CD11b

关注小药说药，一起成长！ 前言 在过去的十年里，免疫疗法的出现确实彻底改变了癌症治疗的模式。许多靶向程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）或其配体（PD-L1）的治疗药物已被监管机构批准作为单一治疗药物，或与化疗和其他靶向药物联合使用。在临床研究中，PD-L1免疫组织化学（IHC）和肿瘤突变负荷（TMB）是迄今为止发现的主要预测性生物标记物，然而，PD-L1 IHC仍然是临床实践中用于告知免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的主要辅助诊断试验。 PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞表面表达，在多种肿瘤类型的研究已经确定了PD-L1水平与单药抗PD-1/PD-L1治疗的临床益处之间的关联。虽然PD-L1高表达的患者通常能获得最大的临床益处，但肿瘤低或无PD-L1表达的患者也依然能受益，这促使我们需要进一步探索不断进化的癌症基因组变化与浸润性免疫细胞亚型之间的因果关系。 考虑到PD-L1作为单一生物标记物的局限性，我们需要了解复杂的肿瘤微环境（TME），以开发更好的生物标记物和诊断方法，更准确地预测临床效益，至关重要的是，更有针对性地对肿瘤产生有效的免疫反应。 预测性生物标志物 PD-L1 IHC 与突变的二元性不同，PD-L1是一种线性生物标记物，因此可以在多个表达阈值下进行评估。由于肿瘤细胞和免疫细胞上PD-L1表达的复杂生物学特性，已批准的PD-L1 IHC分析不仅采用不同的表达阈值，而且采用不同的评分方法。PD-L1评分算法具有分析特异性、适应症依赖性，并且根据治疗路线而变化。有些检测仅对肿瘤细胞表达进行评分（忽略免疫细胞），而有些检测仅对免疫细胞的PD-L1进行评估（忽略肿瘤细胞），其它检测则对肿瘤和免疫细胞的PD-L1同时进行测量。下表显示了非小细胞肺癌（NSCLC）中使用的主要PD-L1 IHC分析的截止值。需要注意的是，这些经验证的截止值的批准和用途是特定于国家的。 PD-L1的表达是动态的，在肿瘤类型、肿瘤部位，甚至在同一肿瘤标本中表现出显著差异。肿瘤细胞中PD-L1的表达受基因组、表观遗传学和转录机制的调控。肿瘤细胞上的PD-L1与NSCLC中CD8+T细胞浸润程度之间的强相关性很可能是由于对炎症信号（如IFN-γ）反应中的转录调节，这些炎症信号是由活跃的抗肿瘤免疫反应产生的。 PD-L1的非均匀表达（通常局限于免疫浸润区域）表明，由于TME内相关细胞因子的高局部浓度，PD-L1被适应性诱导，并进一步突出了肿瘤内的异质性。PD-L1的肿瘤内异质性和可塑性可能会影响患者的管理决策，此外，由于采样可能会产生假阴性得PD-L1 IHC结果。活检的位置和已进行过的治疗是PD-L1表达的重要参数。由于临床原因，在治疗开始时获得新的活检可能不可行，但由于免疫反应的可塑性，尤其是PD-L1，存档肿瘤标本不一定反映复发或转移性病变中的TME。 多种免疫细胞类型，主要是巨噬细胞、树突状细胞（DC），以及T细胞、NK细胞和B细胞，可表达PD-L1。目前尚不清楚哪些特定免疫群体或免疫细胞的空间特征与临床最相关。需要使用多重IHC技术进一步描述肿瘤细胞与特定免疫细胞亚群的空间相互作用，以确定是否需要继续将免疫细胞分类为一个更广泛的类别，这需要更细致、更复杂的分析。 其它生物标志物 临床试验表明，具有大量效应T细胞的肿瘤对ICI治疗更为敏感。有研究使用以IFN-γ为中心的基因表达特征来显示使用抗PD-1抗体pembrolizumab治疗的黑色素瘤患者的总体应答率（ORR）和无进展生存率（PFS）的相关性。与这些发现一致，在NSCLC中进行的IMpower150试验报告了一种T效应细胞（Teff）基因表达特征，由PD-L1、CXCL9和IFN-γ组成，当比较atezolizumab联合化疗比较单独化疗时，该特征对PFS有益。 此外，具有高突变负荷的肿瘤患者从CI治疗中获得了更大的临床益处。TMB和PD-L1 IHC的一致性研究似乎表明，这些生物标记物是正交的，并独立预测CI治疗的益处。因此，pembrolizumab最近获得了监管部门的批准，用于治疗先前治疗后有进展且无替代治疗方案的不可切除或转移性高TMB实体瘤。 随着对更具预测性的生物标志物的研究不断深入，有必要摆脱单一分析方法，整合负责进行免疫反应的各种生物过程。初步的探索性分析表明，联合生物标志物可以转化为临床益处。在Checkmate-026和Checkmate-227研究中，肿瘤表达高水平PD-L1并具有高组织TMB状态的患者从抗PD-1抗体nivolumab治疗中获得最大益处。OAK研究也报告了类似的结果。 免疫效应细胞的表型多样性 许多研究已经描述了肿瘤浸润淋巴细胞及其空间分布与治疗效益之间的关系。识别各种免疫效应细胞的空间分布需要通过功能分析来补充，如激活标记物和抗原反应性，通过分析肿瘤样本中CD8+T细胞TCR序列的内在抗肿瘤反应性，表明识别自体肿瘤的能力仅限于少数肿瘤浸润CD8+T细胞。更复杂的是，肿瘤不同区域（中心与边缘浸润）的CD4+和CD8+T细胞群中可能存在显著的TCR异质性，异质性的程度具有预后意义。 通常，三种不同的CD8+T细胞群体可根据共同的转录谱识别： 表达CC-趋化因子受体7（CCR7）和转录因子7（TCF7）的原始或记忆细胞； 穿孔素1（PRF1）、颗粒酶A（GZMA）和GZMB阳性的细胞毒性细胞；以及 “功能失调”的多样性细胞群体，其特征是与耗竭状态相关的标记物，如PD-1（PDCD1）、LAG3和TIM3（HAVCR2）。 这三个群体的相对比例似乎高度可变，不仅在不同的肿瘤类型中如此，在相同组织学的肿瘤中也是如此。转录谱和TCR测序信息已被用于确定肿瘤内CD8+细胞表型是否发生改变。初步模型表明，TME诱导的表型异质性功能失调细胞群从幼稚的CD8+细胞进化而来，而后者以不依赖TME的方式产生细胞毒性细胞。“功能失调”细胞库中的细胞在多大程度上可以转化为“细胞毒性”状态目前尚不清楚，然而，了解这一点对于设计促进和触发这种转变的疗法非常重要。 此外，在几项研究中已经鉴定出对肿瘤表达的新抗原具有特异性的肿瘤内CD8+T细胞，但其只是表型异质性总群体的一小部分。有趣的是，CD39似乎能够区分肿瘤特异性（高CD39）和旁观者（低CD39）CD8+T细胞。其他表型和功能分析显示，CD39+亚群共表达CD103以及PD-1、TIM3和CTLA-4，这些标记通常与耗竭状态相关。CD39和CD103的共同表达依赖于通过TCR的长时间刺激和TGF-β的暴露。有趣的是，高水平的CD39+CD103+双阳性细胞似乎转化为鳞状细胞头颈癌患者的生存益处。 免疫效应细胞的空间分布 最新的研究分析了CD8+T细胞和MHCII类表达细胞（最可能的抗原呈递细胞）之间的空间关系。在肾细胞癌患者中，TCF1+/CD8+T细胞优先共定位于MHC II类表达细胞的区域，而TCF1−/CD8+细胞在整个肿瘤中呈弥散分布。TCF1+/CD8+细胞的发生率也与DC的发生率相关，而TCF1−/CD8+细胞没有表现出这种相关性。有趣的是，含有TCF1+/CD8+T细胞和表达MHC II类APC高密度区域的肿瘤具有更好的临床疗效，APC密集区可能为干细胞样CD8+T细胞分化为能够维持抗肿瘤免疫反应的效应细胞提供了肿瘤内环境。 很明显，成熟、活跃的树突状细胞向肿瘤床的肿瘤浸润增加了免疫激活和活性免疫效应细胞的募集。准确识别和量化DCs具有重要价值，然而，标记物如CD11c、CD11b、CD163和MHC-II不是DC特异性的，并且在其他细胞类型如巨噬细胞上表达。DC可以促进或抑制新生免疫反应的观察结果进一步增加了复杂性，因为目前还没有有效的标记来区分两种DC状态。 在肿瘤进展过程中，TME转变为一种主动保护肿瘤细胞免受免疫攻击的环境，被认为具有肿瘤保护功能的TME细胞包括T调节细胞（Treg）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和髓系抑制细胞（MDSCs）。 肿瘤保护作用通常通过分泌的细胞因子和趋化因子介导，这些细胞因子和趋化因子可防止免疫效应T细胞侵入肿瘤床或使这些细胞功能失效，例如，TGF-β。TGB-β抑制剂和抗PD-L1抗体的联合治疗可导致Teff的肿瘤内渗透，将表型从“排除”改变为“炎性”，减少转移并提高长期生存率。 MDSC是中性粒细胞和单核细胞样髓样细胞的异质群体，越来越多地被认为是各种癌症免疫抑制的关键介质。在癌症患者中，循环MDSC数量的增加与晚期临床分期、转移性疾病发病率的增加和免疫抑制相关。除了免疫抑制功能外，MDSC还可以通过与肿瘤细胞和周围基质的复杂串扰积极塑造肿瘤微环境，从而增加血管生成、肿瘤侵袭和转移。 肿瘤细胞的内在抗性 目前，我们对于肿瘤免疫治疗的不同反应和耐药机制的了解仍然有许多空白。虽然我们希望找到一颗灵丹妙药，但可能的事实是，有许多机制有助于产生抵抗。虽然肿瘤抑制因子（如p53）的突变增加了突变负荷，有助于放大新抗原的数量，并使肿瘤对免疫系统更敏感，但这些突变也可以驱动抗原呈递途径和关键细胞机制的突变，从而触发转录和代谢变化，进而对肿瘤浸润性免疫细胞产生间接影响。  肿瘤抗原呈递机制的一个关键组成部分是MHC I类分子，它由HLA I类（HLA-I）亚单位和β2微球蛋白（β2M）组成。MHC-I的下调存在于多种肿瘤类型中，可能通过多种机制发生，包括基因突变、表观遗传沉默、转录变化和翻译后修饰。 MHC-I的下调如何影响TME？研究发现，HLA-I阳性表达与免疫浸润密度相关，与PD-L1状态无关。所有HLA-I+/PD-L1+的肿瘤都有高度的CD8+T细胞浸润，而HLA-I缺失与肿瘤内T淋巴细胞数量减少相关，其空间局限于肿瘤周围的基质。而HLA-I-/PD-L1-的肿瘤较大，CD8+T细胞密度较低。这项研究表明，肿瘤免疫逃逸表型结合了两种独立的免疫逃逸机制：HLA-I的丢失和PD-L1的上调。 新辅助治疗中获得经验 最近对早期疾病免疫治疗的探索为了解TME及其在治疗反应中的变化提供了新的机会。新辅助研究特别丰富，因为治疗前经常收集诊断性活检，并可与新辅助治疗后立即进行的手术切除进行比较。 ABACUS试验是一项单臂2期研究，研究膀胱切除术前atezolizumab的新辅助治疗。升高的PD-L1水平（SP142；IC≥5%）,基线Teff基因表达和上皮内CD8+T细胞与临床益处相关。有趣的是，与术前相比，在治疗后肿瘤样本中观察到上皮内CD8+T细胞和PD-L1+免疫细胞的数量增加，并且这种增加在应答者中比在复发患者中更为明显。在治疗后样本中发现，TGF-β、成纤维细胞活化蛋白和细胞周期基因升高与耐药性相关。 PURE-01研究报告了类似的结果，膀胱上皮癌患者在根治性膀胱切除术前接受了三个周期的pembrolizumab。与PD-L1状态较低的患者相比，PD-L1 IHC升高的患者（22C3；CPS≥10%）获得了更高的病理完全缓解率。与治疗前活检相比，治疗后切除的PD-L1 CPS水平升高，TMB水平降低。此外，与治疗前样本相比，治疗后样本中的免疫相关基因（包括与IFN-γ信号、抗原呈递和T细胞功能相关的基因）也有所增加。 NABUCCO研究评估了III期尿路上皮癌切除术前使用ipilimumab和nivolumab的效果。与ABACUS和PURE-01研究相比，治疗结果与肿瘤内CD8+T细胞浸润或Teff信号的基线状态无关。相反，研究观察到，在获得完全应答的患者中，TMB升高与DDR基因改变频率升高之间存在一种趋势。无法获得完全应答的患者在基线样本中富含TGF-β基因表达特征，表明可能存在耐药机制。此外，还研究了TIL密度与反应之间的相关性，有趣的是，基线TIL与疗效之间没有相关性，但在治疗后获得CR的患者中观察到TIL富集。 这些观察结果并非膀胱癌所独有。NEOSTAR试验评估了nivolumab或nivolumab加ipilimumab作为可手术NSCLC患者的新辅助治疗。获得影像学或主要病理学反应的患者总体上比基线肿瘤样本的PD-L1更高。与单独使用nivolumab治疗相比，nivolumab加ipilimumab治疗后TIL、组织驻留记忆T细胞、TEFF和效应记忆T细胞的频率更高。 总体来说，基线PD-L1似乎可以预测ICI的反应。TMB、TIL和DDR等作为生物标志物也似乎很有希望，但需要进一步评估和验证。治疗方案的差异以及患者群体的异质性可能导致不同试验结果的不一致。随着新辅助免疫治疗和化疗-免疫治疗联合方案获得监管部门的批准，识别经验证的生物标记物以预测免疫反应对于帮助作出治疗决定至关重要。 小结 随着从化疗向靶向治疗和免疫治疗的过渡不断发展，研究人员将采用更复杂的临床试验设计，如靶向治疗和免疫治疗的联合，不同CI药物的联合，并且更加关注生物标记物的设计，这些生物标记物对预测单药或多药治疗方案的反应或耐药性具有更高的敏感性。 未来，很可能需要多参数的方法来确定最有可能对ICI治疗有反应的患者，开发基于组织的强大复合技术非常重要。这有助于更准备地描述TME的特征，并分析肿瘤和效应免疫细胞之间以及效应细胞和APC之间的相互作用。相关标记物的表达谱可能提示效应细胞的激活、抑制或耗竭状态，并提示耐药机制。 参考文献： 1.Microenvironmental regulation of tumourimmunity and response to immunotherapy. J Pathol. 2021 Jul; 254(4):374–383. 公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

【导读】 肝转移是癌症相关死亡的主要原因。在转移过程中，循环癌细胞很难通过狭窄的毛细血管，从而导致细胞核变形。然而，细胞核变形及其潜在机制对转移的影响仍需进一步研究。 12月31日，西安交通大学研究团队在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“Mechanical Force-Induced cGAS Activation in Carcinoma Cells Facilitates Splenocytes into Liver to Drive Metastasis”，本研究中，研究表明机械力诱导的核变形通过激活 cGAS-STING 通路加剧了肝转移，该通路促进了脾细胞向肝脏的浸润。尤其是，抑制 cGAS 的活性以及阻断脾细胞向肝脏迁移均能有效改善肝转移。 总体而言，这些发现揭示了机械力诱导的核变形通过调节脾细胞向肝脏的浸润而加剧肝转移的机制，并支持将靶向 cGAS 和阻断脾细胞募集作为肝转移的潜在治疗策略。 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1002/advs.202401127 背景信息 01 转移是恶性肿瘤的主要特征，是导致癌症相关死亡的主要原因，也是肿瘤细胞从原发肿瘤部位扩散到远处部位的过程。肝脏是转移最常见的器官，例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌向肝脏转移率很高。病理学和解剖学的研究表明，这些癌症从原发部位转移到肝脏主要是通过门静脉系统。尽管这种转移倾向反映了循环肿瘤细胞的机械性捕获，但肝转移依赖于形成支持癌细胞定植和生长的促转移微环境。由于通过门静脉血流的癌细胞代表了在肝脏定植的初始状态，阻断定植进程可能潜在地中断肝转移的途径。 复杂的转移级联过程可以简化为两个主要阶段：迁移阶段和定植阶段。在受限的环境中迁移会对细胞核造成相当大的机械应力，并导致不同的结果。轻度的核变形会引发核膜（NE）的张力，并促进通过核孔的输入/输出。中度的核变形会导致核膜暂时破裂，从而使得核质与细胞质之间发生不受控制的交换，随后基因组 DNA 暴露于细胞质中，导致 DNA 损伤以及cGAS的激活，这是一种细胞质 DNA 传感器。重度的核变形通常会导致核膜破裂和细胞死亡，这可能是癌细胞转移过程效率极低的原因。机械力导致的获得性 DNA 损伤会增加癌细胞的基因组不稳定性，但 cGAS 激活在癌细胞转移中是否发挥关键作用是一个激动人心且不可避免的问题。 核变形癌细胞促进 VHPV 转移中的单核细胞/巨噬细胞浸润 02 研究人员利用光转换型 KikGR 转基因小鼠，在 VHPV 转移模型中通过活体成像追踪脾细胞在肝脏中的情况。在对照小鼠肝脏中观察到了光转换型 KikRed 脾细胞，而癌细胞侵袭导致肝脏中光转换型 KikRed 脾细胞浸润增加。进一步分析表明，尽管脾淋巴细胞和中性粒细胞也能迁移到肝脏，但被癌细胞侵袭的肝脏中脾单核细胞/巨噬细胞的含量显著增加。这些数据为脾单核细胞/巨噬细胞向肝脏迁移并浸润以形成炎症微环境提供了证据。 为了验证脾细胞在肝转移中的作用，研究人员将 KikGreen+ CD11b+ 脾细胞输注给进行了脾切除和接种 B16 细胞 VHPV 的 C57BL/6 小鼠。与仅进行脾切除的小鼠相比，接受 KikGreen+ CD11b+ 脾细胞输注的小鼠表现出 Kikgreen+ 脾细胞在肝脏中的浸润，并加剧了肝转移。这些数据表明，核变形介导脾细胞（主要是脾单核细胞/巨噬细胞）在肝脏中的浸润，并加剧肝转移。 cGAS激活和脾细胞浸润对肝转移均至关重要 03 为了进一步探究脾细胞功能群在促进肝转移恶化中的作用，研究人员将 B16 细胞接种到小鼠的肝静脉门脉区。可是，脾切除术并未影响小鼠肝脏中髓样细胞的分布。然而，癌细胞侵袭显著增加了肝脏中髓样细胞的浸润，包括 CD11bhiLy6G+ 中性粒细胞、CD11blowF4/80hi 库普弗细胞和 CD11bhiF4/80low 单核细胞衍生的浸润性巨噬细胞。在癌细胞接种前进行脾切除术可减少肝脏中单核细胞衍生的浸润性巨噬细胞，但不影响中性粒细胞和库普弗细胞的数量。这些结果表明，脾脏输出的单核细胞/巨噬细胞对于加速癌细胞在肝脏中的定植至关重要。 cGAS的激活和脾细胞浸润对于肝转移都至关重要 此外，研究人员证实脾切除术不会影响通过 HPV 注射进入肝毛细血管的癌细胞分布。重要的是，与接受假手术并接种 B16 细胞的小鼠相比，进行脾切除术显著降低了肝脏转移性肿瘤负荷。在另一个小鼠肝癌细胞系 H22 接种的 VHPV 转移模型中也观察到了脾脏对肝脏转移的促进作用。尤其是，cGAS 抑制剂治疗显著改善了肝脏转移，而进行脾切除术并未进一步减轻这些小鼠的肝脏转移性肿瘤负荷。这些结果表明，cGAS 激活和脾细胞补充对于肝脏转移都是必不可少的。综上所述，这些数据表明癌细胞中cGAS的激活和脾单核/巨噬细胞对肝脏的补充都是加剧肝转移的必要因素。 结论 04 综上所述，本研究结果强调了机械力和脾细胞在肝转移中的作用，支持靶向机械传感器通路和阻断脾细胞募集作为肝转移的潜在治疗策略。 【参考资料】 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1002/advs.202401127 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 线上｜2024年12月6日-2025年1月16日 ▶ 《我的2024》 🕓 全国｜2024年12月-2025年03月 ▶ 中国转化医学产业大会 🕓 上海｜2025年02月28日-03月01日 ▶ 第四届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛 点击对应文字 查看详情

文章解读+创新点拓展，为您带来科研新体验～ 导读 随着单细胞测序技术和类器官培养技术的发展，科学家们对复杂生物系统的理解达到了前所未有的深度。近期，由张旭、吴倩和王小群领导的研究团队在《Cell》上发表了一篇重磅论文《Decoding transcriptional identity in developing human sensory neurons and organoid modeling》，通过构建人类胚胎期背根神经节（DRG）的时空发育图谱，开发了模拟人类DRG发育的类器官系统，揭示了感觉神经元分化的路径和调控机制。这项研究不仅加深了我们对神经系统发育的认识，也为未来临床治疗开辟了新的途径。 研究背景 感觉神经元是传递触觉、温度、疼痛等感觉信号的重要媒介。了解这些神经元如何从干细胞中分化而来，对于探索神经系统疾病的发生机制及开发相应的治疗方法至关重要。然而，由于伦理和技术限制，直接研究人体内感觉神经元的发育过程一直是一个巨大的挑战。本研究利用单核RNA测序（snRNA-seq）和转录因子序列荧光原位杂交（TF-seqFISH）技术，成功绘制了覆盖妊娠早期至中期的人类DRG发育的高分辨率时空图谱，填补了这一领域的空白。 研究设计与结果 研究人员首先收集了来自不同发育阶段的人类胚胎样本，并使用先进的snRNA-seq技术对其进行了全面分析。通过对数万个单个细胞的数据进行处理，他们识别出了多种特定的感觉神经元亚型及其随时间变化的空间分布模式。此外，还建立了一个人工模拟环境下的DRG类器官系统，能够再现体内DRG的发育特征。通过这种方式，研究人员可以在实验室条件下详细观察和操控感觉神经元的分化过程。 为了验证所建立的DRG类器官系统的可靠性，研究者们实施了一系列实验，包括钙成像、基因敲减以及药物抑制实验等。结果显示，这种体外培养系统可以有效地模拟真实组织中的神经元发育情况，并且发现了关键转录因子MEIS2对于某些类型感觉神经元分化的重要性。这些发现进一步证明了DRG类器官作为一种强大的工具，在研究人类神经系统发育方面具有巨大潜力。 图1：人类胚胎DRG的细胞异质性和空间分布 研究人员对妊娠周数（GW）为7-21的DRG样品进行了snRNA测序，观察到相应妊娠阶段样品之间明显的发育连续性和高转录相似性 （图1A）。并注释出19个主要细胞簇，这些细胞簇包括来自神经和胶质谱系的前体细胞及其衍生细胞。通过整合TF-seqFISH转录因子与snRNA-seq数据，研究人员分别绘制了GW8、GW10和GW18的全面DRG时空图谱，揭示了在人类DRG发育过程中细胞分化动态变化及空间特征的变化（图1B）。 通过定量分析人类胚胎DRG中主要细胞类型在妊娠阶段的变化，观察到两个明显的神经发生波。第一个波从GW7之前开始，在GW8结束，主要产生本体感受器和机械感受器；第二个波从GW7到GW12，主要产生伤害性感受器和C类低阈值机械敏感受体 (C-LTMR) 。同时，胶质细胞分化也分为两期进行，施旺细胞（SC） 和卫星胶质细胞（SGC）分别在GW12-GW15、GW17-GW21 进行分化 （图1C、1D）。值得注意的是，GW12 是一个关键的转折点，标志着神经嵴细胞（NCC）的命运从神经元向胶质细胞转变。 TF-seqFISH分析进一步揭示了不同细胞类型独特的时空分布：其中一簇未分化感觉神经元（uSN1）仅在GW8观察到，而另一簇未分化感觉神经元（uSN2）则在GW8和GW10均可见。与神经发生阶段（GW10）存在的少量胶质细胞相比，在GW18时，胶质细胞形成一个结构环包围着神经元，表明胶质增殖和分化进入后期阶段（图1E）。免疫荧光染色也验证了单细胞转录谱推断的发育轨迹，显示在GW7时，来源于uSN1的神经元（NTRK3+/RUNX3+/ISL1+，大直径神经元系）和来源于uSN2的神经元（NTRK1+/RUNX1+/ISL1+，小直径神经元系）的比例相当。 然而，到GW12时，uSN2衍生的神经元比例显著增加至76%，而uSN1衍生的神经元比例下降至8％。值得注意的是，在早期DRG发育过程中，NTRK2+机械感受器（一种uSN1衍生细胞类型）的比例始终保持较低水平（图1F-1I）。 为了准确量化SGC，研究人员对SGC-神经元单元进行了计数，反映了卫星胶质生成的动力学过程。在GW12时，有15.4% 的神经元被SGCs包围，这一比例在GW15时上升至40.9%。SC首次出现在GW17，并随后逐渐增多（图1J、1K ）。 综上所述，这些发现揭示了人类胚胎期早期和中期DRG中细胞特化严格的时间顺序以及不同类型细胞复杂的结构特征。 图2：信号通路和基因调控网络确保了ncc的多种命运分化潜能 对NCC衍生细胞分化轨迹分析发现，NCC衍生细胞可以分为感觉神经元前体细胞（SNP）和SC前体细胞（SCP）子类群。SNP进一步分化为uSN1和uSN2亚型，而SCP则进展到分化成SGC和SC（图2A）。 研究者将轨迹变量基因分为九个模块，进一步根据不同的表达趋势进行分组：持续下调、上调后下调、下调后上调和持续上调 （图2B）。这些基因模块在不同发育阶段的细胞中富集，调控人类DRG发育过程。 进一步发现了在细胞类型特异性中的各种转录因子的作用（图2C、2D）。通过进行信号通路富集分析发现 WNT 、MAPK 信号通路在 NCC 中高度富集，RA 信号通路在 NCC、SNP 和 uSN1 中富集。此外，BDNF 和 NT-3 信号通路在 uSN1 中富集，NGF 信号通路在 uSN2 中富集（图2E）。除了神经发生分支中 RUNX1/3 的特异表达外，还发现 MEIS2 和 SKOR2 是第一波神经发生的必要条件，该波主要产生大量感觉神经元，而 FOXO1 在第二波中起主导作用，主要是产生小的感觉神经元（图2F、2G）。 这一发现得到了GW7 DRG组织免疫荧光染色结果的支持，结果显示 NTRK2/3 与 MEIS2 具有显著共表达（94.6%），以及 NTRK2/RUNX3与SKOR2 之间具有显著共表达（84.8％）（图2H，2I）。同样地，NTRK1 / RUNX1与FOXO1的共表达（33.2％）强调了FOXO1作为第二波神经发生的关键调节因子的可能性（图2J）。 此外，TF-seqFISH数据证实了这些发现，并揭示了一致的RNA共表达模式，强调了uSN1中的MEIS2、SKOR2 和RUNX3以及uSN2 中的FOXO1和RUNX1 的共同表达（图2K，2L）。 图3：第一波感觉神经发生波的发育过程 第一波神经发育过程中uSN1分化为本体感受器和机械感受器（图3A、3B）。分析发现，从uSN1到本体感受器过渡期间上调的基因与神经肌肉接头有关，参与的转录因子有MEF2A 和SMAD9；机械感受器细胞中上调的基因与分化相关，参与的转录因子有DRGX 和SHOX2（图3C、3D）。差异性表达分析发现功能基因PIEZO2 主要在机械感受器中表达，ASIC1 和ASIC2 在本体感受器中表达（图3E），表明 ASIC 阳离子通道在增强本体感受器的机械敏感性方面发挥着重要作用。 研究者进一步探索了潜在的分子调节因子，将三种本体感受器亚型划分为：未特化的本体感受器P-1（NTRK3 和RUNX3）、腹侧远端本体感受器P-2 （CRTAC1、TCERG1L 和PCDH17）以及背侧远端本体感受器P-3 (CDH13、ETV1、TACR3 和ITGA2）（图3F、3G），表明本体感受器神经元的早期身份确定过程受肢体间充质信号的影响。 对于机械感受器，研究人员识别出几种不同的亚型：未特化的机械感受器（NTRK3、NTRK2 和SHOX2），Aβ纤维快适应低阈值机械感受器（Aβ RA LTMR；RET，GFRA2，MAFA和NTRK2-low），Aβ纤维慢适应低阈值机械感受器（Aβ SA LTMRs；NTRK3 和NTRK2-high） ，以及Aδ LTMR（NTRK2 和RET）（图3H、3I）。asmFISH证实了这些特殊本体感觉受和机械感受器亚型在GW18的存在及其定位（图3J）。 研究者进一步使用URD和SCENIC分析来确定分化轨迹的调节基因，发现ETV1+、NPAS2+和MEF2C+在背侧远端本体感受器中占主导地位，并且NFIA和PKNOX2在腹侧远端本体感受器表达显著（图3K）。这些发现表明，在不同的外源信号和转录因子组合在非常早的阶段就开始影响本体感受器的细胞身份和功能发育。此外，研究人员还还识别出不同机械感受器亚型富集的调控子（图3L）。 这些结果突出了TF在塑造机械感受器功能多样性的关键作用，以及皮肤类型依赖性机械感受器发育特征的作用。 图4：第二感觉神经发生波的触觉感受器多样性和分子逻辑 第二波神经发生启动了C-LTMR和伤害感受器的发育（图4A）。将uSN2衍生的神经元分为13个亚型，包括12种伤害感受器亚型和C-LTMR，每个亚型都由独特的离子通道、受体和已知的伤害感受器特异性标记物定义（图4B、4C左）。某些伤害感受器亚型表达多种感觉受体（图4C右），比如N11和N12都是NTRK3+伤害感受器，它们表达CHRNA7、GRM8、SCN1A、HRH1和TRPV1受体，表明其在多模式疼痛过程中的作用（图4B、4C）。asmFISH证实了这种表达模式，证明了这些不同类型的伤害感受器在发育过程中存在（图4D）。 在确定了伤害感受器细胞类型后，分化轨迹分析（图4E、4F）显示uSN2s中的一个分支被分为不同的亚群，这些亚群与伤害感受器亚型相关联。每个分支具有独特的调节子谱系特征。利用TF-seqFISH数据确认了相应伤害感受器亚型中RUNX1与这些特异性转录因子的表达类型，共同调节亚型多样性（图4G）。 由于在URD树中观察到uSN2的早期分离后，研究人员对uSN2进行了无监督聚类，产生了8个异质性亚组（uSN2-1到uSN2-8），每个亚组都显示出与特定的神经元亚型的强关联（图4H）。这些发现表明，从uSN2亚型衍生出的感觉神经元的命运限制可能发生在早期、未特化的阶段。 图5：非神经元细胞发育中的转录程序 在NCC分化为胶质细胞的过程中，出现了一种中间状态的SCP，能够同时向SC和SGC分化（图2A）。研究者使用树状图来追踪从SCP（CDH19+/CDH6+）到成熟SGC（APOE+）和SC（PMP22+）的胶质细胞谱系轨迹（图5A）。分析关键转录因子和基因的时空表达模式揭示了与SGC相关的基因比与SC相关的基因更早被上调，也表明SGC分化先于SC形成（图1C、1D及5B）。GO富集分析显示，在主要表达于SGC和SC中的基因参与了细胞迁移和神经功能成熟等过程（图5B）。 为了进一步阐明感觉神经元和胶质细胞之间的细胞相互作用，使用了CellChat分析，并将配体受体（LR）对分为14种不同的模块（LR1-LR14），以揭示不同细胞类型之间通信的特定LR信号通路（图5C）。神经-胶质单元的形成由外源性基质分子和特异性细胞表面受体介导，如纤连蛋白、胶原蛋白以及 Semaphorin家族超家族成员（图5D）。 值得注意的是，在各种感觉神经元亚型中识别出独特的LR对。例如，LR9 特征是LRRC4C与NTNG1的相互作用，分别富集在SGC和机械感受器中。此外，SGC表达SLIT2/3，它们专一地结合到痛觉感受器中的ROBO2（LR10），而SGC中表达的SEMA4B可以特异地结合到本体感受器中的DCBLD2（LR11）（图5E）。这些细胞类型的特殊胶质-神经元相互作用通过单细胞空间转录组数据进一步得到证实，表明周围 SGC在促进神经元特异功能方面可能发挥专门的作用（图5F）。 巨噬细胞对于免疫相关病理条件下疼痛感受器的激活起着关键作用，这些巨噬细胞表达ITGAM、CSF1R、PTPRC、MRC1和MERTK的细胞（图5G）。免疫染色显示，在DRG中巨噬细胞招募始于GW10，与第二波神经发生结束的时间一致，表明巨噬细胞可能参与并影响神经发育过（图5H）。巨噬细胞（P2RY12+）和神经元（ISL1+）的比例随着时间推移而增加（图5H、5I）。 为了阐明巨噬细胞和感觉神经元之间建立功能单元的分子相互作用，使用CellChat分析LR相互作用。GO富集分析帮助显示semaphorin-plexin和整合素信号通路在巨噬细胞招募中十分重要。此外，APOE-SCARB1、PTPRC-MRC1和SYK-FCGR2A之间的相互作用可能是巨噬细胞-神经元单位的关键调节因子，提示它们在调控DRG发育中巨噬细胞功能方面的潜在作用（图5J、5K）。 图6：感觉神经元的进化保护和分化 基于先前的数据和研究者的研究分析发现，从妊娠7周到21周的人类胚胎DRG发育过程与小鼠胚胎期第12天（E12）到出生后第4天（P4）的DRG发育进程高度相似（图6 A、6B），但存在时间上的差异，进一步分析发现在人类DRG中，细胞分化从妊娠7周至12周明显减少；而小鼠细胞分化在E12.5达峰值并持续下降直至出生（图6 C）。TRPA1、TRPV1、SCN10A、SCN11A 和ANO5 等与疼痛相关的基因的表达水平上在人类中更高；相反，P2RX2 在小鼠中的表达水平高于人类。瘙痒感知相关的基因，HRH1，在人类神经元中相对高表达；此外，参与多模态伤害感受过程的MRGPR家族成员MRGPRD未在人类胚胎DRG中表达。阿片类药物受OPRM1 和OPRD1 的表达水平在人类中较高且范围较广。 此外，TH在小鼠部分感觉神经元中表达，但在发育期的人类DRG中低表达。人与小鼠DRG发育过程中关键基因表达启动时间也有显著差，特别是与瘙痒感知相关的IL31RA、CYSLTR2 和HRH1 基因，这些基因在人类DRG中早于小鼠DRG表达（图6F）。这些观察结果强调了人类和小鼠DRG中独特的基因表达谱，揭示了感觉系统进化适应的重要见解。 此外，人类N6痛觉神经元类似于小鼠TRPM8+ 冷热感受器，N10痛觉神经元类似于小鼠SST+ 神经元，而N11痛觉神经元类似于小鼠CGRP-θ神经元（图6G）。有趣的是，免疫染色结果显示，由RET+特征标记并伴有DCC、SCN1A、NTRK3 和GRM8 的N12，在基因表达模式上没有明显的差异（图6H、6I）。N12神经元表现出钙信号通路、吗啡和尼古丁上瘾、阿片肽信号通路以及apelin信号通路相关基因的高表达。这些途径中的几个靶点被用于治疗精神疾病和偏头痛（图6J、6K）。 总体而言，这些发现揭示了物种间显著差异的基因表达和感受器细胞类型，在感觉和疼痛过程中起着关键作用。 图7：hDRGO模拟了人类感觉神经元的发育特征 基于先前的研究和对人类脊神经节发育的外源信号和内在转录因子调节的理解，研究者建立了一个稳健的方法来生成准确再现人类感觉神经元发育过程和多样性的人类背根神经节类器官（hDRGO）模型（图7A）。免疫荧光染色显示了各种感觉神经元亚型的存在（PRPH+），包括本体感受器（NTRK3+）、机械感受器（NTRK2+）和痛觉受体（NTRK1+）（图7B）。 结合钙成像和免疫荧光染，证实了hDRGO中存在丰富的DCC+/NTRK3+/NTRK1+人伤害感受器神经元，这些伤害感受器通过响应辣椒素显示伤害特征，表明hDRGO有效地反映了人类伤害感受子亚型的多样性和特异性（图7J）。研究人员在第30天和第60天分别进行了hDRGO的snRNA-seq分析，其中包括NCC、SNP、uSN1、uSN2、本体感受器、机械感受器、伤害感受器、SCP、SGC、纤维母细胞和内皮细胞（图7C，7E-7G）。 在整个hDRGO培养过程中，祖细胞（NCC、SNP和SCP）连续分化并形成复杂的细胞类型（图7D）。hDRGO的细胞组成和转录组与胚胎早期至中期发育阶段（GW7-GW15）表现出相似性（图7H）。 使用慢病毒载体递送靶向MEIS2、SKOR2以及FOXO1的shRNA，以分别抑制hDRGO第一波和第二波神经发生（图2F、2G），结果表明，在FOXO1敲除的类器官中NTRK1+神经元减少，而在MEIS2和SKOR2敲除的类器官中NTRK2+和NTRK3+神经元减少（图7K-M）。这些发现进一步证明MEIS2、SKOR2 和FOXO1 在uSN1和uSN2 的细胞命运决定中起关键作用，也验证了hDRGO对人胚胎DRG发育过程的模拟。 拓展延伸 ● 疾病建模 1.癌症研究：通过从肿瘤患者的样本中生成类器官，研究人员能够模拟肿瘤微环境，探索癌细胞的行为和反应机制。例如，结直肠癌类器官被广泛用于研究癌变过程、转移机制以及寻找新的治疗靶点。 2.神经系统疾病：脑类器官（如“迷你大脑”）是研究神经发育障碍（如自闭症谱系障碍）、神经退行性疾病（如亨廷顿舞蹈症）的有力工具。这些模型可以帮助科学家理解疾病的分子基础，并测试潜在的治疗方法。 3.遗传病：对于一些罕见或复杂的遗传病，可以从患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）培养出相应的类器官，以研究基因突变如何影响器官功能。 ● 药物筛选与毒性测试 1.药物发现：制药公司利用类器官进行高通量药物筛选，快速评估大量化合物对特定器官的影响。这种方法有助于早期识别有潜力的候选药物，从而加速新药研发进程。 2.个性化医疗：针对个体患者的类器官可以用来测试不同药物的效果，预测患者对特定治疗方案的响应，实现精准用药。 3.安全性评估：相比传统的二维细胞培养和动物实验，类器官提供了更为真实的体内条件模拟，因此更适合于评估药物的安全性和可能产生的不良反应。 ● 再生医学 1.组织修复：类器官技术有望推动再生医学领域的发展，特别是对于那些难以自我修复的组织，如肝脏、肾脏等。科学家们正在探索将类器官移植到患者体内以促进组织再生的可能性。 2.器官移植：长远来看，如果能够解决免疫排斥等问题，类器官甚至有可能成为人工制造完整器官的基础，解决器官短缺问题。 ● 基础生物学研究 1.器官发育：类器官为研究器官形成过程中涉及的关键步骤提供了前所未有的视角，包括细胞分化、形态发生及器官特异性结构的建立。 2.细胞间通讯：由于类器官保留了原始组织的复杂性，它们非常适合用于研究细胞间的信号传导网络及其在健康和疾病状态下的变化。 ● 毒理学研究 化学物质暴露：类器官可用于评估各种化学物质对人体各器官系统的潜在危害，帮助制定更科学的环境保护政策和产品安全标准。 临床应用与展望 本研究所取得的技术成果将有助于推动神经科学领域向前迈进一大步。首先，通过创建高度仿真的DRG类器官模型，科学家们可以在不依赖于动物实验的情况下，更准确地模拟人类神经系统疾病的状态，从而加速新药研发进程。其次，基于此平台开展的基因编辑或CRISPR筛选实验，可以帮助识别出与特定神经退行性疾病相关的致病基因，为个性化医疗提供理论支持。最后，考虑到DRG在慢性疼痛管理中的重要作用，这项研究有望带来全新的治疗策略，比如针对特定类型的痛觉感受器设计特异性药物靶点，实现更加精准有效的镇痛效果。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献 Lu T, Wang M, Zhou W, Ni Q, Yue Y, Wang W, Shi Y, Liu Z, Li C, Hong B, Zhou X, Zhong S, Wang K, Zeng B, Zhang J, Wang W, Zhang X, Wu Q, Wang X. Decoding transcriptional identity in developing human sensory neurons and organoid modeling. Cell. 2024 Nov 4:S0092-8674(24)01205-4.  点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多相关课程和实验技术服务支持~