MHC II x LAG3

今天小编给大家解读一篇2月发表在Journal of Hepatology杂志（IF：25.7/Q1）的文章“Single cell landscape of functionally cured chronic hepatitis B patients reveals activation of innate and altered CD4-CTL-driven adaptive immunity”。在本文中作者结合单细胞数据、流式细胞术和免疫荧光，阐明与慢性乙型肝炎（CHB）和功能治愈（FC）患者相关的免疫病理细胞状态。背景慢性乙型肝炎(CHB)病毒感染影响2.57亿人，主要在亚太地区和非洲地区，每年估计有80万人死于肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎患者很难彻底治愈和清除病毒感染，在患者血清中出现或不出现抗HBs抗体的情况下，病毒表面抗原(HBsAg)的丧失，也叫功能治愈(FC)。病毒感染的清除在很大程度上取决于强大和持久的适应性免疫反应。病毒特异性CD8 T细胞参与急性乙肝病毒感染。然在慢性乙肝患者中，乙肝病毒特异的CD8 T细胞最终耗尽。最近的研究表明，适应性免疫反应的损害除了高抗原负荷外，还与暴露于病毒抗原的时间有关。先天免疫反应在慢性乙型病毒性肝炎中的具体作用仍存在争议，且相对知之甚少。先天免疫反应通常被认为是慢性乙肝患者的功能受损。最近一项研究发现了一种特定的Kupffer细胞(KC)亚群，该细胞在IL2的存在下重新激活了乙肝病毒特异性CD8 T细胞的抗病毒功能。此外，其他研究表明，NK细胞细胞毒活性的增强与肝脏炎症之间存在正相关关系，尤其是在核苷类似物(NA)治疗后清除乙肝表面抗原的患者中。这些研究暗示了先天免疫细胞在慢性乙肝的解决中的潜在功能。尽管最近的研究已经通过不同测序方法探索了CHB不同阶段的肝脏环境的动态情况，但FC患者的疾病相关细胞状态(DAC)仍然难以捉摸。在本文中，作者主要目的是探索持续控制乙肝表面抗原丢失的机制基础。同时用scRNA-seq和多参数流式细胞术检测了每例肝穿刺活检的核心细胞和匹配的PBMCs，并分离了CHB患者或已实现功能性治愈的患者。通过对转录组谱、推断的细胞间相互作用和基于流式细胞术的验证研究的系统分析，作者发现了不同的免疫和上皮细胞状态，如CD4-CTL、NK细胞、中性粒细胞和表达MHC-II类分子的肝细胞，这些细胞可能在FC患者实现和维持HBsAg持续丢失中发挥重要功能。此外，作者首次提供了FC患者中存在cccDNA的直接证据。结果CHB和FC患者肝脏和PBMCs的单细胞图谱作者将CHB患者分为治疗组(n=29)和未治疗组(n=29)，其中检测到病毒HBsAg, CHB患者达到FC (n=9)。FC患者在治疗后(n=7)或自发(n=2)显示病毒HBsAg清除，并在HBsAg消失后7 ~ 84个月进行分析。作者对肝脏活检和患者匹配的PBMCs中分离出的细胞进行了scRNA-seq，以及多参数流式细胞术。并利用多重免疫荧光(mIF)染色和图像分析对来自同一肝活检的组织切片进行了验证研究（图1A）。为了重点分析免疫细胞亚群和HBV特异性T细胞的表型，CHB患者根据其定量HBsAg (qHBsAg)进行分层，高(>10000 IU/ml)，中(1000-10000 IU/ml)，和低(0.05-1000 IU/ml)（表1）。 表1：样本的EASL指南图1 CHB和FC患者的肝脏单细胞转录组图谱和匹配的PBMCs肝脏中适应性和固有免疫细胞的组成有明显的变化CHB (n=15)和FC (n=8)患者的单细胞转录组分析在肝内捕获了47109个细胞，包括26种不同的主要细胞类型/状态，分别是上皮细胞(肝细胞和胆管细胞)、免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和肥大细胞)、内皮细胞和星状细胞(图1B)。PBMCs主要由17种不同免疫细胞亚型(主要包括T、NK、单核细胞、DCs和B细胞以及干细胞和中性粒细胞)构成(图1E)。FC患者肝内环境中T细胞显著减少，同时NK细胞和中性粒细胞增加(图1D)。而这一现象在PBMCs种并未观察到(图1G)。流式细胞术(图1H)也证实FC患者肝活检中T细胞的减少和NK/NK T细胞群的增加，而外周血则没有这种类似的改变(图1-I)。总体而言，这些观察结果提示，功能治愈的患者肝脏内的免疫细胞组成可能存在特定变化，而这些变化可能并不总是准确地反映在PBMCs中。FC患者表现为CD8 T细胞耗竭减少并出现CD4相关的适应性免疫应答接下来作者细分了主要的T细胞和NK细胞簇，然后对这些细胞类型进行重新聚类(图2A-A’)。确定了不同的细胞亚型，包括CD4辅助性T细胞、CD4细胞毒性T细胞或CD4-CTLs 、CD8效应T细胞、耗竭的CD8 T细胞、CD8记忆T细胞、Treg 细胞、肝脏常驻NK或LR-NK、常规NK或cNK 细胞以及NK T细胞。FC患者中，耗竭的PDCD1+CD8 T细胞显著减少，FOXP3+Treg几乎完全缺失(图2A-D)。耗竭标志物如TIGIT、LAG3和PDCD1在FC患者中显著降低(图2C-D)。而且这种图变化主要反映在肝脏而非PBMCs。与CHB患者相比，FC患者的FOXP3+ Treg频率下降，在肝脏中更明显(图2C)。对肝脏CD8 T细胞进行流式细胞术分析也显示，在FC患者中，PD1+和TIM3+耗竭CD8 T细胞的频率显著较低(图2E)。这不仅体现在CD69+组织驻留CD8 T细胞中，也体现在转运CD69- T细胞中。根据qHBsAg水平对CHB患者进行分层表明，耗竭CD8 T细胞的减少与qHBsAg的减少相关(图2E)。FC的患者中伴随着耗竭的CD8 T细胞和Treg细胞的丢失，CD4-CTL细胞数量增加（表达效应毒性淋巴细胞相关标志物PRF1、GZMA、GZMK、TNF、NCR3）(图2 F-F’)。此外，这些CD4-CTLs表达与终末分化、抗原敏感的CD4 T细胞(IL7R, KLRG1)相关的标记物，这些标记物显示出独特的炎症和细胞毒性效应细胞特征，包括肿瘤坏死因子(TNF)。同时它们也表达NCR3基因，类似于NK样细胞的特征（图2F, F）。流式细胞术分析显示，在组织驻留(CD69+)和转化(CD69-) T细胞中，KLRG1+ CD4 T细胞的频率均增加(图2F”)。低qHBsAg组CHB患者外周血中CD4+KLRG1+细胞比例显著高于高qHBsAg组。如图2G-G'所示，与高qHBsAg患者相比，低qHBsAg患者KLRG1+ CD4细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达增加约2-3倍，进一步证实了qHBsAg的丢失可能与CD4-CTL的出现有关。RNA velocity 分析表明，FC患者CD4-CTL的出现和增加很可能是由naïve CD4细胞分化而来(图2H)。轨迹分析也揭示了CD4-CTL和传统CD8 T细胞之间存在明确界限。作者鉴定了两种CD8 T细胞亚群：一种细胞主要在CHB中，也产生耗竭的CD8 T细胞，以PDCD1、LAG3和TIGIT的表达为标志(图2C, D)。FC的标志是耗竭的CD8 T细胞簇明显消失。剩余的CD8 T细胞亚群向NKT和cNK细胞转变。在CMV暴露的情况下也观察到类似的观察结果，CD8 T细胞表现出先天样特征，这归因于BCL11B表达缺失。cNK和NKT细胞簇在FC患者的LR-NK细胞中增加，这表明从CD8到NKT或cNK到LR-NK的转变可能促进固有免疫激活状态。总之，这些数据表明存在与CD4-CTL表达效应蛋白(PRF1, GZMA, IFNG, TNF)和通路(如IL2, STAT5)相关的适应性免疫应答改变。也强调了T细胞的可塑性以获得先天样特征功能。图2 FC患者表现出Tregs缺失、CD8 T细胞耗竭以及cd4相关适应性免疫反应的出现抗原特异性CD4 T细胞在FC患者中作为病毒清除的关键调节因子接下来，作者利用流式细胞术全面表征并比较了在CHB患者(n=17)和FC患者(n=6)肝脏和PBMCs中发现的CD8和CD4 T细胞群的表型。HBV DNA水平和qHBsAg水平之间有很强的正相关。组织驻留(CD69+) CD4和CD8 T细胞显示了记忆样T细胞(CD127+)频率的增加，以及衰老(CD57+)和终末分化(HLADR+)标志物的丧失。这些观察结果再次表明，不仅在免疫表型变化的稳健性方面，而且在两种组织类型(肝脏与PBMCs)之间观察到的模式方面存在显著差异。耗竭和衰老的丧失，加上记忆样T细胞的增加，提示FC患者在缺乏病毒抗原的情况下，CD4和CD8 T细胞的效应表型和增殖能力增加（补充图1C-E）。这些观察结果表明，FC患者耗竭和衰老的丧失，加上记忆样T细胞的增加，提示FC患者在缺乏病毒抗原的情况下，CD4和CD8 T细胞的效应表型和增殖能力增加。补充图1在HBV感染的自然史中，HBV特异性T细胞，尤其是CD8 T细胞与病毒控制相关。作者询问HBV特异性T细胞应答在CHB和FC患者之间是否有差异。利用酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked Immunospot Assay,  ELISpot）对HBV特异性T细胞进行去卷积，发现慢性乙型肝炎患者和FC患者的HBV特异性T细胞应答均具有肽-特异性（peptide-specific）。通过细胞内细胞因子染色进行的进一步分析表明，在出现FC的患者中，HBV特异性T细胞主要包含在CD4 T细胞群中，而HBs-特异性CD4 T细胞的出现频率高于相应的CD8 T细胞(图2I)。在所有CHB患者中均发现了核心和HBx-特异性CD8 T细胞，但频率较低(无论qHBsAg水平如何，图2I)。FC患者的pol和HBs特异性CD8 T细胞明显增加。HBV特异性CD4 T细胞(主要是pol和HBs特异性)只在出现FC的患者中观察到(图2I)，这提示在功能性治愈的长期维持中，某些肽-特异性（peptide-specific）T细胞的稳健效应功能具有重要意义。肝内NK细胞在FC患者中表现为启动状态除了CD4-CTLs的增加外，FC患者还表现出经典固有免疫应答的增加。肝脏scRNA-seq数据的分析显示，LR-NK细胞显著增加(图3A-A′)，这些细胞被认为通过分泌细胞因子和参与与各种类型细胞的信号相互作用(如招募DCs到炎症部位，促进抗原交叉呈递，从而重塑肝脏环境。FCGR3A+传统NK (cNK)细胞直接参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并且可促进抗病毒T细胞应答，在FC患者中也显示出轻度增加(图3A-A′)。LR-NK细胞和cNK细胞的免疫效应功能均增加，并具有细胞因子-趋化因子分泌特异性（图3B-C）。此外，肝脏中流式细胞术分析显示，随着qHBsAg水平的下降，CXCR6+ CD69+ NK簇逐渐富集(图3D)。在FC患者中，这些细胞中激活性受体(NKp46、CD38、NKG2D和TRAIL)的表达升高和抑制性受体(如PD1和TIM3)表达降低(图3D’-D’’)。在早期的研究中已经报道过CXCR6+ CD69+ NK细胞是scRNA-seq分析中确定的LR-NK细胞的代表。也就是说，部分FC患者的LR-NK细胞还表现出其他抑制性受体的中高表达，如PD1和LAG3(图3D’-D’’)。基于这些标志物，作者确定了CD69+ CXCR6high CD16-(图3D' )和CD69+ CXCR6low CD16+(图3D' )细胞亚群，这些细胞随着HBsAg水平下降而出现，并在FC中富集。作者还发现了另一个由CD69+CXCR6- CD16-标记的细胞群，该细胞中qHBsAg水平较低(图3D'-3D'')。总之，多参数流式细胞术数据表明，组织驻留的NK细胞的效应细胞毒性功能必须被活化和抑制受体的平衡表达仔细调节。图3 FC患者表现出肝内NK细胞的预激状态FC患者肝内髓样环境重塑为免疫活跃状态以上数据表明FC患者的肝脏逐渐向免疫激活状态转变。为了了解患者的全身免疫反应，作者通过Luminex分析了血浆细胞因子、趋化因子和可溶性受体。血浆分析显示，促炎细胞因子和趋化因子如IL -1 β， ENA-78 (CXCL5)， BAFF和MCP-1 (CCL2)逐渐增加，而qHBsAg水平降低。其中，ENA-78是一种上皮中性粒细胞吸引蛋白，已知由内皮细胞产生，募集中性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜酸性粒细胞到肝脏，这表明FC患者的低度炎症。中性粒细胞是构成抵御病原体第一道防线的肝内髓系细胞群的关键组成部分。越来越多的证据表明，中性粒细胞可作为固有免疫的长期调节剂，并在病毒感染和消退期间改变免疫环境中发挥作用。因此，作者探索了中性粒细胞的性质和组成在CHB和FC患者的全血和肝室中的变化。如图4A和A'所示，FC患者的全血总体中性粒细胞频率较低。然而，cluster 4(图4A和A′′cl4)显示的成熟亚群似乎在FC患者中频率增加。在不同的全血中性粒细胞亚群中， FC患者的中性粒细胞募集标志物(如CXCR2、CXCL8、CEBPB、NCF和NAMPT)总体下降。然而，在FC患者中，全血cl4中性粒细胞显示出高水平的DUSP1、PTGS2、CEBPB、ISG15、IFIT3、IFITM1和IFITM3的表达(图4B)。与CHB患者相比，FC患者上调的通路显示了通过NFkB、干扰素应答、细胞因子产生的调节、对病毒和模式识别受体通路的应答增加(图4B'和B')。FC患者的肝室中中性粒细胞数量高于CHB患者(图4C-C”)。中性粒细胞的富集可能是由于在肺部疾病和其他组织中经常观察到的中性粒细胞浸润和边集现。此外， 中性粒细胞和内皮细胞的CXCR4-CXCL12相互作用增加，CXCR1/2-CXCL2相互作用减少(图4D)，这意味着在功能治愈的患者中，中性粒细胞运输增加，并且它们长期驻留在肝脏内。FC中性粒细胞中干扰素刺激基因(ISG)的减少表明，它们可能不再积极地参与诱导先天应答(图4E)。然而，这些细胞在病毒再激活过程中反复暴露的情况下，仍有能力分泌关键细胞因子给信号效应细胞(CD4/CD8 T细胞，NK细胞)以清除病毒。此外，作者还分析了MacParland等人整合的健康肝脏中的髓系细胞中炎症基因的表达，并将其与作者自己的scRNA-seq数据进行了比较。FC患者的髓系细胞显示出不同水平的促炎和免疫活性基因(IL1B, TNF, IFNG, TGFB1, NFKB1, IL6和CD80)，而抗炎基因，如IL10的表达似乎在FC患者中比CHB和健康肝脏低得多。此外，髓系细胞的单细胞谱也提示，FC患者的肝脏环境发生了明显的重塑，转变为免疫活动状态。流式细胞术分析证实，FC患者肝脏内的CD14+促炎单核细胞增加，表明存在低级别免疫应答的生态系统。CellPhoneDB分析显示，DC2和FOLR2/VSIG4 KC群体与CD4-CTLs和记忆样CD8细胞均显示出稳健的相互作用(补充图2E-E”)，因此提示它们在诱导主动免疫应答方面的假定功能。总之，这些数据强调了髓系细胞在调节从抗炎环境向免疫活性环境的转变方面的重要功能，其机制可能是通过FOLR2/VSIG4 KCs调节增加的病毒抗原呈递和效应细胞的再教育。重要的是，这些结果强调了中性粒细胞作为FC患者持续病毒清除的重要介质的重要作用，并进一步支持增强的固有免疫反应可能在实现功能性治愈中发挥重要作用的假设。补充图2图4 FC患者肝脏内存在边缘中性粒细胞图5 功能性治愈患者肝细胞中MHC II类分子表达增加FC患者肝细胞表达MHC-IIFC患者肝脏中的免疫细胞谱显示肝脏环境中存在促炎开关，通过LR-NK，cNK和中性粒细胞增加固有免疫应答；通过特异性KCs促进CD4和CD8 T细胞的抗原呈递；以及CD4-CTLs的出现，这些CTL可以被促炎刺激(IL2, TNF, IFNG)激活，并由KC培养。目前的关键问题是，在功能性治愈患者中，CD4-CTL或HBV特异性T细胞如何有效靶向呈递病毒抗原的肝细胞。在这项研究中，作者成功地从15例CHB和8例FC患者中提取了足够数量的肝细胞(n~1850)。肝细胞亚群(图5A-A′′)似乎与FC患者特异性相关。除了HLA-A、HLAB和HLA-C表达外，MHC Il类分子(包括HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DRA、HLA-DRB1、CD74和CTSS)也高表达(图5B、C)。总体而言，与CHB患者相比，FC患者中MHC I/MHC ll值较低的肝细胞数量较多。据报道，干扰素治疗可在体外肝细胞(HepG2-NTCP和PHH)和体内小鼠模型中诱导MHC Il类分子表达。通路分析显示，在MHC ll高的肝细胞中，细胞质翻译、抗原呈递和处理、凋亡、白细胞分化信号和淋巴细胞活化等增加(图5D)。在CellPhoneDB分析中，与CHB患者相比，FC患者中肝细胞与LR-NK或CD4-CTLs之间的HLA-C-FAM3C、EGFR-MIF、EGFR-COPA的相互作用减少，而XCR1-XCL1/2、HLA-DPA1-TNFSF9、CD74-COPA、CD74-MIF的相互作用增加(图5E-F)。即使在NUC+/-IFNa治疗后HBsAg仍然为阳性的患者(表1)，与FC (Sloss)患者相比，MHC Il基因(HLA-DRA、HLADRB1、HLA-DPB1)的表达显著减少(图5G)。与此同时，与FC患者相比，接受治疗的非sloss (NSLoss)患者还表现出功能障碍、耗竭的CD4-CTL其效应蛋白(如GZMA、PRF1和TNF)的表达水平较低(图5H)，同时检查点基因(包括PDCD1)的表达水平显著较高(图5H’)。总之，MHC ll高的肝细胞与LR-NKs细胞和活化的CD4-CTL之间的相互作用增强，可能触发靶向免疫应答，从而维持对CHB的长期控制。作者猜想是否有低水平的残留HBsAg由整合DNA合成，或极低水平的残留活性cccDNA可能被anti-HBs抗体掩盖，因此不容易被qHBsAg检测法检出。通过数字微流控PCR对FC患者进行的病毒学研究显示，与CHB相比，FC患者的肝活检中cccDNA水平低50倍，但持续存在(图6A)。此外，尽管FC患者的cccDNA、HBV DNA(图6B)和3.5kb HBV RNA水平较低，但FC患者的3.5kb HBV RNA与cccDNA的比值与CHB患者相似(图6 C-D)。此外，利用HBV-bait捕获富集的病毒序列的单细胞cDNA扩增(sccDNA)证实了数字微流控PCR的结果(图6E-H)。具体来说，在映射到与患者匹配的病毒基因型(图6E-H)后，病毒转录本在CHB(图6E, F)和FC(图6G,H)肝细胞中均有表达。正如预期的那样，从FC样本分离的肝细胞中病毒转录水平比CHB低100-1000倍。总之，这些数据表明，FC患者的残留cccDNA可被积极转录，以支持少量肝细胞内低水平的持续病毒复制。图6 FC患者肝细胞内存在低水平的cccDNA和病毒转录物总结在这项工作中，作者使用了多种方法包括单细胞测序、流式细胞术、ELISpot、细胞内细胞因子染色等等，主要研究了乙肝患者不同治疗结局中的免疫病理标志以及潜在的机制。文章的亮点之一就是数据，作者的患者数据非常丰富,不仅有不同乙肝患者而且测了肝脏组织以及样本匹配的PBMCs。通过单细胞分析肝组织和相匹配患者的PBMCs中疾病相关细胞状态研究，以此来为非功能性治愈患者的潜在机制提供新的见解。另外的一个亮点是，虽然文章以生物信息分析为主，但使用了非常多的湿实验手段，来证明生信分析的结果。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：免疫肿瘤学彻底改变了癌症治疗，为开发疫苗接种方法开辟了新的机会。基于 DNA 的癌症疫苗已经成为一种有希望的方法来激活身体免疫系统对抗癌症。质粒 DNA 免疫显示了良好的安全性特征，在临床前和早期临床实验中发生了诱导的普遍和定制的免疫应答。然而，这些疫苗在免疫原性和异质性方面存在显著局限性，需要改进。DNA 疫苗技术一直专注于提高疫苗效力和递送，以纳米颗粒为基础的递送系统和 CRISPR/Cas9 等基因编辑技术平行发展。这种方法在增强和调整疫苗接种的免疫应答方面显示了巨大的前景。增强DNA疫苗效力的策略包括选择合适的抗原，优化在质粒中的插入，研究疫苗与常规策略和靶向治疗的组合。联合治疗减弱了肿瘤微环境中的免疫抑制活性，并增强了免疫细胞的能力。这篇综述概述了DNA疫苗在肿瘤学中的当前框架，并重点介绍了新策略，包括已确立的联合疗法和仍在开发中的疗法。同时也强调了肿瘤学家、科学家和研究人员建立DNA疫苗作为战胜癌症的前卫方法所需要克服的挑战。免疫治疗方法的临床意义和预测性生物标志物的需要也进行了综述。我们也试图将中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 的作用扩展到 DNA 疫苗。免疫治疗方法的临床意义也进行了综述。最终，精炼和优化DNA疫苗将能够利用免疫系统识别和消除癌细胞的天然能力，引领世界走向癌症治愈的革命。关键词：基于DNA的疫苗；癌症疫苗；联合治疗；佐剂；免疫治疗；免疫反应；疫苗研制。缩略词1.简介癌症是整个医学辞典中最可怕的一个术语。由于治疗方案不同，准确和早期诊断癌症模式及其分期至关重要。癌症的理想药物治疗包括手术、放疗和全身治疗（单独或联合）。然而，细胞毒性癌症治疗被证明对患者来说是难以忍受的，也不能提供终生保护。我们已经进入了一个时代，这个六字母的词几乎造成了六分之一的死亡。2020年的全球流行病学事实表明，癌症死亡人数约为 990 万。其中男性发病 550万，超过女性 11%。癌症患病率呈上升趋势，2020 年达到高峰，约 193 万。有趣的是，自世纪之交以来，尽管癌症发病率、新发癌症病例和癌症死亡病例显著增加，但经年龄校正的死亡率仍显示癌症死亡率降低。为了使癌症死亡率的下降变得显著，我们需要一定的量子飞跃，DNA 疫苗可以是其中之一，经过正确的努力。要理解DNA疫苗的作用机制，首先需要了解免疫系统与癌症的关系。免疫抑制性肿瘤微环境 (TME)和功能失调的抗肿瘤 T 细胞定义了这种关系。TME 构成细胞的复合网络，通常包括癌细胞、多种免疫细胞、基质细胞、血管、细胞外基质和调节蛋白。癌细胞通过逃避 TME 内的免疫攻击而存活，通过各种机制使环境免疫抑制。T 细胞介导的针对肿瘤细胞的反应涉及以下步骤：(a) 抗原呈递细胞 (APC) 阻止死亡肿瘤细胞释放的新抗原；(b) 将捕获的抗原呈递给 T 细胞；(c) 针对肿瘤抗原 (TA) 的 T 细胞反应；(d) 将效应 T 细胞向肿瘤位点推进；(e) T 细胞浸润肿瘤；(f) 识别效应 T 细胞并将其与 TA 结合；(g) 抗原特异性 T 细胞破坏癌细胞。正常情况下，针对肿瘤抗原的T细胞活化需要两个信号——识别抗原和来自 APC 的共刺激信号。CTLA-4 和 CD-28 是结构上同源的 T 细胞受体，它们共享共刺激因子 B7-1 和 B7-2。在它们与共享配体形成复合物时，CD-28 刺激免疫反应，而 CTLA-4 则抑制免疫反应。在健康宿主中，免疫应答的激活和抑制之间维持着错综复杂的平衡。然而，肿瘤通过促进 CTLA-4 和 PD-1，将平衡转向消灭免疫反应。由于 TME 的复杂性和肿瘤细胞逃避免疫的能力，身体保护机制下降，这是免疫治疗的表现。肿瘤间和肿瘤内异质性是细胞毒性化疗方案抗气候反应增加的主要缺点。2013 年，《科学》杂志，宣布治疗癌症的免疫疗法为“年度突破”。随后，免疫治疗重新振兴了肿瘤治疗领域。免疫治疗有多种分类，包括过继性细胞转移 (ACT)、免疫检查点抑制剂 (ICI)、癌症疫苗、抗体治疗和细胞因子治疗。ACT 涉及 T 细胞的输注，这些 T 细胞经过基因修饰以对肿瘤细胞作出反应。嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞和 T 细胞受体修饰的 T 细胞是 ACT 的两种亚型。ICI 是最近纳入单克隆抗体的药物，靶向负性免疫调节剂。溶瘤病毒疫苗是癌症疫苗的亚型，病毒自然存在或通过基因操作靶向癌细胞，而不影响正常细胞。癌症疫苗靶向突变抗原和 TAA。它们可分为 (a) 基于细胞的疫苗；(b) 基于肽的疫苗；(c) 基于病毒和细菌的疫苗；(d) 基于基因的疫苗。白细胞介素-2 和 α-干扰素作为癌症治疗中的经典治疗细胞因子。新抗原是最近的一项突破是基于个体基因突变。作为这篇综述的中心，DNA 疫苗展示了基因疫苗惊人的技术进步。这些是一类核酸疫苗 (NAV)，最近成为一种方法。这些构成了针对肿瘤抗原的遗传信息，并将其传递给宿主，这有助于引起足够的免疫应答。DNA 疫苗可以通过各种途径接种，较好的途径是电穿孔、超声处理、DNA 纹身和基因枪。一旦所需的基因序列进入细胞核，它就会被主要组织相容性复合体-I (MHC-I) 和主要组织相容性复合体-II (MHC-II) 分子标记，从而激活分化簇 (CD) 细胞、CD4 和 CD8 以及 B 细胞。与其他非靶向治疗相比，DNA 疫苗提供了更好的抗原特异性和安全性，引起的副作用更少。然而，DNA 疫苗的免疫原性较差，这是其主要缺点。这篇综述的最终思想旨在探索和研究基于 DNA 的疫苗接种的每个方面，从而为更好地推进肿瘤治疗铺平道路。2.基于DNA的疫苗构建，增强免疫原性的策略嵌合DNA疫苗造成癌症 DNA 疫苗批准失败的几个原因是靶抗原的选择、疫苗的配制工艺以及超越耐受问题。为了克服这些限制，引入了嵌合 DNA 疫苗对抗癌症抗原的概念。利用异种元素，如从另一个物种中提取的蛋白质或肽，与自身直系同源物显著同源。由于这些序列相似且不相同，它们可以帮助规避免疫耐受并引起潜在的免疫原性反应。这种非自身抗原和固有蛋白之间的细微差异是刺激针对异种抗原的 T 细胞和 B 细胞应答的原因。这些反应可能与天然抗原或自身抗原发生交叉反应。ONCEPT 代表着第一个异种 DNA 疫苗被批准用于犬黑色素瘤，如前所述。嵌合疫苗的效力可以通过与免疫调节剂的联合使用来放大。间皮素 (MSLN) 已被确定为卵巢和胰腺肿瘤等多种恶性肿瘤的肿瘤抗原。内衬间皮素的抗原特异性结缔组织生长因子 (CTGF/MSLN) 与免疫调节剂表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG) 联合使用。这种组合通过树突状细胞的成熟增强了疫苗的抗原特异性抗肿瘤作用。除了异种方法引起针对癌症抗原的反应外，还有一些其他策略。其中之一是同时将疫苗与诱导 CD4 T 细胞的肽类共同注射。这些肽的示例为使用长肽或泛 HLADR 表位 (PADRE) 肽，其刺激 CD4 细胞以及树突状细胞。尽管如此，很少有研究观察到与异种疫苗接种相比，自身抗体的应答在自体疫苗中是稳健的。显而易见的原因是对 DNA 疫苗触发的抗体同源抗原的特异性。因此，嵌合 DNA 疫苗存在低亲和力抗体反应的显著缺陷。为了超越低亲和力抗体反应的这一限制，在嵌合元件包括异种以及自体抗原结构域的地方，也可以制造杂交疫苗。其中一个例子是引入编码嵌合 neu-HER2 抗原的质粒，诱导与 ErbB2 + 肿瘤相反的免疫应答。基于MUC1的DNA疫苗黏蛋白 1 (MUC1) 在人体中以跨膜蛋白的形式存在，体现了三部分：(a) N 端胞外区由可变数量的 20 个氨基酸串联重复序列 (VNTR) 单位组成 (b) 跨膜区 (c) 细胞内 c 端区。该肽的基本部分在 MUC1 VNTR 的苏氨酸或丝氨酸残基上携带 5 个 O-连接糖基化位点。这种蛋白主要在乳房、卵巢、肺、肾、胰腺和结肠中表达。在具有正常生理功能的细胞中，这些蛋白高度糖基化。相反，在致瘤细胞中，其发生低糖基化或异常糖基化，这使其成为潜在的目标。在动物模型中，通过肌内途径引入 MUC-1 编码的重组真核载体表达，从而刺激 T 细胞和 b 细胞。这些疫苗发挥作用的三个值得注意的机制是：(a) MUC-1 肽释放到细胞外，并暴露于 APC。然后，这些 APC 帮助肽的内吞作用，并将 MUC-1 的片段呈递给 MHC-II 分子。这种递呈最终导致诱导 CD4 T 细胞分化为 Th1 和 Th2 细胞 (b) MUC-1 蛋白分泌到胞外区，直接与 b 细胞的受体结合诱导抗体的产生 (c) 粘蛋白肽降解为含有 8-12 个氨基酸 % 的肽__% 通过 MHC-I 途径诱导 CD8 T 细胞分化为细胞毒性 T 细胞。为了使抗肿瘤疫苗应答有效，接受疫苗的候选者应能够同时产生细胞免疫和体液免疫。仅含 MUC1 肽的疫苗未能证明足够的有效性，因此，使用了不同的 T 细胞和 B 细胞表位和佐剂。设计了一种编码粘蛋白基因的嵌合 MUC-1 DNA 疫苗，该基因具有跨膜和 C 末端的缺失，并与人热休克蛋白 (HSP70) 基因融合。该疫苗在小鼠模型中发挥抗肿瘤作用方面表现出必要的有效性。新抗原和个性化DNA疫苗尽管 TAA 是 DNA 疫苗的主要部分，但与标准方案相比，通过非突变抗原的免疫未能显示显著结果。这些不充分结果背后的原因是免疫耐受的概念，因为这些抗原通常存在于组织中，并阻止强烈的免疫应答。然而，新抗原的发展已经改变了表格，使我们有能力更具体地靶向肿瘤。新抗原是肿瘤特异性基因改变的结果，并产生新的表位。这种疗法靶向多种癌症抗原，这些抗原在每个患者中都是独一无二的。每个患者都体现了一组独特的肿瘤抗原，并受到克隆变异的影响。由于受试者间变异性，存在肿瘤内异质性，包括较多数量的分支突变。这些突变增加了肿瘤内亚克隆的数量，并导致 T 细胞对新抗原特异性的微弱报复。除了在肿瘤中定制靶向的益处，新抗原显示出极小的不良反应。冷肿瘤转化为热肿瘤，因为促炎性细胞因子倾向于蓄积，T 细胞暴露增加。这一过程还伴随着 TME 中 PD-L1 的调节增强。由于这些获益，肿瘤对免疫检查点阻滞剂 (ICBs) 更敏感。新抗原被宿主免疫系统识别为“非自身”抗原，这使其无法逃避免疫耐受。这些巧妙的新抗原的产生过程首先涉及从肿瘤活检中提取遗传信息，然后进行外显子测序。通过将肿瘤获得序列与正常基因图谱进行比较，鉴定导致致瘤序列发生的突变。根据某些抗原预测算法选择 MHC-I 或 MHC-II 同源的抗原。然而，并非通过该过程鉴定的所有抗原均具有免疫原性，因此需要确立最佳方案。有了这一点，新抗原的另一个缺点是它们的制造时间。开发所需的时间约为 5 个月，这在治疗癌症中似乎不方便，其中时间具有价值。与基于 RNA 和肽的疫苗相比，DNA 疫苗克服了这些限制，刺激了针对所需新抗原的显著强效 CD8 应答，因此更值得信赖。这些疫苗中的大多数正在进行试验，评价在实体瘤和联合治疗中的疗效。简而言之，新抗原提供了一个很好的个性化量子和量身定制的治疗让癌症患者获得更好的缓解。基于多表位的DNA疫苗体细胞 DNA 的改变形成肿瘤新抗原，使蛋白质序列发生变化，诱导适应性免疫反应。随着基因测序技术的发展，我们识别新抗原的能力不断提高。利用癌细胞测序结合表位预测算法识别和排序新抗原，将其整合到个性化癌症疫苗中。DNA 疫苗的首要地位与在单一结构中可以传递大量序列的事实有关。多表位 DNA 疫苗的基本概念从 CTL 开始。MHC-I 分子呈递抗原，被 CTL 识别为短肽（一般由 8-10 个氨基酸组成）。这些短肽或片段被命名为术语，T 细胞毒性细胞决定簇 (DTcs)。多表位 DNA 疫苗在微基因结构中用几种 DTcs 测序，以诱导针对广泛靶标库的 CTL 应答。换句话说，作为一种多表位 DNA 疫苗，同时递送非典型和免疫显性表位可以引起 CTL 的综合应答。据报道，单一表位疫苗可编码超过 20 种抗原。与合成长肽 (SLP)、DC 和 RNA 相比，以 DNA 质粒形式生产多表位疫苗观察到相对容易生产、理想的安全性特征和分子灵活性。其中一项研究报道，编码 20-25 个表位的多表位构建体，有或无间隔区，与泛素的突变形式融合，可以被有效处理。基于这种方法的模型 DNA 疫苗成功地在体内展示了显著的结果。评价基于 polyepitope-based DNA 疫苗的临床前试验证明诱导了抗肿瘤反应。而且，临床试验观察到新抗原特异性 T 细胞反应的刺激。尽管当培养基为疫苗接种时，CD8 + T 细胞是诱导抗肿瘤应答的主要元素，但已发现 CD4 + T 细胞可引起更广泛和更强的免疫应答。因此，辅助性 T 细胞 (Th) 肽与 DNA 疫苗联合给药，以增强对 Th-细胞的刺激，并最终增强 CTL 应答。Th 肽的一个例子是泛 DR 表位 (PADRE)，它确实增加了免疫系统的抗肿瘤作用。多项临床试验正在进行中，以评价多表位 DNA 疫苗对乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和胰腺癌的疗效。描绘 DNA 结构类型的插图已在 1.3.基于DNA的癌症疫苗批准遇到的障碍和需要完成的挑战基于DNA的癌症疫苗已经接近其目的。其设计可理解，并具有长期保护潜力。在生产方面具有成本效益，与减毒活疫苗相比更安全。此外，其在室温下保持稳定，并具有良好的溶解度特征。然而，这些资产已经被一些但相当大的缺点所超越，这些缺点阻碍了基于 DNA 的疫苗在人类中的批准，对抗癌症。DNA 疫苗的潜在缺点是不能诱导必要的免疫原性，主要因素是缺乏最佳的 DNA 转染和免疫刺激。由于每个个体中细胞和核膜的复杂性，这些疫苗的 DNA 转染能力产生了不一致的结果。质粒需要通过胞饮作用或内吞作用穿过富含磷脂的细胞膜。质粒也需要逃避溶酶体、内体和核酸酶进行的降解过程。通过物理和化学手段改善质粒的递送，可以抑制这些挑战。从物理方法开始，通过针头插入质粒，无论是皮内 (ID)、肌内 (IM)、经皮或粘膜，均显示出较差的转染。通过针头插入导致 DNA 集中在细胞内空间，而不是进入细胞本身，在那里它们可以转录为 mRNA。因此，使用 ID 或 IM 电穿孔已经取代了针头递送系统。电穿孔涉及通过针头施加电流，跟随并邻近 DNA 插入部位（通过针头和注射器插入）。除电穿孔外，还考虑了其他几种物理技术，如微粒介导表皮给药 (PMED) 和无针注射系统 (NFIS)。向化学方法发展，包括生物制药以增强转染能力。脂质体是一种生物药物，是将胆固醇和磷脂基团并入脂质双层以允许与脂质富集细胞膜融合的球形分子。这种融合使得 DNA 很容易插入细胞。脂质体通过有助于转染效率的增强以及作为佐剂发挥双重作用。通过灌输可生物降解的聚合物微颗粒和纳米颗粒的最新技术，可以临时制备给药系统。这些两亲性颗粒的尺寸应为 0.5-10 μm。伴随着物理和化学传递技术，另一种有助于增加免疫原性的策略是使用包含 DNA 的疫苗鸡尾酒以及编码佐剂免疫调节元件的质粒。细胞因子和二核苷酸基序是这些分子佐剂的范例。5’—C—phosphate—G—3’ (CpG) 基序是一种二核苷酸基序，与 DNA 疫苗理想匹配，整合到疫苗的骨架中。它有三种类型，即 A、B 和 C。A 型触发细胞免疫应答，而 B 型诱导体液免疫。CpG-C 具有刺激细胞和体液免疫应答的能力。白细胞介素 (IL)-2 是一种用作佐剂的主要细胞因子，可潜在诱导淋巴细胞。该佐剂已获批用于减轻转移性黑色素瘤和肾细胞癌。IL-15 与 IL-2 相似，可刺激 NK-和 T-细胞的增殖。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GMCSF) 是另一种佐剂细胞因子，可将 APC 结合到接种部位并促进树突状细胞成熟。以聚乳酸 (PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA) 为例的聚合物载体的利用，和壳聚糖，作为纳米颗粒形式的佐剂和递送助剂表现出了有利的结果。Toll 样受体 (TLR) 配体也是最近关注的佐剂。这些佐剂编码质粒的益处是表达与抗原相同跨度的蛋白，并允许更长时间的免疫刺激。其次，考虑到安全性问题，这些疫苗倾向于通过促发过度的细胞因子释放诱导全身炎症反应，可导致持续发热。为了阐明这一点，我们需要证明受 DNA 疫苗引入影响的炎性免疫途径，并采用防止细胞因子风暴的方法（如佐剂编码质粒所示）。质粒 DNA 载体含有细菌区域元件，如复制起点和选择标记物。一旦细胞培养停止，这些功能元件是徒劳的，往往会对疫苗的有效性和稳定性造成负面影响。伴随这些不利影响，由于抗生素耐药标志物水平传播至宿主肠道细菌种群的可能性，安全性结果受到影响 。图1 建立了增强基于DNA的癌症疫苗免疫原性的结构。已经建立了 4 种类型的 DNA 结构来增加基于 DNA 的癌症疫苗的免疫原性潜力。包括嵌合 DNA 疫苗利用异种抗原 b MUC-1 为基础的 DNA 疫苗，由粘蛋白肽组成c编码新抗原的个性化 DNA 疫苗，对每名患者特异d多表位DNA疫苗，包含多个新抗原或表位的序列。针对耐药标志物的传播而设计的策略，是开发基于小细菌RNA的无抗生素选择标志物，也称为非编码标志物。而且，这些标记物的大小较小，小于200个碱基对，从而降低了载体大小，提高了转染效率（较小的载体能够抵抗递送过程中遇到的剪切力）。进一步解决安全性问题时，可能会发生疫苗散毒至环境中，并通过捕食性动物传播。DNA 疫苗还存在整合到宿主基因组中的风险，最终破坏宿主基因组的表达。因此，为了监测这些问题，制定了准则和管理框架，这些框架因国家而异。法规要求基于受试种属。DNA 接种动物需要标记转基因生物 (GMO)，以帮助阻碍 DNA 疫苗的广泛使用。必须彻底检查 DNA 结构是否整合到宿主染色体中，并应保持与健康风险评估和环境危害相关的透明度。此外，将癌细胞的细胞学和生物分子机制平行化是很麻烦的，这最终使肿瘤抗原的识别和抑制变得复杂。此外，肿瘤新抗原具有突变趋势，导致抗原靶向疫苗无效。同时，肿瘤细胞的复合免疫抑制环境延缓了这些疫苗的效力。我们需要超越癌症抗原的这些免疫逃避能力，并增强 APC 对其的递呈，以越来越多地部署抗原特异性 T 细胞。无法开发针对癌症的疫苗最明显的原因是在动物模型和人类的解剖结构中遇到的差异。从更光明的方面来说，2021 年 8 月，ZyCoV-D，世界上首个基于 DNA 的预防性疫苗获得了印度药物控制总干事 (DCGI) 的批准，fo rCovid-19 感染病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2)。基于 DNA 的免疫已被批准用于动物以减轻几种兽医疾病，其中之一是 Oncept。它是美国食品药品监督管理局 (USFDA) 批准的异种人酪氨酸酶质粒 DNA 疫苗，用于减轻犬的恶性黑色素瘤。它靶向一种称为酪氨酸酶的自身抗原，该抗原在犬和人的几种恶性黑色素瘤中上调。再者，一种新技术利用基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑技术，在疫苗开发中。该技术由一系列短重复组成，与大肠杆菌基因组中的短序列间隔。它展示了有希望的效率、简单性、特异性、成本效益和灵活性，这使我们朝着基因乐观的未来前进工程疫苗。随着这一进步的步伐，很可能所有这些障碍都将得到解决，DNA 疫苗将很快完成治疗癌症。上述讨论的障碍如图 2 所示。4.基于DNA的癌症疫苗的免疫机制和特征如前所述，免疫抑制性TME和T细胞功能障碍是肿瘤细胞逃避机体免疫系统的主要原因。TME 连同基质细胞、血管、细胞外基质和调节蛋白，也体现了免疫细胞。在这些免疫细胞中，髓源性干细胞 (MDSCs) 和调节性 T 细胞 (Tregs) 是突出的。MDSCs 是肿瘤浸润巨噬细胞，具有免疫抑制表型，参与抗炎过程。Tregs 与转录因子叉头框蛋白 3 基因 (FoxP3) 一起表达 CD4 和 CD25，均为获得性免疫的调节因子。Tregs 通过释放抑制性细胞因子如 IL-35 和转化生长因子-β (TGF-β)，能够抑制抗肿瘤免疫反应。此外，癌细胞下调 MHC 分子（通过促进非经典 MHC-I 分子，如 HLA-E 和 HLA-G）和靶抗原的表达能力。肿瘤扩大了其对引流淋巴结的耐受性，并增强了 Tregs 的活性。肿瘤通过释放可溶性因子如血管内皮生长因子 (VEGF)、TGF-β 和 IL-10，对 APC 的成熟和分化产生负面影响。简言之，免疫抑制性 MDSCs、Tregs、VEGF、IL-10，加上免疫刺激 T 细胞的功能障碍，负责肿瘤逃逸免疫力并最终破坏造血的能力。因此癌症免疫疗法背后的概念化是诱导对癌细胞免疫的充分报复。对于特定的癌症抗原，需要各自和持续的免疫应答，这是基于核酸的疫苗开发的假设。基于 DNA 或信使 RNA (mRNA) 的核酸疫苗首先需要体现在细胞质中，随后体现在细胞核中，以最终实现基因表达 [17]。质粒 DNA 的构成和免疫的及时性，是 DNA 疫苗的两个主要特征。首先，插入 DNA 的载体可以是病毒载体、脂质体、裸质粒 DNA 和基因或粒子枪介导的直接 DNA 传递。所有这些方法都携带肿瘤表达抗原的遗传特性，并指导免疫引起针对该特异性抗原的反应。TA 是在肿瘤组织中过表达的抗原蛋白，它们可以作为肿瘤标志物。随着基因测序和分析的进步，TA 被确定并作为癌症疫苗中的关键元素。TA 的分类分为两类，肿瘤特异性抗原 (TSA) 和肿瘤相关抗原 (TAA)。TSAs 又称突变抗原或新抗原是自身抗原突变的结果。这些细胞严格局限于肿瘤，在正常细胞中不表达。P53、Ras 和 Bcr-Abl 是常见的 TSA。相反，TAA 不会发生突变。它们是自身抗原与正常细胞相比，肿瘤细胞中上调。TAA 中包括沉默基因产物，如癌症/睾丸抗原、前列腺特异性抗原 (PSA)、前列腺酸性磷酸酶 (PAP)、酪氨酸酶和人表皮生长因子受体 2 (HER2)/neu。随着质粒 DNA 的引入，抗原被确定，免疫可以区分它应该对哪种物质作出反应。借助于诱导的免疫机制，表达后的抗原与APC结合，然后呈递给T细胞。图2 DNA疫苗审批所遇到的障碍和挑战以及所需的进展。DNA疫苗的批准面临几个障碍和挑战，包括稳定性、低免疫原性和整合到宿主基因组的潜力等问题。此外，DNA 疫苗的递送需要先进的技术来有效地将质粒 DNA 递送到靶细胞。尽管存在这些挑战，但近年来取得了重大进展，包括开发新的递送系统、佐剂和增强DNA疫苗免疫原性的策略。需要进一步的研究来应对这些挑战，推进DNA疫苗的开发和批准。如图3所示，疫苗DNA质粒编码的遗传信息通过固有佐剂特性或通过TA表达进行处理。这些疫苗的益处是通过内源性和外源性途径分别使用人白细胞抗原 (HLA)、HLA-1 和 HLA-2 作为 APC。这显示了 CD4 + 和 CD8 + T 细胞的令人垂涎的抗原，受益者是诱导细胞和体液免疫应答。在癌细胞抗原被识别之前，借助 1 型传统 CD103 + 迁移 DC（APC 的一种类型）阐明 CTL（CD8 + T 细胞），通过：(a) 共刺激分子（如 CD80/86 和 CD28/152）(b) 癌症抗原与 MHC-I 的粘附 (c) 促炎细胞因子（如肿瘤抗原定制 CTL）识别肿瘤抗原的表位，与 T 细胞受体 (TCR) 形成复合物后。TCR 信号通过三个主要途径使肿瘤细胞死亡：(a) TNF 相关凋亡诱导配体 (TRAIL) (b) 穿孔素和丝氨酸蛋白酶的释放通过脱颗粒 (c) 增强了分化配体簇 (CD95L) 的调节。已观察到活化的 CD8 + T 细胞释放 IFN-γ 和 TNF-α，并显示肿瘤细胞减少。另一方面，IFN-γ、TNF-α 和 IL-2 由 CD4 + T 细胞产生，并显示患者耐力改善。固有免疫应答暴露于固有佐剂特性（如疫苗的双链 DNA (dsDNA) 和鸟嘌呤残基 (CpG)）后被激活。图3 图示证明了基于DNA的癌症疫苗在刺激针对癌细胞的适应性和先天性免疫中的作用机制。该疫苗编码肿瘤特异性抗原，这些抗原被树突状细胞摄取并呈递给 T 细胞。这导致了针对癌细胞的先天和适应性免疫反应的激活。先天免疫细胞，如作为自然杀伤细胞，释放细胞因子和趋化因子，招募额外的免疫细胞到肿瘤部位。然后活化的 T 细胞迁移到肿瘤部位，释放杀死癌细胞的细胞毒性分子。这一机制导致了全身抗肿瘤免疫反应，降低了癌症复发的风险。先天性免疫反应由NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞组成，通过肿瘤结合抗体（识别肿瘤细胞表面表位的抗体）的 Fc 受体识别癌症抗原并吞噬癌细胞。这些疫苗可全身或局部接种。全身途径包括口服、肺部和静脉给药，而局部途径包括肌内、皮下、经皮和皮内给药。据报道，作用机制随给药途径不同而不同。与局部途径相比，全身途径倾向于激活更多的次级淋巴器官 APC。在肌内给药途径中，肌细胞被转染。肌细胞不是专职 APC，与 MHC-I 形成复合物刺激 CD8 + 淋巴细胞，但不能诱导调节性 T 细胞。然而，由于炎症和疫苗接种引起的细胞因子释放，像树突状细胞这样的专业 APC 被招募。然后，这些细胞吞噬转染的体细胞，然后通过与 MHC I 类和 II 类复合物处理和递呈外源性抗原。另一方面，基因枪辅助皮内给予质粒 DNA 转染未成熟的朗格汉斯细胞，然后通过 MHC-I 分子将内源性抗原递呈至 CD8 + T 细胞。APC 也可以直接转染，通过 MHC-I 呈递触发 CD8 + T 细胞。所有这些发现都阐述了 DNA 免疫在消除恶性肿瘤中所产生的深刻机制。5.优缺点关于良好的科学和社会决策，基于dna的癌症疫苗更多的是一个警示故事。考虑到个体患者，权衡这些疫苗的所有利弊非常重要。首先，DNA 疫苗在所有免疫技术中扩展了大量的益处。这些疫苗不含任何类型的感染因子，如由死细菌或其减毒活形式组成的疫苗所示，因此是无害的。考虑到批量生产和储存成本，这些疫苗定价敏锐。其在环境温度下稳定，降低了运输值。它们证实了所需基因靶标的适当处理和递呈，促成因素是在自然感染中观察到的抗原体内递呈和抗原内部翻译后修饰。重组 DNA 技术可缓解抗原的快速修饰。如前所述，它们激活适应性免疫和体液免疫。它们可安全对抗由于先天免疫刺激引起的各种载体相关问题。跳过这些优势，DNA 疫苗有一些限制，阻碍了他们批准治疗人类癌症。DNA疫苗的主要缺点之一是免疫原性不合格。对于免疫系统的中度激发，需要更大量的约 5-10 mg。这些疫苗刺激的免疫反应仅限于基于蛋白质的抗原，对糖衣细菌没有用处。机体可能对通过这些疫苗引入的抗原产生耐受性。最后，自身免疫和质粒 DNA 整合到宿主基因组中始终存在威胁。6.正在开发或试验的疫苗描述人们一直在探索免疫疗法来战胜癌症，改善肿瘤治疗的前景。很少有研究正在进行临床试验来评估基于 DNA 的癌症疫苗减轻乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、脑癌和宫颈癌的有效性，同样的研究也被列入表 1。这些疫苗正在乳腺癌和前列腺癌领域得到最大程度的评价。2020 年乳腺癌病例超过 200 万例，不断将其定位为女性最常发生的癌症。考虑到这一点，DNA 疫苗正在被仔细检查大约 18 类组织学不同的乳腺癌，常见的有 HER2 阳性、HER2 阴性和三阴性乳腺癌 (TNBC)。首先，HER2 阳性乳腺癌体现了人类表皮生长因子受体 2（一种增殖基因）检测阳性的肿瘤细胞。pNGVL3‑hICD和沙格司亭治疗晚期HER2阳性乳腺癌和卵巢癌该疫苗编码 HER-2/neu 原癌基因的胞内结构域，并引起针对 HER2 上调肿瘤细胞的细胞和体液免疫应答。一项入组 66 例 HER2 阳性 BC 或卵巢生殖细胞和上皮癌研究 pNGVL3-hICD（一种基于 DNA 质粒的疫苗）联合 Sargramostim-a 重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rGM-CSF) 的疗效。这是一项开放标签研究，患者接受 pNGVL3-hICD 联合沙格司亭作为辅助治疗，在无疾病进展或不可接受毒性的情况下，每月皮内注射一次，持续3个月。根据剂量分为三组，即10μg、100μg和 500μg 血浆。患者已完成针对其原发疾病的适当治疗，并在入组前停用细胞毒化疗和皮质类固醇至少1个月。本研究的主要目的是确定3剂pNGVL3-hICD 与固定剂量沙格司亭混合皮内给药的安全性。试验概要旨在研究pNGVL3-hICD的副作用并确定最佳剂量。迄今为止获得的结果描述了中等剂量100μg具有免疫原性，其中免疫原性持续 60 周。本试验的估计完成日期为2024年12月1日。STEMVAC联合GM‑CSF治疗HER2阴性晚期乳腺癌STEMVAC是一种多抗原疫苗，利用基因工程来操纵 DNA，指导细胞产生靶抗原。这项 I 期非随机临床试验旨在研究 CD105/Yb-1/SOX2/CDH3/MDM2 多表位质粒 DNA 疫苗的副作用和最有效剂量，该疫苗使用 100 μg 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子作为佐剂 (NCT02157051)。42 例成人患者被分为 3 个 150 μg、300 μg 剂量组，和 600 μg STEMVAC。已完成标准治疗并从近期治疗中恢复（轻度至无残留毒性）的患者已入组并分配至三个组之一。在没有不可接受的毒性或疾病进展的情况下，患者还在第 3 次疫苗接种后 3 个月和 6 个月接受了 2 次额外的 STEMVAC 疫苗加强剂量。主要终点研究安全性和免疫原性，次要结局为疫苗接种后免疫应答的持续性，以及 MDSC 和 Tregs 的诱导。迄今为止获得的结果描述了 300 μg 的剂量具有高度持续性。研究治疗完成后，将每年对患者进行两次随访，最长持续 5 年。完成日期估计为 2027 年 2 月 10 日。表1 正在进行的临床试验，重点是针对癌症的DNA疫苗的开发WOKVAC联合沙格司亭治疗非转移性、淋巴结阳性和HER2阴性乳腺癌WOKVAC 是基于DNA质粒的疫苗，编码三种蛋白即胰岛素样生长因子结合蛋白 2 (IGFBP2)、HER2 和胰岛素样生长因子受体-1 (IGF-1R)。这些蛋白在浸润前和高危乳腺病变中过表达，并与进展为浸润性乳腺癌有关。一项在非转移性、淋巴结阳性、人表皮生长因子受体 2 阴性乳腺癌患者中评价 pUMVC3-IGFBP2-HER2-IGF1R 联合沙格司亭预防癌症复发的副作用和适当剂量的 I 期试验 (NCT02780401)。共入组了 24 例缓解且无疾病证据的成人患者。这是一项单组开放标签研究，首次包括在第 1 天接受 WOKVAC 联合沙格司亭 ID 的患者，在无疾病进展或不可接受毒性的情况下，每 28 天重复疗程，最多 3 个疗程。腋窝淋巴结清扫 (ALND) 患者将在对侧手臂接种疫苗，双侧 ALND 患者将在大腿接种疫苗。研究治疗完成后，将在 1 个月、6 个月和每年对患者进行随访，直至 5 年。试验完成日期估计为 2025 年 3 月 31 日。WOKVAC联合化疗和HER‑2靶向免疫治疗药物治疗乳腺癌一项单组、开放标签、II 期研究调查了 WOKVAC 联合紫杉醇、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的疗效 (NCT04329065)。患者将在第1天接受曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，并在第1、8和15天接受紫杉醇输注。WOKVAC 将在 21 天周期的第13天给药。免疫化疗联合疫苗将主要基于肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 的数量进行评估。试验结果将使我们对化疗、单克隆抗体和 DNA 疫苗的组合有一个认识。本试验的完成日期预计为 2027 年 6 月 30 日。STEMVAC联合沙格司他丁治疗三阴性乳腺癌一项2期试验仔细检查了与沙格司亭混合的 STEMVAC 辅助性 T 细胞 (Th1) 多表位质粒疫苗治疗 IB-III 期三阴性乳腺癌患者的能力 (NCT05455658)。共有 33 例成人患者，在无疾病进展或不可接受毒性的情况下，每月皮内给予 STEMVAC 疫苗与 GM-CSF，持续 3 个月。第 3 次接种后 3 个月和第 1 次强化接种后 6 个月，患者将接受 STEMVAC 疫苗联合沙格司他丁 ID 强化注射。待评价的主要结局包括刺激特异性 Th1 免疫应答和次要点研究安全性参数。研究治疗完成后，将在第 28 天对患者进行随访，然后每年一次，持续 5 年。估计完成日期为 2024 年 4 月 30 日。pTVG‑HP联合pTVG‑AR与pembrolizumab治疗前列腺癌—联合两种DNA疫苗的试验这些疫苗是质粒 DNA，其中 pTVG-HP 编码人前列腺酸性磷酸酶，pTVG-AR 编码雄激素受体的配体结合域。一项随机、开放标签和多中心研究的两个实验组之一描述了两种 DNA 疫苗的接种，在周期 1、2、5 和 6 的第 1 天和第 8 天给予 pTVG-HP (NCT04090528)。另外，pTVG-AR 将在第 3、4、7 和 8 周期的第 1 天和第 8 天给药。疫苗将在第 1 天与单克隆抗体 Pembrolizumab 联合给药。本试验旨在评价无进展生存期 (PFS) 作为主要结局和几个次要结局。预计完成日期为 2025 年 12 月。Mammoglobin‑A DNA疫苗联合内分泌治疗的新辅助化疗治疗乳腺癌Mammoglobin-A 是乳腺肿瘤的特殊靶点，属于分泌球蛋白超家族成员，涉及主要在粘膜组织中表达的二聚体蛋白。它具有接近普遍的高表达加上良好的特异性，这使其成为乳腺癌预防或治疗的非凡靶点。已经建立了一项非随机、开放标签研究，评估乳腺球蛋白 A DNA 疫苗在 ER +、HER2-乳腺癌患者中的疗效 (NCT02204098)。其中一组涉及该疫苗接种联合新辅助化疗，另一组设定为疫苗接种联合内分泌治疗。需要测量的结局包括安全性参数、免疫应答、客观缓解率 (ORR)、PFS 和总生存期 (OS)。试验的估计完成日期为 2028 年 8 月 31 日。简而言之，DNA疫苗目前正在进行广泛的癌症类型的测试，包括常见的乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌，再加上确定其在相对罕见的肺、脑和肛门肿瘤中的疗效。这些试验正在进行中，以评价 DNA 疫苗作为预防和治疗方法的有效性。这些试验的广度表明，DNA 疫苗有可能在未来成为肿瘤治疗的一种突出形式，为癌症治疗提供了一种有前景的新方法。7.已完成的证明DNA疫苗有效性的临床试验大量试验已经完成了他们在包括黑色素瘤、多发性骨髓瘤、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌和肺癌在内的各种类型癌症中评估 DNA 疫苗的目标。其中一些关键因素已在表 2 中介绍，其中很少有描述。一项开放标签、非随机、2 期研究评价了 DNA 疫苗 INO-3112 在宫颈癌女性中的安全性、耐受性和免疫原性。此处，VGX-3100 体现了 HPV-16 和 HPV-18 质粒，INO-9012 由编码白细胞介素-12 (IL-12) 的 DNA 组成。18 例经活检证实的 IB-IVB 期浸润性宫颈癌（无法手术且与人乳头状瘤病毒 (HPV) 16 或 18 相关）女性受试者和已接受两种类型治疗的女性受试者入组研究。这两种治疗将患者分为两个队列。队列 I 包括接受过以治愈为目的的标准化疗的患者，而队列 II 包括挽救治疗后 HPV 相关宫颈癌复发的患者。该研究强调，疫苗通过刺激具有细胞毒性 T 细胞 (CTL) 表型的 CD8 + T 细胞诱导了强烈的抗体应答。同时，产生抗原特异性 CTL。不良事件为轻度至中度。报告的 3 级不良事件为病毒性胃肠炎、紧张性头痛和手腕头痛。然而，这些 3 级不良事件与治疗无关。根据实验室参数，仅 2 例患者发生中度低血糖，无需任何治疗。该数据描述了该疫苗驱动对接种抗原的强应答的能力，可推断出该疫苗具有接近治愈的未来。NCT01341652 ii期研究评估了 pTVG-HP 联合 rhGM-CSF 的有效性。入组了 99 例非转移性、去势敏感性前列腺癌患者。患者随机接受 pTVG-HP 皮内给药，联合 200 μg GM-CSF 或 200 μg 单药。2 年无转移间期是待评价的主要终点。待研究的次要结局包括前列腺特异性抗原倍增时间、至放射学疾病进展的中位时间、PSA、PFS 和观察到的毒性的调节。pTVG-HP 治疗未显示 2 年无转移生存期 (MFS) 显著延长。然而，预先设定的 18F-NaF PET/CT 成像显示对微转移性骨病有显著影响。简言之，本研究未显示令人满意的结果，需要进一步分析。正在进行的试验正在研究 pTVG-HP 与 PD-1 抑制剂的联合用药。一项关于ImmunoPulse IL-12 治疗 Merkel 细胞癌有效性的开放标签、非随机、ii 期研究正在进行一项有趣的研究。该疫苗是 tavokinogene telseplasmid（编码 IL-12 的质粒）和体内电穿孔介导质粒 DNA 疫苗的组合。本研究入组了 15 例受试者，以评价主要和次要终点。其中 12 名参与者的肿瘤组织中 IL-12 的表达增加了两倍。与单周期疫苗接种相比，4 个周期接种的不良反应更多，观察到的唯一显著不良反应是注射部位炎症。简而言之，已完成的临床试验相对较少，未能描绘令人满意的结果。然而，pTVG-HP 显然显示了令人鼓舞的结果，并可能在不久的将来成为先驱。此外，大量试验正在进行中，它们可能很快导致治疗方向。8.DNA疫苗与其他疗法的结合DNA 疫苗单独无法克服肿瘤的免疫逃逸策略，包括选择有效缺乏免疫原性抗原的肿瘤细胞以及在 TME 中充分招募免疫抑制细胞。然而，将它们与沉默免疫抑制细胞募集的策略结合，并充分诱导 TME 中抗 TA 的免疫应答，可以增强它们。关于 DNA 疫苗与包含化疗、放疗和手术干预的常规方法联合使用的文献证据可以很好地证明。图 4 说明了基于 DNA 的癌症疫苗的各种组合策略，以及组合如何影响肿瘤细胞。描述 DNA 疫苗与其他疗法联合使用的一些临床前试验列于表 3，已完成的临床试验列于表4。DNA疫苗联合化疗近年来，化疗如何在缓解肿瘤中发挥双向作用已被阐明。在几种化疗药物（如紫杉醇、环磷酰胺和吉西他滨）中观察到 TA 释放诱导以及 TME 中 T 细胞活性增加和免疫抑制细胞清除。在几项临床前研究中，其中一项研究评价了 DNA 疫苗与环磷酰胺联合给药，结果显示 VEGF 和 IL-10 降低，小鼠的生存率增加。如代表正在进行的临床试验的表中所示，涉及 DNA 疫苗和相关化疗药物的联合策略可能在随后几年中至关重要地参与肿瘤治疗。Toll 样受体 4 (TLR4) 模拟介导的检查点阻断敏感性的重建在化疗治疗中已经遇到。将DNA疫苗与靶向治疗相结合扩增 T 细胞启动并刺激 TA 释放的靶向治疗可与 DNA 疫苗联合使用。尽管未与 DNA 疫苗联合检测，但当舒尼替尼（一种酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)）与癌胚抗原 (CEA) 编码的病毒疫苗联合使用时，观察到肿瘤体积减小。然而，未来的研究可能会评估 fda 批准的 TKI，如阿昔替尼、卡博替尼和帕唑帕尼联合 DNA 疫苗。DNA疫苗与免疫检查点抑制剂的结合介导抗原呈递信号机制的共刺激分子是 T 细胞调节的关键要素。肿瘤能够模拟这种共刺激分子，抑制抗 TA 免疫细胞的活化，从而逃避免疫。具有特异性的是，肿瘤细胞表达与抑制性受体连接的配体，如 PD-1、CTLA-4、T 细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域包含-3 (TIM-3) 以及存在于 T 细胞上的淋巴细胞活化基因-3 (LAG-3)。克服肿瘤细胞逃逸的一种方法是阻断 T 细胞上的这些抑制性受体，并阻止其与肿瘤释放配体的相互作用。在临床前模型中评估的 CTLA-4 抑制显示了肿瘤生长的延迟。在黑色素瘤患者中研究相同的 CTLA-4 阻断时，观察到肿瘤排斥。T 细胞活化增强，同时抑制 IL-10 和 TGF-β，可能是这些抗肿瘤作用的原因。除了这一益处，据报道 CTLA-4 抑制剂对免疫记忆有利。此外，抗 PD-1 抗体已获得 FDA 批准用于多种癌症，因为这些抗体表现出显著有效的结果。肿瘤负荷增加的肿瘤具有增加的新抗原。这些大量的新抗原可被抗肿瘤机制很好地识别，并最终使此类癌症对涉及 ICI 的治疗敏感 [。因此，疫苗与 ICI 的组合在未来可能被证明是有益的。表2 评估DNA疫苗特征的已完成临床试验将DNA疫苗与细胞因子结合通过免疫刺激细胞因子的辅助，可提高疫苗对T细胞的效率。它们可以以蛋白质的形式注射，也可以通过靶编码疫苗进行编码。GM-CSF、IL-12 和 IL-2 是临床研究中最常涉及的药物。FDA 已批准 IL-2，因为其通过分化未成熟 T 细胞形成更多的效应 T 细胞和调节 T 细胞。此外，还显示了缓解转移性肾细胞癌和转移性黑色素瘤的有效结果。GM-CSFs，如已经在正在进行的临床试验中引入的沙格司亭，刺激树突状细胞的成熟，并诱导 T 细胞的活化和增殖。IL-12（另一种强效细胞因子）的组合增强了疫苗的有效性，因为其涉及 T 细胞的活化和募集。DNA 疫苗与编码 IL-12 的质粒的融合已在临床前小鼠模型中进行了抗宫颈癌的试验，结果显示 MDSC 减少，这传达了该组合的治疗前景。在一项针对晚期肝细胞癌 (HCC) 的临床试验中，还评估了 IL-12 与新抗原 DNA 疫苗和帕博利珠单抗联合使用的情况。与这三种细胞因子一起，其他细胞因子如 IL-7、IL-15 和干扰素-γ (INF-γ) 以及其他佐剂如 TLR 激活剂也可用于与 DNA 疫苗结合。可与DNA疫苗联合使用的其他方法包括内分泌和放疗。当在临床前研究中评估与疫苗联合使用时，放射治疗的效应包括肿瘤体积减小、癌细胞损伤增加和 TA 释放增加。在激素相关癌症中，如前列腺癌和乳腺癌，内分泌治疗是主要策略，来曲唑显示调节性 T 细胞减少。此外，在前列腺癌中实施雄激素阻断治疗时，观察到 T 细胞数量增加和胸腺细胞再生。其中一项正在进行的试验正在评估 Mammoglobin-A DNA 疫苗联合来曲唑、依西美坦、戈舍瑞林和他莫昔芬的能力。该疫苗针对的是特定的肿瘤抗原，而常规疗法，如化疗、放射治疗和手术，会消灭散装的肿瘤细胞。靶向治疗，如单克隆抗体和小分子肿瘤生长和进展。免疫检查点抑制剂释放免疫系统的刹车，允许更大的 T 细胞激活对抗癌细胞。最后，细胞因子，如干扰素和白细胞介素，刺激免疫细胞，增加其对肿瘤细胞的细胞毒性。这些策略的结合有可能增强癌症治疗的疗效，改善患者预后。图4 图示展示了基于 DNA 的癌症疫苗与常规疗法、靶向疗法、免疫疗法和细胞因子在对抗肿瘤细胞能力方面的组合策略。该疫苗针对的是特定的肿瘤抗原，而常规疗法，如化疗、放射治疗和手术，会消灭散装的肿瘤细胞。靶向治疗，如单克隆抗体和小分子抑制剂，干扰参与肿瘤生长和进展的特定分子。免疫检查点抑制剂释放免疫系统的刹车，允许针对癌细胞的更大 T 细胞激活。最后，细胞因子，如干扰素和白细胞介素，刺激免疫细胞，增加其对肿瘤细胞的细胞毒性。这些策略的结合有可能增强癌症治疗的疗效，改善患者预后。表3 基于DNA的癌症疫苗在小鼠模型中的临床前研究作为新疫苗发现和开发的一部分表4 已完成的DNA疫苗与其他疗法相结合的临床试验9.肿瘤免疫治疗的临床意义针对癌症的免疫治疗策略几乎获得了肿瘤领域常规疗法的地位。考虑到获得更长缓解期和改善患者依从性的机会更高，将标准常规化疗与免疫治疗合并使用可减轻高级别肿瘤。它通过利用和加强机体对抗肿瘤的免疫系统来消除肿瘤细胞的生长。目前的临床情况包括免疫治疗，如单克隆抗体 (mAb)（治疗性、双特异性、免疫检查点）、过继性细胞治疗 (CART、TCR-T、TIL、CAR-NK)、小分子药物（PD-1/PD-L1 抑制剂、IDO1 抑制剂）、溶瘤病毒，最后是该文献的精髓，即疫苗。事件已证明 mAb 治疗是临床病例中一种有前景的方法。然而，由于其免疫原性特征，mAb 可引起严重不良反应，因此需要严格监测，最近开发的 mAb 与 Fc 工程抗体的偶联疗法可用于挽救。小分子抑制剂的特征相对优于 mAb，是实体瘤更好的免疫治疗替代药物。以嵌合体为靶点的蛋白水解 (PROTAC) 是一种新型的小分子抑制剂，目前正在临床试验中进行测试。随着过继细胞治疗的进展，由于安全性问题和脱靶结局，CAR-T/TCR-T 的使用较少。然而，这些药物已成功用于治疗血液肿瘤，并与实体瘤的小分子抑制剂联合使用。随着溶瘤病毒的出现，出现了靶向递送病毒的对抗，因为病毒需要通过身体的全身免疫力量。目前正在开发纳米颗粒辅助递送病毒以克服该问题。最后，正在开发针对癌症的预防和治疗疫苗，其中 Gardasil 和 Cervarix 的制造是一项重大成就。然而，疫苗，特别是 DNA 疫苗需要投入，无论是金钱还是智力。与单药治疗相比，免疫治疗的联合方法在临床上更有前景，FDA 批准了其中的少数。随着肿瘤学、免疫学、生物技术和生物信息学的进步，免疫治疗领域将不断扩展和发展。10.前进的道路随着fda批准，许多病毒样颗粒 (VLP) 和基于细胞的疫苗已经被制造用于对抗癌症，其中 DNA 疫苗面临着相当大的障碍，这是我们在本文的前面部分中引入的。然而，这些新时代在将疫苗接种策略与传统策略相结合方面取得了进展，这导致评价肿瘤疫苗的临床试验死灰复燃。这种合并在很大程度上减少了细胞毒性化疗药物无法控制的毒性事件。它抵消了免疫抑制性 TME，并表现出更大的协同抗肿瘤作用。即便如此，我们仍需要建立未来的研究，以表征联合化学免疫治疗的作用，并通过谨慎选择药物（包括新型免疫佐剂）和重振给药时间，在更大程度上最大化治疗活性。此外，除了晚期癌症外，还需要评估早期癌症的联合治疗。虽然 DNA 疫苗可以皮内或肌内接种，但设备辅助接种——电穿孔法经常被使用。此外，表达单一肿瘤抗原的疫苗，在外延时显示出增加的有效性和免疫原性。Ergo 临床试验越来越多地纳入了外置技术，以达到最佳疗效结局。此外，由 DNA 和载体组成的骨架，可以利用微环 DNA (mcDNA) 进行升级。mcDNA 是一种仅体现所需真核表达的产物，可消除不必要的原核序列，从而防止炎症反应。免疫治疗的可变反应需要建立预测性生物标志物，这也将有助于监测相关的副作用。为了建立这些生物标志物，我们需要在基因组和蛋白质组工具方面取得进展，同时在生物信息学方面取得进展。最后，中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 在以 DC 为基础的癌症疫苗中的作用正在被探索。这些疫苗最初倾向于诱导中性粒细胞募集对抗肿瘤，然而长期暴露于中性粒细胞产生的 NETs 证明 T 细胞免疫反应耗竭，DC 细胞死亡并最终发挥肿瘤保护作用。由于基于 DNA 的癌症疫苗通过分子模式识别受体的复杂参与刺激树突状细胞 (APC)，NETs 的相同作用可应用于基于 DNA 的癌症疫苗。总之，我们需要对免疫调节途径进行更多的探索，这些进展将为潜在的组合癌症疫苗的制备铺平道路，并加强广泛的治疗方式。未来，DNA 疫苗有望通过对中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 形成的影响，有效减少血栓-炎症，在卒中和心肌梗死 (MI) 的管理中发挥举足轻重的作用。血栓炎症是指炎症与血凝块形成之间错综复杂的相互作用，可导致脑卒中和 MI 的发生和发展。NETs 是由染色质（DNA 和组蛋白）组成的网状结构，表面装饰有抗菌肽和酶。尽管 NETs 主要用于捕获和杀灭病原体，但过多的 NET 形成可导致有害作用，包括促进卒中和 MI 的血栓形成和炎症。DNA 疫苗可被设计用于靶向导致卒中和 MI 发生的病原体相关分子模式 (PAMP)。通过诱导针对这些 PAMP 的免疫反应，DNA 疫苗可能潜在缓解由活化的中性粒细胞触发的过度 NET 形成。这种可能的机制有可能减少血栓事件和抑制受影响组织中的炎症反应。因此，重要的是要认识到，DNA 疫苗在管理血栓-炎症中的作用，特别是在卒中和 MI 中，将是一个正在进行的研究和开发领域。然而，为了证明这些可能的机制，临床前研究是必要的，以证明有希望的可能的效果 DNA 疫苗在此背景。11.结论基因，作为人体的基础，制造以基因为基础的疫苗来抵御癌症的想法，无疑是肿瘤学最大的先驱之一。DNA 疫苗已被设计为新一代生物技术之一，正在逐步改良并用于癌症治疗。与传统疫苗相比，这些基因疫苗已被证明是安全的，因为它们携带抗原的遗传信息。此外，它们相对稳定，生产经济。这些疫苗的设计和递送的最新进展，结合最佳肿瘤抗原的鉴定和与其他免疫治疗的联合，在临床前和临床研究中显示出巨大的潜力。尽管存在这些挑战，基于 DNA 的癌症疫苗在广泛的癌症类型中的持续开发和测试突显了它们在癌症治疗的未来发挥重要作用的潜力。随着不断的研究和进步，DNA 疫苗可能为对抗这种毁灭性疾病提供新的有效方法。参考资料：Pandya A, Shah Y, Kothari N, Postwala H, Shah A, Parekh P, Chorawala MR. The future of cancer immunotherapy: DNA vaccines leading the way. Med Oncol. 2023 Jun 9;40(7):200. doi: 10.1007/s12032-023-02060-3. PMID: 37294501; PMCID: PMC10251337.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

mRNA疫苗已经成为一种革命性的工具，可以产生针对传染病和癌症的快速和精确的免疫反应。与灭活病毒、病毒载体、蛋白质亚基或DNA疫苗等传统疫苗相比，mRNA疫苗具有设计简单、生产速度快、安全性强、疗效高等优势。然而，由于mRNA分子固有的不稳定性和易降解性，有效和有针对性的递送仍然是一个重大挑战。纳米技术为克服这些障碍和增强mRNA疫苗的效力提供了创新的解决方案。递送系统的功能是将RNA运送到靶细胞，介导细胞摄取，并使其释放到细胞质中。值得注意的是，传递系统在很大程度上决定了RNA疫苗的给药途径。目前，脂类及脂源性纳米颗粒（NPs）、聚合物NPs、蛋白质NPs和无机NPs是基因疫苗的主要载体。目前正在开发的mRNA疫苗主要有两种类型:经典的非复制mRNA和自我扩增RNA (saRNA)。非复制mRNA具有传统的mRNA形式，编码5 '和3 '非翻译区两侧的靶抗原。以这种方式产生的靶蛋白的数量受到细胞吸收的mRNA分子的数量和细胞将mRNA转化为蛋白质的速度的限制。mRNA疫苗依靠合适的递送平台将它们运送到细胞内，并通过内体逃逸将它们释放到细胞质中。图1 mRNA疫苗的分类和作用机制a.两种mRNA疫苗类型b. mRNA疫苗的免疫机制合理设计和优化纳米材料以有效封装和保护mRNA分子mRNA疫苗的纳米平台的递送效果和耐受性主要取决于它们的组成和物理和化学性质。此外，基于NPs的mRNA疫苗的给药途径对疫苗的器官分布、蛋白质表达动力学和保护功效有很大的影响。图2 基于纳米技术的mRNA疫苗的实验流程a. 不同的纳米载体影响mRNA疫苗的递送效果b. mRNA疫苗研制中给药途径的选择脂基纳米颗粒（LNPs）由于配方简单、生物相容性和高效率，脂质是目前最先进的输送mRNA的载体。LNPs是以脂类为基础的纳米颗粒，由包裹在水中央隔间的单层或多层磷脂组成，因其固有的生物相容性、显著的通用性以及对亲水和疏水性质的物质的包封性而被深入研究并用作药物输送系统。在mRNA传递的背景下，脂质体通常表现出比LNPs更弱的包封率和转染率。目前，大多数生产RNA疫苗的公司都采用了LNPs递送技术。LNPs是稳定的NPs，主要由四种成分组成：可电离氨基脂、磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂。PKa值、分子结构和可电离脂质比例的变化对LNPs的效率有显著影响。LNPs的输送效率还受疏水结构域中双键的数量，脂尾的饱和度，基团距离影响。薄膜蒸发法和乙醇注入法作为传统的mRNA-LNP制备方法，由于纳米粒大小不一、包封率低、难以规模化和重复性差而逐渐被淘汰，交叉T混合器和微流控器件的发展彻底改变了LNPs的制备方法。聚合物纳米粒子早在1976年，聚合物就被报道能够传递蛋白质和DNA。此后，越来越多的聚合物由于其控制精确、表面修饰容易、有效载荷灵活等优点，被广泛采用作为mRNA传递的非病毒载体，如树突、聚合物胶束等。聚乙烯亚胺(PEI)是研究最广泛的基因传递高分子材料之一。PEI输送效率高，部分原因是pH缓冲范围广。然而，高电荷密度使其易于聚集，从而产生细胞毒性。为了克服这些局限性，通常使用低分子量PEI或PEG修饰，偶联环糊精，二硫键和烷基链来降低体内细胞毒性，提高生物相容性和转染效率。通过两亲性嵌段或接枝共聚物的自组装合成的聚合物胶束可以溶解难溶的化合物，提高它们的生物利用度。与单独使用mRNA-LNP相比，添加聚合物胶束后，肝脏中mRNA的表达水平显著增加。此外，不同聚合方式的胶束对mRNA的包封能力也有影响。RNA寡核苷酸衍生物或胆固醇部分已被用来桥接mRNA和多阳离子，以稳定复杂的胶束，从而有效地递送mRNA。基于聚合物的NPs可以作为一种有利的工具将mRNA传递到特定的靶点。然而，由于某些高分子量聚合物在体内容易聚集和细胞毒性，基于聚合物的设计仍然对开发mRNA传递系统具有挑战性。纳米乳液纳米乳液（MEs）是由分散在不同液体中的微小纳米液滴组成的非均相胶体体系，由表面活性剂或乳化剂稳定，NEs的配方和相的多功能性允许包埋saRNA在内的多种治疗分子。角鲨烯阳离子纳米乳液(CNEs)已被广泛探索用于saRNA递送。2014年，诺华公司团队开发了一种用于saRNA疫苗接种的基于角鲨烯的CNE配方，该配方在注射部位诱导了与病毒载体类似的蛋白质表达谱，更重要的是，在包括非人灵长类动物在内的不同动物模型中，以相对较低的剂量产生了针对各种抗原的强大免疫反应。在一项后续研究中，该CNE-saRNA疫苗平台在恒河猴中表现出对HIV的强大免疫原性和最低的全身毒性。由于其显著的包封性和高效的递送能力，CNEs作为saRNA疫苗的有前途的载体已经引起了广泛的兴趣。然而，它们易于聚集和阳离子脂类引起的长期毒性的可能性需要彻底的评估和优化。蛋白质纳米颗粒由于具有良好的生物相容性、可调性和生物降解性，天然衍生的蛋白质NPs作为mRNA的载体越来越受到人们的关注。铁蛋白家族、多肽和病毒样颗粒(VLP)是应用最广泛的蛋白质纳米颗粒。铁蛋白是一种独特的蛋白质NPs，由24个相同的多肽组成，其肿瘤靶向性、高生物相容性和易降解特性确保了其作为体内给药载体的安全。然而，铁蛋白的天然电负性限制了核酸的负载。为此，通过正向突变内表面上带负电荷的氨基酸，构建了具有带正电荷的内腔的核酸负载铁蛋白载体，从而能够有效地负载核酸。多肽分子上的阳离子或两亲胺基团如精氨酸可以通过静电作用与mRNA结合。CureVac目前开发的平台利用富含精氨酸的鱼类精子蛋白多肽作为mRNA载体，用于传染病和癌症的广泛临床试验。有趣的是，各种细胞穿透性多肽也可以通过瞬时表达mRNAs为疾病的诊断和治疗提供重要的策略。VLP主要由病毒衣壳蛋白组成，可以模拟病毒的真实结构，有效地包装mRNA。由于这些VLP没有病毒基因组，不能在细胞内复制，但可以完全激活免疫反应，因此它们更安全、更具可扩展性和更强的免疫原性。目前，用于mRNA传递的VLP是基于逆转录病毒，mRNA被特定的病毒衣壳蛋白识别，随后整合到病毒颗粒中。总之，多种多样的蛋白质类型为制造具有不同递送功能的NPs提供了充足的机会。然而，用于mRNA传递的蛋白质纳米粒的发展仍然面临挑战，包括mRNA包封率低、内毒素诱导的毒性和突释问题。此外，蛋白质的天然性质在制造和配方过程中可能会发生变化，克服这些挑战对于充分利用蛋白质NPs作为基于mRNA治疗有效载体的潜力至关重要。无机纳米颗粒无机NPs的发展为mRNA的传递提供了新的途径。与传统的有机纳米载体相比，这些载体可能具有高效绿色合成、大小和表征可调、通用性强等特点。金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、量子点和氧化铁纳米粒子是目前利用最多的无机纳米粒子类型。金纳米粒子因其尺寸小、可伸缩性、良好的生物相容性和可调节的细胞毒性而成为有吸引力的mRNA载体材料。然而，未经修饰的裸金纳米粒子不稳定，容易以金属颗粒的形式聚集和沉淀。目前，金纳米粒子主要通过共价键或超分子偶联组装来促进载体与mRNA的结合。硅基纳米颗粒通常被设计成纳米载体，用于输送不同的核酸分子。总体而言，无机纳米粒子在尺寸、结构和几何形状上表现出高度可控的特性。然而，这些无机纳米材料的潜在长期毒性和有限的生物降解性仍然存在。给药途径纳米载体是促进mRNA转运到靶细胞的不可或缺的工具，从而使mRNA疫苗的高效输送成为可能。不同的给药途径直接影响纳米材料的选择和设计。此外，纳米平台的设计和特性也会受到注射途径的影响，这决定了纳米载体与人体接触的生理环境，如注射部位的生理条件、细胞类型和免疫微环境。这些因素都会影响纳米载体的稳定性、颗粒大小以及它们与靶细胞相互作用的方式。因此，针对不同的mRNA递送系统选择合适的给药途径是研制核蛋白mRNA疫苗的关键。每种管理方法都有其优点和局限性。静脉注射的主要缺点之一是全身效应，如果NPs不易从体内清除，可能会产生更大的副作用。在静脉注射中，不同电荷和大小的NPs会影响血液中的清除率，较大的NPs的清除率更快。皮下注射在皮肤和骨骼肌之间传递高局部浓度的mRNA，适合一些慢性病患者。但皮下注射对剂量有一定限制，皮下脂肪血管分布不佳则不利于疫苗快速释放。相比之下，皮内注射在发现许多免疫细胞的表皮和真皮之间传递mRNA疫苗，有效地诱导免疫反应。然而，因为两者都不能实现大剂量给药，需要分批注射或多次给药。肌肉注射用于将靶基因转移到肌肉组织，这是目前已批准的新冠肺炎疫苗中使用最广泛的途径。这种用法便于大剂量注射，但可能会产生明显的副作用，如注射部位疼痛、肿胀和发红。鼻腔途径可以产生黏膜和系统免疫反应，减少对针状免疫的依赖，并有助于预防带有粘膜病原体的疾病。然而，目前鼻腔接种疫苗的有效性主要在动物模型中得到证实，还需要进一步的研究来确定是否可以在临床环境中使用。不同给药途径的RNA表达持续时间不同。皮内、肌肉和皮下注射的表达时间最长(10天)，其次是静脉注射(1-4天)。免疫原性和清除率也受给药途径的影响，皮内和肌肉内途径的清除率相似，而鼻腔途径产生的免疫反应较低，清除率较快。只有选择合适的给药方法，纳米材料才能以更低的剂量、更少的副作用和更大的安全性来传递更大的免疫效果。mRNA递送纳米平台表征和毒性不同的化学成分和结构特征影响NPs的mRNA传递效率和免疫原性。与传统的化学物质不同，NPs的分析除了需要它们的化学组成和结构外，还需要对它们的大小和形状、分散状态和表面电荷进行检测。Zeta电位是检测NPs电荷的有效方法，但易受pH值和离子强度的影响。通过测试不同pH和离子强度下的Zeta电位，找到合适的pH和离子强度，或者通过添加具有电位电阻效应或特定吸附电荷的表面保护剂，可以提高NPs的稳定性。尽管有多种可用的测量技术，但确定NPs的关键特性和阐明明确的结构-活性关系仍然是目前基于纳米材料的mRNA疫苗的重要挑战之一。纳米材料可能通过诱导氧化应激和炎症反应等机制诱导对生物体的毒性反应。因此，通过合理设计和优化NPs，安全有效地包封mRNA，调节mRNA疫苗与生物体的相互作用，可以最大限度地减少和消除其在体内产生的毒性。纳米颗粒的mRNA包封效率封装效率在评估NPs作为合适递送载体的潜力方面起着至关重要的作用。通常，mRNA的包封效率是用荧光法测量的，可以通过不同的方式实现。目前，广泛使用的定量包封效率技术是Quant-it Ribogreen RNA试剂盒，这种方法特别适用于进行高通量平板测定，能够快速有效地分析被封装的RNA水平。此外，mRNA配方的稳定性可以通过颗粒大小来监测。凝胶电泳和荧光相关光谱可用于确认mRNA的大小和完整性，或者可以使用高效液相色谱技术或反转录定量PCR来验证mRNA是否被降解。mRNA疫苗体外细胞测定在体外，细胞水平的评估可以通过将mRNA疫苗与目标细胞孵育，并使用共聚焦荧光显微镜和流式细胞术观察靶细胞对mRNA的摄取进行。荧光素酶报告基因检测可以作为一种筛选方法来评估NPs在感兴趣的细胞中的递送效率。细胞毒性试验、细胞活性试验、细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、细胞凋亡和细胞周期试验可用于mRNA疫苗对靶细胞生物学功能的影响。采用荧光定量PCR、western blotting和免疫荧光检测靶基因mRNA和蛋白表达。体内动物水平评估为了评估mRNA疫苗的免疫原性，可以根据NPs的理化性质和mRNA的治疗目的，采用合适的动物模型和注射途径进行免疫接种。可采用多种方法评估mRNA疫苗的药代动力学特性，如聚合酶链反应和质谱法，通过测量血液或尿液等生物样品的核酸浓度。利用免疫组织化学染色和血清学分析研究了基于纳米技术的mRNA在其他器官中的毒性积累。为了研究mRNA疫苗对动物免疫微环境的影响，可以使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验等检测体内免疫细胞和细胞因子的变化。为了评估对致瘤性疾病的疗效，可以通过肿瘤生长(肿瘤体积测量、肿瘤重量测量和高频超声成像)、肿瘤中靶蛋白的表达(免疫组织化学和western blotting)和动物存活率来评估模型。临床评估mRNA疫苗在投入临床使用时应持续监测和评估其有效性和安全性。通常，在首次给药之前和之后的一段时间内，使用酶联免疫吸附法或化学发光免疫分析法测量IgG或IgA等抗体水平，可用于评估mRNA疫苗的有效性，并指导和优化mRNA疫苗接种方案。然而，对于需要多大浓度的中和抗体才能达到mRNA疫苗的预防和治疗目的，目前缺乏公认的标准。此外，应及时监测和报告mRNA接种后严重不良事件的类型和发生率。mRNA疫苗应用COVID-19SARS-CoV-2是一种具有包膜和线性单链阳性链的RNA冠状病毒，编码病毒刺突蛋白(S)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和核蛋白(N)。S、E和M蛋白是表面蛋白，插入包膜中，而N蛋白包裹在基因组RNA周围。SARS-CoV-2主要通过S蛋白进入靶细胞诱导免疫应答。因此，S蛋白被广泛用作COVID-19 mRNA疫苗的免疫原。自科学家首次发表并公布SARS-CoV-2的RNA序列以来，多个疫苗平台参与了候选疫苗的开发。Moderna开发的mRNA-1273和Pfizer-BioNTech开发的BNT162b2使用相同的抗原靶标编码全长刺突蛋白S。这两种疫苗在mRNA生产过程中都使用1mΨ代替U和双链RNA片段去除来进行常规的碱基修饰，从而显著降低mRNA的先天免疫反应。为了使mRNA能够到达细胞质，两种疫苗都使用LNPs作为包封和递送的载体。NPs的组成相似:可电离阳离子脂质(SM-102和ALC-0315)，聚乙二醇修饰脂质(PEG2000-DMG和ALC-0159)和常见的辅助脂质(胆固醇和二硬脂酰磷脂)。图3 COVID-19 mRNA疫苗的结构表征及mRNA疫苗抗传染病的机制其他传染病鉴于mRNA疫苗在减少COVID-19感染方面的成功，针对其他传染病的mRNA疫苗的研究正在迅速扩大。表达感染因子抗原的mRNA疫苗可诱导对病毒、细菌和寄生虫感染的强而有效的细胞和体液免疫，是预防和治疗传染病的有前途的工具。疟疾mRNA疫苗的临床前实验选择环孢子子蛋白作为靶抗原。LNPs用于保护mRNA并将其传递到小鼠的靶细胞中进行翻译，从而诱导针对疟疾的功能性保护性免疫应答。目前，赛诺菲和Translate Bio宣布，他们已开始季节性流感mRNA疫苗的I期临床试验，成为首个进入临床试验的预防甲型流感病毒(H3N2) mRNA疫苗。随后，Moderna、Pfizer、CureVac等多家疫苗公司也开始了流感、HIV、呼吸道合胞病毒(RSV)、埃博拉病毒(EBOV)、狂犬病毒(RV)、疟疾和登革热(DENV)的预防性mRNA疫苗的临床研究。抗癌mRNA疫苗癌症是mRNA技术目前关注的主要疾病，与mRNA技术相关的临床试验处于不同的评估阶段。抗癌mRNA疫苗主要分为两类:编码免疫刺激剂的mRNA和编码肿瘤抗原的mRNA。编码免疫刺激剂的疫苗主要通过递送编码抗体、细胞因子和免疫检查点抑制分子(PD1、CTLA4和LAG3)的mRNA来刺激或抑制免疫通路并重塑肿瘤微环境。基于该技术，已在黑色素瘤、乳腺癌、淋巴瘤等肿瘤患者中开展临床研究。针对传染病的mRNA疫苗通常是具有编码明确抗原特性的预防性疫苗，可通过MHC-II途径诱导抗体。然而，与传染病疫苗不同，大多数癌症mRNA疫苗是治疗性疫苗，除了CD4+T细胞介导的免疫应答外，还需要更强的MHC-I途径介导的CD8+T细胞免疫来杀死和清除肿瘤细胞。此外，肿瘤抗原的个体可变性对识别和有效递送具有高免疫原性的肿瘤特异性抗原提出了挑战。需要多次高剂量注射以达到治疗目的。图4 mRNA癌症疫苗的机制限制和优化虽然mRNA疫苗被广泛认为是一种很有前途的预防和治疗方法，但现有的mRNA疫苗在功能开发过程中仍面临许多限制，包括细胞内和细胞外屏障、免疫原性、储存和安全性等。如果想要克服这些挑战并加快其他mRNA疫苗的临床应用，就需要进一步优化和创新。安全和有效地跨越细胞外和细胞内屏障是mRNA疫苗有效递送到细胞质的紧迫技术限制。细胞外的技术困难包括延长滞留时间和靶向性。由于其对核糖核酸酶的敏感性，mRNA在生理环境中容易降解。此外，单核系统吞噬作用和肾脏清除率极大地限制了mRNA在体内的滞留时间。因此，需要强大的交付载体来克服障碍。基于NPs的非病毒载体由于其免疫原性较低、有效载荷较大且易于合成，是目前应用最广泛的用于克服mRNA疫苗递送生理障碍的递送系统。mRNA NP配方的快速混合可以通过静电相互作用产生稳定的纳米结构。这种稳定性有助于保护NPs免受核酸酶的降解，最终导致免疫的产生。向NPs中添加PEG可减少血清蛋白吸收，并进一步降低单核吞噬细胞系统识别和肾滤过清除率。目前，绝大多数纳米载体主要将mRNA传递到肝脏。改变纳米材料的比例和化学结构或添加特定分子有助于将mRNA靶向递送到特定细胞或非肝脏器官。储存和安全性是mRNA疫苗开发过程中面临的挑战。在mRNA疫苗的储存和物流配送过程中，热稳定性一直是一个亟待解决的问题。除了对mRNA本身进行优化外，还可以通过修饰纳米载体来提高mRNA的稳定性。冻干的阳离子蛋白包膜mRNA编码RV糖蛋白，在5-25℃下保存36个月后仍能保持生物活性。自扩增mRNA疫苗包含工程化mRNA序列以永久产生特异性抗原，从而增强和延长免疫应答。疫苗的接种需要进入人体，这必然要求疫苗具有极高的安全性，不会在体内造成严重的副作用。mRNA生产所需的原料和合成酶可以来自商业产品，从而在一定程度上减少了细胞培养和有毒化学物质带来的安全问题。除了过敏反应引起的全身副作用外，脂质成分的积累也可引起局部细胞毒性。未来的研究将侧重于选择合适的脂质成分或表面修饰，以减轻mRNA疫苗递送载体相关的免疫原性，从而在阳性佐剂和阴性炎症之间实现最大的mRNA递送效率。展望在过去的十年中，基于纳米技术的递送策略主要致力于克服mRNA递送过程中的细胞屏障，并提高了mRNA疫苗的功效，是COVID-19和其他mRNA疫苗开发的创新标志之一。然而，目前mRNA疫苗的效力可以通过更多的优化或技术进步进一步提高。未来几年，对mRNA疫苗免疫机制的深入研究、新纳米材料的发现、新的给药途径的使用、mRNA生产良好生产规范的标准化以及多学科合作将使mRNA疫苗在多个领域得到应用。除了mRNA的免疫激活特性外，在开发基于纳米技术的mRNA疫苗时，考虑NPs本身的免疫药理学特性至关重要。NPs的组成、表征和表面电荷可能影响纳米载体与先天免疫系统和适应性免疫系统的相互作用，从而影响mRNA传递的免疫原性。深入研究mRNA疫苗的免疫机制，可以为优化mRNA序列、递送系统、佐剂或配方策略提供重要的理论依据，有利于开发下一代高效、安全、持久的mRNA疫苗。目前，无论是作为预防性疫苗还是治疗性疫苗，大多数mRNA疫苗都需要多次高剂量治疗才能诱导足够强的免疫反应。事实上，临床使用mRNA疫苗联合其他免疫治疗方法(免疫检查点抑制剂、周行免疫疗法、溶酶病毒等)可以引起更强的免疫反应。目前正在探索软膏、贴片、微针、滴眼液、滴鼻液甚至阴道粘膜等非侵入性给药方案，作为未来给药mRNA疫苗的途径。mRNA疫苗的潜在应用范围超出其目前的用途，包括癌症和传染病等多种领域。最近的临床研究表明mRNA疫苗在癌症治疗的个性化免疫治疗中具有革命性的潜力。未来的方法将包括将mRNA肿瘤疫苗与其他免疫疗法相结合，以达到最佳效果。此外，正在努力开发自我扩增的mRNA疫苗，这种疫苗只需要一次剂量就能有效治疗肿瘤。除了癌症和传染病外，mRNA疫苗在遗传代谢疾病和衰老等疾病方面也显示出令人鼓舞的临床前结果。对疾病发病机制的深入研究和基于纳米技术的mRNA疫苗的进展将推动各种疾病mRNA疫苗的发展，从而在未来取得成功的临床应用。mRNA疫苗的优化面临着无数的挑战，但过去和正在进行的努力已经明确表明，基于纳米技术的mRNA疫苗在临床应用方面具有巨大的潜力。了解mRNA疫苗的生物学机制和推进纳米递送技术仍将是未来十年的主要焦点，为进一步改进提供了重要机会。随着许多数据库和协作平台的出现，mRNA疫苗社区正在迅速发展。这些致力于mRNA疫苗的资源和专题讨论会提供了基于纳米技术的mRNA疫苗的最新研究，使非专业人员能够随时了解情况并与该领域的知名研究人员进行讨论。通过学术界和产业界的持续创新和合作，我们希望看到开发出更有效和临床适用的mRNA疫苗。文献来源：Nanotechnology-based 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