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04月15日的《热心肠日报》，我们解读了 15 篇文献，关注：癌症，免疫治疗，肺癌，肿瘤菌群，工程菌，大肠癌，预后预测，巨噬细胞，临床试验，表观遗传，Exeliom，Seed Health，海特生物，丹码生物，重药集团，启菲亚科技。 该篇日报由R·AI辅助创作生成，人工审核校对。 Cell：系统性看待癌症的复杂性（综述） Cell——[64.5] ① 过去50年来，癌症研究已取得巨大进展，但“复杂性的乌云”依然冲击着癌症生物学和癌症医学的前沿，其中生理性别在癌症易感性、发展和治疗反应中的作用尤为突出。② 癌症驱动的突变与环境或内源性肿瘤启动子会在癌症风险中互作，多种内源性或生活方式因素会影响微生物组，通过刺激其他标志物影响肿瘤的发生和进展；③ 癌症间也存在一定的共性，所有癌症都参与相同的细胞周期机制，表现出p53通路失活以及Myc和PI3K通路的交叉激活；④ 肿瘤微观环境中的细胞生态位由不同细胞群组成，每个生态位可能以不同方式支持其中的癌细胞特征，从而促进肿瘤的生长、侵袭和转移。⑤ 血栓栓塞是导致癌症患者死亡的主要原因之一，血栓形成的潜在易感性与血栓炎症反应的失调有关，其中包括凝血和炎症介质间的互作；⑥ 肠道微生物通过多种不同的机制对免疫和癌症产生不同的影响，针对肠道和肿瘤微生物的定向干预有助于癌症治疗、阻断和预防。 【原文信息】 Embracing cancer complexity: Hallmarks of systemic disease 2024-03-28 , doi: 10.1016/j.cell.2024.02.009 Cell子刊：肠道菌群如何影响免疫治疗？（综述） Cell Reports Medicine——[14.3] ① 微生物与宿主免疫系统的互作决定了免疫检查点抑制剂（ICI）的疗效，菌群相关的机制途径可能是抗肿瘤功效或肿瘤进展效应的基础；② 肠道微生物群可作为肿瘤预测和预后的生物标志物，可能对ICIs反应产生诱导或抑制作用，目前研究揭示了毛螺菌、瘤胃球菌、颤螺菌、乳杆菌、拟杆菌、阿克曼氏菌、红蝽菌和双歧杆菌等分类群成员对ICI的影响；③ 抗生素和益生菌的使用会对ICI疗效产生不同的影响，但粪菌移植或细菌联合用药的应用已显示出对ICI疗法有效性的积极影响，其机制主要涉及抑制有害细菌和激活免疫细胞等；④ 未来微生物组的研究前沿应偏向于设计最佳的免疫刺激联合体，该联合体可以在激活抗肿瘤免疫的同时不增加对正常组织的毒性。 【原文信息】 Microbiome bacterial influencers of host immunity and response to immunotherapy 2024-03-21 , doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101487 国内团队Cell子刊：循环菌群DNA助力肺癌早期诊断和复发预测 Cell Reports Medicine——[14.3] ① 北京大学人民医院邱满堂团队联合深圳市第二人民医院吴昊团队和北京放射医学研究所卢一鸣团队发现循环菌群DNA（cmDNA）可作为肺癌早期诊断和复发的生物标志物；② 对肺癌患者和健康对照组的血浆进行全基因组测序，鉴定出差异富集的微生物物种；③ 开发了一种诊断模型，对肺癌的灵敏度高达87.7%，独立验证数据集的AUC值为93.2%；④ 该模型对于I期肺癌和直径小于1厘米的肿瘤分别具有86.5%和87.1%的灵敏度；⑤ 成功构建复发的cmDNA模型，可精确预测术后肺癌复发；⑥ 本研究强调了肺癌中cmDNA图谱的显著变化，表明其作为早期诊断和复发生物标志物的潜力。 【原文信息】 Circulating microbiome DNA as biomarkers for early diagnosis and recurrence of lung cancer 2024-03-28 , doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101499 国内团队Cell子刊：肿瘤内细菌产生丁酸盐，促进肺癌转移 Cell Reports Medicine——[14.3] ① 北京大学人民医院邱满堂和李运以及江苏省肿瘤医院王洁与团队研究发现，肿瘤内微生物组与肺癌复发相关，肿瘤内微生物组和循环微生物组DNA（cmDNA）可以预测癌症复发，肿瘤内微生物来源的丁酸盐促进肺癌转移；② 对术后三年复发或未复发的肺癌患者的肿瘤组织测序，发现复发组的肿瘤内微生物组多样性较低且产丁酸盐细菌富集；③ 肿瘤内微生物组特征和cmDNA可以准确预测肺癌复发；④ 皮下注射产丁酸盐细菌罗斯氏菌促进小鼠皮下肿瘤生长、迁移、侵袭和转移；⑤ 丁酸盐通过抑制HDAC2和增加H19启动子处的H3K27乙酰化并诱导M2巨噬细胞极化来增加肿瘤细胞中H19的表达，从而促进肺癌转移，巨噬细胞的耗竭部分消除了丁酸盐的转移促进作用。 【原文信息】 Intratumor microbiome-derived butyrate promotes lung cancer metastasis 2024-03-26 , doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101488 蔡林涛/郑明彬/陈廷涛/潘宏Cell子刊：工程益生菌增强T细胞介导的抗肿瘤免疫 Cell Reports——[8.8] ① 深圳先进院蔡林涛、郑明彬、潘宏和南昌大学陈廷涛共同通讯作者发表研究，开发了一种工程益生菌INP-EcN（IL-12纳米粒子大肠杆菌Nissle1917），生物合成抗PD-1并释放IL-12，通过T细胞级联调控启动全身抗肿瘤免疫；② 机制上，INP-EcN不仅可持续生物合成抗PD-1以缓解免疫抑制，且通过IL-12的反应性释放有效级联促进T细胞活化、增殖和浸润，从而达到对免疫检查点阻断治疗（ICB）的足够激活阈值；③ 相比商业抑制剂相比，INP-EcN的肿瘤靶向和定植显著增加了局部药物积累，显著抑制了肿瘤生长和转移；④ 免疫分析显示，抗PD-1/IL-12以CD8+T细胞依赖性方式有效级联促进抗肿瘤作用，阐明了ICB与细胞因子激活的免疫互作。 【原文信息】 T cell cascade regulation initiates systemic antitumor immunity through living drug factory of anti-PD-1/IL-12 engineered probiotics 2024-04-09 , doi: 10.1016/j.celrep.2024.114086 国内团队：MEX3A/circMPP6复合物通过抑制自噬促大肠癌 Signal Transduction and Targeted Therapy——[39.3] ① 中山大学王凤伟、谢丹团队联合广东省人民医院乔贵宾团队揭示了Mex-3 RNA结合家族成员A（MEX3A）/circMPP6复合物通过抑制自噬促进结直肠癌（CRC）进展的新机制；② MEX3A在CRC组织中表达上调与患者预后不良相关，且加速CRC细胞恶化并抑制自噬；③ MEX3A在细胞质中经历依赖内源无序区的液-液相分离，且circMPP6作为框架促进MEX3A与加工体（PBs）蛋白的相互作用；④ MEX3A/circMPP6复合体调控PBs动态，促进UPF介导的磷酸二酯酶5A（PDE5A）mRNA降解，从而导致CRC细胞的侵袭性；⑤ 临床上，MEX3A高表达和PDE5A低表达的CRC患者具有最差的总体生存率，为CRC的预后标志物和/或治疗靶点提供了新的视角。 【原文信息】 Mex-3 RNA binding family member A (MEX3A)/circMPP6 complex promotes colorectal cancer progression by inhibiting autophagy 2024-04-02 , doi: 10.1038/s41392-024-01787-3 南京医科大学Nature子刊：预测大肠癌生存率的新工具 Nature Communications——[16.6] ① 南京医科大学王美林团队成功开发了一种基于病理特征、遗传风险和生活方式的结直肠癌生存预测工具，为降低结直肠癌死亡率提供了新策略；② 对3703名患者进行全基因组生存关联分析，以开发八个候选的多基因预后评分（PPS）；③ 在470名独立队列患者中，确定了一种包含287个变异的PPS（PPS287），具有最佳的预测性能（每标准差风险比（HR）=1.99，P=1.76×10-8）；④ 在两个外部队列中对PPS287进一步验证，每标准差风险比分别为1.90（P=3.21×10-14，543名患者）和1.80（P=1.11×10-9，713名患者）；⑤ 健康的生活方式可减轻病理特征和遗传风险的不利影响，使5年总生存率提高7.62%；⑥ 本研究证实了病理特征、种系变异和生活方式对结直肠癌患者预后的综合影响。 【原文信息】 Integration of pathologic characteristics, genetic risk and lifestyle exposure for colorectal cancer survival assessment 2024-04-08 , doi: 10.1038/s41467-024-47204-9 空间分离的巨噬细胞群体可预测结肠癌的不同结果 Cancer Discovery——[28.2] ① 通过分析scRNA-seq及空间转录组测序数据，结合免疫组化染色和CODEX图像，在正常和恶性人类乳腺和结肠组织中鉴定出5种不同的人类巨噬细胞类群；② 不同的巨噬细胞群体分布在不同的微环境生态位中，并展现出保守的细胞组成，这种分布模式在健康和疾病组织中重复存在；③ IL4I1+巨噬细胞在高细胞周转率区域内吞噬死亡细胞，预示着结肠癌的良好预后，相反，SPP1+巨噬细胞富集于缺氧和坏死的肿瘤区域，预示着结肠癌的不良预后；④ FOLR2+巨噬细胞的一个亚群嵌入在浆细胞生态位，而NLRP3+巨噬细胞与肿瘤中的中性粒细胞共定位，并在其中激活炎症小体。 【原文信息】 Spatially Segregated Macrophage Populations Predict Distinct Outcomes In Colon Cancer 2024-03-28 , doi: 10.1158/2159-8290.CD-23-1300 基于奥沙利铂的辅助化疗治疗III期结肠癌老年患者：无复发时间类似 Journal of Clinical Oncology——[45.3] ① 本研究分析了老年患者接受含奥沙利铂的辅助化疗对III期结肠癌治疗效果的影响，发现与年轻患者相比，老年患者的治疗耐受性良好，无复发时间相似，表明疗效相当；② 纳入7,909名患者，其中24%超过70岁，老年患者早期治疗中断的比率更高；③ 老年患者在接受CAPOX治疗时，腹泻和中性粒细胞减少症更为频繁，其他3级以上不良事件发生率在≥70岁和<70岁的患者之间相似；④ 多变量分析显示，复发时间在≥70岁和<70岁的患者之间无差异，但无病生存期、总生存期、复发后生存期和癌症特异性生存期在≥70岁的患者中显著缩短；⑤ 在老年III期结肠癌患者中，无复发时间可能是更合适的终点指标。 【原文信息】 Oxaliplatin-Based Adjuvant Chemotherapy in Older Patients With Stage III Colon Cancer: An ACCENT/IDEA Pooled Analysis of 12 Trials 2024-03-28 , doi: 10.1200/JCO.23.01326 Science子刊：DNMTi治疗结直肠癌效果不佳与EZH2介导的H3K27me3修饰有关 Science Advances——[13.6] ① DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTi）在实体肿瘤中的疗效有限，且暴露于DNMTi的结肠癌细胞组蛋白发生H3K27me3修饰，研究发现这种EZH2依赖性的抑制性修饰限制了DNMTi的疗效；② 在结肠癌细胞中，低剂量DNMTi处理能使其对EZH2抑制剂更加敏感，且DNMTi诱导的H3K27me3在已有EZH2作用的基因区域积累；③ EZH2抑制剂和DNMTi联用能改变表观遗传图谱，从而上调钙诱导的NFAT:AP-1信号通路的转录，阻断该通路会限制EZH2抑制剂和DNMTi联用的转录激活效果，包括与病毒防御相关的转座元件和先天免疫反应基因的表达；④ 对人类原发性结肠癌样本的分析显示DNMTi、先天免疫反应和钙信号传导相关的转录特征之间存在正相关。⑤ 即补偿性EZH2活性限制了结肠癌中DNMTi的疗效。 【原文信息】 Select EZH2 inhibitors enhance viral mimicry effects of DNMT inhibition through a mechanism involving NFAT:AP-1 signaling 2024-03-27 , doi: 10.1126/sciadv.adk4423 Exeliom启动活菌药EXL01 3项2期临床试验 ① 4月11日，Exeliom Biosciences公司宣布，启动旗下活菌药EXL01 3项2期临床试验；② 试验将评估EXL01与免疫检查点抑制剂联用，治疗胃癌、非小细胞肺癌和肝细胞癌的疗效与安全性问题；③ EXL01是首个使用普拉梭菌（ Faecalibacterium prausnitzii ）的活菌药产品，旨在提高癌症患者对免疫检查点抑制剂的治疗响应，进而延长生存期；④ Exeliom Biosciences公司计划在2026年底分享试验结果，并适时启动3期临床试验。 【原文信息】 Exeliom Biosciences announces three phase II clinical trials in immuno-oncology with lead candidate combined with immune checkpoint inhibitors 2024-04-11 , pharmiweb Seed Health推出计算生物学平台CODA，用于挖掘新益生菌 ① 4月11日，Seed Health公司宣布推出计算生物学平台CODA，用于研究和开发下一代精准益生菌和微生物组健康干预疗法；② CODA平台利用了世界上综合性最强的多组学数据库Human Phenotype Project，该项目由以色列魏茨曼科学研究所Eran Segal教授领导开发；③ CODA平台整合了超过13000名个体的300万个表型数据，结合了微生物组分析和遗传、免疫、代谢组学及蛋白质组学数据；④ 未来，科研人员将利用CODA平台首先开发代谢健康、大脑健康、更年期和长寿等领域的健康解决方案。 【原文信息】 Seed Health Launches Computational Biology Platform, Powered by Most Comprehensive Host-Microbiome Data Set, to Expand Pipeline Beyond the Gut 2024-04-11 , PR Newswire 海特生物HKG-320注射液获批临床 ① 4月11日，武汉海特生物发布公告称，旗下子公司HKG-320注射液临床试验申请获得国家药监局批准；② HKG-320注射液为钾离子竞争性酸阻滞剂，用于降低成人急性胃和/或十二指肠溃疡引起的上消化道出血经内镜治疗后再出血风险；③ 上消化道出血患者通过内镜疗法实现初级止血，有效率为54%~100%，但再出血率高达18%，再出血死亡率最高可达9%；④ HKG-320注射液作为抑酸剂，可克服临床常用的静脉给药质子泵抑制剂（PPIs）的起效慢、夜间酸突破以及个体差异较大等局限性，具有较好的临床开发价值。 【原文信息】 海特生物:关于子公司获得药物临床试验批准通知书的公告 2024-04-11 , 海特生物 丹码生物首个管线国内IND获批 ① 近日，丹码生物泛瘤种适应证检查点抑制剂DM919，其1期新药临床试验申请（IND）获得了中国国家药监局药品审评中心批准；② DM919此前已于2023年12月21日获得美国FDA正式批准开展临床研究；③ DM919是一种靶向MICA/B蛋白的人源化单抗，有望成为全球NK/T细胞检查点抑制剂的首创药物；④ 丹码生物计划在中美开展多中心、开放标签、剂量递增和扩展临床试验，以评估DM919在晚期实体瘤患者中的安全性和临床活性。 【原文信息】 研发动态丨丹码生物首个管线国内IND获批 2024-04-11 , BioBAY 重药集团与启菲亚科技开展宠物健康合作 ① 4月10日，重药集团与启菲亚科技在上海第四届“它博会”上签署战略合作协议；② 双方将依托“卡妮宝利”产品总代业务，共同孵化优质宠物健康产品，进一步加强资源互补、协同共进，携手开创宠物健康领域更为广阔的事业；③ 启菲亚科技是一家集宠物医疗用品研发、生产、销售为一体的公司，致力于构建宠物服务生态平台；④ “卡妮宝利”品牌宠物食品采用“两蛋一芯”双核产品理念，将以科学、安全、高品质的创新双核工艺开启中国宠物食品行业的未来。 【原文信息】 重药集团与启菲亚科技开启宠物健康领域战略合作 2024-04-11 , 重药控股 感谢本期日报的审核者：九卿臣，圆圈儿，RZN，章台柳，Richard 点击阅读过去10天的日报： 0414 | 高分Cell子刊综述，一文讲透发酵食品 0413 | 3篇子刊重磅文章，解析微生物组治疗的现状与未来 0412 | 10文聚焦国内团队新成果，肠道和菌群研究多点开花 0411 | 今日Nature：抵御病菌感染，结肠细胞如何与T细胞协作？ 0410 | 今日Cell：首个大规模泛癌转移瘤菌群图谱重磅出炉 0409 | 高分Nature子刊：菌群产物药物研发取得新进展 0408 | 300万人数据："好"胆固醇与消化道癌症风险有何关联？ 0407 | 100分综述详解：短链脂肪酸链起饮食、菌群和免疫 0406 | 贾伟/刘铁民/郑晓皎Cell子刊新发现：改善抑郁症的肠菌代谢物 0405 | 高分Cell子刊：中国农大团队详解后生元

3 月 25 日，华东医药公告称，其全资子公司中美华东美国合作方 AbbVie Inc. 的 ELAHERE®（索米妥昔单抗注射液）获得FDA完全批准，用于治疗既往接受过 1-3 线系统性治疗的叶酸受体 α（FRα）阳性的铂类耐药的上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成年患者。索米妥昔单抗注射液ELAHERE®（索米妥昔单抗注射液）是全球首创（first-in-class）药物，也是首个和唯一一个在美国获批用于治疗该恶性肿瘤的 ADC 药物，开创了卵巢癌治疗新途径，标志着 PROC（铂耐药复发卵巢癌）治疗进入了 ADC 时代。ELAHERE®为中美华东与ImmunoGen, Inc.（目前已被AbbVie收购）合作开发的针对叶酸受体α（FRα，一种在卵巢癌中高表达的细胞表面蛋白）靶点的全球首创（first-in-class）ADC药物，由 FRα 结合抗体、可裂解的连接子和美登木素生物碱 DM4 组成。华东医药于 2020 年 10 月从 ImmunoGen, Inc.（目前已被 AbbVie 收购）引入 ELAHERE®，获得了 ELAHERE®在大中华区（含中国大陆，香港、澳门和台湾地区）的独家临床开发及商业化权益。2022 年 5 月 23 日，ImmunoGen 宣布美国 FDA 已受理该产品的生物制品许可申请（BLA），并授予优先审评资格。2022 年 11 月 15 日，ImmunoGen 宣布该产品获得美国 FDA 加速批准上市。根据公告显示，本次 ELAHERE®由加速批准转为完全批准是基于验证性 III 期临床试验 MIRASOL。该试验是一项随机试验，比较了 ELAHERE®与研究者选择（IC）的单药化疗（紫杉醇周疗、聚乙二醇脂质体多柔比星（PLD）或拓扑替康）在铂类耐药卵巢癌患者中的疗效和安全性。数据显示，Elahere 治疗带来了 OS 获益，与 IC 化疗组相比，ELAHERE®组的死亡风险降低了 33%，并将癌症进展的风险降低了 35%，与 IC 化疗对照组相比，ELAHERE®组总体上 3 级及以上的不良事件更少，不良事件导致停药率更低。值得一提的是，2023 年 7 月，ELAHERE®已被 CDE 纳入优先审评品种名单。2023 年 10 月，ELAHERE®在中国的上市许可申请获 NMPA 受理，当前正处于审评中。凭借良好的疗效，ELAHERE®刚上市便迎来了好的开局。根据 ImmunoGen 公布的 2023 年 Q3 财报，ELAHERE®第三季度美国净销售额为 1.052 亿美元，前三季度销售额达 2.12 亿美元，远超其 2023 年全球总销售额 6200 万美元的预测。银河证券估计，其首年销售额或将突破 5 亿美元。靶向FRα药物主要进展叶酸受体α（FRα），亦称为叶酸受体1（FOLR1），属于叶酸受体家族，和FRβ亚型同是富含半胱氨酸的糖脂锚定蛋白。目前靶向FRα（FOLR1）药物用于肿瘤治疗已有多种类型，包括单抗、ADC药物、CAR-T疗法以及双抗等。据药研网不完全统计，目前全球至少9款靶向 FRα 的 ADC 药物进入临床或获批上市，ELAHERE®是唯一已上市产品。其中ADC药物进展最快，首个FRa ADC产品Elahere于2022年被FDA加速批准上市。此外，还有多款临床在研的ADC药物，包括进入临床II期的STRO-002和CBP-1008等,其他涉及FRα靶向药物双抗以及CAR-T药物等处于临床I期、II期和临床前阶段。表1. 目前靶向FOLR1的药物研发进展 | 来源：药研网往期推荐视角 | 纸面之外的药明康德2023年报Claudin18.2ADC赛道群雄逐鹿：3家率先进入III期临床下一个10亿美元重磅炸弹选手"裁员潮”仍在加剧：2月多家药企裁员点击下方“药研网”，关注更多精彩内容

今天小编给大家解读一篇2月发表在Journal of Hepatology杂志（IF：25.7/Q1）的文章“Single cell landscape of functionally cured chronic hepatitis B patients reveals activation of innate and altered CD4-CTL-driven adaptive immunity”。在本文中作者结合单细胞数据、流式细胞术和免疫荧光，阐明与慢性乙型肝炎（CHB）和功能治愈（FC）患者相关的免疫病理细胞状态。背景慢性乙型肝炎(CHB)病毒感染影响2.57亿人，主要在亚太地区和非洲地区，每年估计有80万人死于肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎患者很难彻底治愈和清除病毒感染，在患者血清中出现或不出现抗HBs抗体的情况下，病毒表面抗原(HBsAg)的丧失，也叫功能治愈(FC)。病毒感染的清除在很大程度上取决于强大和持久的适应性免疫反应。病毒特异性CD8 T细胞参与急性乙肝病毒感染。然在慢性乙肝患者中，乙肝病毒特异的CD8 T细胞最终耗尽。最近的研究表明，适应性免疫反应的损害除了高抗原负荷外，还与暴露于病毒抗原的时间有关。先天免疫反应在慢性乙型病毒性肝炎中的具体作用仍存在争议，且相对知之甚少。先天免疫反应通常被认为是慢性乙肝患者的功能受损。最近一项研究发现了一种特定的Kupffer细胞(KC)亚群，该细胞在IL2的存在下重新激活了乙肝病毒特异性CD8 T细胞的抗病毒功能。此外，其他研究表明，NK细胞细胞毒活性的增强与肝脏炎症之间存在正相关关系，尤其是在核苷类似物(NA)治疗后清除乙肝表面抗原的患者中。这些研究暗示了先天免疫细胞在慢性乙肝的解决中的潜在功能。尽管最近的研究已经通过不同测序方法探索了CHB不同阶段的肝脏环境的动态情况，但FC患者的疾病相关细胞状态(DAC)仍然难以捉摸。在本文中，作者主要目的是探索持续控制乙肝表面抗原丢失的机制基础。同时用scRNA-seq和多参数流式细胞术检测了每例肝穿刺活检的核心细胞和匹配的PBMCs，并分离了CHB患者或已实现功能性治愈的患者。通过对转录组谱、推断的细胞间相互作用和基于流式细胞术的验证研究的系统分析，作者发现了不同的免疫和上皮细胞状态，如CD4-CTL、NK细胞、中性粒细胞和表达MHC-II类分子的肝细胞，这些细胞可能在FC患者实现和维持HBsAg持续丢失中发挥重要功能。此外，作者首次提供了FC患者中存在cccDNA的直接证据。结果CHB和FC患者肝脏和PBMCs的单细胞图谱作者将CHB患者分为治疗组(n=29)和未治疗组(n=29)，其中检测到病毒HBsAg, CHB患者达到FC (n=9)。FC患者在治疗后(n=7)或自发(n=2)显示病毒HBsAg清除，并在HBsAg消失后7 ~ 84个月进行分析。作者对肝脏活检和患者匹配的PBMCs中分离出的细胞进行了scRNA-seq，以及多参数流式细胞术。并利用多重免疫荧光(mIF)染色和图像分析对来自同一肝活检的组织切片进行了验证研究（图1A）。为了重点分析免疫细胞亚群和HBV特异性T细胞的表型，CHB患者根据其定量HBsAg (qHBsAg)进行分层，高(>10000 IU/ml)，中(1000-10000 IU/ml)，和低(0.05-1000 IU/ml)（表1）。 表1：样本的EASL指南图1 CHB和FC患者的肝脏单细胞转录组图谱和匹配的PBMCs肝脏中适应性和固有免疫细胞的组成有明显的变化CHB (n=15)和FC (n=8)患者的单细胞转录组分析在肝内捕获了47109个细胞，包括26种不同的主要细胞类型/状态，分别是上皮细胞(肝细胞和胆管细胞)、免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和肥大细胞)、内皮细胞和星状细胞(图1B)。PBMCs主要由17种不同免疫细胞亚型(主要包括T、NK、单核细胞、DCs和B细胞以及干细胞和中性粒细胞)构成(图1E)。FC患者肝内环境中T细胞显著减少，同时NK细胞和中性粒细胞增加(图1D)。而这一现象在PBMCs种并未观察到(图1G)。流式细胞术(图1H)也证实FC患者肝活检中T细胞的减少和NK/NK T细胞群的增加，而外周血则没有这种类似的改变(图1-I)。总体而言，这些观察结果提示，功能治愈的患者肝脏内的免疫细胞组成可能存在特定变化，而这些变化可能并不总是准确地反映在PBMCs中。FC患者表现为CD8 T细胞耗竭减少并出现CD4相关的适应性免疫应答接下来作者细分了主要的T细胞和NK细胞簇，然后对这些细胞类型进行重新聚类(图2A-A’)。确定了不同的细胞亚型，包括CD4辅助性T细胞、CD4细胞毒性T细胞或CD4-CTLs 、CD8效应T细胞、耗竭的CD8 T细胞、CD8记忆T细胞、Treg 细胞、肝脏常驻NK或LR-NK、常规NK或cNK 细胞以及NK T细胞。FC患者中，耗竭的PDCD1+CD8 T细胞显著减少，FOXP3+Treg几乎完全缺失(图2A-D)。耗竭标志物如TIGIT、LAG3和PDCD1在FC患者中显著降低(图2C-D)。而且这种图变化主要反映在肝脏而非PBMCs。与CHB患者相比，FC患者的FOXP3+ Treg频率下降，在肝脏中更明显(图2C)。对肝脏CD8 T细胞进行流式细胞术分析也显示，在FC患者中，PD1+和TIM3+耗竭CD8 T细胞的频率显著较低(图2E)。这不仅体现在CD69+组织驻留CD8 T细胞中，也体现在转运CD69- T细胞中。根据qHBsAg水平对CHB患者进行分层表明，耗竭CD8 T细胞的减少与qHBsAg的减少相关(图2E)。FC的患者中伴随着耗竭的CD8 T细胞和Treg细胞的丢失，CD4-CTL细胞数量增加（表达效应毒性淋巴细胞相关标志物PRF1、GZMA、GZMK、TNF、NCR3）(图2 F-F’)。此外，这些CD4-CTLs表达与终末分化、抗原敏感的CD4 T细胞(IL7R, KLRG1)相关的标记物，这些标记物显示出独特的炎症和细胞毒性效应细胞特征，包括肿瘤坏死因子(TNF)。同时它们也表达NCR3基因，类似于NK样细胞的特征（图2F, F）。流式细胞术分析显示，在组织驻留(CD69+)和转化(CD69-) T细胞中，KLRG1+ CD4 T细胞的频率均增加(图2F”)。低qHBsAg组CHB患者外周血中CD4+KLRG1+细胞比例显著高于高qHBsAg组。如图2G-G'所示，与高qHBsAg患者相比，低qHBsAg患者KLRG1+ CD4细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达增加约2-3倍，进一步证实了qHBsAg的丢失可能与CD4-CTL的出现有关。RNA velocity 分析表明，FC患者CD4-CTL的出现和增加很可能是由naïve CD4细胞分化而来(图2H)。轨迹分析也揭示了CD4-CTL和传统CD8 T细胞之间存在明确界限。作者鉴定了两种CD8 T细胞亚群：一种细胞主要在CHB中，也产生耗竭的CD8 T细胞，以PDCD1、LAG3和TIGIT的表达为标志(图2C, D)。FC的标志是耗竭的CD8 T细胞簇明显消失。剩余的CD8 T细胞亚群向NKT和cNK细胞转变。在CMV暴露的情况下也观察到类似的观察结果，CD8 T细胞表现出先天样特征，这归因于BCL11B表达缺失。cNK和NKT细胞簇在FC患者的LR-NK细胞中增加，这表明从CD8到NKT或cNK到LR-NK的转变可能促进固有免疫激活状态。总之，这些数据表明存在与CD4-CTL表达效应蛋白(PRF1, GZMA, IFNG, TNF)和通路(如IL2, STAT5)相关的适应性免疫应答改变。也强调了T细胞的可塑性以获得先天样特征功能。图2 FC患者表现出Tregs缺失、CD8 T细胞耗竭以及cd4相关适应性免疫反应的出现抗原特异性CD4 T细胞在FC患者中作为病毒清除的关键调节因子接下来，作者利用流式细胞术全面表征并比较了在CHB患者(n=17)和FC患者(n=6)肝脏和PBMCs中发现的CD8和CD4 T细胞群的表型。HBV DNA水平和qHBsAg水平之间有很强的正相关。组织驻留(CD69+) CD4和CD8 T细胞显示了记忆样T细胞(CD127+)频率的增加，以及衰老(CD57+)和终末分化(HLADR+)标志物的丧失。这些观察结果再次表明，不仅在免疫表型变化的稳健性方面，而且在两种组织类型(肝脏与PBMCs)之间观察到的模式方面存在显著差异。耗竭和衰老的丧失，加上记忆样T细胞的增加，提示FC患者在缺乏病毒抗原的情况下，CD4和CD8 T细胞的效应表型和增殖能力增加（补充图1C-E）。这些观察结果表明，FC患者耗竭和衰老的丧失，加上记忆样T细胞的增加，提示FC患者在缺乏病毒抗原的情况下，CD4和CD8 T细胞的效应表型和增殖能力增加。补充图1在HBV感染的自然史中，HBV特异性T细胞，尤其是CD8 T细胞与病毒控制相关。作者询问HBV特异性T细胞应答在CHB和FC患者之间是否有差异。利用酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked Immunospot Assay,  ELISpot）对HBV特异性T细胞进行去卷积，发现慢性乙型肝炎患者和FC患者的HBV特异性T细胞应答均具有肽-特异性（peptide-specific）。通过细胞内细胞因子染色进行的进一步分析表明，在出现FC的患者中，HBV特异性T细胞主要包含在CD4 T细胞群中，而HBs-特异性CD4 T细胞的出现频率高于相应的CD8 T细胞(图2I)。在所有CHB患者中均发现了核心和HBx-特异性CD8 T细胞，但频率较低(无论qHBsAg水平如何，图2I)。FC患者的pol和HBs特异性CD8 T细胞明显增加。HBV特异性CD4 T细胞(主要是pol和HBs特异性)只在出现FC的患者中观察到(图2I)，这提示在功能性治愈的长期维持中，某些肽-特异性（peptide-specific）T细胞的稳健效应功能具有重要意义。肝内NK细胞在FC患者中表现为启动状态除了CD4-CTLs的增加外，FC患者还表现出经典固有免疫应答的增加。肝脏scRNA-seq数据的分析显示，LR-NK细胞显著增加(图3A-A′)，这些细胞被认为通过分泌细胞因子和参与与各种类型细胞的信号相互作用(如招募DCs到炎症部位，促进抗原交叉呈递，从而重塑肝脏环境。FCGR3A+传统NK (cNK)细胞直接参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并且可促进抗病毒T细胞应答，在FC患者中也显示出轻度增加(图3A-A′)。LR-NK细胞和cNK细胞的免疫效应功能均增加，并具有细胞因子-趋化因子分泌特异性（图3B-C）。此外，肝脏中流式细胞术分析显示，随着qHBsAg水平的下降，CXCR6+ CD69+ NK簇逐渐富集(图3D)。在FC患者中，这些细胞中激活性受体(NKp46、CD38、NKG2D和TRAIL)的表达升高和抑制性受体(如PD1和TIM3)表达降低(图3D’-D’’)。在早期的研究中已经报道过CXCR6+ CD69+ NK细胞是scRNA-seq分析中确定的LR-NK细胞的代表。也就是说，部分FC患者的LR-NK细胞还表现出其他抑制性受体的中高表达，如PD1和LAG3(图3D’-D’’)。基于这些标志物，作者确定了CD69+ CXCR6high CD16-(图3D' )和CD69+ CXCR6low CD16+(图3D' )细胞亚群，这些细胞随着HBsAg水平下降而出现，并在FC中富集。作者还发现了另一个由CD69+CXCR6- CD16-标记的细胞群，该细胞中qHBsAg水平较低(图3D'-3D'')。总之，多参数流式细胞术数据表明，组织驻留的NK细胞的效应细胞毒性功能必须被活化和抑制受体的平衡表达仔细调节。图3 FC患者表现出肝内NK细胞的预激状态FC患者肝内髓样环境重塑为免疫活跃状态以上数据表明FC患者的肝脏逐渐向免疫激活状态转变。为了了解患者的全身免疫反应，作者通过Luminex分析了血浆细胞因子、趋化因子和可溶性受体。血浆分析显示，促炎细胞因子和趋化因子如IL -1 β， ENA-78 (CXCL5)， BAFF和MCP-1 (CCL2)逐渐增加，而qHBsAg水平降低。其中，ENA-78是一种上皮中性粒细胞吸引蛋白，已知由内皮细胞产生，募集中性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜酸性粒细胞到肝脏，这表明FC患者的低度炎症。中性粒细胞是构成抵御病原体第一道防线的肝内髓系细胞群的关键组成部分。越来越多的证据表明，中性粒细胞可作为固有免疫的长期调节剂，并在病毒感染和消退期间改变免疫环境中发挥作用。因此，作者探索了中性粒细胞的性质和组成在CHB和FC患者的全血和肝室中的变化。如图4A和A'所示，FC患者的全血总体中性粒细胞频率较低。然而，cluster 4(图4A和A′′cl4)显示的成熟亚群似乎在FC患者中频率增加。在不同的全血中性粒细胞亚群中， FC患者的中性粒细胞募集标志物(如CXCR2、CXCL8、CEBPB、NCF和NAMPT)总体下降。然而，在FC患者中，全血cl4中性粒细胞显示出高水平的DUSP1、PTGS2、CEBPB、ISG15、IFIT3、IFITM1和IFITM3的表达(图4B)。与CHB患者相比，FC患者上调的通路显示了通过NFkB、干扰素应答、细胞因子产生的调节、对病毒和模式识别受体通路的应答增加(图4B'和B')。FC患者的肝室中中性粒细胞数量高于CHB患者(图4C-C”)。中性粒细胞的富集可能是由于在肺部疾病和其他组织中经常观察到的中性粒细胞浸润和边集现。此外， 中性粒细胞和内皮细胞的CXCR4-CXCL12相互作用增加，CXCR1/2-CXCL2相互作用减少(图4D)，这意味着在功能治愈的患者中，中性粒细胞运输增加，并且它们长期驻留在肝脏内。FC中性粒细胞中干扰素刺激基因(ISG)的减少表明，它们可能不再积极地参与诱导先天应答(图4E)。然而，这些细胞在病毒再激活过程中反复暴露的情况下，仍有能力分泌关键细胞因子给信号效应细胞(CD4/CD8 T细胞，NK细胞)以清除病毒。此外，作者还分析了MacParland等人整合的健康肝脏中的髓系细胞中炎症基因的表达，并将其与作者自己的scRNA-seq数据进行了比较。FC患者的髓系细胞显示出不同水平的促炎和免疫活性基因(IL1B, TNF, IFNG, TGFB1, NFKB1, IL6和CD80)，而抗炎基因，如IL10的表达似乎在FC患者中比CHB和健康肝脏低得多。此外，髓系细胞的单细胞谱也提示，FC患者的肝脏环境发生了明显的重塑，转变为免疫活动状态。流式细胞术分析证实，FC患者肝脏内的CD14+促炎单核细胞增加，表明存在低级别免疫应答的生态系统。CellPhoneDB分析显示，DC2和FOLR2/VSIG4 KC群体与CD4-CTLs和记忆样CD8细胞均显示出稳健的相互作用(补充图2E-E”)，因此提示它们在诱导主动免疫应答方面的假定功能。总之，这些数据强调了髓系细胞在调节从抗炎环境向免疫活性环境的转变方面的重要功能，其机制可能是通过FOLR2/VSIG4 KCs调节增加的病毒抗原呈递和效应细胞的再教育。重要的是，这些结果强调了中性粒细胞作为FC患者持续病毒清除的重要介质的重要作用，并进一步支持增强的固有免疫反应可能在实现功能性治愈中发挥重要作用的假设。补充图2图4 FC患者肝脏内存在边缘中性粒细胞图5 功能性治愈患者肝细胞中MHC II类分子表达增加FC患者肝细胞表达MHC-IIFC患者肝脏中的免疫细胞谱显示肝脏环境中存在促炎开关，通过LR-NK，cNK和中性粒细胞增加固有免疫应答；通过特异性KCs促进CD4和CD8 T细胞的抗原呈递；以及CD4-CTLs的出现，这些CTL可以被促炎刺激(IL2, TNF, IFNG)激活，并由KC培养。目前的关键问题是，在功能性治愈患者中，CD4-CTL或HBV特异性T细胞如何有效靶向呈递病毒抗原的肝细胞。在这项研究中，作者成功地从15例CHB和8例FC患者中提取了足够数量的肝细胞(n~1850)。肝细胞亚群(图5A-A′′)似乎与FC患者特异性相关。除了HLA-A、HLAB和HLA-C表达外，MHC Il类分子(包括HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、CD74和CTSS)也高表达(图5B、C)。总体而言，与CHB患者相比，FC患者中MHC I/MHC ll值较低的肝细胞数量较多。据报道，干扰素治疗可在体外肝细胞(HepG2-NTCP和PHH)和体内小鼠模型中诱导MHC Il类分子表达。通路分析显示，在MHC ll高的肝细胞中，细胞质翻译、抗原呈递和处理、凋亡、白细胞分化信号和淋巴细胞活化等增加(图5D)。在CellPhoneDB分析中，与CHB患者相比，FC患者中肝细胞与LR-NK或CD4-CTLs之间的HLA-C-FAM3C、EGFR-MIF、EGFR-COPA的相互作用减少，而XCR1-XCL1/2、HLA-DPA1-TNFSF9、CD74-COPA、CD74-MIF的相互作用增加(图5E-F)。即使在NUC+/-IFNa治疗后HBsAg仍然为阳性的患者(表1)，与FC (Sloss)患者相比，MHC Il基因(HLA-DRA、HLADRB1、HLA-DPB1)的表达显著减少(图5G)。与此同时，与FC患者相比，接受治疗的非sloss (NSLoss)患者还表现出功能障碍、耗竭的CD4-CTL其效应蛋白(如GZMA、PRF1和TNF)的表达水平较低(图5H)，同时检查点基因(包括PDCD1)的表达水平显著较高(图5H’)。总之，MHC ll高的肝细胞与LR-NKs细胞和活化的CD4-CTL之间的相互作用增强，可能触发靶向免疫应答，从而维持对CHB的长期控制。作者猜想是否有低水平的残留HBsAg由整合DNA合成，或极低水平的残留活性cccDNA可能被anti-HBs抗体掩盖，因此不容易被qHBsAg检测法检出。通过数字微流控PCR对FC患者进行的病毒学研究显示，与CHB相比，FC患者的肝活检中cccDNA水平低50倍，但持续存在(图6A)。此外，尽管FC患者的cccDNA、HBV DNA(图6B)和3.5kb HBV RNA水平较低，但FC患者的3.5kb HBV RNA与cccDNA的比值与CHB患者相似(图6 C-D)。此外，利用HBV-bait捕获富集的病毒序列的单细胞cDNA扩增(sccDNA)证实了数字微流控PCR的结果(图6E-H)。具体来说，在映射到与患者匹配的病毒基因型(图6E-H)后，病毒转录本在CHB(图6E, F)和FC(图6G,H)肝细胞中均有表达。正如预期的那样，从FC样本分离的肝细胞中病毒转录水平比CHB低100-1000倍。总之，这些数据表明，FC患者的残留cccDNA可被积极转录，以支持少量肝细胞内低水平的持续病毒复制。图6 FC患者肝细胞内存在低水平的cccDNA和病毒转录物总结在这项工作中，作者使用了多种方法包括单细胞测序、流式细胞术、ELISpot、细胞内细胞因子染色等等，主要研究了乙肝患者不同治疗结局中的免疫病理标志以及潜在的机制。文章的亮点之一就是数据，作者的患者数据非常丰富,不仅有不同乙肝患者而且测了肝脏组织以及样本匹配的PBMCs。通过单细胞分析肝组织和相匹配患者的PBMCs中疾病相关细胞状态研究，以此来为非功能性治愈患者的潜在机制提供新的见解。另外的一个亮点是，虽然文章以生物信息分析为主，但使用了非常多的湿实验手段，来证明生信分析的结果。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。