HBV核心蛋白 x cccDNA

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是肝硬化(cirrhosis)和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要病因。目前，全球约有超20亿人感染过HBV，其中2.96亿人（约占总人口3.7%）患有慢性HBV感染，每年可导致全球约82万人死于肝硬化和HCC并发症。 即使有预防性的疫苗，每年仍有约150万例新发感染。世界卫生组织设定了到2030年消除HBV的目标，即与2015年相比，HBV相关死亡率降低65%，发病率降低90%。 当前，临床治疗中关于HBV的疗法已取得显著进展，为实现慢性乙肝（Chronic hepatitis B，CHB）的功能性治愈（乙肝表面抗原（HBsAg）消失）和完全治愈（清除共价闭合环状DNA（cccDNA）和整合HBVDNA）提供了希望。 劲帆医药结合现有及自主研发的肝脏特异性启动子，成功开发了rAAV-HBV1.3-mer WT replicon和rAAV-1.2×HDV系列造模病毒产品，另外还与武汉大学合作开发了一系列AAV-HBV-1.04乙肝造模病毒产品，通过ATR介导DNA损伤（DDR）形成HBV cccDNA，使乙肝表面抗原HBsAg和HBV子代产生，实现更好地模拟病毒复制过程。以上产品具备成模率高、稳定性好、适用范围广等优势，加速推进了乙肝/丁肝病毒复制机制的研究及抗乙肝/丁肝药物的研发进程。 此外，劲帆医药还拥有专业的体内外药效评价团队，可提供肝脏疾病药物筛选、药效学评价、药代动力学研究、Non-GLP非临床安全性评价等服务项目，全面覆盖药物临床前研究的完整流程。 近期，来自美国国立卫生研究院（NIH）国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的Marc G. Ghany研究团队在期刊《Gastroenterology》上发表了题为“Current Best Practice in Hepatitis B Management and Understanding Long-term Prospects for Cure”的综述，该综述涵盖了当前慢性HBV感染的最佳管理实践和HBV感染的新兴疗法及其治愈前景。 1 HBV介绍 01 HBV生命周期 HBV颗粒（也称Dane particle）由一个外层脂质包膜和一个内部核衣壳组成，核衣壳内含有病毒遗传物质（DNA）和复制所需的酶（聚合酶）。病毒基因组是部分双链DNA，具有四个重叠的开放阅读框，它们编码以下7种病毒蛋白：聚合酶，核心蛋白，乙肝e抗原（HBeAg），大、中、小三种HBsAg以及X蛋白。病毒生命周期如图1所示。复制过程中，会产生双链线性DNA（约占5%～10%），这些DNA可能随机整合到宿主基因组中,进而引发肝细胞癌（HCC）。相当比例的HBsAg可能来源于整合的HBV DNA。 图1 HBV生命周期和药物开发靶点 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 02 HBV感染后的免疫机制 免疫反应在HBV清除中起着重要作用。HBV不易激活包括Ⅰ型干扰素（IFN）途径在内的细胞内先天防御机制，但可以通过Ⅰ/Ⅲ型IFN和细胞内抗病毒传感器（如Toll样受体（TLRs）、视黄酸诱导基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）样受体）的药理学激活和外源性IFN治疗来抑制其复制。HBV还可以通过HBV前基因组RNA（pgRNA）与RIG-Ⅰ之间的相互作用以及体外肝细胞中的IFN刺激来诱导产生Ⅲ型IFN。 此外，在急性HBV感染患者中，自然杀伤（NK）细胞和NKT细胞可在早期被激活。因此，一旦HBV在肝细胞中复制，Ⅲ型IFN以及NK细胞和Kupffer细胞（也称枯否细胞）的激活可能有助于在感染早期调节病毒复制和病毒传播。 在动物模型中，T细胞已被证实是HBV清除和肝病发病机制中的关键因素。CD8 T细胞能识别和杀死病毒感染肝细胞，而CD4 T细胞则提供关键的T细胞和协调免疫反应。在急性HBV感染的患者中，广泛的抗病毒T细胞反应和HBsAg特异性中和抗体反应能有效清除病毒，HBV特异性记忆T细胞还能在急性HBV感染临床缓解后持续数十年，这些记忆T细胞由体内微量病毒维持，并可能介导病毒控制；B细胞也参与HBV控制，慢性HBV感染涉及特异性及全身性T细胞和B细胞功能障碍，由于长期暴露于病毒抗原和炎症介质，这将导致免疫衰竭和免疫失调。 另外，先天性和适应性免疫细胞的非特异性炎症浸润在HBV感染的肝脏中积聚，并促进肝细胞损伤和纤维化，而无法抑制病毒。因此，免疫介导的HBV治疗需要在病毒免疫控制和肝细胞损伤之间取得平衡以避免不良临床后果。 2 治疗策略 01 HBV感染治疗目标 慢性乙肝（CHB）治疗的主要目标是预防肝硬化、HCC发展和降低肝脏相关死亡率。然而，从感染HBV到发生这些终点事件，病情发展通常需要经过几十年。因此，评估慢性HBV感染治疗方法的研究依赖于替代终点，包括HBV DNA水平低于可检测下限、谷丙转氨酶（ALT）正常化、HBeAg清除、HBsAg清除和组织学改善，其中HBsAg清除被认为是最佳的终点，但自发性和治疗相关的HBsAg清除率较低，每年大约只有1%。 02 CHB治疗指征 CHB是一种动态疾病。HBeAg状态、HBV DNA和ALT水平是评估CHB疾病活动的主要指标。美国肝病研究学会（AASLD）、欧洲肝病研究学会（EASL）和亚太肝病研究学会（APASL）这三大肝脏学会已就治疗指征提供了指导（表1）。此外，世界卫生组织针对可能无法进行病毒载量检测的低收入和中等收入国家开发了一种更为简化的治疗方法。所有指南均强烈建议对失代偿性肝病、肝硬化，以及具有活动性疾病指征的患者（HBV DNA和ALT水平升高的患者）进行治疗。其它治疗或预防指征见表2。 另有一些专家提出了一种可替代且更简化的“全面治疗”法，即无论患者ALT水平如何，对所有HBsAg阳性且可检出病毒血症的个体进行治疗。但该方法在部分患者中存在争议，研究人员建议“逐例分析”，来考虑疾病进展和肝癌的风险因素以及患者接受治疗的意愿，从而处理指南治疗标准之外的情况。 表1 关于CHB肝病学会指南和世界卫生组织的治疗指征 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 表2 关于HBV感染的其他治疗及预防指征 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 03 CHB治疗药物 美国已获批7种用于治疗慢性HBV感染的药物，包括标准干扰素α-2b（美国和欧洲已不再使用）、聚乙二醇干扰素α-2a、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韦（adefovir）、替比夫定（telbivudine）、恩替卡韦（entecavir, ETV）、富马酸替诺福韦二吡呋酯（tenofovir disoproxil fumarate, TDF）和替诺福韦艾拉酚胺（tenofovir alafenamide, TAF）。由于聚乙二醇干扰素具有更优越的药代动力学和给药方案（每周一次与每周三次相比），因此它优于标准干扰素。 在核苷（酸）类似物中，由于恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺具有更强的药效和更低的抗病毒耐药性，因此它们被推荐用于替代拉米夫定、阿德福韦和替比夫定。肝病学会指南推荐了两种治疗策略（表3）。一种是使用聚乙二醇干扰素α-2a进行为期48周疗程治疗，另一种是使用推荐的核苷（酸）类似物之一进行长期治疗。 表3 目前获批上市的治疗CHB药物及其疗效 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） ▎聚乙二醇干扰素α-2a 作用机制：尚不完全清楚，但具有抗病毒和免疫调节两种特性。 推荐剂量和治疗周期：对于HBeAg阳性和HBeAg阴性的患者，推荐剂量均为180mg，每周一次皮下注射，持续48周。 优点：HBeAg阳性患者的HBeAg清除率较高（30%），并能在较短时间内清除HBsAg（HBeAg阳性患者为2%-7%，HBeAg阴性患者为4%），特别是在HBV基因型为A、B的患者中。此外，HBeAg和HBsAg能保持持续阴性。 缺点：需要皮下注射给药，存在许多严重的不良事件。 禁忌症：禁用于失代偿性肝硬化患者、伴有临床上显著门静脉高压的代偿性肝硬化患者和妊娠期女性。 ▎核苷（酸）类似物 作用机制：通过被HBV逆转录酶整合到新合成的DNA中，作为DNA链终止剂抑制病毒复制。 优点：核苷（酸）类似物的疗效因药物而异（表3），普遍具有良好的安全性和耐受性。 缺点：对cccDNA无活性，停药后易复发；存在引起肾病和骨量丢失的风险，尤其是TDF。 适用人群：可用于失代偿期肝硬化患者和孕妇，用以治疗或预防母婴传播。 04 治疗终点 在HBeAg阳性患者中，聚乙二醇化干扰素相关的HBeAg血清学转换是主要治疗终点之一。大约25%的患者在短期（停药后的6-12个月）内可以持续抑制HBV DNA至2000 IU/mL以下。相比，在HBeAg阴性患者中，只有19%的患者可以在停药后维持HBV DNA ＜400 copies/mL。 使用核苷（酸）类似物治疗时的最佳终点是至少2次检测中确认HBsAg已清除，无论是否出现Anti-HBs。对于非肝硬化、HBeAg阳性的患者，如果实现HBeAg血清学转换、HBV DNA检测不出，并接受至少12个月的巩固治疗，则可以停用核苷（酸）类似物。 建议进行至少1年的治疗后监测（每3个月一次），以检测疾病是否重新活跃。对于HBeAg阴性患者，AASLD建议进行无限期治疗，直至HBsAg消失。对于无肝硬化的患者，如果实现HBV DNA检测不出且ALT水平正常持续2-3年，APASL和EASL则建议可以停止治疗。 实际上，病毒学复发几乎普遍存在，停药后的前3个月内，10-30%的患者观察到病情恶化，近一半的患者可能需要重新开始治疗。因此，停用治疗的决定需要与患者仔细商议，并且患者必须同意在停药后接受密切监测。由于存在肝功能失代偿的风险，肝硬化患者不应停用抗病毒治疗。 05 未治疗患者的监测和筛查 由于慢性HBV感染的动态特性，未治疗患者应每3～6个月检测一次HBV DNA和ALT水平，直至出现自发性HBsAg丢失。对于HBeAg阳性患者，应每6～12个月检测一次HBeAg状态。对于HBeAg阴性、HBV DNA水平较低（<2000 IU/mL）且ALT水平正常（非活跃性携带者/HBeAg阴性慢性感染）的患者，应在1年内每3个月检测一次HBV DNA和ALT水平，以确认疾病处于非活跃状态，之后可每6～12个月监测一次，还应每年检测一次HBsAg丢失情况，以及每2～3年进行一次无创性肝纤维化评估。 针对肝硬化患者，应每6个月进行一次超声筛查，可结合甲胎蛋白（AFP）检测。HBsAg阳性且无肝硬化的成年人，但如果属于HCC高风险人群（40岁以上的亚洲或黑人男性以及50岁以上的亚洲女性、一级亲属有HCC病史者、或丁型肝炎病毒感染者）也应每6个月进行一次筛查。HBsAg清除后，对于肝硬化患者、一级亲属患HCC或有长期感染史（男性>40岁，女性>50岁）的患者，应继续进行HCC监测。 3 创新疗法 由于上述疗法对cccDNA和整合HBV DNA的影响有限，且无法恢复慢性HBV感染的免疫功能紊乱。因此，迫切需要能够实现高HBsAg清除率的治疗方案。目前在研的创新疗法包括阻断病毒产生（表4，图1）和恢复耗竭的免疫反应（表4，图2）。 表4 目前在研的抗病毒药物 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 图2 HBV发病机理中的免疫亚群及免疫调节治疗策略 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 01 直接抗病毒药物 靶向病毒入侵的前提是阻断新一轮的肝细胞感染，从而防止cccDNA的形成并减少cccDNA库。 Bulevirtide：能不可逆地阻断牛磺胆酸钠共转运蛋白受体，从而阻止病毒入侵，现已被欧洲药品管理局（EMA）批准用于治疗慢性丁型肝炎病毒感染。研究结果显示，在HBeAg阴性的CHB患者中，以不同剂量给予Bulevirtide 12周后，少数患者的HBsAg水平下降了≥0.5log IU/mL，但无人实现HBsAg清除，还观察到无症状的胆汁酸升高。 Hepalatide：另一种牛磺胆酸钠共转运蛋白受体阻断剂，目前正在进行一项双盲、安慰剂对照的Ⅱ期临床研究，用以评估其联合pegylated IFN与单独使用pegylated IFN治疗CHB的效果。 单/多克隆抗体制剂：除阻断病毒入侵外，单克隆抗体还可以降低病毒血症和亚病毒颗粒水平，并通过呈递病毒抗原刺激T细胞，使得HBsAg清除。GC1102是一项正处于Ⅱ期临床试验中的重组乙型肝炎免疫球蛋白。VIR-3434是一种新型单克隆抗体，正在病毒抑制患者中进行Ⅰ期临床研究（NCT04423393），初步结果表明，HBsAg水平呈剂量依赖性快速下降，且未发生显著不良事件。 ▎靶向HBV转录物的药物 抑制病毒产生的另一种方法是通过RNA干扰（RNAi）和反义寡核苷酸（ASOs）靶向编码信使RNA（mRNAs）的蛋白质。这种方法的治疗优势是单个小干扰RNA（siRNA）/ASO可以沉默多个病毒转录物。 siRNA：能与病毒mRNA结合，并引起细胞内RNA诱导的沉默复合体（RISC）降解病毒RNA。然而，由于该种疗法存在递送载体毒性和长期作用效果差，因此研究人员建议可以作为诱导疗法在短期疗程内给药以降低HBsAg水平。在部分患者中，研究人员发现AB-729可抑制HBsAg水平，从而增强HBV特异性免疫反应，这可能是该药物的另一个益处。 ASOs：能与病毒mRNA结合，并通过RNAseH1或空间位阻效应诱导其降解，从而阻止翻译。目前有两种反义分子，bepirovirsen和IONIS-HBVLRx，正在接受核苷（酸）类似物治疗的患者中进行Ⅱa期临床试验，最近的研究进展显示其均有积极的治疗效果。 ▎靶向HBV核心蛋白的药物 HBV核心蛋白作为病毒核衣壳的结构蛋白，是基因组进行逆转录和复制的场所。核心蛋白还调节HBV基因组的亚细胞转运和释放、RNA代谢、cccDNA转录，并抑制宿主先天性免疫反应。因此，HBV核心蛋白是乙肝药物开发的一个重要靶点。 核心蛋白变构调节剂（CpAMs）通过形成异常组装的核衣壳或缺乏pgRNA的形态正常但空的核衣壳（或两者兼有），来抑制HBV复制。目前至少有12种CpAMs处于药物开发的不同阶段（表4）。CpAMs在抑制所有HBV基因型的HBV复制方面非常有效，不过该类药物必须与一种或多种不同类型的抗病毒药物联合应用。CpAMs与核苷（酸）类似物联合应用时，会带来更快和更显著的病毒抑制作用。 ▎靶向HBV聚合酶的药物 靶向HBV聚合酶逆转录酶功能的药物是治疗慢性HBV感染广泛使用的药物。ATI-2173是一种乙肝病毒聚合酶抑制剂。在Ⅰ期临床研究中，28天给药后导致HBV DNA平均减少2.8 log10 IU/mL，且无任何严重不良事件。预计在短暂的给药间隔内，HBsAg水平没有变化，该药的Ⅱ期临床研究正在进行中。其他靶向HBV聚合酶如pradefovir、HS-10234，分别源自阿德福韦和替诺福韦，旨在提高抗病毒效力并降低代谢物毒性。初步数据表明，其有效性与TDF相似。靶向HBV聚合酶RNase H功能的药物也正在临床前开发中。 ▎靶向HBsAg释放的药物 由于HBsAg的清除被定义为功能性治愈，因此开发能够降低HBsAg水平和限制病毒产生的药物引起了研究人员的极大兴趣。此外，HBsAg在慢性HBV感染中以亚病毒颗粒的形式大量循环，因此有望通过降低HBsAg来恢复免疫反应。核酸聚合物（NAP）是一种短的合成寡核苷酸，能够与HBV亚病毒颗粒相互作用并阻断其分泌。一项只有40例病患的临床研究中，研究人员评估了REP2139或REP2165这两种NAPs与替诺福韦和pegylated IFN联用，并与替诺福韦和pegylated IFN单用进行了为期48周的比较。 结果显示，在治疗方案中加入NAPs的情况下，44%的患者HBsAg持续降低至检测水平以下，且全部产生了Anti-HBs，大多数接受NAPs治疗的患者（90%）观察到3-4级ALT升高，而在未接受NAP治疗的患者中为20%。未来还需要更大数量患者组的对照研究来进一步评估NAP的有效性和安全性。 另一种类似方法是使用S-抗原转运抑制寡核苷酸聚合物（STOPS）。STOPS也是一种单链寡核苷酸，可以隔离HBsAg产生所需的细胞蛋白。体外研究表明，STOPS比NAP具有更大的效力。然而，该药物的Ⅰ期临床研究结果显示，HBsAg未显著降低，因此试验已被终止。 ▎靶向HBV cccDNA的药物 消除肝细胞核内的cccDNA是治愈慢性HBV感染的关键。目前，有几种消除或沉默cccDNA的方法正在临床前开发阶段。然而，脱靶效应的潜在风险可能会限制这一方法的应用。基因编辑技术如锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶和CRISPR/Cas-9蛋白，通过在DNA中引入靶向双链断裂，然后通过同源修复在裂解位点产生突变使cccDNA失活。一项使用来自嗜热链球菌的CRISPR/Cas9系统对HBV感染细胞系的研究中，成功清除了90%的HBV cccDNA。 但在靶标特异性、安全高效以及提高编辑效率以消除所有cccDNA等方面还需进一步的研究。此外，靶向HBV X蛋白（HBX）可能是沉默cccDNA的可行方法。Pevonedistat和dicoumarol显示可降低HBX表达，恢复Smc5/6水平，并在培养的肝细胞和人源化小鼠模型中抑制病毒转录。另外，通过上调APOBEC3A/B表达也可导致cccDNA降解。 02 间接抗病毒药物 当前与治疗相关的一个问题是，是否可以通过纯抗病毒方法实现治愈，或者是否有必要添加免疫调节剂。目前的免疫学方法均针对先天性和适应性免疫系统，以广泛增强细胞防御并促进HBV适应性免疫应答（图2）。 ▎靶向先天性免疫系统 先天性免疫系统对HBV的识别能力很差，因此HBV被视为一种隐匿性病毒。然而，观察到肝非实质细胞产生的某些细胞因子（如IFN-α、IFN-γ、肿瘤坏死因子-β和白细胞介素[IL]-1α）以及LTbR介导的APOBEC（载脂蛋白BmRNA编辑酶，催化多肽样）激活或RIG-I激活，可以通过非细胞溶解机制抑制甚至清除HBV，这为开发先天性免疫反应的外源性激活剂提供了理论依据。几种病原体识别传感器的激动剂，例如TLRs、RIG-I和干扰素基因刺激物（STING），已被证明能诱导产生IFN刺激基因和促炎细胞因子，从而清除病毒。 先天免疫激动剂 TLRs在许多细胞亚群（包括免疫细胞）中表达，作为病毒和细菌病原体相关分子模式的传感器，在宿主防御中发挥着重要作用。在土拨鼠模型中，CpG寡脱氧核苷酸与ETV联合治疗被证明可以抑制土拨鼠肝炎病毒的病毒载量。几种口服TLR-7/8激动剂正在进行临床试验，包括GS-9620、RO7020531（RG7854）、RG7795（ANA773）、JNJ-4964（AL-034/TQ-A3334）和GS-9688。 刺激和恢复适应性免疫因子 目前临床上已经探索了几种策略来重新激活对HBV的弱适应性免疫应答，其中一个关键考虑因素是安全诱导治疗应答，而不会引起严重的肝细胞损伤和临床失代偿。 免疫检查点抑制剂：在一项小型试验研究中，评估了在核苷（酸）类似物治疗的患者中使用PD-1抑制剂（nivolumab）的效果，观察到HBsAg有轻微下降。一名患者在3级ALT升高之前实现了HBsAg血清学转换，且未观察到严重不良事件。最近的一项Ⅱ期临床研究评估了在有核苷（酸）类似物治疗经验的患者中使用PD-1单克隆抗体恩沃利单抗（envafolimab, ASC22）的效果。 观察到HBsAg最大降低1.2log10 IU/mL，且未出现显著的ALT升高，患者对治疗耐受性良好。另一种靶向PD-1途径的方法是通过核糖核酸酶H（RNAseH）途径降解PD-1配体mRNA。尽管免疫检查点抑制具有潜在作用，但对其安全性和不可预测反应还需进行更大规模的研究。 基因编辑T细胞：免疫疗法在癌症治疗中的成功，为乙肝治疗提供了新思路，如使用CAR-T细胞、TCR-T细胞激活T细胞受体，从而更新替代体内耗竭的T细胞并产生新的功能性T细胞。动物模型的初步证据表明，这种方法可以降低HBsAg和HBV DNA的水平，而不会引起显著的肝脏损伤。未来还需要在非肝细胞癌患者中进行进一步的临床研究以验证其安全性和有效性。 新型治疗性疫苗：目前的疫苗方法采用独特的策略来提高疫苗效力，包括纳入多种抗原以扩大T细胞应答（GS-4774，一种包含HBsAg、HB核心抗原和HBX的酵母载体）；改进递送系统（电穿孔，例如编码HBsAg和HB核心抗原的INO-1800疫苗，编码HBV核心和聚合酶蛋白的JNJ-64300535疫苗）；采用新型佐剂（INO-1800疫苗加INO-9112）；与检查点抑制剂联合使用；使用病毒载体（非复制型人腺病毒、黑猩猩腺病毒、改良后的安卡拉痘苗病毒和沙粒病毒）等。 — 总结 — 慢性HBV感染会导致慢性肝炎，患者一生都有发展为肝硬化和肝细胞癌的风险。因此，有必要进行终身监测以检测疾病进展。尽管当前治疗能改善临床结局，但由于药物对共价闭合环状DNA（cccDNA）和整合HBV DNA效果甚微，因此无法完全实现长期治愈。 鉴于全球疾病负担，迫切需要更有效的治疗方法，对HBV生命周期和持续性感染的免疫发病机制有更深入的了解，以及开发创新药物和给药方式。要实现功能性治愈可能需要多种药物联合治疗，包括抗病毒药物、降低病毒抗原负荷的药物以及增强免疫反应的免疫调节剂。 另外，还需要进一步完善基因编辑疗法。疾病负担在低收入和中等收入国家最为严重，因此，就需要开发出更安全、有效、疗程有限且负担得起的治疗方法。 扫码获取全文 劲帆医药已开发rAAV-HBV1.3-mer WT replicon、AAV-HBV-1.04（与武汉大学合作开发）和rAAV-1.2×HDV系列造模病毒产品，具备成模率高、稳定性好、适用范围广等优势，加速推进了乙肝/丁肝病毒复制机制的研究及抗乙肝/丁肝药物的研发进程。 01 乙肝造模AAV病毒产品 ▎产品信息 可根据客户不同需求定制HBV基因组点突变株。 应用场景：慢性乙肝模型、HBV持续复制模型，可用于研究乙肝病毒复制机制及抗乙肝药物的开发。 可提供的现货产品见下表，另相关AAV-HBV-1.04系列造模病毒产品可致电客服17720514121详询。 ▎产品列表 02 丁肝造模AAV病毒产品 ▎产品信息 可根据客户不同需求定制不同肝脏特异性启动子启动的HDV基因组及其点突变株。 应用场景：慢性乙肝/丁肝合并感染模型，可用于研究丁肝病毒复制机制及抗丁肝药物的开发。 可提供的现货产品见下表。 ▎产品列表 END 劲帆医药自主研发的昆虫杆状病毒One-Bac 4.0系统，能克服传统Bac/Sf9系统感染效率低、空壳率高、种毒传代不稳定等问题，在大规模量产定制化AAV过程中，可实现高产率、高感染活性、高实心率，单批次产能可达1E+18vg，为您的基因治疗药物研发保驾护航！业务合作欢迎致电17720514121详询！ 关于劲帆医药 劲帆生物医药科技（武汉）有限公司简称“劲帆医药”，创立于2022年，提供一站式基因治疗药物CRO/CDMO服务。拥有全球领先的AAV规模化制备专利技术平台及cGMP级病毒载体生产车间，致力于推进基因治疗更有效，更安全，更经济，更可及，赋能客户，造福患者。 联系我们 电话：17720522078 官网：www.genevoyager.com 邮箱：marketing@genevoyager.com 地址：中国武汉东湖高新区光谷七路128号 微信：Genevoyager2022 关于同写意  同写意论坛是中国新药研发行业权威的多元化交流平台，二十年来共举办会议论坛百余期。“同写意新药英才俱乐部”基于同写意论坛而成立，早已成为众多新药英才的精神家园和中国新药思想的重要发源地之一。同写意在北京、苏州、深圳、成都设立多个管理中心负责同写意活动的运营。 尊享多重企业/机构会员特权  ● 分享庞大新药生态圈资源库； ● 同写意活动优享折扣； ● 会员专属坐席及专家交流机会； ● 同写意活动优先赞助权； ● 机构品牌活动策划与全方位推广； ● 秘书处一对一贴心服务。 入会请联系同写意秘书处  同写意创新链盟机构  （上下滑动查看更多） 国通新药 | 通瑞生物 | 科济药业丨立迪生物 | 森西赛智 | 汇芯生物 | 申科生物 | 方拓生物 | 东抗生物 | 科盛达 | 依利特 | 翊曼生物丨锐拓生物丨复百澳生物丨圆因生物丨普洛斯丨华润三九丨皓阳生物丨人福医药丨广生堂药业丨澳宗生物丨妙顺生物 | 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点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注直接靶向HBV的小分子抑制剂研究进展来源《药学学报》2023年作者周加慧，王硕，丁当，徐祥瑞，徐淑静，何勇，刘新泳，展鹏山东大学药学院药物化学研究所，化学生物学教育部重点实验室摘要乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染严重威胁人类的生命健康。现有治疗药物干扰素和核苷（酸）类似物具有不良反应严重，停药后易反弹以及不同程度的耐药性等问题，并且二者均无法有效清除共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），从而导致无法彻底治愈乙肝。因此，直接针对HBV自身蛋白或核酸的新药研发仍是公共卫生领域的当务之急。本文精选近10年的研究典例，从药物化学的视角总结了直接靶向HBV小分子抑制剂的前沿进展。关键词乙肝病毒；抑制剂；药物靶标；药物化学；药物设计_正文_乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝DNA病毒，包括10种主要的基因型（A~J），长期感染可引发一系列恶性病症，如慢性乙型肝炎、肝代谢失常、肝硬化甚至是肝癌[1]。根据世界卫生组织估计，截止到2019年，全球有2.96亿人患有慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB），累计报告死亡病例高达82万[2]。然而，目前已上市的小分子抗乙肝药物核苷（酸）类似物（nucleos(t) ide analogues，NAs）存在耐药性并且需要长期给药等缺陷[3-5]。因此，基于新靶标、新机制研发高效抗耐药的HBV抑制剂具有重要意义。靶向宿主或直接靶向病毒是抗病毒药物研发的主要策略，但是靶向宿主的抗病毒药物不良反应大，可能会影响宿主细胞的正常生理活动。而直接靶向病毒的药物选择性强、安全性高，因此成为抗病毒药物设计的首选策略[6]。鉴于此，本文综述了近10年文献报道的直接靶向HBV的抑制剂，主要包括靶向逆转录结构域的DNA聚合酶抑制剂、核心蛋白变构调节剂、核糖核酸酶H抑制剂、表面抗原分泌抑制剂、HBx抑制剂及cccDNA小分子抑制剂[7]（图1）。Figure 1 Outline of small molecule inhibitors directly targeting hepatitis B virus (HBV) in this review1HBV的生命周期HBV的生命周期包括吸附、侵入、脱壳、修复、转录、翻译、衣壳装配、DNA复制、包膜的形成及释放等步骤（图2）[8]。首先，HBV可逆、非特异性地与肝细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）结合，然后病毒表面蛋白的preS1结构域特异性识别并结合牛磺胆酸钠离子转运多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）进而侵入肝细胞内[9]；随后，病毒衣壳被释放至细胞质中，衣壳内的松弛环状DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）被转运至细胞核；利用宿主DNA修复机制，rcDNA被修复形成cccDNA（covalently closed circular DNA）。以cccDNA为模板转录成4种RNA，包括3.5kb的pgRNA（pregenomic RNA）和3种亚基因组RNA（2.4kb的preS1、2.1kb的preS2和0.7kb的X RNA）。这些RNA能产生7种蛋白质，即pgRNA翻译的核心蛋白（HBV core protein，HBc）和聚合酶（polymerase，pol）；precore RNA翻译的分泌型e抗原（HBV e antigen，HBeAg）；X RNA翻译的X蛋白（HBV X protein，HBx）；preS1RNA翻译的大乙肝表面抗原（large-HBV surface antigen，L-HBsAg）；preS2RNA翻译的中乙肝表面抗原（middle-HBV surface antigen，M-HBsAg）和小乙肝表面抗原（small-HBV surface antigen，S-HBsAg）。细胞质中核心蛋白将pgRNA和病毒聚合酶包裹起来，形成新的病毒衣壳；在衣壳内，以pgRNA为模板，由病毒聚合酶催化逆转录合成第二代病毒DNA；随后，成熟的、含有rcDNA的新生HBV衣壳重新进入细胞核被再次利用，或经过高尔基体修饰后分泌至细胞外[10]。文章内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明【来源：凡默谷公众号】。2直接靶向HBV的小分子抑制剂2.1 靶向逆转录结构域的DNA聚合酶抑制剂聚合酶中的逆转录结构域是在HBV基因组的复制和转录过程中发挥重要作用的一个关键区域，是开发抗乙肝药物的有效靶标。目前靶向逆转录结构域的抗HBV药物主要是核苷（酸）类似物，该类药物有拉米夫定（lamivudine，3TC，1，图3，原研公司：GlaxoSmithKline，1998年美国上市）、阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，ADV，2，Gilead Sciences，2002年美国上市）、恩替卡韦（entecavir，ETV，3，Bristol Myers Squibb，2005年美国上市）、替比夫定（telbivudine，TBV，4，Novartis Pharma，2006年美国上市）、富马酸替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF，5，Gilead Sciences，2008年美国上市）、富马酸替诺福韦艾拉酚胺（tenofovir alafenamide fumarate，TAF，6，Gilead Sciences，2016年美国上市）和马来酸贝西福韦酯（besifovir dipivoxil maleate，BSV，7，LG Life Sciences，2017年韩国上市）。然而，它们存在肝组织分布不佳、耐受性差和安全低等问题。在肝脏中选择性递送或激活的前药可以一定程度解决此类问题，例如替诺福韦（tenofovir，TFV）的前药TAF、tenofovir exalidex（8）等[11]。此外，该类药物在长期治疗后会产生不同程度的耐药问题，如恩替卡韦耐药株L180M、M204V/I等，影响患者长期用药的效果[12]。因此开发新结构的非核苷类HBV逆转录酶抑制剂具有重要的意义。Figure 3 Representative DNA polymerase inhibitors targeting reverse transcription domains由于难以产生大量具有DNA延伸活性的重组聚合酶，影响了非核苷类HBV聚合酶抑制剂的高通量筛选，使该类抑制剂研究进展缓慢。Nakajima等[13]通过中通量筛选鉴定出的二苯乙烯衍生物PDM2（9）能够与逆转录结构域结合来抑制HBV的复制（EC50=14.4±7.7μmol·L-1）。PDM2对野生型HBV和恩替卡韦耐药的L180M/S202G/M204V突变型HBV均表现出相当的抑制活性（EC50值分别为：13.3 ± 1.1和16.4 ± 5.4μmol·L-1）。2.2 核心蛋白变构调节剂（core protein allosteric modulators，CpAMs）HBV核心蛋白通常以二聚体的形式存在，90或120个同源二聚体核心蛋白通过相互作用形成二十面体衣壳[14]。在衣壳组装过程中，HBV pgRNA和HBV聚合酶被包裹进衣壳形成具有完整功能的核心颗粒，在其内HBV pgRNA经过逆转录和复制产生rcDNA[15]。此外，影响核心蛋白的组装不仅能阻断病毒DNA 复制，还能抑制cccDNA的从头合成[16]。因此，核心蛋白也成为了抗乙肝药物研发的热门靶标。靶向核心蛋白组装的药物被称为核心蛋白变构调节剂，也称为衣壳组装调控剂，按照结构骨架可以分为二氢嘧啶类、芳基丙烯酰胺类、磺酰苯甲酰胺类及其他类[16, 17]。2.2.1 二氢嘧啶类（heteroaryldihydropyrimidines，HAPs）二氢嘧啶类的作用机制是通过加速衣壳组装，来诱导非衣壳聚合物或核心蛋白多聚体的形成，从而干扰正常衣壳的形成。Bay41-4109（10，图4）属于第一代HAPs类核心蛋白变构调节剂。在稳定转染的HepG2.2.15细胞中显示出显著的抗HBV活性（EC50=0.05μmol·L-1，CC50=7μmol·L-1）。Bay41-4109在15mg·kg-1时即对HBV转基因小鼠表现出显著的抗病毒作用[18]，对Alb-uPA/SCID小鼠给药5天后，可将其HBV DNA降低1log10IU·mL-1[19]。但是Bay41-4109因在高剂量下诱导大鼠肝脏毒性而终止了进一步的临床开发[20]。Figure 4 Representative compounds of four generations dihydropyrimidine-based HBV core protein allosteric modulators第二代的HAPs是在第一代的基础上对C2位和C6位进行结构修饰得到的化合物。将C2位吡啶基以其生物电子等排体噻唑基取代并在C6位引入吗啉环，得到GLS4（11，HepG2.2.15细胞系，EC50=12nmol·L-1）[21]。由东阳光公司研发的GLS4不仅在野生型HBV上表现出比阿德福韦酯（HepG2.2.15细胞系，EC50=1.011µmol·L-1）更好的活性，对阿德福韦酯耐药株（rtA181T/V，rtN236T）也表现出一定的抗HBV活性（EC50=0.161µmol·L-1，EC50=0.131µmol·L-1），该化合物目前处于临床IIIa期（CTR20160068）。NVR-010-001-E2（12，HepG2.2.15细胞系，EC50=11nmol·L-1）是第二代HAPs的另一代表化合物[22], 2015年，Klumpp等[23]揭示了其与衣壳蛋白的结合模式：溴氟取代的苯基伸进由Pro25、Asp29、Leu30、Thr33、Trp102、Ile105和Ser106组成的疏水口袋中；噻唑环伸进由芳香残基Phe23、Trp102、Phe122和Tyr118形成的疏水口袋，二氢嘧啶环上的氮原子与Trp102的侧链吲哚氨基形成关键氢键；5位的酯基位于Thr109、Phe110、Thr33和Leu37形成的腔穴顶部；同时C6位的吗啉环与相邻亚基的Val124、Trp125、Thr128和Pro134形成额外的相互作用（PDB code：5E0I，图5A），因此，相较于Bay41-4109活性有所提高。与第一代相比，第二代HAPs一般还具有更低的细胞毒性和更高的水溶性。Figure 5 (A) The X-ray crystal structure of the HBV capsid hexamer bound to NVR-010-001-E2 (PDB code: 5E0I). (B) The X-ray crystal structure of the HBV capsid hexamer bound to HAP_R01 (PDB code: 5WRE). (C) The X-ray crystal structure of the HBV capsid hexamer bound to AT-130 (PDB code: 4G93). (D) The X-ray crystal structure of the HBV capsid hexamer bound to NVR 3-778 (PDB code: 5T2P). The figures were generated with PyMOL (www.pymol.org)罗氏公司在第二代HAPs类化合物C6位吗啉环上引入羧基得到的HAP_R10（13）是第三代HAPs代表性化合物。与第二代HAPs相比，其抗病毒活性得到进一步的提高（HepG2.2.15细胞系，EC50=3nmol·L-1），药代动力学性质和安全性也得到了改善[24]。将C6位吗啉环替换为偕二氟吡咯烷得到HAP_R10的类似物HAP_R01（14），该化合物具有与HAP_R10相当的活性（HepG2.2.15细胞系，EC50=6.4nmol·L-1）。并且，Zhou等[25]还揭示了HAP_R01与衣壳蛋白的结合模式：除了3位氮原子与Trp102侧链氮原子形成氢键外，羧酸部分可以与Ser141的主链氨基和侧链羟基形成双重氢键作用（PDB code：5WRE，图5B），这可能是HAP_R01的亲和力和抗病毒活性均有所改善的原因[24]。将C6位的吗啉环或偕二氟吡咯烷进一步修饰得到了化合物15（HepG2.2.15细胞系，EC50=4nmol·L-1，CC50>100μmol·L-1）和16（HepG2.2.15细胞系，EC50=0.7nmol·L-1），二者都具有较低的人肝微粒体清除率（分别为2.9和4.5mL·min-1·kg-1）及良好的药代动力学性质[26]。在C6位引入桥环得到了第四代HAPs代表性化合物RO7049389（RG7907，Linvencorvir，17），其不仅具有良好的人肝微粒体清除率（0.8mL·min-1·kg-1），也表现出突出的抗病毒活性（HepG2.2.15细胞系，EC50=7nmol·L-1；HepDE19细胞系，CC50>100μmol·L-1）[27]。RO7049389在中国健康受试者中的安全性、耐受性良好，在中国健康志愿者中的血浆暴露量高于非亚洲型健康自愿者，这为进一步的临床用药提供了指导[28]。近期公布的数据表明该药物具有较低的CYP3A4酶诱导活性、较高的代谢稳定性、较低的hERG毒性及良好的药代动力学性质[29]。该化合物目前处于临床II期试验阶段（CTR20201678）。此外，为了对GLS4的溶剂开口区进行探索，本课题组将GLS4的吗啉环替换为取代的三氮唑得到化合物18（图6），该化合物的抗HBV DNA复制的活性（EC50=0.35±0.04μmol·L-1）优于阳性对照药物拉米夫定（EC50=0.62μmol·L-1）[30]。同时，为了改善GLS4的亲水性和药代动力学性质，2021年，本课题组保留GLS4的优势片段，采用骨架跃迁策略将易代谢的吗啉环替换为由氢键供体和受体组成的不同大小的螺环。其中化合物19（EC50=0.20μmol·L-1，CC50>87.03μmol·L-1）具有较强的体外抗HBV活性，优于阳性对照拉米夫定（EC50=0.37μmol·L-1，CC50>100μmol·L-1），约为GLS4（EC50=0.045μmol·L-1，CC50>99.20μmol·L-1）的1/4。对化合物19的物理化学性质进行预测，结果显示其符合类药五原则，表明其可能有良好的吸收和渗透性[31]。2.2.2 芳基丙烯酰胺类（phenylpropenamides，PPAs）PPAs类化合物的作用机制与HAPs类不同，其是通过形成形态正常的不含pgRNA和病毒聚合酶的空衣壳来抑制HBV的复制[32]。AT-61（20，图6）和AT-130（21）是最早的两个芳基丙烯酰胺类衍生物[33, 34]。AT-61在HepAD38细胞系中可以有效抑制HBV DNA的复制（EC50=1.9μmol·L-1），对其进行系统的构效关系研究后得到化合物AT-130，抗病毒活性（EC50=0.13μmol·L-1）是化合物AT-61近15倍[35]。AT-61和AT-130都能很好地抑制野生型HBV和拉米夫定耐药株[36]。2013年Katen等[37]首次报道了AT-130与衣壳蛋白的晶体结构（图5C，PDB code：4G93），AT-130处于氨基酸残基Tyr118、Trp102和Pro25形成疏水口袋中，两个羰基分别与氨基酸残基Trp102吲哚环上氮原子和Ser106侧链羟基氧原子形成氢键，硝基中氮原子分别与Asp29主链羰基和Thr33侧链羟基形成氢键[38]。这些结合模式为基于靶标的精准药物设计提供了重要信息。2.2.3 磺酰苯甲酰胺类（sulfamoylbenzamides，SBAs）磺酰苯甲酰胺类化合物的作用机制与丙烯酰胺类相同，其早期代表性化合物是DVR-23（22），在多种细胞系中均表现出良好的抗病毒活性（AML12HBV10细胞系，EC50=0.3μmol·L-1；HepDES19细胞系，EC50=0.1μmol·L-1）[39]。诺华公司研发的NVR3-778是另一代表性化合物（23，HepG2.2.15细胞系，EC50=0.4μmol·L-1，CC50=14.5μmol·L-1），对多种耐药株（rtA181V/N236T、rtL180M/M204V、rtL180M/M204V/N236T、rtN236T和rtA181V）均具有抑制作用[40, 41]。NVR3-778以1.5 mg·kg-1的剂量对狗灌胃后平均Cmax和AUC0-inf值分别为0.56 μg·mL-1和3.50 μg·h·mL-1，平均口服生物利用度为84.6%[42]。该类药物与HAPs结合在相同的口袋（PDB code：5T2P，图5D），但结合模式有所不同，其酰胺中的羰基和氨基分别与Trp102的侧链吲哚上的氨基和Thr128侧链羟基氧原子形成氢键，且与Phe23、Tyr118和Phe122形成疏水作用。其较低的水溶性和活性阻碍其进一步开发。本课题组以NVR3-778为先导，将含有对位羟基的哌啶环替换为间位的苯硼酸并适当延长碳链得到化合物24。在HepDES19细胞系中，该化合物活性（EC50=0.83±0.33μmol·L-1，CC50=19.4±5.0μmol·L-1）与先导NVR3-778（EC50=0.73±0.20μmol·L-1，CC50=23.4±7.0μmol·L-1）相当。在pH=7时，化合物24的水溶性（328.8μg·mL-1）相较于先导化合物（35.8μg·mL-1）得到了显著提升[43]。将NVR3-778做成羧酸酯前药25亦显著改善水溶性[44]。此外，强生公司研发的JNJ-6379（26，HepG2.2.15细胞系，EC50=0.069μmol·L-1，EC90=0.24μmol·L-1）表现出比DVR-23和NVR3-778更强的体外HBV抑制作用。近期公布的临床II期试验数据也表明JNJ-6379与NAs联用时可以显著降低患者体内的HBV DNA和RNA水平[45]。此外，Yin等[46]于2023年也发现磺酰苯甲酰胺类衍生物27能够在HepAD38细胞中显著抑制HBV复制和低的细胞毒性（EC50=0.11μmol·L-1，CC50=85.27μmol·L-1）。以100mg·kg-1，一天两次的剂量对HBV转基因小鼠灌胃给药，12天后可使血清HBV DNA降低2.42log IU·mL-1。此外，还有一些活性较优的磺酰苯甲酰胺类衍生物也被广泛报道[47]。2.2.4 其他类型的CpAMs2014年，Yang等[48]报道了从天然产物中发现的一种双噻唑类化合物NZ–4（28，图7），其抑制HBV复制的EC50为1.33μmol·L-1；当浓度为10μmol·L-1时，其阻断pgRNA的组装，并促进空衣壳的产生。2020年，本课题组以NZ-4先导化合物，运用生物电子等排策略，将苄基中的亚甲基替换为氨基得到29，其具有与NZ-4相当的抗HBV DNA复制活性（EC50=2.2±1.1μmol·L-1）。NZ-4和化合物29与HBV衣壳蛋白相互作用的亲和常数分别为50.6和60.0μmol·L-1，这也合理解释了两者的活性差异[49]。AB-506（30）作为一种靶向HBV核心蛋白的小分子调节剂，它在体外（HepAD38细胞系，EC50=0.077μmol·L-1，CC50>25μmol·L-1）和体内（HBV小鼠模型，血清HBV DNA降低3.0log10IU·mL-1）均能显著抑制HBV复制[50]。并且，其可以阻断cccDNA的生成，抑制病毒RNA、HBsAg和HBeAg产生（EC50=0.64~1.92nmol·L-1），但因肝毒性而终止临床开发[51]。Assembly Biosciences公司开发的ABI-H0731（31）可以促进空衣壳的产生，抑制病毒DNA的复制（HepAD38细胞系，EC50=0.37μmol·L-1；原代人肝细胞系（primary human hepatocytes，PHHs），EC50=0.15μmol·L-1）[52]，目前处于临床II期试验阶段（NCT04454567）。近期，由Assembly bioscience公司的开发的ABI-4334（结构未公布）是一种新型的HBV核心蛋白变构调节剂，其作用机制是促进空衣壳的形成及阻止cccDNA的生成[53, 54]。2022年末，该公司披露了另一新型核心蛋白变构调节剂ABI-H2158（32）的临床前数据。ABI-H2158通过阻断pgRNA的包装来抑制HBV的复制（HepAD38细胞系，EC50=22nmol·L-1；HepG2-NTCP细胞系，EC50=27nmol·L-1；PHH细胞系，EC50=41nmol·L-1），并且对HBV的各种基因型均有显著抑制作用（EC50=7.1~22nmol·L-1）。另外，ABI-H2158在HepG2-NTCP细胞系中通过提前破坏及分解衣壳蛋白，阻断HBV感染初期cccDNA的形成（EC50≈200nmol·L-1）。这些数据表明ABI-H2158能在HBV复制过程的早期和晚期具有双重的作用机制[55]。但遗憾的是该药在临床II期试验（NCT04398134）因肝脏毒性而终止了开发。有报道称核心蛋白在细胞核中可以通过表观遗传学机制影响病毒DNA[56]。但是，近期夏宇尘课题组利用一系列细胞和小鼠模型发现HBV核心蛋白并不参与病毒微染色体cccDNA的转录调控[57]，更精确的机制还有待进一步研究。2.3 HBx抑制剂HBx（HBV X protein）是一种具有多种生理活性的蛋白[58]，其通过多种方式参与cccDNA的转录过程。HBx可以与宿主蛋白损伤特异性DNA结合蛋白1（damaged DNA binding protein1，DDB1）结合[59, 60]，组装成一个HBx-DDB1-CUL4-ROC1E3连接酶复合体。该复合体可以靶向Smc5/6（structural maintenance of chromosome5/6），而Smc5/6能阻止病毒转录。因此，若HBx复合体靶向Smc5/6并使其泛素化降解，则可以增强病毒cccDNA转录[61]。另外，HBx还可以通过多种途径参与肝癌的形成以及发展[62]。因此，HBx以及HBx与宿主蛋白的相互作用是抗HBV药物研发的重要靶标。2019年Sekiba等[63]通过高通量筛选发现硝唑尼特（nitazoxanide，NTZ，33，图8）可以抑制HBx-DDB1的相互作用。NTZ是一种FDA批准的用于治疗原虫性肠炎的噻唑类药物，临床上具有良好的安全性。其可以通过抑制HBx蛋白诱导的Smc5/6的降解，进而抑制HBV DNA转录和相关蛋白的产生。荧光素酶实验证明NTZ以剂量依赖的方式抑制HBx-DDB1的相互作用（HepG2细胞系，IC50<10μmol·L-1，CC50=57μmol·L-1）。然而NTZ的抗HBV活性较弱，还需进行后续的结构优化。2022年Ma等[64]利用表面等离子体共振成像（surface plasmon resonance imaging，SPRi）测定上市药物与HBx的结合能力，发现抗过敏药曲尼司特（tranilast，34）与HBx具有高亲和力（KD=1.35μmol·L-1）。使用HepG2.2.15.7细胞系对tranilast进行抗HBV活性评价，结果表明阳性对照药entecavir在10μmol·L-1浓度下将HBV DNA降低至10%以内，但是却并不能影响HBsAg水平，而tranilast可以在同等浓度下同时降低两者的含量。但tranilast是否通过抑制HBx与DDB1相互作用来抑制HBV仍然有待验证。2022年He等[65]运用高通量筛选发现雌二醇能剂量依赖性地降低HBeAg、HBsAg、HBV pgRNA和HBV DNA的含量。他们还利用同源模建的方法构建了HBx蛋白模型，并将分子与HBx进行分子对接模拟，其结果显示苯甲酸雌二醇（estradiol benzoate，35）中羰基氧和羟基氢分别与Trp87吲哚环上的氢原子及Trp107主链羰基氧形成氢键。黄爱龙课题组利用构建的HiBiT-HBx系统筛选出两种HBx抑制剂，双香豆素（dicoumarol，36）和雷帕霉素（rapamycin，37）。2021年筛选的双香豆素是一种NQO1抑制剂，通过促进HBx的降解来阻断cccDNA转录（EC50=10μmol·L-1），但不影响HBsAg、HBc和HBV聚合酶表达的含量[66]。2022年筛选的雷帕霉素通过泛素-蛋白酶体系统促进HBx蛋白的降解，从而降低HBx蛋白的含量。并且雷帕霉素能够降低HBV感染细胞中的HBV RNA、DNA的含量及抑制cccDNA的转录水平[67]。用5μmol·L-1雷帕霉素处理HepG2-NTCP细胞系，6天后HBV总RNA和3.5kb RNA水平分别下降46%和49%，核心DNA减少58%，HBV总RNA/cccDNA和3.5kb RNA/cccDNA比值分别降低46%和39.8%，这些参数均能指示cccDNA转录水平。CHB的功能性治愈是指在血清中检查不到HBsAg和HBV DNA[61, 68]。以上数据表明雷帕霉素可以作为CHB功能性治愈的潜在候选药物[67]。2.4 核糖核酸酶H抑制剂核糖核酸酶H（ribonuclease H，RNase H）属于非序列特异性核糖核酸内切酶，在病毒的复制过程中发挥重要作用。当pgRNA被逆转录成负链DNA后，pgRNA被HBV RNase H降解。RNase H通常在活性位点有两个Mg2+离子，通过亲核进攻激活水分子从而分解RNA[69]。抑制RNase H的活性将使负链DNA延伸过早停止，导致病毒衣壳内大量积累RNA: DNA异源双链，并阻止病毒正链DNA的合成[70]。因此，RNase H是抗乙肝药物研发非常有前景的靶标。然而，基于该靶标的药物设计仍存在一些挑战。首先，RNase H难以作为功能性重组酶表达，限制了高通量筛选技术在相关抑制剂筛选中的应用。其次，抑制RNase H的直接作用是阻止病毒正链DNA的产生，但是大量负链DNA的截断导致在检测HBV DNA的产生时筛选分析的背景较高[71, 72]。因此，目前主要采用基于重组HBV RNase H的低通量筛选技术对该靶标的化合物进行活性评价[71]。目前处于临床前的抑制剂包括α-羟基托酚酮（α-hydroxytropolones，αHTs）、N-羟基异喹啉二酮（N-hydroxyisoquinolinedione，HID）和N-羟基吡啶二酮（N-hydroxy pyridinediones，HPD）等。2.4.1 α-羟基托酚酮（α-hydroxytropolones，α-HTs）2013年，Hu等[70]发现HIV RNase H抑制剂β-侧柏酚（β-thujaplicinol，38，图9A）（IC50=0.2~0.3μmol·L-1）也具有抗HBV活性（HepDES19细胞系，EC50=1.0μmol·L-1，CC50=25μmol·L-1），其抑制HBV D和H基因型RNase H的IC50分别为5.9和2.3μmol·L-1。β-侧柏酚对两种病毒活性差异较大的原因可能与酶的同源性较低相关。在筛选一系列托酚酮类化合物后确定α-羟基托酚酮（α-hydroxytropolones，α-HTs）可以作为抗HBV的骨架[73]，进一步结构改造发现了两个活性较好的化合物#110（39，图9A，HepDES19细胞系，EC50=0.34μmol·L-1，CC50=32μmol·L-1）和#106（40，图9A，HepDES19细胞系，EC50=2.7μmol·L-1，CC50=38μmol·L-1），并确证环庚三烯铜中的三氧原子是活性所必需的基团（图9B）。但是这些化合物对人RNase H1也具有抑制作用，并具有一定的细胞毒性。Lomonosova等[74]在α-HTs母核R1、R2、R3位置进行修饰后活性没有得到提高，但细胞毒性显著降低，如化合物41（HepDES19细胞系，EC50=0.6μmol·L-1，CC50=100μmol·L-1）。Li等[75]建立以Ty3RNase H为模板的HBV RNase H的分子模型，并在化合物39的基础上对甲基酮进行修饰得到一系列酰胺化合物，将化合物与RNase H模型进行对接，对接结果显示化合物上的三氧原子可以螯合模拟活性位点的两个Mn2+离子。2.4.2 N-羟基异喹啉二酮（HID）和N-羟基吡啶二酮（HPD）2014年Cai等[76]通过低通量筛选得到一个活性较弱的HBV RNase H抑制剂N-羟基异喹啉二酮（HID，42，IC50=28.1μmol·L-1，EC50=4.2μmol·L-1）。Edwards等[77]筛选39个HID类似物，其中两个活性最好的化合物是N-羟基吡啶二酮（HPD）类化合物Sun B8155（43，HepDES19细胞系，EC50=0.69μmol·L-1, CC50=15μmol·L-1，SI（CC50/EC50）=22）和HID类衍生物VS42（44，EC50=1.4μmol·L-1，CC50=99μmol·L-1，SI=71)。为进一步提高抗病毒活性以及降低毒性，Edwards等[78]对HID和HPD进行一系列结构改造。结果显示7个新的HIDs活性并没有提高，而9个新的HPDs与初始的苗头化合物相比活性和选择性均有很大提升。其中，A24（45）的SI为352，这比Sun B8155（43）提高约16倍；A23（46，EC50=0.11μmol·L-1，SI=300）活性最高，这表明HPD骨架可能比HID骨架要更具有优势。构效关系（图9C）表明A环中的第一个氮原子和三个氧原子基团是活性所必需的；A环和B环之间连接的第二个氮原子以及B环均不利于活性；6和7位添加C环也不利于活性；4位的羰基以连接大的疏水基团活性为佳，而连接烷基全部丧失活性。这些构效关系为进一步的药物设计提供了重要信息。总之，目前已有的HBV RNase H抑制剂含有较多的羟基，存在极性较强、透膜性差、水溶性差及抗病毒活性弱的问题[73]，鉴于HBV RNase H的结构生物学研究滞后，给基于结构的合理药物设计带来困难。因此加快HBV RNase H结构生物学研究并研发成药性好、抗病毒活性强的新型HBV RNase H抑制剂是重要的研究方向。2.5 乙肝表面抗原分泌抑制剂乙肝表面抗原（HBsAg）在HBV感染的发病过程中起着重要的作用，例如，HBsAg水平与肝内cccDNA水平相关[79, 80]，HBsAg的持续产生预示着细胞内HBV转录和翻译的主模板cccDNA处于高转录水平状态。此外，在治疗结束时，HBsAg水平下降超过1个对数或HBsAg浓度小于等于10IU·mL-1的患者，3年后HBsAg阴转率较高[81]。这表明靶向HBsAg对CHB的功能性治愈都有重要意义[80]。2007年，Dougherty等[82]通过高通量筛选发现四氢四唑嘧啶类化合物HBF-0259（47，图10），以剂量依赖的方式特异性靶向HepG2.2.15细胞系（EC50=11.3μmol·L-1，CC50>50μmol·L-1）和HepDE19细胞系（EC50=1.5μmol·L-1，CC50>50μmol·L-1）中所有形式的HBsAg。机制研究表明，HBF-0259并不影响病毒DNA合成和HBeAg分泌。基于HBF-0259的取代基修饰得到三唑并嘧啶类化合物PBHBV-2-15（48，HepG2.2.15细胞系，EC50=1.4μmol·L-1，SI≥36)[83]，活性较HBF-0259提高近8倍。在急性毒性实验（CL57BL/6小鼠，i. v. ）和亚急性毒性实验（HBV转基因小鼠/品系1.3.32，p. o. ，q. d. ）中化合物48均表现可接受的毒性，且在雄性Sprague–Dawley大鼠口服生物利用度可达42%±16%。BM601（49）是基于ELISA定量检测HBsAg的高通量筛选得到的一种苯并咪唑衍生物。BM601抑制体外HBsAg分泌和HBV病毒颗粒形成（HepG2.2.15细胞系，EC50=1.5μmol·L-1和EC50=0.6μmol·L-1，CC50=24.5μmol·L-1）。但并不对HBV DNA复制、转录和衣壳形成产生影响。免疫荧光分析BM601可能通过干扰表面蛋白在反式高尔基体的聚集来抑制病毒粒子和HBsAg的分泌[84]。50是一种胞苷衍生物，有显著的HBV抗原分泌抑制活性（HepG2.2.15细胞系，EC50[HBsAg）=9nmol·L-1，EC50（HBeAg）=0.25μmol·L-1]和抑制DNA复制活性（胞内EC50=0.099μmol·L-1；胞外EC50<0.01μmol·L-1）[85]。且该化合物在1250μmol·L-1仍无细胞毒性。然而，化合物50是否直接抑制HBsAg的分泌还有待进一步的机制验证[85]。2.6 靶向cccDNA的小分子化合物HBV cccDNA在感染的肝细胞内持续稳定存在，并且是病毒转录和蛋白质合成的主模板，尽管数量少，但由于其在HBV生命周期中的核心作用以及超长的半衰期，使其成为CHB的罪魁祸首和慢性感染极难清除的主导因素[8]。清除cccDNA将意味着完全治愈乙型肝炎。因此，靶向cccDNA是乙肝彻底治愈的新靶点。Cai等[86]利用HBeAg作为cccDNA的替代生物标志物，通过高通量筛选发现2个双取代磺胺类化合物CCC-0975（51，图11）和CCC-0346（52），两者能在低微摩范围内（HepDE19细胞系，EC50=10μmol·L-1；EC50=3μmol·L-1）抑制从rcDNA去除共价连接的聚合酶进而抑制cccDNA的产生；此外，CCC-0975还能够减少原代鸭肝细胞中DHBV cccDNA的生物合成。这是首次发现小分子能靶向cccDNA生成，然而这种磺胺类似物的作用机制尚未被阐明。Liu等[87]从中草药化合物库中筛选出3种水解单宁酸punicalagin（53）、punicalin（54）和geraniin（55）。这些可水解单宁酸通过阻止cccDNA形成和促进cccDNA降解的双重机制来抑制HBV cccDNA的产生。罗氏公司发明的吡咯并[2, 3‑b]吡嗪化合物56在降低cccDNA水平方面特别有效（PHH细胞系，EC50（HBeAg）=0.39μmol·L-1，EC50（cccDNA）=6.76μmol·L-1），且对4种HBV基因型A至D均表现出有效的cccDNA抑制活性[88]。Wang等[89]采用基于HBV感染原代人肝细胞的表型筛选发现了新型cccDNA抑制剂ccc_R08（57）。在HBV circle小鼠模型中，ccc_R08能剂量依赖性地抑制胞外HBsAg、胞外HBeAg和DNA以及胞内病毒DNA和RNA，EC50值在0.2至5μmol·L-1之间。这是一种首创的口服cccDNA抑制剂，具有重要开发前景。目前直接靶向于cccDNA从而抑制HBV复制的小分子化合物十分有限，且很多的具体作用机制仍然有待验证。从rcDNA到cccDNA的过程中，需要结合组蛋白（H2A、H2B、H3、H4和H1）及非组蛋白（HBcAg、HBx和宿主因子），理论上干扰任何一个蛋白都会使cccDNA的形成降低[90]。然而，cccDNA动力学和基础生物学机制尚不清楚，因此发现能够消除或者沉默cccDNA的小分子治疗药物是一项巨大的挑战[8]。3总结与展望HBV感染导致的CHB严重影响人们的生命健康安全，是全球范围内的一类重大疾病。然而，有关CHB的研究进展比较缓慢，相关治疗主要依赖于作用机制单一的NAs药物，并且需要终身服药。IFNs作为治疗CHB的另一类药物也因严重的不良反应而导致使用人群受限。因此，迫切需要研发新靶标、新机制的HBV抑制剂。本文分别从靶向逆转录结构域的DNA聚合酶抑制剂、CpAMs、HBx抑制剂、RNase H抑制剂、HBsAg分泌抑制剂和靶向cccDNA的小分子6个方面综述了近年来直接靶向HBV小分子的研究进展。其中，CpAMs是进入临床研究种类最多的一类HBV抑制剂。科研人员针对已有的CpAMs，通过采用生物电子等排、骨架跃迁、构象限制和前药修饰等药物化学策略来提高其活性、代谢稳定性及成药性等特征。例如，应用生物电子等排策略得到的GLS4，目前处于临床IIIa期试验阶段，有望成为上市的CpAMs类抗乙肝药物。此外，结构生物学的发展也为基于靶标结构的精准药物设计提供了合理依据，从而使科研人员可以更有针对性地设计出活性更高并且抗耐药突变的药物[91, 92]。然而，HBx和HBV RNase H的结构生物学发展缓慢，限制药物化学领域研究人员基于靶标的合理药物设计。同样受到限制还有靶向cccDNA的小分子，cccDNA检测的灵敏度低是阻碍其发展的主要原因之一。未来仍然需要X-ray晶体衍射、cryo-EM、CADD和AI等多种技术在本领域更广泛的应用。自NTCP作为HBV/HDV的进入受体被发现[93]，直接靶向宿主的药物也成为研究的热点之一。其中基于L-HBsAg中preS1的结构进行合理药物设计研发的多肽类药物myrcludex-B，目前处于临床II期试验阶段（治疗丙肝已经在欧洲上市）[94]，其通过直接靶向NTCP抑制HBV感染，能够在远低于阻断胆盐转运所需的浓度下抑制HBV进入肝细胞。但阻碍NTCP对胆汁酸的摄取仍然是目前靶向NTCP的小分子药物亟需解决的问题[95]。此外，增强宿主固有免疫或诱导HBV特异性适应性免疫应答也有助于控制和清除HBV持续性感染。RIG-I激动剂、STING激动剂及TLR激动剂等模式识别受体激动剂是增强固有免疫的主要策略，目前已有多种药物在临床前实验中表现出良好的治疗效果并进入临床试验阶段[96, 97]。现有的NAs和IFNs远不能满足临床需求。随着HBV的新靶点和新结构药物的迅速发展，相信将会发现活性更高且成药性更好的抗乙肝药物。更多的乙肝治疗药物及联合用药方案也将为控制HBV感染，实现患者的功能性治愈甚至彻底治愈提供可能。作者贡献周加慧、王硕负责查阅文献和文章初稿的撰写；丁当、徐祥瑞、徐淑静和何勇负责查阅文献和修改文章；刘新泳、展鹏负责构思文章框架，指导文章撰写、修改并最后定稿。参考文献详见《药学学报》2023年文章信息源于公众号凡默谷，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读

在创新药“扎堆”的背景下，存在大量未被满足临床需求的疾病领域，吸引越来越多的药企进入赛道。例如，乙肝领域就是其中之一。在近期举办的亚太肝脏研究学会（APASL 2023）会议上，乙肝新药的研发传来了好消息。腾盛博药研发的BRII-835与 BRII-179联合疗法用于治愈乙型肝炎病毒（HBV）感染Ⅱ期研究取得了积极的中期结果；歌礼制药也公布了其研发的皮下注射PD-L1抗体ASC22（恩沃利单抗）可以实现慢乙肝功能性治愈，且在慢性乙肝患者中安全性、耐受性良好。除此以外，全球还有许多针对乙肝功能性治愈的在研新型疗法，使得乙肝用药赛道呈现出火热态势。01患者人群广、治疗药物匮乏存在大量未满足临床需求所谓乙型病毒肝炎症（又称乙肝），是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的以肝脏病变为主的一种世界性疾病，临床症状表现为食欲减退、全身乏力等。而且，乙肝患者还可能发展为肝硬化和肝癌。据统计，全球约三分之一的肝癌可归因于乙肝病毒感染。从患者人数看，全球约2.9亿HBV携带者，我国大约有8000万，是全球乙肝病毒感染人数最多的国家，其中慢性乙型肝炎患者约2000万-3000万例。值得一提的是，虽然目前市面上已拥有乙肝疫苗和NAs核苷类药物（恩替卡韦、替诺福韦等均需终身服药）、干扰素类药物，但只能起到乙肝预防和缓解症状的作用，并不能治愈乙肝。乙肝无法治愈的根本原因在于：共价闭合环状DNA（cccDNA）具有高稳定性，在细胞核内可以维持长达数年之久，所以导致病情复发，即便治疗后仍会出现不定期反弹。例如，NAs核苷类药物NAs只能抑制乙肝病毒RNA逆转录为乙肝病毒DNA，却不能抑制乙肝病毒cccDNA转录为乙肝病毒RNA，因此对HBsAg没有抑制作用，无法彻底清除肝细胞内的cccDNA。这意味着，一旦肝细胞核内仍存在乙肝病毒，就仍有发生肝细胞癌的风险。此外，慢性乙肝治疗药物还出现匮乏的状态，在目前FDA批准的8款药物中有7款是在2008年以前上市，近十几年仅有一款替诺福韦升级版获批上市。02siRNA、ASO等新型疗法亮相国内外掀研发热潮随着研发水平的不断进步，科学家们已找到实现乙肝完全治愈的策略：可通过清除cccDNA或永久沉默cccDNA转录，实现在不杀死受感染肝细胞的情况下治愈乙肝，也可通过诱导免疫调节，安全清除HBV受感染肝细胞治愈乙肝。具体而言，药企可从以下两个策略研发乙肝新型疗法。靶向HBV生命周期靶向HBV生命周期，包括靶向cccDNA的新药和间接靶向cccDNA的新药，前者包括cccDNA抑制剂（表观遗传修饰、失稳剂、基因编辑），后者包括入胞抑制剂、核衣壳抑制剂、siRNAs、反义RNA和HBsAg释放抑制剂。通过靶向宿主免疫系统来攻击乙肝病毒通过靶向宿主免疫系统来攻击乙肝病毒，包括治疗性疫苗、PD-1/PD-L1抑制剂、凋亡诱导剂、TLR激活剂和HBV特异性免疫重建（T细胞免疫调节剂等）。从作用机制看，小干扰核酸（siRNA）药物主要通过RNA干扰的方式沉默乙肝mRNA的表达以起到治疗作用；反义寡核苷酸（ASO）是通过与病毒mRNA结合的方式沉默乙肝mRNA的表达以起到治疗作用；HBsAg抑制剂能够抑制或者干扰HBsAg的分泌。目前，全球在研的乙肝新型疗法类型多样，其中进展最快的GSK和Ionis共同研发的Bepirovirsen（GSK836）已进入III期临床。Bepirovirsen属于反义寡核苷酸（ASO）药物，作用机制是在抑制HBsAg蛋白表达的同时，通过TLR8刺激免疫应答，激活免疫系统清除血液循环系统中的病毒。2022年，Ionis/GSK在EASL上发表了Bepirovirsen II期B-Clear研究数据：针对接受核苷治疗的患者，在完成24周治疗时达到28%的临床治愈率；针对没有接受核苷治疗的患者，在完成24周治疗时达到29%的临床治愈。2023年2月，GSK更新了Bepirovirsen的最新进展，已启动B-WELL1和B-WELL2等两项III期临床研究，探索ASO联用核苷（NA）功能性治愈慢性乙型肝炎。国内方面，布局最多的乙肝疗法为核衣壳抑制剂，作用机制是通过阻断衣壳蛋白装配，或加快衣壳蛋白降解，从而阻断衣壳装配过程，影响病毒复制。根据安信证券研报披露显示，目前国内有超过10款核衣壳抑制剂已在注册临床阶段，包括齐鲁制药的QL-007、科伦药业的KL060332、东阳光药的甲磺酸莫非赛定、广生堂的GST-HG141和恒瑞医药的HRS5091等。03国内药企角逐乙肝赛道东阳光药、广生堂、恒瑞……乙肝赛道呈现出的良好前景，吸引了包括腾盛博药和歌礼制药等在内的不少国内药企进入赛道。例如，腾盛博药研发的BRII-835与 BRII-179联合疗法安全且耐受性良好，与单独使用BRII-835或BRII-179相比，联合疗法诱导了更强的抗乙肝表面抗原（HBsAg）的抗体反应，并改善了HBsAg特异性T细胞应答。其中，BRII-835属于siRNA药物，BRII-179属于新型重组蛋白免疫疗法，也是一种基于病毒样颗粒的治疗性乙肝疫苗。图源：腾盛博药公告、安信证券整理歌礼制药的ASC22（恩沃利单抗）是全球临床进度最快的通过阻断PD-1/PD-L1通路用于慢乙肝功能性治愈（即HBsAg清除）的免疫疗法。实际上，恩沃利单抗（KN035）是康宁杰瑞自主研发的PD-L1单域抗体Fc融合蛋白，于2021年11月25日获国家药监局批准用于治疗DNA错配修复功能缺陷（dMMR）晚期实体瘤，是全球首个获批上市的皮下注射PD-L1抑制剂。2021年11月8日，歌礼制药与康宁杰瑞签署协议，获得恩沃利单抗全球独家开发和商业化权益，用于治疗包括乙型肝炎和艾滋病在内的所有病毒性疾病。在近期举办的APASL 2023会议上，歌礼制药公布了ASC22（恩沃利单抗）取得积极的II期研究结果，可以实现慢乙肝功能性治愈，42.9%（3/7）基线HBsAg≤100 IU/mL的患者在治疗期间实现了HBsAg持续清除。图源：歌礼制药公告东阳光药的Morphothiadin（甲磺酸莫非赛定胶囊，GLS4）属于新一代的二氢嘧啶类药物，是基于拜耳的Bay41-4109经过结构优化和活性筛选获得的一款化合物，其作用机制是干扰HBV病毒衣壳体组装，可呈剂量依赖性减少病毒衣壳的正确组装，加速异常衣壳形成，从而强烈抑制HBV的复制及成熟病毒颗粒的产生。Morphothiadin是同靶点在全球范围内研发进展最快的化合物，也是全球首个临床证实可以明确抑制s抗原的小分子化合物，目前已处于III期临床阶段，预计最快2024年上市。广生堂的GST-HG121是乙肝表面抗原（HBsAg）抑制剂，基础研究表明其通过降解RNA的方式发挥作用，可有效地抑制HBsAg表达，降低乙肝表面抗原滴度，有望提高乙肝表面抗原转阴率，恢复免疫监视机制，已于2022年6月获得I期临床试验伦理委员会批件。另外，广生堂还有两款在研的乙肝创新药：HBsAg抑制剂GST-HG131，目前Ia期临床试验已完成所有受试者的给药和耐受性、安全性观察；GST-HG141是全球First in class的MOA II型乙肝核心蛋白调制剂，可以抑制HBV衣壳的脱壳与组装，专一性针对病毒靶点，对宿主靶点作用风险小，安全性高，目前已于2023年2月完成II期多中心临床试验首例受试者成功入组，全球尚无该靶点药物上市，竞争格局良好。除此以外，恒瑞医药也有两款乙肝药物在研发当中，HRS9950（TLR-8选择性激动剂）和HRS5091（HBV核衣壳组装调节剂）目前均处于I期临床试验阶段。参考资料1.各公司财报、公告2.医药生物行业周报：聊聊乙肝功能性治愈》，国盛证券3.《特宝生物-688278-勇攀乙肝治愈珠峰，长效生物制剂龙头强势崛起》，安信证券4.《生物医药行业新药周观点：APASL2023国内企业披露最新数据，全球范围内多个乙肝新兴疗法兴起》，安信证券END👇关注药渡数据媒体矩阵