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本研究为理解剪接体的早期组装过程以及分支位点的识别和选择机制提供了重要的结构信息，同时也为与癌症相关的SF3B1突变的致病机制提供了新的见解。 西湖大学施一公团队在《自然结构与分子生物学》（Nature Structural and Molecular Biology）在线发表了题为“Structural Insights into Branch Site Proofreading by Human Spliceosome”的最新研究论文，报道了人源17S U2 snRNP复合物和剪接体pre-A复合物的高分辨率结构，并结合生化和功能实验，揭示了剪接体进行分支位点选择、校正的分子机理。

北京时间2024年1月9日，西湖大学施一公团队在《自然结构与分子生物学》（Nature Structural and Molecular Biology）在线发表了题为“Structural Insights into Branch Site Proofreading by Human Spliceosome”的最新研究论文，报道了人源17S U2 snRNP复合物和剪接体pre-A复合物的高分辨率结构，并结合生化和功能实验，揭示了剪接体进行分支位点选择、校正的分子机理。mRNA剪接是真核生物基因表达的关键步骤，由剪接体催化完成。剪接体是一个巨大且高度动态的分子机器，其核心组成元件为5种核内小核糖核蛋白复合物（snRNP），分别为U1，U2，U4，U5和U6 snRNP。剪接体通过识别pre-mRNA上保守的剪接位点完成早期的组装。首先，U1 snRNP识别5'剪接位点，剪接因子SF1识别分支位点（branch site, BS），形成E complex。随后，U2 snRNP替换SF1，识别分支位点，并且U2 snRNA与分支位点形成RNA双螺旋，完成A complex的组装1。在高等真核生物中，大部分基因都会发生可变剪接，这个过程需要剪接体选择不同的剪接位点。因此，研究这些早期复合物对于理解剪接反应的保真性和调控机制至关重要。近些年，随着冷冻电镜技术的突破，一系列人源和酵母的剪接体复合物结构获得解析，极大地促进了人们对mRNA剪接分子机制的认识2-5。但由于剪接反应早期的复合物具有高度的动态性和不稳定性，其结构研究进展缓慢。研究人员首先通过PRP5上引入的FLAG标签纯化出内源的17S U2 snRNP并解析了整体分辨率达到2.5 Å的电镜结构。随后通过使用exon-definition的pre-mRNA底物和小分子抑制剂spliceostatin A (SSA)，成功捕获了一个介于E和A complex之间的中间反应状态，命名为pre-A复合物。Pre-A复合物主要包含两个区域：U2 snRNP区域和U1 snRNP区域。其中U1 snRNP非常柔性，未能解析到较高的分辨率，而U2 snRNP区域整体分辨率达到3Å，可以搭建原子模型（图1）。图1: 17S U2 snRNP和pre-A复合物的电镜结构在17S U2 snRNP中PRP5主要通过其N端锚定在SF3B1外围，其中acidic loop占据了SF3B1的RNA通道，而它的解旋酶结构域则结合在U2 snRNA附近。剪接因子TAT-SF1通过其Linker domain将U2 snRNA的BS-interacting stem loop （BSL）包裹起来，从而避免BSL过早打开以及结合pre-mRNA。在pre-A复合物中，SF3B1仍然处于开放状态，PRP5的acidic loop依然结合在SF3B1的RNA通道中，但其解旋酶结构域发生了显著的构象变化。与之相应的，TAT-SF1从复合物中解离，并且U2 snRNA和pre-mRNA通过部分的互补配对，形成了一个初始的双链结构（initial U2/BS duplex）。剪接因子SF1和DNAJC8稳定了局部的构象。同先前报道的剪接反应抑制剂E7107一样6， SSA也结合在SF3B1和PHF5A形成的铰链口袋（hinged pocket）中。不同的是，SSA与PHF5A第26位的半胱氨酸形成了共价键。由于SSA的结合，导致分支位点腺苷（BS-A）无法进入铰链口袋而游离在外面。与此同时，分支位点下游的多聚嘧啶区（polypyrimidine tract）也没有替换PRP5的acidic loop结合到SF3B1的RNA通道path中。据此，研究人员推测，BS-A进入铰链口袋是诱发SF3B1从开放到关闭构象变化的初始条件，而伴随着SF3B1的构象变化，PRP5、SF1以及DNAJC8会发生解离，SF3B1紧紧包裹住pre-mRNA，从而完成U2 snRNP对分支位点的选择，形成A complex（图2）。在这个过程中， PRP5的acidic loop与PPT竞争结合SF3B1的RNA通道是PRP5行使其校正功能的关键。图2: 17S U2 snRNP到A complex过程中的结构变化以及PRP5校正U2/BS duplex的模型图值得关注的是，研究人员发现PRP5的acidic loop与SF3B1的结合界面上，分布着大量与癌症相关的突变位点。结合先前对PRP5功能7和癌症患者中剪接异常现象8的研究，研究人员推测这些突变可能是通过削弱PRR5的结合，影响其对分支位点的校正功能，进而引发剪接异常，导致疾病的发生。研究人员的生化和RNA-seq数据支持了这种观点。总的来说，本研究为理解剪接体的早期组装过程以及分支位点的识别和选择机制提供了重要的结构信息，同时也为与癌症相关的SF3B1突变的致病机制提供了新的见解。文章链接：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41594-023-01188-0本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

导读：研究发现三种RNA解旋酶-DDX42、DDX46和DHX15 与人类U2 snRNP相关，但它们在U2 snRNP和剪接体组装中的作用和机制尚不清楚。2月17日，西湖大学施一公及张晓峰团队在《Nature Communications》发表题为“Mechanisms of the RNA helicases DDX42 and DDX46 in human U2 snRNP assembly”的研究论文，研究揭示了人U2 snRNP 组装中RNA解旋酶DDX42和DDX46的作用机制。https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41467-023-36489-x研究背景 01 Pre-mRNA的剪接由称为剪接体的异常动态的RNA-蛋白质复合物执行。剪接体由五个小的核糖核蛋白颗粒（snRNPs）组装而成，称为U1、U2、U4、U5和U6，以及非snRNP因子。每个snRNP是由一个单独的小核RNA (snRNA)， 7个常见的Sm蛋白(或在U6的情况下是LSm)和一些特定的蛋白质因子构建的。在5个snRNPs中，U2 snRNPs在内含子识别和折叠前体组装过程中起着重要作用。人类的U2 snRNP尤其复杂和动态；它的组装是一个多步骤且人们知之甚少的过程。17S U2被认为是直接参与早期剪接体组装的人类U2 snRNP的功能形式。17S U2 snRNP的核心成分包括SF3b复合物、SF3a复合物、12S U2核心、剪接因子TAT-SF1和DDX46。体外实验表明，SF3b与12S U2核依次组装，形成一种称为15S粒子的中间产物，然后是SF3a复合物。然而，对编排这一装配过程的蛋白质因子知之甚少。值得注意的是，研究发现三种RNA依赖性ATP酶：DDX42，DDX46和DHX15与U2 snRNP相关。前两个是DEAD-box解旋酶家族的成员，而DHX15属于DEAH-box亚科。DDX42与SF3b 复合物共纯化，但在17S U2 snRNP 中几乎检测不到。因此，具有RNA伴侣活性的DDX4220，很可能在履行其在U2 snRNP 组装中的作用后发布。与DDX42相比，DDX46（酵母Prp5同系物）是17S U2的组成部分，在预剪接体组装和分支位点校对过程中起着至关重要的作用，但DDX46是否在U2 snRNP组装中具有其他作用尚不清楚。此外，DHX15（酵母Prp43直系同源物）在内含子-拉里亚特剪接体（ILS）复合物拆解中的机制已被广泛研究，其在U2 snRNP和早期剪接复合体中的作用仍然是神秘的。研究进展 02 在DDX42-U2复合物中，DDX42的N端仍然锚定在SF3B1上，但解旋酶结构域已被U2 snRNA和TAT-SF1取代。通过体外实验，研究发现DDX42和DDX46在与SF3b的结合方面是互斥的。SF3B1的癌症驱动突变靶向RNA路径中直接与DDX42和DDX46相互作用的残基。这些发现揭示了DDX42和DDX46在17S U2 snRNP组装中的不同作用，并为SF3B1癌症突变的机制提供了见解。A、17SU2snRNP形成的工作模型图。在默认状态下，SF3B1核心与DDX42形成稳定的复合物，其中SF3B1的RNA路径被DDX42的N-plug占据。在步骤1中，DDX42与来自12SU2核心的U2 snRNA结合，并可能驱动其构象变化以形成BSL。在此过程中，SF3a复合物TAT-SF1被募集到复合物中，导致DDX42解旋酶结构域的位移和DDX42-U2复合物的形成。DDX1-U42中TAT-SF2的UHM结构域相对移动，因此表示为虚线圆圈。在步骤2中，DDX42解旋酶结构域的移动可能会破坏其N末端与SF3B1之间的相互作用;这可能促进DDX46从SF42B3中胜过DDX1，形成成熟的17SU2snRNP。TAT-SF1的UHM域，与DDX46交互，可能有助于稳定BSL的构象和DDX46的解旋酶结构域。B、 SF3B1中绝大多数癌症衍生突变聚集在其与DDX42和DDX46的界面上。研究意义 03 总而言之，研究报道了DDX42-SF3b复合物的高分辨率结构和含有DDX42的17S U2 snRNP的假定组装中间体。同时，研究还分离出一种含有DHX15的U2 snRNP，但DHX15的位置没有被EM密度图识别出来。该研究结构揭示了SF3B1与DDX42、DDX46和pre-mRNA的多嘧啶束(PPT)相互作用的共同显著模式。结合结构引导的生化分析，该研究揭示了DDX42和DDX46在U2 snRNP组装中的作用，并为SF3B1癌症突变提供了见解。参考资料：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41467-023-36489-x