Protein kinase G (PKG) family

摘要:高浓度蛋白质冻干药物产品具有适合ADC及其他稳定性敏感分子的产品稳定性优势，能够加快首次人体临床试验的速度（缩短开发时间），以及允许低体积高剂量的蛋白质治疗药物的皮下给药。成功开发出在药学和经济上可行的高蛋白质浓度冻干药物产品，需要对高蛋白质浓度对关键质量属性和冻干过程的影响有深入的理解，以及实施配方和工艺开发的综合方法。在本章中，我们讨论了与高蛋白质浓度冻干药物产品开发相关的科学基础和独特挑战。还提供了成功开发高蛋白质浓度冻干药物产品的实际指导，以及一种可能的稳定性策略，用于开发可在室温下储存的冻干蛋白质药物产品。 1.引言 自1986年美国食品药品监督管理局（FDA）批准首个治疗性单克隆抗体（mAb）muromonab-CD3（Orthoclone OKT3）以来，单克隆抗体治疗药物已成为过去几十年中多种疾病的主要治疗方式。技术进步极大地加速了单克隆抗体治疗药物的发现和开发。如今，单克隆抗体治疗药物越来越多地应用于肿瘤学、免疫学和血液学等多个疾病领域。许多单克隆抗体治疗药物，如Humira、Dupixent和Keytruda，具有多种疾病适应症。目前，Humira是全球最畅销的药物，通过皮下（SC）注射给药，用于治疗类风湿关节炎和其他TNFα介导的慢性衰弱性疾病。皮下注射具有允许患者在家中自我给药以及在临床环境中由医疗保健提供者使用各种药物输送系统给药的优势。皮下注射还可以显著缩短剂量准备和给药时间，并降低设施成本。 然而，皮下注射传统上每次注射量通常限制在1-2毫升。对于需要高剂量生物制剂（>200毫克）的皮下给药，通常需要高浓度配方。高浓度配方通常含有≥100毫克/毫升的蛋白质，并通过辅料稳定的配方缓冲液来实现。除了高粘度外，高蛋白质浓度还可能导致蛋白质稳定性降低，原因是蛋白质-蛋白质和蛋白质-辅料之间的分子间相互作用增加。在低浓度蛋白质配方中通常被严格控制在极低水平的杂质（如宿主细胞蛋白）可能会在生产过程中与蛋白质共同浓缩，从而影响药物产品的稳定性和安全性。 与液体配方相比，冻干配方通常具有更好的稳定性、便于储存和运输以及更短的开发时间。对于高浓度配方而言，开发稳定的液体配方往往更具挑战性，这一点尤为明显。冻干配方还提供了更大的剂量灵活性。通过调整复溶体积，一种冻干药物产品可以复溶成不同浓度，以满足静脉注射（IV）和皮下注射（SC）的需求。由于这些优势，冻干蛋白质药物产品特别适合于早期临床开发阶段，此时快速进入人体试验（FIH）通常是优先考虑的事项，而用于配方开发的时间和资源有限。如果开发稳定的高蛋白质浓度液体配方不可行，冻干高浓度蛋白质药物产品也可能是商业药物产品开发的一种可行策略。值得一提的是，冻干蛋白质药物产品有可能被开发成室温稳定的药物产品，以便于储存和运输。开发室温稳定的冻干蛋白质药物产品可以使药物在冷链不可用的偏远地区也能使用。 尽管具有这些优势，但在开发高浓度冻干蛋白质药物产品的过程中，可能会遇到一些潜在的挑战，如次优的干燥过程、有限的长期储存和复溶时间慢，这些因素可能会影响液体配方与冻干配方之间的选择。在药物开发的早期使用冻干药物产品，特别是用于首次人体临床试验（例如安全性评估、I期），一个显著的优势是为优化最终配方（即液体或冻干）以满足商业需求提供足够的时间和资源。 本章讨论了高蛋白质浓度药物产品冻干的科学基础以及相关的关键问题。具体而言，讨论了冻干的相互关联过程、相关的变性压力以及更重要的，对冻干蛋白质配方的影响。此外，还提出了成功开发高浓度抗体冻干配方的指导方针。 2.高蛋白质浓度冻干药物产品的特点 蛋白质浓度的增加可能会对冻干蛋白质药物产品的关键质量属性（例如物理外观、饼状结构、粘度、渗透压、复溶时间）和冻干过程（例如初级干燥时间）产生广泛影响。在本节中，我们将讨论高蛋白质浓度冻干药物产品的关键特点。 2.1.物理外观和饼状结构 高蛋白浓度冻干药物产品通常呈现出从灰白色到淡黄色的颜色，这种颜色通常由配方药物物质引起，并随着蛋白质浓度的增加而加深。复溶后，药物产品通常显得乳白。蛋白质配方的乳白通常是由蛋白质分子的瑞利散射引起的，通常被认为是蛋白质药物产品的不良特性。乳白与制药优雅的普遍观念不一致，也容易与由蛋白质聚集和颗粒形成引起的浑浊混淆，引起对药物产品质量的担忧。此外，开发与乳白药物产品外观相匹配的安慰剂产品通常更加困难。研究表明，高蛋白浓度配方中的乳白通常与蛋白质分子的可逆自结合和瞬时蛋白质网络的形成相关。通过改变配方条件（例如pH值和盐浓度）来减轻蛋白质可逆自结合已被证明能够减少高蛋白浓度配方中的乳白。 蛋白质浓度还会影响蛋糕结构。如图1所示，随着蛋白质浓度的增加，冻干蛋白质药物产品的蛋糕变得更加密实且孔隙更少。尽管这种特性使得对于高蛋白浓度药物产品来说更容易获得坚固的蛋糕，但它也使得高蛋白浓度冻干药物产品的复溶更加困难。 图 1 单克隆抗体的冻干程度与上样浓度的函数关系。左上面板：从左到右的加载浓度分别为 40 、 60 、 80 、 100 和 110 mg/mL，同时保持相同的 MAb 和赋形剂总质量。左下面板：扫描冻干固体的电子显微镜检查，用于 40 和 110 mg/mLMAb 负载浓度 2.2.长时间复溶 高蛋白浓度的冻干药品通常表现出较长的复溶时间，从几分钟到数小时不等。如图2所示，复溶时间通常与蛋白浓度呈正相关。从剂量准备和给药的角度来看，长时间复溶是极其不理想的，并且会显著限制冻干药品的实际使用。长时间复溶还可能增加在给药前复溶不完全的可能性，尤其是在患者自行给药的情况下，这可能导致给药溶液中存在未溶解的蛋白颗粒，增加免疫反应的风险，从而影响冻干药品的安全性和有效性。 图 2 蛋白质浓度范围为 40 至 210 mg/m 的冻干单克隆抗体制剂的重构时间 高蛋白浓度冻干药品的长时间复溶通常可归因于其不理想的饼状特性，如润湿性差、吸水倾向低、崩解性差和孔隙率低；最近一项研究表明，高蛋白浓度冻干药品的长时间复溶还可能源于饼状溶解表面的高局部粘度。Kulkarni等人表明，对于>50 mg/mL蛋白的无定形配方，复溶时间主要与“浓缩配方粘度”相关（此处定义为用复溶液体1/3体积复溶后得到的溶液的粘度），而不是饼状特性。然而，复溶时间与完全复溶溶液的粘度相关性较差。作者提出，“浓缩配方粘度”与复溶时间之间的相关性更好，是因为“浓缩配方粘度”更能反映对侵蚀速率、润湿和饼状核心水化有重大影响的饼状溶解表面的粘度。作者还建议，可以使用降低粘度的辅料，如盐酸精氨酸和氯化钠，通过降低“浓缩配方粘度”来缩短复溶时间。考虑到粘度与蛋白浓度之间的关系，有理由相信高蛋白浓度冻干药品的长时间复溶可能源于溶解表面的高局部粘度。据报道，高蛋白浓度还可能通过影响冻干饼的结晶度来影响复溶时间。在研究一种含有Fc融合蛋白、蔗糖、甘露醇和聚山梨酯20的配方时，Cao等人揭示了高蛋白浓度可通过抑制甘露醇的结晶，从而降低冻干饼的结晶度，进而延长复溶时间。作者还表明，在100 mg/mL蛋白浓度下，更高的甘露醇与蔗糖比例可导致结晶度更高的冻干饼和更短的复溶时间。这项研究的另一个有趣发现是，在30–150 mg/mL的蛋白浓度范围内，冻干饼的比表面积保持在约1 m²/g，表明比表面积在这种情况下可能并非复溶时间的关键因素。 2.3.高粘度 蛋白浓度与粘度之间的关系已得到广泛研究。当蛋白浓度相对较低时，蛋白配方的粘度通常会随着蛋白浓度的增加而适度增加。然而，对于高浓度蛋白配方，粘度与蛋白浓度之间通常呈现出近似的指数关系。研究表明，高蛋白浓度下粘度的显著增加通常是由于蛋白分子的可逆自聚集以及瞬时蛋白网络的形成。在将冻干产品复溶为较小体积以实现更高蛋白浓度（这是使用冻干药品的常见策略）的情况下，根据复溶后的蛋白浓度和蛋白本身（即可逆自聚集的倾向以及瞬时蛋白网络的形成），复溶溶液的粘度可能显著高于冻干前的液体配方。由于高蛋白浓度冻干药品通常用于皮下给药，复溶溶液的粘度需要控制在给药装置可接受的范围内，通常低于20–30 cp，以用于自动注射器。可以在配方中加入粘度降低剂，如盐酸精氨酸和氯化钠，以减轻复溶后的粘度。 2.4.更长的一次干燥时间 高蛋白浓度配方的总溶质重量通常超过配方总重量的10%。高溶质含量会导致一次干燥过程中阻力更大（或水蒸气通过干燥层的通量更低），因此一次干燥时间更长，使得冻干过程更加耗时且成本更高。为了避免饼状坍塌，一次干燥通常在最大冻浓缩溶液的玻璃化转变温度（Tg’）或坍塌温度（Tc）以下2–3 °C的温度下进行。如图3所示，Tg’和Tc随着蛋白浓度的增加而增加。在较低蛋白浓度下，Tg’和Tc通常在1–2 °C范围内，可以互换使用。然而，在较高蛋白浓度下，Tc可能显著高于Tg’。据报道，对于高蛋白浓度的无定形配方，在Tg’以上但低于Tc的温度下进行一次干燥可以显著缩短一次干燥时间，但仍能产生药学上可接受的冻干饼。然而，当蛋白浓度相对较低时，同样的一次干燥策略可能会导致冻干饼坍塌。在Tg’以下进行一次干燥的另一个原因是避免蛋白展开，因为蛋白在Tg’以上的温度下热力学不稳定。作者等人的研究表明，即使在远高于Tg’的产品温度下，如果配方具有高粘度，蛋白展开可能仍然太慢，无法在冻干的时间尺度上发生。高蛋白浓度配方通常具有高粘度，因此在冻干过程中对蛋白展开的动力学阻力更大。高蛋白浓度配方的这一特性便于在一次干燥过程中以相对较高的搁板温度进行操作，以减少冻干过程的时间和成本。 图 3 最大冷冻浓缩溶液的玻璃化转变温度和 Tc 与蛋白质浓度的关系。mAb A 的值用三角形表示，mAb B 用圆圈表示，mAb C 用正方形表示，Pro X 用菱形表示。闭合符号：Tg';开路符号：Tc 2.5.渗透压 渗透压是开发高蛋白浓度冻干药品时需要特别考虑的另一个关键质量属性，因为高蛋白浓度配方通常用于皮下给药，要求渗透压为600 mOsm/kg或更低，以尽量减少注射疼痛。大多数蛋白易受到冻干过程和长期储存带来的压力的影响，需要添加稳定辅料以保持其稳定性。由于通常需要一定摩尔比的稳定剂与蛋白才能达到足够的稳定效果，高蛋白浓度配方往往需要更多的稳定辅料，从而使配方呈高渗状态，对患者的舒适性不利。为了尽量降低高蛋白浓度配方的渗透压，通常需要筛选pH值和辅料，以确定在较低摩尔浓度下具有足够稳定效果的稳定辅料。有时，配方科学家在开发配方时可能需要在配方稳定性和渗透压之间进行平衡。 3.高蛋白浓度冻干药品开发中的稳定性考虑 在冻干过程中，可能会出现多种导致蛋白变性的压力，包括冷变性、冻浓缩、冰-水界面、pH变化、相分离和脱水。这些压力可能会直接损害药品在冻干过程和/或长期储存期间的稳定性。在本节中，我们将讨论蛋白在冻干过程中会暴露的主要压力。 3.1.蛋白冷变性 冷变性是指蛋白在低温下自发展开。与热变性相比，冷变性研究较少。根据当前理论，蛋白展开的自由能与温度呈抛物线关系，存在两个展开转变点，其中展开的自由能为零。高于室温的转变点通常被称为热变性点，而另一个通常低于冰点的转变点被称为冷变性点。当温度高于热变性点或低于冷变性点时，蛋白的展开在能量上是有利的。与熵驱动的热变性不同，冷变性是一个焓驱动的过程，主要是由于在温度降低时，非极性基团在水中的溶解度增加，导致蛋白中的疏水相互作用减弱。冷变性可能发生在冻干的冷冻过程中（操作温度为-20 °C至-50 °C），从而损害过程中的稳定性以及长期储存稳定性。以β-乳球蛋白和磷酸甘油酸激酶（PGK）为模型蛋白，作者等人表明，蛋白配方的冷稳定性取决于pH值、蛋白浓度和添加剂，稳定剂（如糖和/或多元醇）的存在可显著增强蛋白的冷稳定性。如图4所示，该研究还观察到在较高蛋白浓度下冷稳定性显著增加，这可能是由于分子间非特异性立体排斥引起的宏观分子拥挤效应。这一结果表明，与低蛋白浓度配方相比，高蛋白浓度配方通常在冷变性方面风险更低。 图 4 通过 DSC 测定的蛋白质浓度对 β-乳球蛋白冷变性温度的影响 在另一项研究中，作者等人研究了低温下蛋白展开速率与系统粘度之间的相关性。结果表明，冻干冷冻步骤中的冻浓缩效应和低温会导致一个高度粘稠的系统，其中冷变性的速率显著降低，因此蛋白冷变性可能不会在远低于冷变性温度的温度下发生。这一结果表明，由于高粘度，高蛋白浓度配方在动力学上可能对冷变性更具抵抗力。 3.2.冻结压力 3.2.1.冻结浓缩 在冷冻干燥的冷冻过程中，蛋白质和其他溶质被排除在冰晶之外，导致溶液中剩余溶质的浓度急剧增加。这种现象通常被称为冻结浓缩。例如，当150 mM NaCl溶液被冷冻到其共晶温度-21°C时，其浓度可以增加24倍，达到3.5 M。冻结浓缩还可能导致蛋白质浓度增加7倍，并将低分子质量碳水化合物的浓度提高到高达80%。任何与溶质浓度相关的性质都可能因冻结浓缩而显著改变，而这种改变可能会导致蛋白质不稳定。例如，由于冻结浓缩导致离子强度急剧增加以及相应的盐浓度增加，可能会导致蛋白质变性和聚集。冻结浓缩还可以增加溶液中杂质的浓度，如活性氧和蛋白酶。Wisniewski等人报告称，由于冻结浓缩，溶液中的氧浓度可以增加1150倍。尽管化学反应速率通常会随着温度的降低而降低，但由于冻结浓缩导致杂质浓度急剧增加，仍然可以加速蛋白质的降解。还有报道称，冻结浓缩中的停留时间对蛋白质稳定性有深远影响，较长的停留时间可能会导致蛋白质聚集显著增加。 3.2.2.冰 - 水界面 在冷冻过程中，随着冰晶的形成，蛋白质暴露于广泛存在于部分冻结状态的冰 - 水界面。蛋白质直接吸附到冰 - 水界面可能会诱导蛋白质展开和聚集。即使没有蛋白质直接吸附到界面，冰 - 水界面诱导的蛋白质变性也可能发生。利用分子动力学模拟，Arsiccio等人证明，冰 - 水界面可以通过增加冰 - 水界面附近水分子的活性来增强界面附近蛋白质的冷变性，这些水分子通过水合蛋白质的非极性基团，从而降低蛋白质展开的自由能障碍。该研究还表明，冰 - 水界面介导的蛋白质冷变性增强可以通过添加抗冻剂（如糖）来缓解。冰 - 水界面的面积取决于冰晶的大小和形态。较大的冰晶通常与较小的冰 - 水界面面积相关。冷冻速率可以直接影响冰晶的大小和形态。在较慢的冷却速率下，可以获得较大的冰晶或较小的冰 - 水界面面积。冰晶的成核温度和冰晶成核后配方的热历史也可以影响冰晶的大小和形态，进而影响冰 - 水界面的面积。在较高温度下进行受控成核已被证明有助于通过促进形成较大冰晶和较小冰 - 水界面面积来降低冰 - 水界面的风险。 3.2.3.pH变化 在冷冻干燥的冷冻过程中，由于缓冲盐的差异结晶，可能会发生显著的pH变化。例如，在冷冻过程中，磷酸氢二钠比磷酸二氢钠更容易结晶，这可能导致pH值降至4.0或更低。磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的差异结晶可能导致最终pH值达到9。由于缓冲盐在冷冻过程中的差异结晶导致的pH剧烈变化，可能会损害过程中的蛋白质稳定性以及在长期储存期间干燥产品的稳定性。对于那些对pH敏感且仅在相对较窄的pH范围内稳定的蛋白质，冷冻过程中pH的变化尤其令人关注。因此，在开发冷冻干燥药物产品时，通常更倾向于选择在冷冻过程中pH变化最小的缓冲盐，如组氨酸、Tris和柠檬酸，而不是那些可能导致pH剧烈变化的缓冲盐，如磷酸氢二钠和磷酸氢二钾。通过优化冷冻过程和配方组成，可以减少冷冻过程中缓冲盐的结晶。有报道称，快速冷冻和缩短退火时间有助于最小化缓冲盐的结晶。在另一项研究中，几种辅料，包括蔗糖、山梨醇、乳糖、海藻糖和葡聚糖，可以减轻或防止磷酸氢二钠的结晶。 3.3.相分离 在冷冻干燥的冷冻过程中，冻结浓缩和低温下溶解度降低可能会使所有溶质在冻结浓缩物中保持单一相变得热力学上不利。因此，配方基质可能会分离成几个不同的相。缓冲盐、填充剂和稳定辅料等配方组分可能会在冷冻过程中结晶并与富含蛋白质的相分离。在冷冻过程中也可能发生液 - 液相分离，这可能导致形成富含蛋白质的相和富含稳定剂的相，以及大量的蛋白质变性液 - 液界面。由于相分离导致的溶液性质（如pH和离子强度）的剧烈变化以及蛋白质与稳定剂的分离，可能会在冷冻干燥过程和长期储存期间损害蛋白质的稳定性。鉴于相分离对冷冻干燥药物产品稳定性的影响显著，因此在冻结浓缩物和干燥状态下检测和控制相分离至关重要。检测晶体相的形成相对较为简单。粉末X射线衍射、偏振光显微镜和振动光谱学等多种技术已被应用于晶体相的检测。然而，检测非晶相的形成通常更具挑战性。差示扫描量热法（DSC）、扫描电子显微镜（SEM）和拉曼成像已被用于检测冻结浓缩物和固态中的非晶相分离。DSC检测到多个玻璃化转变温度通常表明存在多个非晶相。由于蛋白质的热容变化较小（在玻璃化转变期间）以及蛋白质的宽玻璃化转变温度，DSC对富含蛋白质的相通常不太敏感。扫描电子显微镜（SEM）依赖于视觉识别代表非晶相分离的特征。据报道，拉曼成像分析已用于检测几种蛋白质 - 聚合物配方和蛋白质 - 二糖配方中的非晶相分离。 3.4.脱水压力 在水溶液中的蛋白质分子被一层水化壳（或一层水分子单层）覆盖，其重量约为每克蛋白质0.35克。水化壳中的水分子可以与蛋白质表面的极性基团形成氢键，这些氢键对于维持蛋白质的天然结构和构象至关重要。在干燥过程中，蛋白质表面的大部分水化壳被移除，导致稳定氢键的破坏和蛋白质展开。文献中已广泛记录了脱水诱导的蛋白质结构和构象变化。这些变化通常是不可逆的，可能会损害过程中的稳定性以及干燥产品在长期储存期间的稳定性。还有报道称，移除水化壳会导致蛋白质表面电荷的丧失，从而促进蛋白质聚集。如果水对蛋白质的功能至关重要（例如依赖于活性位点中的水进行催化的酶），脱水可能会直接导致蛋白质功能丧失，而不会干扰蛋白质结构。为了在干燥过程中保护蛋白质免受脱水压力的影响，通常会在配方中加入具有功能羟基的稳定剂，如二糖（例如蔗糖和海藻糖）和多元醇（例如山梨醇和甘露醇）。这些辅料可以替代水分子并与蛋白质形成氢键，这对于在固态中维持蛋白质结构至关重要。 4.在冷冻干燥过程和货架寿命储存期间最小化蛋白质降解的稳定性策略 通过添加稳定剂（如糖（例如蔗糖或海藻糖）和氨基酸）以及含有微量表面活性剂的pH缓冲系统，可以提高冷冻干燥药物产品的蛋白质稳定性。 4.1.缓冲盐、表面活性剂和粘度降低剂的选择 为了最小化pH变化，最好选择在冷冻过程中不易结晶的有机缓冲盐，如组氨酸、柠檬酸和Tris。如果由于蛋白质稳定性必须使用磷酸盐缓冲液，则应使用相对较低浓度的磷酸盐缓冲液（例如，≤20 mM），以最小化磷酸氢二钠的结晶，从而减少在冷冻过程中潜在的pH变化。表面活性剂（通常在临界胶束浓度以上）被包含在冷冻干燥的蛋白质配方中，以保护蛋白质免受冷冻过程中冰晶形成的界面应力以及在复溶过程中空气 - 液体界面应力的影响。一般来说，建议使用最少量的表面活性剂，以有效保护蛋白质分子免受冷冻过程中蛋白质 - 冰晶界面应力以及复溶过程中空气 - 液体界面应力的影响。可以将粘度降低剂（如盐酸精氨酸或氯化钠）包含在配方中，以管理高浓度冷冻干燥蛋白质药物产品的粘度。氯化钠倾向于在冷冻干燥过程或货架寿命储存期间部分结晶，这可能会导致蛋白质降解。由于盐酸精氨酸保持非晶态并稳定蛋白质，因此它是粘度降低剂的首选。 4.2.稳定剂的选择 稳定剂可以作为抗冻剂和冻干保护剂，在冷冻干燥过程中保护蛋白质分子免受冷冻和脱水压力的影响。稳定剂还可以保护蛋白质在产品长期货架寿命储存期间免受降解（主要是聚集形成对于冷冻干燥蛋白质药物产品）。在常用的稳定剂中，二糖（如蔗糖或海藻糖）已被证明是有效的冻干保护剂和抗冻剂，并已广泛用于冷冻干燥的蛋白质药物产品。不建议在高浓度冷冻干燥蛋白质配方中使用多糖（如葡聚糖和羟乙基淀粉）和其他聚合物（如聚乙烯吡咯烷酮），因为在冷冻干燥过程中稳定剂和蛋白质之间可能存在相分离。为了在储存期间为蛋白质分子提供足够的稳定效果以防止聚集，需要特定的糖（如蔗糖或海藻糖）与蛋白质的最小摩尔比。在摩尔比为360:1或更高时，蛋白质稳定性得到优化。对于高浓度单克隆抗体配方（例如，150 mg/mL单克隆抗体），蔗糖或海藻糖的浓度应为360 mM或更高（在复溶药物产品中蔗糖或海藻糖的浓度≥12.3% w/v），以实现稳定剂与蛋白质的摩尔比为360:1。一般来说，当配方中含有较高摩尔比的稳定剂与蛋白质时，单克隆抗体更稳定。如图5所示，在不同储存条件（即5°C、25°C和30°C）下研究了150 mg/mL冷冻干燥单克隆抗体（聚集形成率与储存时间平方根的关系）的稳定性。结果表明，随着作为稳定剂的蔗糖浓度增加，蛋白质稳定性得到改善。当150 mg/mL冷冻干燥单克隆抗体配方中含有18%（w/v）的蔗糖时，观察到最佳稳定性，这代表了本研究中评估的最高稳定剂浓度。对于高浓度单克隆抗体配方（例如，150 mg/mL单克隆抗体），含有约9%蔗糖（或海藻糖）的配方是等渗配方，增加蔗糖（或海藻糖）浓度会显著增加配方的渗透压和粘度，而具有过高粘度和渗透压的配方会使制造生产和皮下给药变得困难或不可能。考虑到高浓度蛋白质配方中粘度降低剂（如盐酸精氨酸）对渗透压的贡献，为了实现等渗药物产品，稳定剂的浓度会进一步受到限制。因此，对于旨在皮下给药的高浓度冷冻干燥单克隆抗体配方，通过增加稳定剂浓度来增强蛋白质稳定性显然存在明显的限制。 图 5 150 mg/mL 冻干 mAb 在不同条件下的稳定性（聚集形成速率与储存时间平方根的函数关系）蔗糖作为稳定剂的浓度 4.3.高浓度冻干蛋白药物产品的稳定性策略，适用于室温储存 为了克服仅通过增加稳定剂浓度来提高蛋白稳定性的局限性，需要一种替代策略来提高高浓度冻干单克隆抗体（mAb）的稳定性，同时不会不利地增加产品黏度和渗透压。一般来说，冻干过程旨在从药物产品中去除残留水分，以获得低水分含量的干燥产品，从而实现药物产品的长期储存稳定性。冻干药物产品提供了干燥基质，固定了蛋白分子，防止其降解。然而，也可以加入增塑剂以降低干燥无定形基质中蛋白分子的局部流动性，在某些情况下，增塑剂有助于保持蛋白的天然结构和稳定性。增塑剂包括小分子量的糖醇（如山梨醇和甘油）和其他多元醇，或者是故意保留在冻干蛋白药物产品中的少量水分（水分子）。在冻干蛋白药物产品中使用水分作为稳定剂，不需要在配方中添加额外的辅料，因此不会增加复溶产品的黏度或渗透压。在图 6 中，总结了不同水分含量的 150 mg/mL 冻干 mAb 配方的稳定性。通过聚集形成速率作为储存时间平方根的函数来衡量冻干药物产品的稳定性，结果显示，水分含量最低（约 0% 水分含量或未检出水分含量）的冻干药物产品在 5 °C 至高达 50 °C 的任何储存条件下都没有达到最佳稳定性。对于冷藏（5 °C）和室温储存（25 °C 和/或 30 °C），约 4%（3–5%）的水分含量是最优的。在较高储存温度（50 °C）下，最佳蛋白稳定性的最优水分含量较低（约 2.5%）。这种稳定性策略的优势在于，药物产品中的水分含量不会增加配方黏度或渗透压。因此，通过优化水分含量，可以开发出具有可接受产品黏度和渗透压的等渗稳定高蛋白浓度冻干产品。 图 6 150 mg/mL 冻干 mAb 在不同水分下的稳定性（聚集形成速率与储存时间平方根的函数关系）内容。产品水分含量为 0% 表示水分含量仪无法检测到水分含量 在图 4 中，进一步研究了在约 4% 的最佳水分含量下，高浓度 mAb 冻干药物产品在 24 个月内的不同时间点的稳定性。实验使用 150 mg/mL mAb 等渗配方，在 25 °C 的控制室温条件下进行储存，通过使用凝胶排阻色谱法（SEC）检测主要降解途径（即高分子量聚集物的形成）。与水分含量低于 0.5% 的配方（蓝色曲线）相比，水分含量约为 4% 的配方（红色曲线）在 25 °C 的储存条件下至少在 24 个月内表现出更好的稳定性。冻干蛋白药物产品中相对较高的残留水分含量可以作为无定形蛋白 - 稳定剂基质在“固态”中的有效增塑剂，至少在 24 个月内稳定蛋白，同时在室温下储存（图 7）。 图 7 具有最佳水分含量（~4% H2O，红色）的室温稳定冻干高浓度 mAb 制剂 （150 mg/mL mAb）痕量）和低水分含量（<0.5% H2O，蓝色痕量），一种适用于静脉和皮下给药的等渗制剂 4.4.高浓度冻干蛋白药物产品的共配方 在制药行业，越来越多的人对联合使用生物治疗剂感兴趣，即将针对相同或不同抗原的多种抗体混合在同一药物产品中，特别是在肿瘤学（例如，百时美施贵宝的 Nivolumab + Ipilimumab 共配方用于黑色素瘤）和传染病（例如，Regeneron 的针对埃博拉病毒感染的三重人 IgG1 鸡尾酒共配方）领域。共配方产品的开发技术上具有挑战性，需要将不同的蛋白分子（有时具有非常不同的稳定性特征）配制在同一配方中。蛋白与蛋白之间的不相容性（非天然相互作用）以及异质性聚集物的形成是开发两种或更多蛋白治疗剂共配方用于长期储存的主要障碍。为了将不同的蛋白分子混合在同一溶液中，可能会产生妥协配方，使得每种混合的蛋白分子相对于其独立配方的稳定性较低，尤其是当共配方的蛋白分子对 pH 值、辅料类型和离子强度的偏好非常不同时。因此，开发一种液体共配方对于早期临床开发的时间限制具有挑战性，特别是当需要高浓度蛋白共配方用于皮下（SC）给药时。在这种情况下，考虑到冻干蛋白药物产品具有稳定性高和快速进入临床的优势，冻干共配方可以成为液体配方的可行替代品。一个冻干蛋白共配方的例子是 Durvalumab（抗 PD-L1，Imfinzi®）和 Tremelimumab（抗 CTLA-4）。Durvalumab 和 Tremelimumab 被配制成各自稳定的配方，并以不同的体积比混合，以获得一系列新的液体和冻干共配方，具有不同的蛋白浓度比。与液体共配方相比，冻干共配方显示出显著的稳定性优势，当没有足够的液体共配方稳定性数据（包括长期储存稳定性数据）时，冻干共配方具有更快进入临床的较低风险。 5.最小化复溶时间的配方和工艺策略 在给药前，冻干产品需复溶成溶液。复溶时间是冻干药物产品的一个关键质量属性。对于给定的冻干蛋白药物产品，其复溶时间取决于复溶后的蛋白浓度（图 8）。通常，当冻干药物产品复溶为较高蛋白浓度时，复溶时间会更长。在冻干配方中，随着蛋白浓度从 70 mg/mL 增加到 140 mg/mL，复溶时间从 6 分钟逐渐增加到 16 分钟，正如预期的那样，复溶时间随蛋白浓度增加而增加。 图 8 蛋白质浓度范围为 10 mg/mL 至 100 mg/mL 的冻干样品的复溶时间 5.1.提高饼的润湿性和结晶度 人们认为复溶特性（如复溶时间）与冻干饼的表面积和形态相关。表面积减少可能导致润湿性差，从而延长复溶时间（图 9）。提高润湿性可缩短这些部分结晶饼的复溶时间。在 122 mg/mL 配方中，8% 的结晶度改善了饼的润湿性，从而显著缩短了复溶时间（从 0% 结晶时的 13 分钟缩短到 8% 结晶时的 4 分钟）。在冻干配方中，甘露醇或甘氨酸等填充剂可以在冻干过程中结晶。如表 1 所示，通过 XRPD 显示部分结晶的药物产品配方的复溶时间较短（约 1–5 分钟）。然而，当饼呈无定形时，复溶时间要长得多（约 13–18 分钟）。减少稀释剂体积的复溶方法能够在复溶溶液中实现高蛋白浓度，并且复溶时间较短。数据显示，即使稀释剂体积减半，70 mg/mL 配方的复溶时间也显著缩短（图 10）。减少稀释剂体积的复溶方法实现了最终复溶浓度为 140 mg/mL，且复溶时间较快（约 4 分钟），相比之下，100 mg/mL 配方的复溶时间为 12–14 分钟。与 140 mg/mL 配方的复溶时间（通常在 15 至 28 分钟之间）相比，这种方法实现了 4–7 倍的复溶时间缩短。在真空下进行复溶的程序也有潜力缩短高浓度配方的复溶时间（图 10）。 图 9 重构时间冻干样品（100 毫克/mL 蛋白浓度），其中不同的稀释剂 图 10 重构时间不同的稀释剂体积 5.2.控制成核 据报道，“控制冰晶成核”技术改善了复溶特性，并提出复溶时间的缩短归因于冻干饼中形成了更大的孔隙。在 -5 °C 成核的冻干药物产品比采用传统冻干过程的产品复溶时间更快。值得注意的是，与正常冷冻过程的样品相比，控制成核的样品在复水过程中产生的泡沫要少得多。采用控制成核方法的冻干单克隆抗体药物产品与采用传统冻干冷冻过程的产品相比，复溶时间显著缩短（图 11）。 图 11 重构时间确定为不同的冻结协议和所有 reconstitution 设置配方 6.高蛋白浓度药物产品的冻干周期开发 冻干周期开发在制造用于临床使用和商业化的高浓度冻干蛋白药物产品方面发挥着重要作用，这些产品具有所需的关键质量属性。冻干药物产品的重要质量属性包括可接受的稳定性、不塌陷（或不回熔）的冻干干饼，具有期望的水分含量，以及相对较短的复溶时间，以便于临床使用。冻干过程经过优化，以生产出具有期望质量属性的产品，并且相对较短的冻干周期可最小化制造成本。典型的冻干过程包括冷冻、一次干燥和二次干燥步骤。 6.1.冻结 冻结是冷冻干燥过程的第一步，确保产品溶液处于冻结状态且低于无定形系统的玻璃化转变温度（Tg'）或结晶系统的共晶温度。冻结过程中冷却速率可能会影响过冷度的程度以及冰晶的大小和类型，这可能会对初级和次级干燥速率产生影响。通常，在冷冻干燥机中通过改变冷却速率来操纵过冷度并不现实，因为冷却速率通常限制在每分钟小于2°C，而在如此小的范围内过冷度不太可能发生变化。缓慢冻结还可能会增加易发生相分离系统的蛋白质损伤，并延长蛋白质存在于冰-液界面的浓缩液体状态的时间，在这种状态下生物分子降解反应会加速。通常，每分钟0.5-1°C的冷却速率可以获得合理的过冷度，同时在给定的小瓶内以及从小瓶到小瓶之间形成适度的冰表面积和均匀的冰结构。当配方中使用结晶填充剂（如甘露醇或甘氨酸）来管理复溶时间时，需要进行退火步骤以实现填充剂的有效结晶。退火温度应在无定形相的Tg'和填充剂的Teu之间，以实现高结晶速率和完全结晶。足够的退火时间是完成结晶所必需的。在高于Tg'的玻璃化转变温度的温度下进行退火，有助于冰晶的生长，这降低了产品对水蒸气流动的阻力，从而缩短了初级干燥时间。此外，可以将控制冰晶成核技术应用于冻结步骤，以减少高浓度冷冻干燥蛋白药物产品的复溶时间。 6.2.初级干燥 初级干燥是在冻结步骤之后通过高真空使冰升华的过程，以从药物配方中去除冻结的水分。由于初级干燥通常消耗冷冻干燥循环时间的最大部分，因此优化这一部分过程具有显著的经济影响。优化后的冷冻干燥过程在尽可能高的产品温度下运行，通常比产品塌陷温度（Tc）低几度，以获得外观可接受的干燥产品。Tc通常比蛋白质配方中的Tg'高几度，具体取决于蛋白质和稳定剂的浓度。在典型的蛋白质配方（例如，基于蔗糖或海藻糖的配方）中，随着蛋白质浓度的增加，Tg'也会增加。此外，当蛋白质浓度增加时，Tc和Tg'之间的温差更大，在≥100 mg/mL的蛋白质配方中，Tc可能比相应的Tg'高出15°C以上。因此，高浓度蛋白质配方的Tc通常较高，这使得冷冻干燥过程可以在相对较高的搁板温度下进行初级干燥（例如，搁板温度在0°C或以上），以尽量缩短冷冻干燥过程的总时长。在高搁板温度（例如，>10°C）和快速冰升华速率下进行冷冻干燥时，必须注意不要超出冷冻干燥机的热量和质量传递能力。由于初级干燥中的产品温度相对较高，建议在初级干燥中采用适中的腔室压力（例如100-150毫托），以实现一组玻璃小瓶之间热量传递的最佳均匀性。然而，如果配方中包含大量盐酸精氨酸（例如，≥100 mM）以管理溶液粘度，则需要考虑盐酸精氨酸对产品塌陷温度的负面影响，并相应调整初级干燥条件。对于高浓度蛋白质配方（含有大量无定形稳定剂，如蔗糖或海藻糖），冷冻干燥产品将处于无定形状态，呈现出适度的饼状收缩外观。这种预期的适度饼状收缩通常被视为无定形饼的外观特征，不会对药物产品的关键质量属性产生不利影响，包括蛋白质稳定性、水分含量和复溶时间。可以通过在初级干燥期间以较低的搁板温度冷冻干燥产品，并在次级干燥期间以较慢的升温速率进行操作，从而减轻饼状收缩，但这会导致较长的冷冻干燥周期。然而，为了减轻饼状收缩而过度开发较长的冷冻干燥周期在技术上或经济上都不会带来益处。一般来说，高浓度蛋白质配方（含有较高溶质含量，例如15-20%或以上）会导致在初级干燥过程中饼状物对冰升华的阻力较大，从而在给定的搁板温度和腔室压力组合下，初级干燥时间相对较长。必须有足够的初级干燥时间，以确保完成冰升华且产品不会熔化回流（或饼状物塌陷）。因此，确定初级干燥的终点和初级干燥的持续时间以实现完全的冰升华非常重要。可以通过几种不同的方法检测初级干燥的终点，包括产品小瓶中的热电偶、皮拉尼规和电容规之间测量的腔室压力差，以及气压温度测量（MTM）。在初级干燥结束时，产品温度会上升到搁板温度，冷冻干燥腔中的蒸汽组成从初级干燥期间几乎全部为水蒸气变为主要是空气或氮气。因此，当产品温度接近搁板温度时，可以使用产品温度数据作为初级干燥终点的指示。由于热电偶小瓶由于冻结偏差引起的质量传递效应会比其他小瓶更早完成冰升华，因此通常会增加一个安全裕度，以确保所有小瓶都完成初级干燥。另一种常用的方法是使用皮拉尼压力规和电容压力规之间的压力差，当压力差减小并接近零时，表明初级干燥结束。MTM方法是另一种非常灵敏的方法，用于指示初级干燥的终点。通过将压力上升数据拟合到MTM方程来确定冰的蒸汽压，当冰完全升华时，冰的蒸汽压接近腔室压力，这可以用来确定初级干燥的终点。 6.3.次级干燥 冷冻干燥的最后阶段是次级干燥。在这个阶段，通过从溶质相中解吸来去除冷冻干燥饼中的吸附水。次级干燥的目标是将残余水分含量降低到适合稳定性的水平。为了确保饼状物的完整性，次级干燥的搁板温度应缓慢升高，因为快速升温可能会导致在次级干燥初期，残余水分含量较高且玻璃化转变温度较低的无定形产品发生塌陷。一般来说，对于高浓度蛋白质配方，考虑到其相对较高的玻璃化转变温度，每分钟0.2-0.3°C的适中升温速率是一个安全且合适的操作程序。次级干燥的搁板温度通常高于初级干燥所用的温度，以便在相同的初级干燥腔室压力下，从无定形基质中解吸水分。在较高溶质浓度（包括配方中的高浓度蛋白质和稳定剂，即溶液中固体含量>15%）的情况下，干燥产品具有较小的比表面积，因此更难以去除产品中的吸附水。为了达到冷冻干燥药物产品所需的水分含量，可能需要在相对较高的搁板温度（例如，≥35°C）下进行较长时间的次级干燥（例如，≥6小时），以完成次级干燥。 6.4.冷冻干燥周期放大考虑因素 使用实验室规模的冷冻干燥机开发的冷冻干燥过程需要放大到生产规模的冷冻干燥机，以用于药物生产。实验室和生产冷冻干燥机在搁板温度控制、搁板冷却和加热速率、腔室真空控制以及搁板内和搁板间的温度均匀性方面应具有可比性。此外，还需要考虑生产冷冻干燥机冷凝器容量和冰捕获速率的限制，以确保在初级干燥期间不会过载。当开发用于早期临床试验的冷冻干燥药物产品时，冷冻干燥周期可以相对保守，具有更大的安全裕度，以确保成功放大到生产冷冻干燥机，考虑到快速进入临床和有限的生产批次。保守的冷冻干燥周期在不同生产地点以及不同的生产单元进行药物产品制造时具有优势。然而，对于晚期或商业生产，需要一个优化的稳健冷冻干燥过程，并且必须考虑过程的可放大性以及实验室规模和产品规模单元之间的差异。最重要的冷冻干燥可放大性因素是实验室和商业冷冻干燥机之间的热传递差异、实验室和生产冷冻干燥产品在初级干燥期间对冰升华的干燥饼阻力差异以及过程参数控制的变异性。实验室冷冻干燥机的非典型辐射和边缘效应更为显著，因为商业单元通常具有更好的隔热性能，并安装在受控环境中。应根据实验室和生产规模冷冻干燥机之间的小瓶热传递系数差异调整初级干燥条件（例如，搁板温度设定点和初级干燥时间）。此外，清洁的GMP操作工作环境（即，颗粒物较少）倾向于在冷冻干燥过程的冻结阶段诱导更高的过冷度，特别是对于高蛋白质浓度和高粘度的药物溶液，这会导致形成较小的冰晶和较大的干燥饼对冰升华的阻力，在初级干燥期间需要考虑这一点。在这种情况下，需要延长初级干燥时间，以确保在过程进入次级干燥步骤之前完成冰升华。 7.总结 除了冷冻干燥药物产品的典型优势，包括更好的稳定性（特别是对于抗体偶联药物和其他稳定性敏感分子）、便于储存和运输以及较短的开发时间（适用于早期临床试验）之外，对低体积高剂量皮下给药的蛋白质治疗药物的快速增长需求极大地提高了对高蛋白质浓度冷冻干燥药物产品开发的兴趣。蛋白质浓度的增加可能会对冷冻干燥药物产品的关键质量属性（例如稳定性、粘度、饼状结构、复溶时间）和冷冻干燥过程（例如初级干燥时间）产生直接或间接的影响，因此也会影响药物产品的制造、储存和给药能力。理想的高浓度蛋白质冷冻干燥药物产品将具有以下一种或多种产品质量属性： 适合静脉注射和皮下注射的粘度和渗透压 临床使用时复溶时间短 便于患者在家中使用双室注射器系统（前室为干粉，后室为复溶溶液）等设备进行给药 在2-8°C下长期储存和分发稳定 理想情况下，室温储存和分发稳定 成功开发出药学上和经济上都合适的高蛋白质浓度冷冻干燥药物产品需要对高蛋白质浓度对关键质量属性和冷冻干燥过程的影响有深入的理解，并实施配方和工艺开发的综合方法。在本章中，我们讨论了高蛋白质浓度冷冻干燥药物产品开发的科学依据及其独特的挑战。还提供了成功开发高蛋白质浓度冷冻干燥药物产品的实用指导。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

1 前言 自然杀伤（NK）细胞是起源于淋巴的细胞毒性先天免疫细胞。1973年，人们发现了一种非T非B淋巴细胞亚群可有效杀死被抗体识别的细胞，随后首次被描述为“null”杀伤细胞。两年后，有报道称这种细胞能够杀死各种类型的肿瘤细胞，并创造了术语“自然”杀伤细胞。NK细胞不仅在抗肿瘤反应中发挥作用，而且在抵抗微生物感染方面也发挥作用。 NK细胞表达多种激活和抑制受体，这些受体介导的信号之间的平衡决定了NK细胞激活的结果。NK细胞在没有预先致敏的情况下杀死癌细胞的能力在肿瘤免疫监测中发挥重要作用。以 NK 细胞为基础的肿瘤免疫治疗领域已经到了一个激动人心的关头。虽然这些疗法还没有取得与过继性 T 细胞疗法同样程度的临床成功，但是早期的令人鼓舞的结果使 NK 细胞疗法的开发热情越来越高。 2 NK细胞生物学 NK细胞是第一个被鉴定的先天性淋巴细胞（ILC）亚型，能对病毒感染和/或转化的细胞产生多种效应器功能，主要是细胞杀伤和产生促炎细胞因子。NK细胞和其他ILC家族成员（—1型ILC（ILC1s）、ILC2s和ILC3s）与B细胞和T细胞来源于相同的淋巴祖细胞。NK细胞的细胞毒性活性使它们在功能上与CD8+T细胞最为相似，而ILC1、ILC2和ILC3群体的细胞因子生成模式将这些细胞分别对应CD4+T细胞的TH1、TH2和TH17亚群。 NK细胞的两个最典型的亚群是CD56brightCD16-和CD56dimCD16+群体。CD56bright细胞在外周血中的数量较少（循环中90%的NK细胞是CD56dim），而组织中的NK细胞主要是CD56bright。CD56bright NK细胞是强有力的细胞因子产生者，除非受到促炎性细胞因子如IL-15的刺激，否则细胞毒性较弱。相比之下，CD56dim NK细胞群可介导感染细胞和恶性细胞的连续杀伤，主要通过包含颗粒酶B和穿孔素的预先组装的溶细胞颗粒在免疫突触中的胞吐，最终诱导靶细胞凋亡。 3 NK细胞的抗肿瘤效应机制 NK细胞具有多种功能，可以限制癌细胞的生长和扩散。在TME先天性和适应性免疫细胞产生促炎性趋化因子的指导下，循环NK细胞可被招募到肿瘤发生的部位。CXCR3–CXCR4、CX3CR1和CCR3–CCR5是NK细胞亚群差异表达的主要趋化受体。 进入TME后，NK细胞可以通过“丢失自我”机制杀死癌细胞。许多癌细胞下调MHC I分子的表达，以逃避细胞毒性CD8+T细胞的检测，然而NK细胞能够识别和响应这种缺失的自我表型的细胞，最终导致靶细胞裂解。因此，在T细胞不能识别MHC I下调癌细胞的情况下，NK细胞具有治疗潜力。  ADCC是NK细胞介导的杀伤癌细胞的另一个关键机制。除了直接诱导细胞毒性外，NK细胞还通过产生促炎性细胞因子（包括IFN-γ和TNF）对转化细胞作出反应。 4 NK细胞的免疫检查点抑制 关于ICI的研究主要集中在抗肿瘤T细胞的去抑制，这种治疗模式增强NK细胞的活性也引起了相当大的关注。例如，人源化抗NKG2A单克隆抗体monalizumab目前正在对多种癌症患者进行单药试验，或与其他免疫检查点抑制剂联合应用，临床前数据表明这种药物能显著增强NK细胞和T细胞的细胞毒性。 TIGIT是另一种由NK细胞和T细胞表达的抑制性受体，其配体在人类肿瘤浸润的NK细胞上过表达。在一些小鼠模型中，TIGIT抑制逆转NK细胞衰竭并促进NK细胞依赖性抗肿瘤免疫。已经设计了一些积极的临床试验来测试单独抗TIGIT药物以及与其他免疫检查点抑制剂联合使用的有效性和/或安全性。（如NCT03119428、NCT04150965、NCT04047862、NCT04256421、NCT03563716和NCT04294810） 另外还有LAG-3和TIM-3，来自小鼠NK细胞研究的数据表明LAG-3在介导对肿瘤细胞系的细胞毒性方面起着积极作用；肺腺癌患者NK细胞上TIM-3表达增加预示着不良预后，体外抑制这种NK细胞的TIM-3增强了其细胞毒性和IFNγ的产生。目前，多个临床试验正在对各种癌症患者进行LAG-3和TIM-3抑制剂的试验，（包括NCT01968109、NCT04150965、NCT04140500、NCT03625323、NCT0331142、NCT03066648、NCT03489343、NCT03680508和NCT04139902等）。 其它基于NK细胞的免疫检查点还包括CD96、 Siglec-7/9、CD200R、CD47、CTLA-4、PD-1和B7-H3，将这些检查点结合起来进行协同抗肿瘤反应是未来充分发挥NK细胞杀伤肿瘤作用的方向。 5 过继性NK细胞疗法 异基因外周血NK细胞只是治疗性NK细胞众多潜在来源之一。NK细胞约占外周血淋巴细胞总数的10%，而脐带血（UCB）中的NK细胞占淋巴细胞总数的30%；因此，UCB是治疗效应NK细胞的可靠来源。UCBNK细胞的治疗效果目前正在一些临床试验中进行评估（如NCT01619761和NCT02280525）。 克隆性NK细胞系，如NK-92、KHYG-1和YT细胞，是异基因NK细胞的替代来源，NK-92细胞系已在临床试验中得到广泛测试。然而，这些细胞是非整倍体，因此遗传不稳定，这就要求它们在输注前接受辐照。辐照的NK-92细胞被观察到可以杀死癌症患者的肿瘤细胞。 此外，临床上正在对来自多种来源的干细胞衍生NK细胞产物进行检测，包括来自UCB干细胞或诱导多能干细胞（IPSC）的NK细胞产物。将成年细胞重新编程为多能干细胞，以使其分化为NK细胞并扩展生成最终产物，是基于iPSC的方法的一个独特特征。一项临床试验目前正在招募血液或实体癌患者，以测试这些现成的iPSC衍生NK细胞的安全性。 适应性NK细胞是治疗性NK细胞的另一个新兴来源。适应性NK细胞是一种自然发生的细胞群，在HCMV感染或再激活后在人类中扩增。HCMV UL40衍生肽抗原-HLA-E复合物与NK细胞上NKG2C之间的相互作用，导致NKG2ChiCD57+NK细胞增殖，NKG2ChiCD57+NK细胞下调参与细胞内信号传导的某些蛋白质，包括PLZF、SYK和FcεRIγ。适应性NK细胞具有一些独特的效应器特性，包括增强的ADCC、增强的细胞因子反应和对MDSCs和Treg细胞免疫抑制作用的固有抵抗。目前，三项临床试验正在评估这些适应性NK细胞对各种癌症患者的疗效。 细胞因子诱导记忆样（CIML）NK细胞是异基因细胞治疗的另一种选择，与其他类型的NK细胞产品相比具有独特的优势。CIML-NK细胞在体外通过IL-12、IL-15和IL-18的短暂启动，产生对细胞因子反应增强的NK细胞，并激活持续数周至数月的受体刺激。将这些CIML-NK细胞输注到携带AML异种移植物的小鼠体内可产生强大的抗肿瘤作用并显著延长存活时间。在I期试验中，CIML NK细胞具有良好的安全性，在44%的可评估AML患者（4/9）体内扩增并诱导病情缓解。 6 CAR-NK 嵌合抗原受体（CAR）是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-NK细胞免疫疗法比CAR-T细胞免疫疗法更安全，而且NK细胞的安全性已在一些临床领域得到验证。例如，一些I/II期试验显示，同种异体NK细胞输注耐受性良好，不会引起GVHD和明显的毒性。因此，NK细胞是一种适应性更强的CAR载体，而不仅仅局限于自体细胞。 NK细胞上表达的功能性CAR分子由三部分组成：胞外结构域、跨膜区以及胞内的信号结构域。胞外结构域由一个信号肽和识别抗原的单链抗体片段（scFv）组成，一段铰链区将这个结构连接到跨膜区，它也在细胞内连接到包含激活信号的胞内结构域。成功的CAR设计是通过仔细的设计和功能测试相结合来实现的。 载体骨架和启动子 载体骨架包含表达CAR所需的所有元件，如启动子、polyA信号和转录调控片段。 启动子的选择直接影响到转基因的表达水平。目前，对不同启动子在NK细胞系中的CAR表达和功能的比较只有一次报道，而对原代NK细胞没有比较数据。就这一次单个报告来看，还不能确定CAR-NK细胞的最佳启动子。 目前关于CAR-NK细胞的报道显示，多种启动子被用于驱动CAR的表达，无论是细胞系来源的还是原代NK细胞。在原代CAR-NK和CAR-NK细胞系中，病毒启动子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比组成性活性启动子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。 信号肽 在信号肽中存在着巨大的异质性，这直接转化为不同水平的蛋白质分泌效率。对于CAR-NK和CAR-T细胞，还没有确定最佳信号肽的比较研究。目前，CD8a-SP是原代NK细胞最常用的信号肽序列（16%，71%的研究中未公布）和NK细胞系的免疫球蛋白重链或轻链信号肽（29%）。 单链抗体 单链抗体片段是CAR的肿瘤抗原结合域，该结构域将决定CAR-NK细胞的特异性和功能。 由于单链抗体不是抗体的天然形式，因此重链和轻链的顺序是人工确定的。到目前为止，对于CAR-NK设计，大多数更喜欢VH-VL方向，而不是VL-VH方向。 Fujiwara等人证明重链和轻链的顺序不影响T细胞上抗KDR CAR的表达水平。 此外，细胞可以配备多个单链抗体，从而扩大CAR效应细胞的抗原识别能力。在这里，有多种选择：CARs可以用双元件的载体转导，诱导两个CAR结构的表达；或者将两个单链抗体融合在一个结构中，产生串联单链抗体的“单柄”CAR。虽然这些技术已用于生产CAR-T细胞，但CAR-NK细胞仍未知。 目前大多数临床CAR-T细胞试验都使用了来自小鼠抗体的单链抗体，这增加了抗小鼠IgG细胞宿主抗移植物病的风险，这个问题可以通过人源化或筛选全人抗体避免。然而不幸的是，由于这些CAR受体的嵌合特性，即使是人源化的单链抗体也可能诱导宿主抗独特型免疫反应。幸运的是，在迄今为止数量有限的CAR-NK临床试验中，没有发现与抗CAR免疫反应相关的重大副作用。 连接区 重链和轻链之间的连接区有助于稳定单链抗体的构象，过短会导致多聚体的形成，过长可能导致水解或降低VH和VL结构域之间的关联。对于CAR-NK细胞，五肽GGGGS的多聚体应用最为广泛，通常为3个重复。另一个旨在增强蛋白水解稳定性的连接体是Whitlow“218”连接体：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。 目前，虽然大多数CAR-NK研究没有提供连接细节，但已有的研究报道中，有22项使用了G4S连接，有2项应用了218连接。 铰链区 铰链区是连接单链抗体单位和跨膜结构域的CAR细胞外结构区，它通常维持效应细胞中稳健的CAR表达和活性所需的稳定性。大多数CAR-NK构建使用CD8α或CD28胞外结构域的衍生物或基于IgG的铰链区。 铰链区的类型和长度对CAR的功能活动有重要影响。但是目前大多数信息全来自CAR-T领域，能否直接转化为CAR-NK还有待证明。 在CD28和CD8α铰链区之间的直接比较中，发现CD28更有可能促进CAR分子的二聚化，因此，CD28铰链区的CAR产生的激活刺激更强。虽然这可能是有益的，但也可能导致更严重的副作用。 IgG为基础的铰链区也广泛应用于CAR结构。基于IgG铰链区的一个主要优点是结构的灵活性，该结构通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3结构域组成。铰链区的长度可以调节以适应抗原识别，但研究发现，间隔区越短，细胞因子的产生越高，CAR-T细胞增殖越快，体内持久性和抗肿瘤效果越好。 对于CAR-NK细胞，大多数研究在原代NK细胞（16/35）和CAR-NK细胞系（41/72）中均采用CD8α铰链区。其它使用的铰链区包括CD28、IgG Fc结构域和DAP12。 跨膜结构域  跨膜（TM）结构域连接CAR的胞外结构域和细胞内激活信号结构域，CAR-NK最常用的TM部分来自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。 TM结构域的选择影响了CAR结构在细胞功能上的活化程度。通常在NK细胞上表达的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM会导致更多的CD107a脱颗粒和更高的细胞毒性，因此，TM的具体来源将决定CAR-NK的活性。 TM结构域的一个重要方面是，最佳TM区域应遵循T细胞或NK细胞上跨膜蛋白的蛋白质自然取向（N端到C端顺序）。NKG2D虽然是一种强大的NK细胞激活剂，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜区。 目前，CD8α和CD28修饰的TM在原代CAR-NK细胞中最常见，而CD28是CAR-NK细胞系的首选TM区域。 CAR-NK激活信号 CAR的细胞内激活信号的数量决定了其属于哪一“代”CAR。 第一代CAR-NK细胞与CAR-T细胞一样，只含有CD3ζ信号。第二代和第三代CAR-NK分别携带一个和两个额外的共刺激信号，共刺激分子通常来源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相关受体家族（2B4）。到目前为止，唯一公布的CAR-NK临床试验采用了第二代CAR-NK构建，该构建通过加入IL-15表达和诱导Caspase9增强活性。 目前大多数CAR结构依赖于CD3ζ链信号域，强烈的激活信号对于诱导有效的抗肿瘤反应很重要，但也可能导致效应细胞的快速衰竭。因此，共刺激域的组合可用于校准所需的免疫细胞反应。与基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表现出更快的效应器特征，诱导更高水平的IFN-γ、颗粒酶B、TNF-α。然而，这种强烈的共刺激信号也会导致活化诱导的细胞死亡（AICD）。 相比较，4-1BB-CD3ζ信号优先诱导记忆相关基因和持续的抗肿瘤活性。原因可能是4-1BB结构域改善了CD28结构域引起的T细胞耗竭。 如上图所示，在CAR-NK细胞系和原代CAR-NK细胞的研究中，CD3ζ几乎被普遍用作主要的激活域，其中大约一半携带一个额外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代结构，CD28/4-1BB/CD3ζ的组合是最常用的。 7 NK细胞定向接合器 各种免疫逃避机制限制了NK细胞在体内与肿瘤细胞的结合程度，是实现广泛有效的NK细胞治疗的主要障碍。为了增强肿瘤浸润性NK细胞的自然细胞毒性，许多研究团队已经在开发一些分子，使这些细胞以抗原特异性的方式与肿瘤细胞接触。这些分子通常是由多个抗体（通常为单链抗体）组成的双特异或三特异性接合器，使得一个结构域针对NK细胞激活受体，另一个与特定肿瘤相关抗原结合。例如，一种由两个单链抗体组成的三特异性杀伤接合器（TriKE），一个针对NK细胞上的CD16，另一个针对AML细胞的CD33，通过IL-15结构域连接，该结构域旨在增强NK细胞的存活和增殖。 这种抗CD16、IL-15和抗CD33 TriKE（GTB-3550）增强了NK细胞效应器功能的其他几个重要方面，在临床前研究中观察到了改善迁移能力、增加连续杀伤和缩短首次杀伤时间。 在临床前研究中，其他几种NKCE分子也被证明具有强大的抗肿瘤作用。AFM13靶向淋巴瘤相关抗原CD30和CD16a，后者是NK细胞表达的CD16的跨膜形式。AFM13在AACR 2022中表现惊艳，AFM13+脐血来源NK细胞治疗，完全缓解率达到62%。 8 展望 自然杀伤细胞是一组独特的抗肿瘤效应细胞，具有不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。一些癌症的发生与功能失调的NK细胞有关。因此，修复这种NK细胞可能是抗肿瘤免疫治疗的一个潜在选择。这种修复的一种方法是抑制免疫检查点，即癌细胞通过控制免疫细胞表面的抑制受体进行免疫逃逸。 利用NK细胞与抗体、免疫细胞接合器、CARs和其它检查点抑制剂的组合方法进行试验，这些方法旨在调节抑制检查点和增强抗肿瘤能力。目标是找到一种基于NK细胞的治疗策略，这种策略是安全的，并且具有广泛临床应用所需的确切疗效。 参考文献： 1.Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat RevClin Oncol. 2020 Sep 15. 2. K Cell-Based Immune Checkpoint Inhibition. Front. Immunol., 13February 2020  3. CAR-expressing NK cells for cancer therapy: a new hope. BiosciTrends. 2020 Sep 6. 4. Chimeric antigen receptornatural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. JHematol Oncol. 2021; 14: 73. 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学 | 人人学懂免疫学（语音版）    综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普 | 医药前沿笔记 PROTAC技术 | 抗体药物 | 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术 | 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

摘要：将遗传物质转移到宿主患者体内以获得治疗益处的概念已经有超过半个世纪的历史。然而，直到2017年，随着美国FDA批准首个CAR-T细胞疗法，随后欧盟也批准了这一疗法，这一概念才成为临床现实。自首个产品获批以来，已有更多基因疗法上市，而且处于晚期临床试验阶段的产品数量表明，基因疗法可能成为生物制药行业增长最快的领域之一。对于任何生物制药产品的商业成功来说，能够经济地大规模生产治疗产品以满足市场需求是一个关键因素。迄今为止，制造过程已经能够在必要的规模上生产满足临床研究需求的基因治疗病毒载体。然而，为了满足商业需求，尤其是对于治疗患者群体庞大的疾病的疗法，当前的生物制造过程需要扩大规模和优化。 1.介绍 基因转移至宿主细胞以替代缺失或有缺陷的基因，并且转移的基因表达能够提供治疗益处的概念最早由西奥多·弗里德曼（Theodore Friedmann）提出，第一个临床实验是在1970年进行的。基因治疗最初被设想为一种治疗遗传病的方法。然而，也构想了替代策略来治疗其他具有遗传成分的疾病。当前的基因治疗模型包括：（i）基因替代，传递一个功能性基因以替代一个不起作用的基因；（ii）基因沉默，使一个对细胞有毒的突变基因失活；（iii）基因添加，过度表达一个“外来”或外源基因以影响细胞功能；以及（iv）基因编辑，对患者基因组中的基因进行永久性操作。 在过去50年中，基因治疗经历了过山车般的发展，许多进步之后伴随着挫折。1980年，随着重组DNA的出现，科学家们证明了可以在体外用rDNA转化小鼠骨髓细胞，并将转化后的细胞注射到经过辐射的小鼠体内，产生主导的骨髓群体。同样的技术也被用来转化两名患有遗传性疾病β-地中海贫血患者的骨髓细胞，使用重组人类β-珠蛋白基因。第一个涉及人类患者的试验使用了逆转录病毒介导的腺苷脱氨酶（ADA）基因转移到两名患有严重联合免疫缺陷（SCID）的儿童的T细胞中。总体而言，结果是肯定的，并提供了概念验证，即基因治疗对某些患者是一种安全有效的治疗方法。然而，1999年杰西·格尔辛格（Jesse Gelsinger），一名18岁患有较轻微的氮代谢障碍鸟氨酸转氨甲酰酶（OT）缺乏症的青年，在参加基因治疗试验时因腺病毒载体相关毒性死亡，这表明了与基因转移相关的科学复杂性。在五名患有严重联合免疫缺陷-X1（SCID-X1）的患者体外转染CD34+细胞后发展成白血病，其中一人死亡，进一步引发了担忧，这些细胞被转染了编码γ链细胞因子受体亚单位的小鼠逆转录病毒载体。这项研究包括了20名患者，基因治疗确实为两名患者提供了完全的疾病表型纠正。中国的监管机构在2003年批准了世界上第一个商业化的基因治疗产品Gendicine，用于治疗头颈鳞状细胞癌，这是一种皮肤癌。Gendicine是一种经过工程改造的病毒，携带有制造抗肿瘤蛋白的基因指令。这种产品在中国以外没有获得批准，直到2012年欧洲才批准了第一个基因治疗产品Glybera。Glybera利用一种重组腺相关病毒（AAV），可用于治疗家族性脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD）。然而，由于LPLD是一种罕见疾病，患者数量极少，这种药物无利可图。因此，制造商拒绝更新市场授权，Glybera在2017年退出市场。2017年8月30日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了tisagenlecleucel（Kymriah），这是第一个获得FDA批准的基因治疗产品。Kymriah是一种针对CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞免疫疗法，用于治疗年龄≤25岁的B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者，这些患者对治疗有抗性，处于第二次或更晚的复发状态。Kymriah随后在2018年获得欧盟批准。表14.1提供了截至2022年12月FDA批准的所有基因治疗产品的列表。 转染宿主细胞的三种通用协议（如图14.1所示）：体外、体内和原位。在体外基因转移中，患者的细胞被分离并用治疗基因转染。转染的细胞在被重新输回患者之前进行扩增。这种方法已有效地用于儿童白血病的CAR-T细胞治疗。虽然体外基因治疗对治疗血液疾病有效，但体内基因治疗对治疗脑部、脊髓或肝脏疾病更有效。体内基因治疗直接将基因载体注入宿主，通过循环血液或脑脊液，在全身范围内转染目标细胞。主要使用两种类型的病毒载体：腺病毒（AdV）载体和腺相关病毒（AAV）载体。与体内基因治疗类似，原位基因治疗直接向宿主患者引入载体；然而，主要区别在于载体是被施用于患者的特定器官或区域，而不是静脉注射。 图 14.1 传递治疗基因和转染宿主细胞的方法。 与体内基因治疗相比，这种方法具有几个优点，比如减少潜在的副作用、降低载体剂量的需求，以及因此而降低的成本。任何基因治疗策略成功的关键在于拥有一个能够作为安全且高效基因传递工具的载体。治疗性基因可以通过病毒载体或非病毒载体传递给细胞。研究最多的非病毒载体是聚合物、脂质、无机颗粒或不同类型的组合。与病毒载体相比，非病毒载体在细胞毒性、免疫原性和致突变性方面较低。然而，非病毒载体并不具备理想的特性，并且面临诸如基因转移效率、特异性、基因表达持续时间和安全性等关键挑战。目前FDA批准的基因治疗中没有使用非病毒载体。相比之下，病毒具有复杂而精确的结构特征，通过自然进化调整，以高效转染特定的宿主细胞或组织。目前FDA批准的基因治疗中使用几种病毒作为基因传递载体，包括逆转录病毒（由小鼠白血病病毒（MLV）衍生的γ-逆转录病毒载体和主要来自HIV-1的慢病毒载体（LV））、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒1型。这些病毒载体的典型特征总结在表14.2中。病毒载体的主要限制是非优化过程的产量相对较低。要使病毒基因治疗在临床和商业上取得成功，必须有能够高效和经济地生产病毒的生物制造系统，以满足市场需求。 2.慢病毒 慢病毒是逆转录病毒科的一个亚科。与其他病毒相比，逆转录病毒具有独特的特点，它们包含单链RNA，在宿主细胞感染期间会被逆转录。与早期临床试验中作为潜在基因治疗载体被广泛研究的肿瘤病毒亚科不同，慢病毒亚科能够感染静止和后有丝分裂细胞，被归类为复杂逆转录病毒。逆转录病毒的衣壳是一个包膜蛋白壳，包含病毒基因组，直径为80-100纳米。围绕衣壳的包膜结构是一个脂质双层，包含病毒编码的表面糖蛋白和源自宿主细胞的跨膜糖蛋白。慢病毒亚科的基因组是线性的、非分段的、单链RNA，长度为7-12 kb。简单逆转录病毒的基因组，如γ-逆转录病毒，包含三个主要编码段和一个小型编码域。主要段包含三个基因——gag、pol和env——它们编码对病毒整合、复制和包装重要的蛋白。小型编码域包含pro基因，编码病毒蛋白酶。复杂逆转录病毒，如慢病毒，的基因组包含与简单逆转录病毒相同的基因（gag、pol和env），但还包含六个额外的基因——两个调节基因和四个辅助基因——它们编码对病毒复制、结合、感染和释放重要的蛋白。表14.3概述了这六个基因及其表达蛋白的功能。 逆转录病毒通过外层包膜上的糖蛋白与特定细胞受体之间的相互作用感染细胞。一旦病毒与细胞表面受体结合，就会发生一系列事件，导致病毒颗粒被纳入细胞脂质双层，随后病毒遗传物质被卸入细胞质。然而，慢病毒的生命周期中发生了一些独特的事件，这解释了它们能够感染非分裂细胞的能力。首先，基因表达发生在两个独立的阶段，即早期和晚期，这两个阶段由rev蛋白的结合分隔。其次，慢病毒通过vpr基因表达的蛋白感染非分裂细胞。最后，仅在复杂逆转录病毒中发现的tat基因对HIV-1的复制至关重要。 2.1.慢病毒载体在基因治疗中的应用 作为基因治疗载体研究最多的慢病毒（LV）是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。安全性至关重要，由于HIV-1对人类的致病性，LV载体系统被设计为复制缺陷型。几乎所有的临床和研究工作，包括用于生产CAR T细胞的慢病毒载体，都基于第三代包装系统和自失活（SIN）配置，自第三代慢病毒载体开发以来，最先进的慢病毒载体的设计并没有发生戏剧性的变化。第三代载体基于一个四质粒系统，包括一个基因转移载体（TV质粒）和三个辅助质粒，如图14.2所示。TV质粒是转移到目标细胞的唯一遗传物质，由包含转基因表达盒的LV骨干组成，其两侧是需要用于包装、逆转录和整合的顺式作用元素。所有辅助基因，nef、vpr、vpu和Vif，都被移除，因为它们是不必要的，调节tat基因被消除。复制所需的rev基因以转录方式提供，以创建一个条件包装平台。载体被赋予一个由非常特定的糖蛋白组成的包膜结构，即狂犬病病毒糖蛋白（VSV-G），这使得载体具有高亲和力，能够感染多种细胞类型。通过删除包含TATA盒和转录因子结合位点的3′-LTR的一部分，安全性得到进一步增强。因此，载体包装系统变得自失活（SIN）。 图 14.2 第三代不依赖Tat的慢病毒载体系统的示意图。所示的SIN转移载体包含cPPT以实现有效的核输入，并使用MSCV LTR启动子（MU3）作为内部启动子来驱动转基因的表达，以及WPRE（W）元件以实现高水平的转基因表达。三个包装构建编码HIV-1的gag-pol和rev蛋白以及VSV-g包膜糖蛋白。 2.2.生产细胞系 大多数当前的LV载体生产系统涉及对HEK293或HEK293T细胞的瞬时转染。这些细胞被转染含有gag-pol、env、rev和TV质粒的四个质粒。与HEK293细胞系相比，HEK293T细胞系产生更高的病毒滴度，因此是首选的生产平台。HEK293细胞系和HEK293T细胞系之间的唯一区别是后者携带肿瘤病毒SV40大T抗原。表达SV40 T-抗原的细胞中引发细胞生长和转染效率增加的机制尚不清楚，但这一现象也在CV-1（SV40 T-抗原阴性）和COS-1（SV40 T-抗原阳性）细胞之间得到证实。然而，SV40 T-抗原是肿瘤病毒，因此带来了一些安全问题。使用四质粒转染方法在病毒滴度上的批次间变异性也是一个重大挑战。第一个成功的稳定生产细胞系之一是STAR包装细胞系。该细胞系是通过将HEK293T细胞与编码密码子优化的gag-pol基因的γ-逆转录病毒载体共转染，随后引入HIV-1调节蛋白Tat和Rev的基因、一个包膜蛋白和一个HIV-1 LV载体。优化转染载体基因组表达盒的结构，导致了SIN LV载体生产细胞系的开发。与瞬时转染相比，稳定生产细胞系具有几个优点，包括批次间的可重复性、可扩展性和成本。基于HIV-1的LV载体开发稳定生产细胞系已被证明是具有挑战性的。包装基因和与HIV-1基础LV载体发生的基因沉默在长期培养期间会导致细胞毒性。为克服这一限制，采用了两种不同的策略。第一种策略使用四环素诱导系统来控制VSV-G和gal-pol基因的表达。替代诱导型稳定细胞系的策略是创建组成型包装细胞系。这些已经为一些比VSV-G毒性小的包膜蛋白开发出来，如cocal和RD114-TR。 2.3.慢病毒载体生产 慢病毒载体在几种FDA批准的基因治疗中得到应用。如表14.1所示，这些治疗都采用体外基因转移，并且剂量要求高达10^9个CAR-T阳性细胞。根据FDA指南，CAR-T阳性细胞被视为最终治疗产品（在欧盟也称为药品），而LV载体被视为关键原材料。尽管最终的细胞产品是自体的，并且必须为每个患者单独生产，但LV载体可以大量生产，并在-80°C下冷冻保存数年。 慢病毒载体的商业规模生产可以通过扩展（即增加辅助生产系统）支持锚定依赖细胞的小规模系统，或者通过扩展支持悬浮细胞扩增的系统来实现。目前，大多数大规模生产依赖于锚定依赖细胞。由于HEK293细胞是弱锚定依赖的，滚筒瓶培养并不普遍。生产是在多托盘系统的平行培养中进行的——无论是细胞工厂还是细胞堆叠。首选系统是10堆叠系统。从理论上讲，可以使用40堆叠系统，但这些系统由于其大小和重量而存在处理问题。此外，堆叠之间的质量传递可能不均匀，这导致溶解氧水平的变化。LV载体收获次数可以从一次最终收获到最多三次收获，从12-24个10堆叠细胞工厂设备中生产出20-52升。使用细胞工厂生产LV载体有一些缺点，即收获窗口有限、劳动强度大、在开放式系统中保持无菌以及需要大量的孵化器空间。为此，研究人员已经研究了固定床系统、中空纤维生物反应器和装有Fibra-cel圆盘的Wave生物反应器，细胞被固定在圆盘上。表14.4比较了在LV载体生产中使用的不同的生产系统。 由于锚定依赖细胞在可扩展性上的固有限制，HEK-293 T培养物可以适应无血清、悬浮培养，用于慢病毒载体生产，并在传统的搅拌罐生物反应器中使用。无血清悬浮培养的主要缺点是细胞密度较低，与锚定依赖细胞培养系统相比，病毒滴度降低。使用悬浮培养的初始研究表明，病毒滴度在10^6 TU/mL及以下。通过在连续模式下而不是批量模式下运行生物反应器，LV载体的累积产量可以增加高达15倍，滴度达到3.2×10^7 TU/mL，与锚定依赖细胞培养系统相当。最近的研究通过在悬浮介质中逐渐适应，报告了10^8 TU/mL的LV载体滴度。在悬浮培养中培养细胞时，另一个考虑因素是从上清液中分离细胞和病毒。连续培养利用了声波细胞过滤技术和切向流深层过滤（TFDF），这些技术能够在生物反应器内保留细胞。累积功能产量达到3.3×10^11和3.9×10^11转导单位；前者在6天的LV生产中，使用了16.3升的灌注介质，后者在4天内使用了16升。批量培养依赖于收获后使用离心和过滤来去除细胞。 3.腺病毒 腺病毒（Ad）最初于1953年在人类脂肪组织中被鉴定出来。有六个物种（A-F）感染人类，进一步细分为五十多种感染性血清型。腺病毒衣壳的球形旋钮结构对coxsackie/腺病毒受体（CAR）具有高亲和力，该受体可在人体各种细胞中找到。因此，人类腺病毒被认为是所有急性呼吸道感染的5-10%的原因。腺病毒的传染性，以及它们利用细胞机制合成病毒mRNA和蛋白的能力，导致腺病毒载体在大约50%的当前临床试验中得到使用。 腺病毒是一种无包膜病毒。基因组是线性的、双链DNA（dsDNA），长度在26到40 kb之间[73]。这种线性形式在病毒衣壳内被组织成紧凑的类似核小体的结构，并且在每个DNA链的末端具有类似发夹的倒置末端重复（ITR）序列。ITRs的长度不同，可以在末端之间有30到371 bp。如图14.3所示，病毒基因组包含两个主要的转录区域，称为早期区域和晚期区域。基因组的早期区域包含四个重要的转录单元（E1, E2, E3和E4），这些单元在细胞感染后被激活。此外，基因组包含两个延迟早期转录单元（IX和IVa2）和一个主要的晚期（ML）转录单元，通过翻译后处理（从L1到L5）处理生成晚期区域mRNAs。 图 14.3 腺病毒5型(Ad5)基因组地图以及不同代的腺病毒载体。 3.1.腺病毒载体在基因治疗中的应用 第一代腺病毒载体的基因组中E1A/E1B区域被多达4.5 kb的DNA转基因盒替换。E1A蛋白是病毒复制所必需的。从病毒基因组中删除这些基因，因此需要开发互补的生产细胞系，这些细胞系提供了这些基因，如293, 911, N52.E6或PER.C6。E3区域对病毒复制并非必需，也可以被删除以创造额外的空间用于转基因盒。这些消除允许向载体中插入多达8.3 kb的DNA。第一代腺病毒载体受到两个限制的困扰：（i）腺病毒蛋白的新表达可以激活宿主免疫反应，导致清除病毒感染的细胞；（ii）如果在腺病毒载体和生产细胞的工程E1区域之间发生自发重组，可以在基因扩增期间产生具有复制能力的腺病毒。 除了删除E1和E3基因外，第二代腺病毒载体还删除了E2和E4基因。删除这些额外的基因允许插入多达14 kb的DNA转基因盒。然而，E2和E4区域包含转录增加病毒编码基因表达的蛋白的基因。因此，与第一代腺病毒载体相比，第二代腺病毒载体中治疗基因的表达较低。与第一代载体一样，细胞毒性T细胞攻击并消除体内转导的第二代腺病毒载体的细胞，限制了治疗基因表达的持续时间。 第三代腺病毒载体，也称为剥离或无病毒载体，除了ITR和包装区域外，所有腺病毒DNA都被移除。这允许向载体中插入36 kb的DNA。复制需要包装细胞与辅助载体（HV）共感染，辅助载体能够在转录中产生所有必要的蛋白。剥离的腺病毒载体在表达HV和Cre重组酶的HEK293生产细胞中生产。HV蛋白允许剥离载体的复制和包装。工程化的Cre确保通过Cre介导的loxP位点重组，HV基因组包装信号被切除，并且只有剥离的腺病毒基因组可以被包装。 3.2.腺病毒载体生产 几个上游过程参数影响腺病毒载体生产的数量和质量。这些包括生产细胞系、病毒感染参数、细胞生长条件和操作模式。这些参数可以相互影响，需要一个全面的、系统级的方法来优化生物制造过程。 第一代腺病毒载体的生产通常使用HEK293和PER.C6细胞。HEK293细胞系是通过将人类胚胎肾（HEK）细胞与切碎的人类Ad5 DNA共转染而产生的，其中核苷酸1-4344，包括E1区域，被整合到19号染色体上。这些细胞非常多功能，可以在悬浮或贴壁状态下培养，并且可以使用无血清或含血清的培养基。据预测，HEK293细胞的悬浮培养可以达到高达10,000升的规模，病毒产量在10^9到10^10 VP/mL之间。 HEK293细胞系的一个严重缺点是在生产过程中由于同源重组事件频繁产生具有复制能力的腺病毒（RCA）。PER.C6细胞系的开发旨在减少生产过程中RCA出现的风险。PER.C6细胞系包含Ad5 E1A和E1B编码序列（核苷酸459-3510），在人类磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子的控制下。通过将细胞与没有序列重叠的腺病毒载体结合，克服了RCA的产生。PER.C6细胞可以在有无血清的悬浮培养中生长，已成为行业标准。 第二代腺病毒载体，缺乏E1、E2和E4区域，可以与源自HeLa和Vero细胞的跨补细胞系一起生产。已经开发了细胞系来生产E2缺陷的腺病毒载体和E4缺陷的腺病毒载体。基于HEK293、911和E1修饰的A549细胞的细胞系也已被生成，以允许第二代腺病毒载体的传播。 第三代或无病毒载体，除了对病毒DNA复制和包装所必需的顺式作用序列外，所有基因都被移除。由于需要一个适当的生产细胞系来提供所有必要的病毒元素，载体生产变得复杂。一些腺病毒蛋白的细胞毒性可能是创建补充这些载体的细胞系工作失败的最可能原因。因此，有必要提供辅助腺病毒载体（HV），它提供病毒粒子所需的包装蛋白。生产细胞系源自293细胞，并表达Cre重组酶，而HV被修饰为包含包装位点周围的loxP位点。在293Cre细胞中，包装信号被有效地切除，防止辅助病毒基因组被包装。然而，切除效率并不完美，与HV的污染是一个严重的问题，报告的水平在0.01-1%之间。 腺病毒载体的滴度受到多种因素的影响，包括感染的多重性（MOI）、收获时间（TOH）和感染时的细胞浓度（CCI）。一旦生产细胞被腺病毒载体接种，感染可以迅速发生，大约需要48小时完成一个感染周期。因此，制造过程被配置为单轮感染周期，MOI>1以确保所有细胞都被感染。应为每个系统确定最佳MOI；然而，Ad5培养过程的典型值范围是每个细胞10到200个病毒颗粒，结果是放大比率>200。 可以在搅拌罐生物反应器中培养适应悬浮培养的Per.C6和293细胞。当细胞在批量培养中生长时，病毒生产的最佳细胞密度约为5×10^5细胞/mL，比可能的理论最大细胞密度低一个数量级。这被称为“细胞密度效应”。细胞代谢受到营养耗尽和代谢物积累的阻碍，使细胞无法在高密度下支持病毒生产。在感染时交换介质可以减少细胞密度效应，因为这补充了底物并去除了代谢物。当使用连续培养模式时，密度超过5×10^6细胞/mL，规模从3到20升。通过替换至少90%的介质，可以实现最佳病毒生产，每毫升1×10^6细胞。通过优化生物反应器中的物理化学条件可以显著提高病毒滴度。温度、pH值、溶解氧（DO）和部分CO2压力（pCO2）都已被证明是细胞生长、代谢和腺病毒生产的重要参数。 4.腺相关病毒 腺相关病毒（AAV）是一种小的、自然复制缺陷病毒，最初在1965年作为腺病毒的共感染因子被发现。为了在宿主细胞核内复制，AAV需要腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒的帮助，或某种形式的基因毒性应激。有11种不同的AAV血清型和100多种AAV变体，尽管血清型AAV6几乎与AAV1相同，AAV10和AAV11的表征不是很好。每种血清型都有自己的特征衣壳，对某些宿主细胞受体有特殊的亲和力，允许它被用来针对各种组织类型。AAV基因组由单链DNA组成，大约5 kb长。基因组缺乏病毒复制和表达自身基因组所需的基本基因。腺病毒从E1、E2a、E4和VA RNA基因提供这些功能。AAV基因组包含四个已知的开放阅读框（ORF），四个复制基因（rep）包含在第一个ORF中，编码三个病毒衣壳蛋白的cap基因位于第二个ORF，第三个和第四个ORF上的亚基因组mRNA被转录以产生组装激活蛋白（AAP）。基因组的两端都由倒置末端重复（ITR）序列所包围，这些序列作为复制的自我启动结构，并提供Rep介导的包装信号。 4.1.腺相关病毒载体在基因治疗中的应用 从AAV制作载体的过程始于删除编码Rep和Cap蛋白的基因。这种删除提供了大约5 kb的包装空间，用于外来DNA。新的DNA被插入到只包含ITRs的“剥离”病毒中。ITRs包含在辅助病毒存在下复制和包装所需的所有顺式作用元素。Rep和Cap蛋白和所有必要的腺病毒辅助基因在一到两个质粒上表达。从质粒上表达Ad基因消除了与野生型腺病毒共感染的需要。 4.2.腺相关病毒载体生产 生产AAV载体的三种不同生产系统。传统方法利用哺乳动物细胞的瞬时转染，最常见的是HEK293细胞。细胞被共转染三种质粒，以等摩尔比包含rAAV载体（即，由ITRs包围的转基因）、rep和cap基因，以及腺病毒辅助基因E1、E2a、E4和VA RNA。存在该协议的变体，使用双质粒系统，将包装和辅助功能合并到单个质粒上，或四质粒系统将rep和cap基因分别放置在不同的质粒上。通过添加酵母提取物（酵母素、Trypton N1或两者）可以增强rAAV的生产，这可以增加2.8至3.4倍的生产产量。 无血清悬浮培养已成功用于通过瞬时转染生产rAAV载体。研究表明，可以使用20升WAVE生物反应器成功生产rAAV载体，病毒产量为10^14 VG/L。该系统可能被扩大到100升，这对于涉及相对较低剂量的计划和LCA2等罕见疾病适应症是足够的。然而，对于成功的临床计划，特别是进入后期临床试验的，以及针对患者数量更多和/或每个患者需要更高载体剂量的疾病应用，预计需要增加一个到两个数量级的生产能力，以满足基因治疗可能针对的不断增加的疾病适应症的数量。通过增加生产细胞的比例可以实现载体滴度的增加。尽管获得了高转染效率和名义载体产量，研究表明只有5%-10%的细胞似乎能产生可测量水平的组装AAV衣壳。 作为复杂瞬时转染方法的替代方案，可以降低成本的是开发稳定生产细胞系。这些细胞将病毒和货物基因整合到细胞中，消除了瞬时转染的需要，并消除了批次间差异。已从A549细胞和HeLa细胞开发生产细胞系。包装细胞包含包含cap、rep和由ITR序列包围的转基因盒以及可选择标记基因的质粒。通过感染提供辅助病毒蛋白的复制能力Ad来启动AAV生产。生产细胞系已适应无血清悬浮培养，并可在生物反应器中培养，产量为每15升规模的10^4病毒颗粒/细胞，有潜力扩大到500升。其他研究表明，可以在250升搅拌罐反应器中从生产细胞中生产rAAV，没有预见到扩大到商业规模2000升生物反应器或更大的障碍。 杆状病毒表达载体系统（BEVS）是另一个已被成功用于生产rAAV载体的平台。使用BEVS的主要优点是不需要腺病毒辅助病毒。第一代BEVS需要将三杆状病毒表达载体（BEVs）共感染S. frugiperda（Sf9）细胞，每个载体提供AAV生成的三个基本基因（rep：Bac-Rep，cap：Bac-Cap，和ITR包围的感兴趣基因：Bac-ITR-GOI）。第一代BEVS受到BEVs的遗传不稳定性的困扰，导致AAV产量和无法生产其他血清型的功能性AAV载体的能力下降。因此，它们没有得到广泛使用。通过开发依赖于一个或两个BEVs的系统，即One-Bac/Mono-Bac和Two-Bac，克服了这些限制。Mono-Bac系统要求Sf9细胞感染带有所有三个基本AAV基因的单个BEV。这是一种与One-Bac1.0协议不同的方法，该协议利用杆状病毒（BV）在稳定的Sf9包装细胞中诱导rep2（AAV2 rep）和capX（X = 感兴趣的血清型）基因。细胞被感染带有ITR包围的转基因盒的单个杆状病毒载体。由BEV编码的即刻-早期转录调节因子1（IE-1）介导的表达增强，从整合的居民基因的扩增和表达中诱导结果。One-Bac 1.0系统生产的AAV2载体颗粒的细胞特异性产量比Three-Bac高出十倍[139]。Two-Bac系统使用一个包含rep和cap表达盒的单个BEV（Bac-Rep-Cap或Bac-In-RepCap），因此现在只需要共感染两个杆状病毒。这种方法可以从悬浮培养的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中每细胞产生7×10^4纯化rAAV颗粒。 5.未来方向和挑战 近年来，获批的基因疗法数量呈指数级增长，指标表明我们将继续看到更多产品成功完成临床试验并上市。慢病毒和腺相关病毒是未来基因疗法研究中最可行的载体选择，因为它们的不良反应有限且免疫原性特征良好。尽管基因疗法最近取得了成功，但一些生物制造挑战仍然存在。迄今为止的许多研究都集中在优化病毒载体的设计和高效的生产者及包装细胞系统上。未来的研究需要关注能够有效监控和控制影响关键质量属性（CQA）的关键过程参数（CPP）的过程分析技术（PAT），从而提高最终产品的一致性并优化生物过程生产方法。国家细胞制造联盟（NCMC）——一个由行业、政府、临床和学术领袖组成的公私合营联盟——在2016年国家路线图（以及随后的2017年和2019年更新）中确定了多个核心挑战，这些挑战涵盖了过程监控和控制、细胞处理和自动化、供应链和运输物流以及劳动力发展，必须在国家层面解决，以实现细胞和基因制造的未来。在确定的核心挑战中包括：（i）缺乏足够的生物加工模型来预测制造条件和材料对细胞行为的影响；（ii）缺乏足够的替代标记物来理解细胞关键质量属性（CQAs）；（iii）缺乏足够的过程分析技术（PAT）和检测细胞特性的检测方法。这些挑战——是行业、学术和政府利益相关者确定的最关键研究和发展领域——需要在人工智能（AI）（包括机器学习理论和自动化机器人学及控制学）、数据分析和预测建模方面具有显著的技能。过程控制需要超越传统的物理化学过程控制参数（pH、溶解O2和温度），并纳入组学、实时细胞代谢物分析以及内源性因素、表面标记物和基因表达的非破坏性测量。新的PAT将阐明哪些制造或过程变量可以产生具有适当CQAs的一致且可复制的产品。这反过来，又可以导致基于质量的设计（QbD）制造过程，从而提高大规模、可复制、低成本生产高质量和安全基因疗法的能力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。