表面化学修饰而被广泛用于研究和开发。Meka小组使用通过6-氨基己烷巯基间隔区与模拟甘露糖的莽草酸配体（SL）偶联的金纳米粒（AuNPs-SL），通过与DNA疫苗的静电络合用于基于体外DC转染的遗传免疫，进一步发展了莽草酸配体转染DCs的概念。C57BL/6J小鼠皮下给予体外转染AuNPs-SL静电复合物和黑色素瘤抗原（MART1）编码的DNA疫苗（p-CMV-MART1）的DCs，在随后用致死剂量的黑色素瘤激发后，在免疫小鼠中诱导了持久（200天）的抗肿瘤免疫应答。另一类无机NP，介孔二氧化硅纳米粒（MSNs）是生物可降解和化学稳定的具有独特大孔隙率的纳米结构材料。这种多孔性允许膨胀的表面积，可用于NP表面化学修饰和药物包封，并允许许多位点高效携带核酸。An及其同事设计了阳离子二氧化硅纳米粒（SiNP）递送系统，以通过静电相互作用高效地同时装载带负电荷的寡核苷酸佐剂和卵清蛋白（OVA）抗原，从而靶向淋巴结。抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞介导的免疫对于慢性感染性疾病和癌症至关重要。由于T细胞介导的免疫在次级淋巴器官（如LNs）中诱导，最近的此类研究集中在开发靶向LNs的疫苗策略，以及靶向驻留在淋巴组织中的抗原提呈细胞（APC），如DCs。由于病毒可以通过其体内LN引流诱导强大的辅助性T细胞和CTL免疫应答，作者设计了SiNPs来模拟病毒颗粒在LNs的APCs中蓄积。通过SiNPs免疫的小鼠可产生抗原特异性细胞毒性T细胞和体液免疫应答，从而增强抗肿瘤疗效、最小化全身散布并降低疫苗诱导的毒性。在动物肿瘤模型中，该制剂的性能优于可溶性疫苗。最近的研究表明，MSNs表现出固有的免疫佐剂活性，并促进了MSN-核酸疫苗的开发。Song等人报道了一种基于MSN的DNA疫苗的开发，该疫苗使用类似于红毛丹的MSN作为基因载体和佐剂。通过间苯二酚-甲醛（RF）树脂和二氧化硅的共聚开发了红毛丹样MSN，以显示独特的尖刺状纳米形貌，并进一步用阳离子PEI修饰（图5），而PEI此前已被证明具有优越的pDNA递送和对核酸酶降解基因的高效保护作用。作者发现，含有编码卵清蛋白（OVA）pDNA（pDNA-OVA）疫苗的红毛丹样MSN可促进小鼠中抗原特异性IgG的产生和树突状细胞的成熟，并增强CD80和CD86的表达，另外MSNs可促进抗原特异性IgG抗体、细胞因子IFN-γ的生成，并增加CD8+ T细胞的活化。此外，基于MSN的DNA疫苗的免疫应答优于市售转染剂（in vivo-jetPEI）。有证据显示这种AuNPs能与靶向配体偶联并与DNA疫苗络合以进行成功的肿瘤免疫，MSNs显示基于LN蓄积的T细胞和体液免疫应答，而另一项用PEI和RF修饰的MSN研究显示， pDNA递送较市售转染剂有所增强。尽管AuNPs由于其独特的尺寸、形状、结构和光学性质而表现出稳定性、易修饰表面和低毒性，但其核酸递送设计仍存在挑战。例如，研究人员必须充分阐明偶联配体如何影响可能发生的药代动力学、生物分布和副作用，因为阳离子配体显示更高的细胞毒性。在MSNs方面，一个常见的主要问题是颗粒的内涵体包裹，导致细胞质递送效率低和核酸有效载荷性能降低。此外，许多用于核酸递送的无机纳米粒子是概念验证研究，这必然意味着需要对核酸/配体比例进行进一步优化，以及在更大的动物中进行测试、临床试验和改进设计以实现未来的可放大性。总的来说，无机纳米粒是高度稳定的纳米粒，在DNA/mRNA疫苗递送中逐渐得到更多的应用。图5.红毛丹样介孔二氧化硅纳米粒显示出优越的pDNA吸附。A）Ram–MSNs的TEM图B）Ram–MSNs-PEI的TEM图以及C）由DLS测定的相应的粒度分布D）氮吸附等温线。经许可复制。版权所有2019 Wiley-VCH GmbH。3.4基于肽的纳米粒系统肽，除了本身用作疫苗制剂外，已被用于促进核酸疫苗递送。用于核酸递送的肽通过引入赖氨酸和精氨酸残基带正电荷，以静电方式结合带负电荷的核酸形成纳米复合物（可视为纳米粒），而正负比影响复合物的形成。此外，病毒样颗粒（VLP）已被用于递送核酸疫苗。例如，Udhayakumar等展示了使用具有两亲性RALA基序的细胞穿透肽（CPPs）递送mRNA疫苗。RALA是一种两亲性肽（N-WEARLARALARALA RHLARALARALRACEA-C）CPP，在一侧显示带正电的精氨酸残基，而另一侧为中性亮氨酸残基。RALA能够将mRNA压缩成具有酸性pH依赖性从内涵体膜中逃逸能力的纳米复合物。为了说明这一点，基于RALA的mRNA被DCs摄取，内涵体释放mRNA，导致有效的抗原表达。与未修饰的mRNA纳米复合物相比，用假尿嘧啶核苷和5-甲基胞苷修饰的mRNA显示出强效的细胞溶解性T细胞应答和优越的疗效。RALA介导的mRNA疫苗接种也被证明优于具有阳离子脂质DOTAP和融合脂质DOPE的脂质体mRNA制剂。这项研究表明，RALA和其他CPPs是mRNA递送和进一步研究的非常有利的载体。聚（乳酸）（PLA）NPs已被证明可以包封和/或吸附各种抗原和免疫刺激分子，并能被DCs高效摄取。由于PLA-NP表面和mRNA生物分子均带负电荷，阳离子CPP已被用作将mRNA装载到PLA-NPs上的阳离子中间体（图6）。Coolen及其同事开发了mRNA-PLA NP平台，使用三种不同的CPP（称为RALA、LAH4和LAH4-L1）作为阳离子中间体，将mRNA运送到PLA-NPs上。带负电荷的mRNA与阳离子肽（RALA、LAH4或LAH4-L1）络合，形成肽/mRNA复合物。然后，将该复合物吸附到PLA-NPs上，形成PLA-NP/肽/mRNA纳米复合物。LAH4-L1和PLA-NP/LAH4-L1制剂在体外通过吞噬作用和网格蛋白依赖的内吞作用表现出最高的蛋白表达，进一步研究揭示了网格蛋白介导的内吞和吞噬途径是PLA-NPs进入DCs的关键。图6.PLA-NPs与阳离子肽中间体的mRNA装载。mRNA在PLA-NPs上装载策略的示意图。带负电荷的mRNA与阳离子肽（RALA、LAH4或LAH4-L1）络合形成肽/mRNA复合物。复合物吸附在PLA-NPs上，形成PLA-NP/肽/mRNA纳米复合物。经许可复制。版权所有 2019 Elsevier。具有两亲性RALA基序的CPPs已被证明可将mRNA压缩成纳米复合物，其可从内涵体中逃逸并在体内引起T细胞免疫，优于另一种基于脂质体的mRNA制剂。此外，已证明用PLA对CPP进行修饰可形成用于DC递送的阳离子肽/mRNA复合物。因此，CPPs具有多种能力，可单独作用于压缩核酸有效载荷，或与聚合物联用以提高疗效。对CPPs的进一步研究可能涉及对脂质体、聚合物纳米粒和无机纳米粒的进一步修饰，以实现协同作用。病毒样颗粒是病毒结构蛋白，通过重组或无细胞蛋白合成产生，在不存在病毒遗传物质的情况下自组装。这使它们成为非感染性抗原纳米粒，引起了人们的广泛兴趣和开发。VLPs可以装载小分子、蛋白质以及核酸。它们可以进一步被肽、抗体片段或PEG功能化，用于靶向或延长循环时间。Cheng等人开发了一种包封在病毒样颗粒中的非甲基化富含CpG-A基序的G10寡脱氧核苷酸（ODN），称为CMP-001。与CpG-B和CpG-C相比，CpG-A ODN刺激来自pDCs的大量1型IFN，[158]而VLP在这种情况下作为ODN的保护包装，可以防止降解。研究人员表明，在抗Qβ存在的情况下，CMP-001原位接种可诱导局部和远位抗肿瘤免疫应答。事实上，在人乳头瘤病毒阳性（HPV+）肿瘤小鼠模型中，CMP-001可显著增强肿瘤对抗PD-1疗法的响应，并激活浆细胞样树突状细胞（pDC）以及自然杀伤（NK）细胞。CMP-001目前正在进行联合PD-1阻断治疗黑色素瘤、结肠癌、HNSCC和淋巴瘤等多种肿瘤类型的临床试验。由于所有生物系统中均存在天然结构，基于肽的纳米粒是递送核酸疫苗的天然方法。尽管基于肽的NP系统最近对核酸疫苗递送领域产生了重要影响，但在其开发中仅有少数有效的小化合物库可供借鉴。因此，可以通过开发有效的新化合物库和扩大可构建肽递送系统的材料库来进行改进。其次，通常因其强效而使用的富含精氨酸的CPP也显示出肾毒性，研究人员在处方中应用这些化合物时应谨慎。[160]VLPs面临稳定性和吞噬细胞介导的清除问题。由于这些是最近开发的平台，关于优化、化学修饰、可放大性、储存和大型动物/临床试验中测试的挑战也适用于基于肽的NP系统。3.5临床试验每种候选NP疫苗都需要通过一系列临床试验来评估在人体中的安全性、免疫原性和保护效力。下表列举了目前正在进行不同阶段临床试验的NP疫苗疗法（表1）。很明显，许多是基于脂质体的，这代表了完善和改进基于聚合物、无机物和肽的NPs用于临床的巨大机会。此外，只有少数涉及NPs的临床试验是基于核酸的，表明通过上述NP和核酸设计的改进，仍然有很大的机会在临床上填补NP介导的核酸递送的利基。4.观点、挑战和结论DNA和mRNA疫苗为现代化疫苗接种系统提供了许多益处，可以快速适应变化的致病株以及廉价和快速生产能力。由于与用于DNA/mRNA递送的病毒载体相关的限制，非病毒载体，尤其是使用不同的材料（包括脂质、聚合物、无机分子、肽及其组合）具有各种有利递送特性的纳米粒制剂被开发出来。NPs提供了突破性的机会来开发具有所需生物分布、药代动力学、生物利用度和安全性特征的高效靶向疗法，从而提高疫苗的有效性。我们目前正在看到NP递送策略的巨大创造力和独创性，以优化有效载荷保护、内涵体逃逸、APC/LN靶向和转染效率。将核酸靶向递送至DCs大大增强了免疫应答，这只是基于NP递送的另一个方面。自SARS-Cov-2全球大流行以来，针对基于核酸的疫苗的探索和开发出现了爆炸性增长，以满足对可以快速转变的合适和有效疫苗的需求。随着基于核酸的疫苗设计和修饰技术的进步，已经开发了多种纳米粒，并在临床前和临床研究中用作核酸疫苗的载体。到目前为止，一些开发的纳米粒制剂已在动物实验和临床研究的早期阶段证明了核酸疫苗递送的有效性。然而，仍然存在需要解决的挑战。首先，需要进一步研究NP介导的递送过程的详细机制，以促进内涵体逃逸（用于mRNA疫苗）和核转运（用于DNA疫苗），从而提高转染效率。重要的是要注意，在疫苗开发过程中，转染效率不是我们需要考虑的唯一参数。理解转染细胞有效促进保护性免疫应答的生物学过程对于开发和设计新一代核酸疫苗至关重要。另一个挑战是实现单一或不同核酸疫苗组合的体内靶向递送至相同的目标免疫细胞。多种配体已被修饰到NP表面使NP疫苗具有靶向能力，已显示出增强免疫效果的潜力。尽管在动物实验中观察到有效免疫，但可能不适用于人类。由于人和动物模型之间免疫系统的差异，需要对NP处方、核酸剂量和给药途径进行综合评价，以确定人体试验中预期免疫应答的最佳参数。人们已经使用脂质体、聚合物、无机和基于肽的纳米粒子进行新的研究，它们有各种各样不同的形态、大小和修饰，都旨在提高核酸递送的有效性，但缺乏全面的研究来比较所有不同的递送平台，而这可能为设计最佳的NP介导的核酸疫苗以及预测体内免疫应答提供有价值的指导。最后，优化NP制剂的安全性特征同时保持其疫苗有效性也至关重要。由于SARS-CoV-2大流行导致的许多疫苗的政府层面快速跟进，包括走向III期临床试验的基于NP的mRNA疫苗，显著加速了核酸疫苗NPs的合理设计和临床试验。如果这种趋势持续下去，则可能很快出现第一代NP核酸疫苗。基于之前在临床开发过程中的成功经验和对NP介导的核酸疫苗诱导的免疫应答的更好理解，对DNA/mRNA有效载荷和NP处方设计的进一步改进将产生更快可用的疫苗，在针对传染病和癌症的响应中可能仅需要数月的时间来开发。尽管COVID-19大流行在全球范围内造成了巨大的损害和生命损失，但它唤醒了世界设计疫苗新技术和概念。通过解决上述挑战，我们相信未来将发掘NP-介导的核酸疫苗的全部潜力。原文来源：Next-Generation Vaccines: Nanoparticle-Mediated DNA and mRNA Delivery识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。