SRSF1

01. 文献概述 近期，北大的团队在Nature Catalysis期刊发表了一篇名为《In situ lysosomal proteomics enabled by bioorthogonal photocatalytic proximity labelling》的文章，主要描述了其开发了一种新的溶酶体邻近标记技术。 图1. CAT-Lyso系统用于活细胞中溶酶体蛋白质组分析的示意图。 溶酶体是细胞内的一个重要细胞器，参与多种细胞过程。溶酶体功能异常与多种疾病相关。 传统的亚细胞蛋白质组学方法，需要细胞裂解处理，会改变细胞和细胞器的原始状态，且存在材料需求大、时空分辨率低、易受污染等问题。而生物催化邻近标记方法需要基因工程改造细胞以引入外源酶，限制了其在原代样本中的应用。 而北大团队开发的这项技术将能够突破这些壁垒，特异性的靶向活细胞溶酶体中的蛋白质并进行标记。 02. 研究方法 1. 伊红在吗啉基团的加入下，LysoCat（伊红光催化剂）就形成啦，这是一种能够靶向溶酶体的伊红衍生物，它可以用于对活细胞中溶酶体蛋白质组的原位分析。注意： 没有引物吗啉基团的伊红可是没有特定靶向的哦，它是在细胞质内均匀分布的。 2. LysoCat在被活细胞摄取后，细胞内的酯酶会将其去乙酰化，释放出高活性的伊红会定向到细胞的溶酶体，在那里，如果用绿色发光二极管（LED；波长520 nm，功率15 mW/cm²)照射的话，被保护的探针就会被催化，脱离保护被暴露出来，从而被激活。这些被激活的，与生物素偶联探针，就会标记附近的溶酶体内蛋白质啦。 3. 利用链霉素对生物素的亲和作用，这些被生物素偶联的蛋白质就会被富集到一起，然后就可以通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）进行富集和蛋白质组分析，鉴定出溶酶体内蛋白质或跨膜蛋白质啦。 03. 基础实验小课堂 问：为什么要测试不同的细胞类型？ 答：为了测试并验证该技术平台对于各类细胞的普适性。 那么要如何测试呢？让我们一起来看一下吧 不同细胞类型的溶酶体光催化邻近标记（CAT-Lyso） 图2. 免疫印记分析前细胞处理的示意图 流程： 1. 将Hela细胞接种到12孔板中培养，待汇合度>90%时，移除培养基 2. 将细胞与LysoCat（10 µM，1 ml DMEM）在37°C、5% CO₂下孵育30分钟 3. 用DMEM洗涤三次，用PBS洗涤一次 4. 加入SF2（50 µM，1 ml DMEM），细胞在37°C、5% CO₂下孵育30分钟 5. 在室温下用绿色LED照射15分钟，并在黑暗中放置15分钟 6. 用PBS（每孔1 ml）洗涤一次 7. 用100 µl RIPA强裂解缓冲液重悬 8. 在冰上孵育10分钟 9. 加入25 µl 5× SDS-PAGE还原上样缓冲液（上样缓冲液的最终浓度为1×） 10. 在95°C下加热15分钟 11. 4-15%梯度SDS-PAGE和0.2-µm PVDF膜进行免疫印迹分析 12. 使用小鼠抗生物素单克隆抗体（mAb）和β-肌动蛋白mAb作为一抗（1:1,000稀释），辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗小鼠免疫球蛋白G（作为二抗（1:5,000稀释） 结果解读： 图3. 经LysoCat处理的Hela细胞的免疫印迹结果 阴性对照（左一泳道）为没有经过临近标记技术处理的Hela细胞组，接着（中间泳道和右一泳道）是经过不同浓度的LysoCat处理后的实验组，通过免疫印迹法检测到强烈的生物素标记信号，证实了光催化标记的发生，更高的LysoCat浓度会导致更强的标记信号。 图4. 经LysoCat处理的不同细胞的免疫印迹结果 在其他对多种类型的细胞（HEK293T、RAW264.7、iBMDM、Raji、K562和Jurkat）进行了相同的标记程序，这些细胞类型从上皮样细胞到巨噬细胞和白血病细胞都有涉及。在所有测试的细胞系中都检测到了明显的光催化标记信号，这表明该策略对广泛的细胞类型都有效。 实验中用到的主要试剂： 图片来源：生产商：康为世纪（CWBIO) 知识点敲黑板： A. 免疫印记是什么？ 这是一种用于检测样本中特异性蛋白的实验技术。它是将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。 B. Actin是什么？ 肌动蛋白（Actin） 是一种广泛存在于真核细胞中的蛋白质，具有多种重要的生物学功能在分子生物学实验中，肌动蛋白（Actin）常被用作内参（内参照）基因或蛋白。 C. 为什么选择actin作为内参? 原因主要基于其以下特性： 1.高度保守性 • 序列保守：肌动蛋白基因在不同物种之间高度保守，这意味着其序列在进化过程中变化很小。例如，不同哺乳动物的β-actin基因序列高度相似。 • 结构保守：肌动蛋白的蛋白质结构在不同物种中也高度保守，这使得针对肌动蛋白的抗体可以广泛应用于多种物种的实验。 2.表达稳定且丰富 • 广泛表达：肌动蛋白在几乎所有真核细胞中都有表达，且在不同组织和细胞类型中的表达量相对稳定。 • 表达量适中：肌动蛋白的表达量既不过高也不过低，适合用作内参来标准化实验中的信号。 3.功能重要性 • 细胞骨架成分：作为细胞骨架的重要组成部分，肌动蛋白参与细胞形态维持、细胞运动、细胞分裂等多种生物学过程。 • 实验中的可靠性：由于其在细胞中的重要性，肌动蛋白的表达水平通常不会因实验处理而发生显著变化，这使得它成为可靠的内参。 4.其他优势 • 易于检测：肌动蛋白的分子量适中（约42-43 kDa），且有多种特异性抗体可供选择，便于在Western Blot等实验中检测。 • 适用范围广：适用于多种实验条件和组织类型，但在某些特殊情况下（如肌肉组织）可能需要选择其他内参。 D. 免疫印记中内参的作用? 1.校正蛋白上样量 • 确保上样量一致：在Western Blot实验中，不同样本的蛋白质上样量可能存在差异，这会影响实验结果的准确性。通过检测内参蛋白的表达水平，可以确保各泳道之间的蛋白上样量一致，从而更准确地比较目标蛋白的表达差异。 2.检测转膜效率 • 评估转膜效果：在电泳分离后的蛋白质转移到膜上的过程中，不同泳道的转膜效率可能不同。内参蛋白的转印效率可以帮助确定目的蛋白是否被有效转印到膜上。 3.排除实验误差 • 监测实验体系：内参可以作为实验体系的空白对照，帮助检测整个实验过程中的误差，包括蛋白提取、转膜、显色或发光体系等是否正常。 4.提供定量标准 • 用于定量分析：在半定量或定量分析目标蛋白表达水平时，内参蛋白的表达水平可以作为标准化的参考。通过计算目标蛋白与内参蛋白的灰度值比值，可以更准确地反映目标蛋白的相对表达量。 04. 研究意义 技术优势：CAT-lyso系统作为一种无基因改造的亚细胞蛋白质组学技术，具有广泛的适用性，能够对难以转染的细胞、原代细胞以及临床样本进行原位亚细胞蛋白质组分析。 疾病研究与治疗：该技术为深入研究溶酶体相关疾病的发生机制、发现新的疾病标志物和治疗靶点提供了有力支持，有助于推动相关疾病的研究和治疗进展。 推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。 原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。 有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。 ©2021 医药速览 保留所有权利 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学 | 人人学懂免疫学（语音版）    综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普 | 医药前沿笔记 PROTAC技术 | 抗体药物 | 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术 | 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

*仅供医学专业人士阅读参考“近朱者赤，近墨者黑”，这句话在癌症相关研究里可真不是地图炮，毕竟某个蛋白质家族里一旦出现一个促癌反派，其它成员也大概率不是什么好东西，相信大家都能想到不少例子吧？今天奇点糕要批判的，是一群名叫丝氨酸/精氨酸丰富剪接因子（SRSF）的家伙，而且这批判还有点连续剧的意思，半年多前被点名的是SRSF10，这回就换成SRSF1啦。近日，Signal Transduction and Targeted Therapy期刊上发表了同样来自复旦大学附属中山医院樊嘉院士及史颖弘、代智等研究者的研究成果：抑制SRSF1一方面能够全面提升CD8+T细胞的抗癌能力和促进代谢重编程，另一方面则能降低癌细胞的糖酵解能力，减缓它们的增殖速度，从而“一石二鸟”式地助力现有免疫治疗[1]。论文首页截图在发现多种实体瘤中均有SRSF1过表达后，既往研究大多都在关注SRSF1对癌细胞的直接作用[2]，但以今天的眼光来看，不分析SRSF1对肿瘤微环境其它组分，特别是对免疫细胞的影响可不够。在本次研究中，研究者们一上来就证实，多种人类实体瘤样本内SRSF1的mRNA水平与耗竭CD8+T细胞呈正相关，而与细胞毒性或记忆性T细胞呈负相关。研究者们又使用肝细胞癌（HCC）细胞展开实验，证实耗竭CD8+T细胞内的SRSF1表达水平显著高于细胞毒性CD8+T细胞，且SRSF1表达水平直接受耗竭相关转录因子NFATC2调控；同时，对PD-1抑制剂新辅助治疗无应答HCC患者的肿瘤组织内，SRSF1表达水平也显著较高，这都说明SRSF1的存在不利于抗肿瘤免疫。SRSF1表达水平与实体瘤内耗竭CD8+T细胞数量呈正相关选择性敲除小鼠CD8+T细胞中的Srsf1，就能显著增强它们的细胞毒性，表现为CD8+T细胞抑癌能力上升、且CD38表达上调（提示细胞毒效应更强[3]），肿瘤内也有更多CD8+T细胞浸润，且这种增效对过继性CD8+T细胞疗法也同样成立。自然而然，下一步当然就要分析敲除Srsf1增强CD8+T细胞战斗力的具体机制了。RNA测序分析显示，敲除Srsf1后的CD8+T细胞不仅发生了细胞毒性相关基因（如Ifng, Gzma）的表达上调，PI3K/AKT/mTOR通路也被显著激活，符合既往研究SRSF1通过上调PTEN表达、抑制mTOR通路活性的发现；研究者们还发现，敲除Srsf1也是使CD38表达上调的直接原因，这是因为SRSF1可通过调控转录因子FOXO1影响CD38表达，另外CD8+T细胞的糖酵解能力也显著增强，又从代谢层面获得了加持。SRSF1可通过调控转录因子FOXO1影响CD38表达接下来，研究者们用短发夹RNA（shRNA）抑制了HCC细胞SRSF1表达，发现肿瘤生长速度在免疫健全小鼠身上比裸鼠更慢，说明肿瘤内源性的SRSF1也会对T细胞有所影响，同时肿瘤内也有更多功能增强的CD8+T细胞浸润；就癌细胞本身而言，缺少SRSF1后被抑制的则是糖酵解能力，这同样是SRSF1调控转录因子活性，影响糖酵解相关基因表达的结果。既然抑制SRSF1既会助力CD8+T细胞，又能削弱癌细胞，研究者们最后经筛选开发了一种新型小分子SRSF1抑制剂（TN2008），并证实了它单独使用的抑癌效应和联合PD-1抑制剂时的协同增效作用，希望它能尽快进入临床研究一展身手啦。TN2008的发现过程和临床前研究中的抑癌作用参考文献[1]Zhu G-Q, Tang Z, Chu T-H, et al. Targeting SRSF1 improves cancer immunotherapy by dually acting on CD8+T and tumor cells[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2025, 10: 25.[2]Anczuków O, Akerman M, Cléry A, et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer[J]. Molecular Cell, 2015, 60(1): 105-117.[3]Wu P, Zhao L, Chen Y, et al. CD38 identifies pre-activated CD8+ T cells which can be reinvigorated by anti-PD-1 blockade in human lung cancer[J]. Cancer Immunology, Immunotherapy, 2021, 70: 3603-3616.本文作者丨谭硕

引言在人类衰老的进程中，克隆性造血（Clonal Hematopoiesis, CH）的出现是一个显著的现象，它在血液组织中尤为明显，并与癌症风险和衰老相关表型紧密相关。克隆性造血通常是由于一系列已知基因的体细胞突变所引发，但大多数克隆扩张背后的驱动因素仍然未知。近期，一项基于UK Biobank 200,618个个体全血外显子组数据的研究（Nature Genetics, “Analysis of somatic mutations in whole blood from 200,618 individuals identifies pervasive positive selection and novel drivers of clonal hematopoiesis”），通过推断全血外显子组中的基因水平正选择，揭示了17个新的基因，包括ZBTB33、ZNF318、ZNF234、SPRED2、SH2B3、SRCAP、SIK3、SRSF1、CHEK2、CCDC115、CCL22、BAX、YLPM1、MYD88、MTA2、MAGEC3和IGLL5，这些基因在群体水平上受到正选择，并在单细胞衍生的造血细胞群中验证了这一选择模式。这些基因的突变克隆随着年龄的增长在频率和大小上都有所增加，与经典的CH驱动因子相当。它们与感染风险的增加、死亡风险和血液系统恶性肿瘤的相关性，突显了这些新增基因在衰老过程中的重要性。该研究的发现不仅扩展了我们对CH遗传基础的理解，而且为与衰老相关的疾病提供了新的生物标志物。通过使用dN/dS比率（非同义突变与同义突变的比率）作为正选择的指标，研究人员能够区分出在净化选择、中性选择和正选择下的基因和特定突变。在全球范围内，研究者发现在所有类型的非同义编码突变中，dN/dS比率为1.13，表明在检测到的非同义突变中，约八分之一受到了选择。特别是，每8至11个错义突变、每4至5个截断突变和大约每3个剪接突变显示出血液中的正选择证据。此外，研究还发现，与CH相关的新的适应性推断驱动因子（fitness-inferred drivers）在健康个体的造血细胞中普遍存在，并且在健康造血过程中受到正选择的作用。这些发现为未来的研究提供了新的方向，即通过鉴定和理解这些新的CH基因，可以更好地揭示衰老过程中的克隆选择机制，以及如何通过调节体细胞突变克隆的负担来改善健康结果。该研究不仅在科学上具有重要意义，而且对于临床实践也有潜在的影响。它提示了未来可能通过干预这些基因相关的生物学过程，来开发针对衰老相关疾病的新疗法。随着对CH及其驱动基因更深入的理解，我们有望在延缓衰老和提高老年人生活质量方面取得进展。随着年龄的增长，人体细胞会积累体细胞突变(somatic mutations)，这些突变会导致不同组织中克隆的扩展，特别是在血液中，形成克隆性造血(clonal hematopoiesis, CH)。这些克隆性造血不仅与癌症风险有关，还与多种衰老相关的表型相关。通过对英国生物银行(UK Biobank)中200,618名个体的血液样本进行全外显子组测序分析，研究人员识别出了一系列受正向选择影响的基因，并验证了这些基因的突变与感染、死亡和血液恶性肿瘤风险的关系。克隆性造血的基础克隆性造血（Clonal Hematopoiesis, CH）是指造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells, HSC)因体细胞突变而引发的克隆扩展现象。这种现象在老年人群中非常常见，特别是在70岁以上的个体中。研究发现，这些突变主要发生在已知的驱动基因中，如DNMT3A、TET2和ASXL1。这些基因的突变能够提供选择优势，促进克隆的扩展。然而，许多克隆性造血的克隆并没有已知的驱动突变，表明存在许多未知的因素在起作用。研究方法在该研究中，研究人员利用Mutect2（Broad Institute开发的一种高灵敏度体细胞突变识别工具）对UK Biobank中200,618名个体的全外显子组测序数据进行分析，识别出52,701个可能的编码体细胞变异。为了确保数据的准确性，研究团队实施了严格的过滤步骤，剔除了可能的测序伪影和常见的种系变异（如在1000 Genomes、ExAC和gnomAD数据库中常见的单核苷酸多态性）。研究团队使用dNdScv软件评估了每个基因的非同义突变与同义突变的比率（dN/dS），以区分受到净化选择、中性选择和正向选择的基因。全球范围内，所有类型的非同义编码突变的dN/dS比率为1.13，这表明在这一数据集中，每八个非同义突变中就有一个受到选择。具体地，错义突变、无义突变和剪接突变分别表现出1/8-11、1/4-5和1/3的正向选择比率。UKBB中全血外显子组中的普遍选择（Credit: Nature Genetics）新发现的驱动基因研究人员识别出17个新的受正向选择影响的基因，包括ZBTB33、ZNF318、ZNF234、SPRED2、SH2B3、SRCAP、SIK3、SRSF1、CHEK2、CCDC115、CCL22、BAX、YLPM1、MYD88、MTA2、MAGEC3和IGLL5。这些基因的突变频率和克隆大小随着年龄的增长而增加。例如，MYD88基因中的p.Leu265Pro突变已知与多种淋巴瘤相关，包括华氏巨球蛋白血症(Waldenström's macroglobulinemia)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)。克隆性造血与健康风险的关系携带这些新发现基因突变的个体表现出更高的感染、死亡和血液恶性肿瘤的风险。例如，研究发现，具有MYD88和IGLL5基因突变的个体更容易患慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)和急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)。此外，携带ZBTB33基因突变的个体显示出异常的血细胞计数，这表明这些基因突变对血液系统的功能有显著影响。克隆性造血的普遍性在该研究中，研究人员发现23%的UK Biobank个体（即47,026人）在经典或新发现的CH基因中存在可检测到的突变。这些体细胞突变在不同类型的非同义编码突变中表现出正向选择，特别是错义突变、无义突变和剪接突变（主要影响DNMT3A）。研究人员通过计算dN/dS比率来评估基因水平的正向选择，结果显示在所有类型的非同义编码突变中，dN/dS比率为1.13，这表明每八个非同义突变中就有一个受到选择。此外，研究还发现，在携带DNMT3A、TET2和ASXL1基因突变的个体中，这些突变的等位基因频率(VAF)和克隆频率随着年龄的增长而增加。未来的研究需要进一步探索这些克隆扩展在血液和其他自我更新组织中的广泛影响，以确定调节体细胞突变负担对改善健康结果的潜在作用。通过更加敏感和低误差的测序技术，结合人口数据集，将有助于更全面地理解血液中受正向选择影响的进化基础。通过对英国生物银行中大规模个体的分析，该研究识别出了多种新的受正向选择影响的基因，并验证了这些基因突变与多种不良健康结果的关系。这些发现为理解克隆性造血在衰老过程中的作用提供了新的视角，并为未来的研究指明了方向。研究强调了在老年人群中，克隆性造血现象的普遍性及其对健康的潜在影响，提示需要进一步的研究来探索这些克隆扩展的机制及其调控方式，以期改善老年人的健康结果。原文链接Bernstein N, Spencer Chapman M, Nyamondo K, Chen Z, Williams N, Mitchell E, Campbell PJ, Cohen RL, Nangalia J. Analysis of somatic mutations in whole blood from 200,618 individuals identifies pervasive positive selection and novel drivers of clonal hematopoiesis. Nat Genet. 2024 May 14. doi: 10.1038/s41588-024-01755-1. Epub ahead of print. PMID: 38744975.https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41588-024-01755-1责编|探索君排版|探索君转载请注明来源于【生物探索】End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述