ANXA1

学术前沿 单细胞结合空间转录组的研究思路和案例分享 ——肿瘤免疫研究领域（下） 01 引言 单细胞转录组测序是在单个细胞水平进行高通量转录组测序的一项技术，其能有效解决细胞异质性以及之前bulk RNA-seq被掩盖的种种问题。随着该技术在分辨率和通量方面的不断优化，研究者从异质性样本中分析细胞类型特异性基因调控网络的能力也相对提高，但是在细胞的空间位置水平尚有欠缺。空间转录组技术于2020年被《自然》杂志评为年度技术，可以解析时间和空间维度上单个细胞的基因表达模式，以及细胞类群的空间位置关系及生物学特征。其原理是将空间条形码寡核苷酸引物固定在载玻片上，然后将组织贴于载玻片实现组织内转录组序列的捕获与检测。随着10x Genomics的空间Visium技术的登场和不断更新加强，单细胞联合空间转录组的研究如火如荼的开展，遍布了遗传、发育、肿瘤、免疫等多个生物科研和医学热门领域。 一、研究目的 1.某肿瘤中，整体的细胞图谱、空间图谱及细胞间机制探索。 2.某肿瘤中，不同进展期（病变期）、不同亚型、特殊基因表达或原发灶与转移灶样本之间差异机制探索。 3.某肿瘤中，肿瘤对治疗方案的疗效应答中的差异机制探索。 二、样本选择 1. 某癌种中，根据其样本类型的特殊性，选择一定数量的样本，包括新鲜组织、冰冻组织或石蜡样本。 2. 某癌种中，根据原发灶和转移灶、免疫类型（浸润型、沙漠型、排斥型）、基因表达（阴/阳）或不同病理亚型的分组取样。 3. 某癌种中，根据PD1免疫药物治疗/靶向药物治疗/常规放化疗等治疗药物，新辅助、转化治疗等方案，选取应答/无应答、治疗前/治疗后的样本分组取样检测。 三、研究方法 1.主要研究方法：主要应用在发现探索阶段的方法,一般包括流式细胞技术(Facs)、单细胞组学（scRNA-seq）、空间转录组(visium HD)、多重免疫荧光染色(mIF)、探针原位杂交（Xenium）等； 2.其他辅助方法：辅助研究方法应用在机制验证方面，会根据验证模型的不同水平，比如细胞水平、动物模型、人源组织、类器官、网络数据库等等，对应各种生物检测分析方法并没有固定的思路。 四、分析思路 1.单细胞图谱：细胞类型的空间分布特征，亚群的图谱分类； 2.空间图谱绘制：细胞类型的空间分布特征，亚群的定位； 3.各个亚群细胞中的特征，寻找对比差异显著的细胞亚群，从剖析细胞/基因功能空间动态变化、空间细胞分化规律（拟时序）去分析细胞发生的机制和可能作用； 4.各类细胞亚群的相关性，通过细胞通讯、ST定位以及IHC或mIF等图像直观证明细胞亚群间特异的互动关系； 5.实验验证靶点和机制：细胞水平、类器官水平、动物模型水平做敲除干预治疗等验证。 五、文献分享 案例1 《单细胞和空间转录组分析揭示了肝转移性结直肠癌的细胞异质性》 发表期刊：Cell，影响因子：11.5 研究背景：结直肠癌(CRC)是世界上第三大最常见的恶性肿瘤，而转移性 CRC 的生存率很低。CRC转移过程是一个多步骤的过程，包含了癌细胞和基质细胞之间的交流通过分泌细胞因子、生长因子和蛋白酶来促进转移性扩散，从而重塑肿瘤微环境。TME 的细胞组成非常复杂，包括多种成纤维细胞和免疫细胞，它们在癌症逃避、转移和治疗反应中发挥着重要作用。癌症相关成纤维细胞（CAF）是许多类型恶性肿瘤（包括 CRC、乳腺癌和胰腺癌）的主要基质细胞成分。为了全面绘制结直肠癌和匹配的肝转移的细胞景观，研究人员使用scRNA-seq结合空间转录组(ST)和免疫组织化学(IHC)染色以及流式细胞术生成了高分辨率的细胞图谱。 检测技术组合：流式细胞术、单细胞转录组、空间转录组 样本类型：1. 6例CRC患者的27份样本，包括原发性结直肠癌(CC)、邻近正常结直肠粘膜(CN)、肝转移(LM)、邻近正常肝组织(LN)和外周血(PB)五种组织类型用于单细胞转录组检测。 2. 6例CRC患者，包含4例CRC原发性肿瘤（C1至C4）和2例肝转移性肿瘤（L1和L2）采用空间转录组。 主要结果： 1.根据免疫和非免疫细胞群，分别展示了CRC原发肿瘤和CRC肝转移性肿瘤的单细胞转录组图基本分类，以及原发和转移的差异。 Fig.1.CRC原发及肝转移中的全球细胞景观 2.CRC原发性肿瘤和CRC源性肝转移性肿瘤的空间分布 在ST组织中鉴定出B细胞、 T细胞、 NK细胞、浆细胞、髓样细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞。这些细胞簇的比例和分数在每个地区都不同。与C1、C3和C4的肿瘤旁组织相比，肿瘤组织中浆细胞的比率降低。 Fig.2.空间转录组样本的细胞鉴定 3.原发性肿瘤和肝转移性肿瘤之间肿瘤细胞的转录组异质性 亚聚类分析揭示了肿瘤细胞的不同分化谱系。在各群中鉴定出簇状细胞的分化标志基因。肿瘤细胞群的异质性表明肿瘤细胞的分化潜力。 为了进一步研究不同肿瘤细胞簇的功能通路和转录程序，进行了基因集变异分析（GSVA）和转录因子（TF）分析。结果显示，表明CA2可能是TME中的干细胞亚群。 Fig.3.原发性和转移性肿瘤细胞的转录组特征和异质性 4.TME重塑髓系细胞的组成 鉴定出三种髓系细胞：单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞。使用亚聚类分析确定了8个单核细胞/巨噬细胞簇和3个常规DC（cDC）簇，GSVA分析显示，Mac_SPP1亚群参与了与炎症反应相关的通路。拟时序显示Mac_CXCL9 和 Mac_SPP1 亚群均发生终末分化，表明它们是肿瘤激活的Mac亚群。cDC_LAMP3 亚群还表现出高水平的成本刺激分子CD40CD80和CD86 表达，它们是DC成熟的标志物。在LM中，cDC_LAMP3亚群的比例显著增加表明肿瘤细胞对TIME的重塑作用。 Fig.4.骨髓细胞的免疫景观 5.CXCL13T 细胞在肝转移性肿瘤中富集 在 T 细胞中，7个CD8 T细胞簇、5个常规CD4 T（cCD4）细胞簇和2个调节T细胞簇被识别。从细胞比例显示，无论是CD8还是CD4的T细胞，LM的CXCL13T细胞子集比例都很高。GSVA分析显示，CD8_CXCL13亚群富含T细胞增殖通路，CD4_CXCL13 亚群富含G细胞+2-M检查点通路。用流式细胞术鉴定了CD69+CD103+CD8+T细胞。CC和LM的CD69+CD103+CD8+T细胞的Ki67表达水平均高于其他CD8+T细胞。然而，来自CN和LN的不同CD8+T细胞亚群的增殖特性几乎相同。 Fig.5.CXCL13+T细胞在肝转移瘤中富集 6.CXCL13 T细胞与CRC患者的良好预后相关 在上图验证CD8_CXCL13细胞可能是肿瘤激活的亚群。进一步对CD8_CXCL13子集的特征做深入研究。与其他亚群相比，在CD8_CXCL13亚群中观察到高水平的耗竭标志物，且耗竭表型表明它们的肿瘤反应性。IHC难以检测组织中的CXCL13，因此选用CD69和CD103标记CXCL13细胞，结果显示该群T细胞比肿瘤组织中的其他CD8 T细胞更接近CK19肿瘤细胞。将基因表达综合（GEO）队列中的CRC患者分为CXCL13+高和CXCL13低组，发现CC中 CXCL13 的较高表达预示着更好的总生存期。 Fig.6. CXCL13+ T细胞的特性及预后影响 7.成纤维细胞的不同亚群存在于 CRC 的原发性和肝脏转移性肿瘤中 在CRC的TME中鉴定出8个具有不同基因表达模式的成纤维细胞簇，然后研究人员对各类成纤维细胞分别做了转录组数据比较、IHC组化、拟时序分析、以及ST分析，在CRC原发性和肝转移性肿瘤之间观察到不同的表型谱和成纤维细胞的高度可变频率，这表明在不同癌症环境中TME内的细胞异质性。 Fig.7. 原发性和转移性肿瘤中成纤维细胞的转录组特征和异质性 8.在原发性肿瘤中富集的 F3 表达成纤维细胞亚群分泌促肿瘤因子，并与 CRC 患者的不良预后相关 为了研究富含CC和LM的不同成纤维细胞对TME 的重塑，研究人员分析了F2_MCAM和F4_F3的特征。通过差异基因富集以及F4_F3细胞与肿瘤细胞之间揭示了通过NRG1和Erb-B2受体酪氨酸激酶3 （ERBB3）通路进行串扰。在ST中发现了两类细胞 F3与NRG1的共定位并通过transwell细胞实验迁移证明。最后在预后数据中发现F3和NRG1 高表达水平的CRC患者总生存期较差。 Fig.8. F3+成纤维细胞的特性及预后影响 9. LM的TME中表达MCAM的成纤维细胞通过Notch 信号通路调节CD8_CXCL13细胞的产生 之前发现RBPJ在LM中的表达与CXCL13和ITGAE呈正相关。为了进一步了解两个亚群受到什么类型的细胞调节Notch信号，采用cellphoneDB分析，在内皮细胞中E2_DLL4亚群与CXCL13+ T细胞的相互作用最强，在成纤维细胞中F2_MCAM簇通JAG1-NOTCH1与CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群相互作用。由于TME中成纤维细胞的分散分布模式，推测F2_MCAM亚群有助于CXCL13+ T细胞中Notch信号的激活。此外根据LM中F2_MCAM的比例高低，发现F2_MCAM高组患者LM中CD8_CXCL13亚群的浸润评分更高，并在ST中得到了验证，使用JASPAR预测表明RBPJ可能作TF影响CXCL13的表达。 Fig.9. TME中的NOTCH信号调节CD8_CXCL13细胞的生成 10.ST组织中的细胞间相互作用网络 原发性肿瘤和肝转移性肿瘤ST中不同簇之间的细胞相互作用，表明ERBB3-NRG1相互作用在原发性肿瘤发生和转移中的潜在作用，发现在CRC原发肿瘤中富集的F3成纤维细胞可以通过产生各种促肿瘤因子（包括 NRG1）来调节发展和/或迁移，这些因子与肿瘤细胞上表达的ERBB3相互作用以发挥其促肿瘤功能。 Fig.10. ST组织中的细胞配体和受体相互作用 案例2 《空间和单细胞转录组学揭示了HNSCC中与癌症相关的成纤维细胞亚群限制了CD8+ T细胞的浸润和抗肿瘤活性》 发表期刊：Cancer Research，影响因子：12.5 样本类型：5例头颈部鳞状细胞癌HNSCC癌和癌旁组织； 技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫组化、免疫荧光、其他等等； 研究背景：免疫治疗可以延长一些HNSCC患者的生存期，但应答率仍然很低。阐明肿瘤微环境中cd8+t细胞浸润和功能障碍的关键机制有助于最大限度地发挥免疫治疗HNSCC的益处。CD8+T细胞与包括CAFs在内的其他类型细胞之间的相互作用决定了CD8+T细胞如何在这一动态TME中发挥作用，本研究对五对肿瘤和邻近组织的不同免疫浸润和单细胞RNA测序的HNSCC标本进行了空间转录组学分析，揭示了与cd8 + t细胞浸润限制和功能障碍相关的特定癌症相关成纤维细胞(CAF)亚群。 技术路线： 主要结果： 1. HNSCC肿瘤组织对CD8+T细胞具有招募趋化作用，CD8+T细胞存在于肿瘤基质中，且免疫排斥型的HNSCC中CD8a+被受限无法浸润到肿瘤巢中； Fig 1.CD8+T细胞在不同HNSCC肿瘤亚型中的分布 2.MHC-IhiCAFs（5亚群）是肿瘤组织中区别于癌旁组织的最主要的CAFs亚群，高表达CXCLs和MHC-I增强了CAFs与CD8+T的结合，且可通过限制CD8+T细胞的抗肿瘤能力造成预后不良； Fig 2.HNSCC肿瘤及邻近组织成纤维细胞的整体分析 3. MHC-IhiCAFs中存在LGALS9（编码galectin-9蛋白）的富集，大部分HNSCC肿瘤基质中均存在galectin-9蛋白的表达；MHC-IhiCAFs中galectin-9蛋白的表达依赖于干扰素信号； Fig3. TCF1 ~ GZMK ~ CD8 + T细胞与galectin-9的CAF细胞呈负相关 4.在CAFs中敲减LGALS9表达会降低CD8+T表达免疫检查点分子，同时促进干性和细胞毒性分子的表达，且动物实验证明Gal-9+CAFs促进干细胞样CD8+T细胞耗竭转化。 图4. 动物实验验证MHC I类的高表达限制了cd8+T细胞的抗肿瘤功能 案例3 《上皮细胞激活成纤维细胞促进食管癌的发展》 发表期刊：Cancer cell，影响因子：48.8 样本类型：29例ESCC患者79个多期食管病变的正常上皮、癌前病变和癌组织； 技术组合：单细胞RNA转录组、空间转录组、免疫组化、免疫荧光、其他等等； 研究背景：食管鳞状细胞癌(ESCC)的发展经历了多阶段上皮癌的形成，即从正常上皮、低级别和高级别上皮内瘤变到浸润性癌。然而，癌前病变如何发展为癌机制尚未可知。 主要结果： 1.ESCC多阶段肿瘤发生过程各种细胞类型图谱分析 Fig 1.单细胞转录组学分析揭示了ESCC多阶段肿瘤发生过程中的各种细胞类型 2.上皮细胞中ANXA1的功能失调可能是ESCC肿瘤发生中至关重要的事件； Fig 2.上皮细胞在ESCC肿瘤发生过程中逐渐抑制ANXA1表达 3.ESCC肿瘤发生过程中上皮细胞与成纤维细胞的相互作用，食管上皮细胞产生的ANXA1功能的丧失可能导致NF-CAF转化； Fig 3.上皮细胞抑制ANXA1可促进NF向CAFs转化 4.KLF4、KLF5、CEBPB和FOXA1与ANXA1的RNA水平呈正相关，细胞实验发现只有靶向KFL4的SiRNA可显著抑制ANXA1表达，KLF4调节ANXA1转录，促进NFs向myCAF的转化。 图4.在体外和体内，抑制上皮细胞ANXA1可促进myCAF的激活 参考文献： [1]Wang F, Long J, Li L, Wu ZX, Da TT, Wang XQ, Huang C, Jiang YH, Yao XQ, Ma HQ, Lian ZX, Zhao ZB, Cao J. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023 Jun 16;9(24):eadf5464. doi: 10.1126/sciadv.adf5464. Epub 2023 Jun 16. PMID: 37327339; PMCID: PMC10275599. [2]Li C, Guo H, Zhai P, Yan M, Liu C, Wang X, Shi C, Li J, Tong T, Zhang Z, Ma H, Zhang J. Spatial and Single-Cell Transcriptomics Reveal a Cancer-Associated Fibroblast Subset in HNSCC That Restricts Infiltration and Antitumor Activity of CD8+ T Cells. Cancer Res. 2024 Jan 16;84(2):258-275. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1448. PMID: 37930937; PMCID: PMC10790129. [3]Chen Y, Zhu S, Liu T, Zhang S, Lu J, Fan W, Lin L, Xiang T, Yang J, Zhao X, Xi Y, Ma Y, Cheng G, Lin D, Wu C. Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer Cell. 2023 May 8;41(5):903-918.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2023.03.001. Epub 2023 Mar 23. PMID: 36963399. 本文由 科研学术部 何鼎 提供

摘要：溶瘤病毒（OVs）正成为癌症治疗的潜在选择。自然和基因工程病毒表现出多种抗肿瘤机制。OVs通过直接细胞溶解、通过抗原释放增强免疫系统以及激活炎症反应来发挥作用，或者间接通过干扰肿瘤微环境中的不同类型元素、改变肿瘤细胞的能量代谢和抗血管生成作用。OVs的作用是多方面的，它们与宿主和肿瘤细胞有多种相互作用。在溶瘤病毒治疗中的一个重要障碍是病毒进入肿瘤细胞的途径以及它可能与不同的生物和非生物载体结合的可能性。在许多临床试验中，OVs已被证明能够消除对标准治疗有抵抗力的癌细胞（黑色素瘤、肺癌和肝癌）；然而，病毒本身的作用存在几种抗性元素。因此，有必要评估OVs与其他标准治疗方式（如化疗、免疫治疗、靶向治疗和细胞治疗）的结合，以提高反应率。本综述提供了OVs、它们在溶瘤病毒治疗中的使用以及这种疗法与目前用于癌症治疗的标准疗法的未来前景的全面更新。 1.引言 病毒通常被认为是导致人体致命感染的恶魔，但近几十年来，人们开始意识到可以将它们转变为保护天使，用作对抗恶性细胞的武器。使用病毒治疗癌症的想法源于一些病例报告中记录的肿瘤消退与病毒感染之间的关联。 近年来，溶瘤病毒（OVs）因其能够选择性地攻击和破坏肿瘤细胞，并可能刺激抗肿瘤免疫而受到特别关注。工程化肿瘤选择性靶向OVs具有可控的安全概况和对不同癌症的有效性，具有许多优势。被选为破坏肿瘤细胞的候选病毒必须具备某些特征：它必须是促炎性的，不应引起慢性传染病，对各种人群安全，应在肿瘤细胞中发挥溶解活性，并应具有整合到宿主基因组中的能力。促炎性的溶瘤病毒具有以下特征：存在可被免疫系统识别的抗原性，感染性，复制以触发强烈的免疫反应，以及有助于免疫识别和炎症反应的基因变异。 基因工程在开发具有可控安全概况和对广泛癌症高效性的OVs中发挥着重要作用。在这方面，OVs必须通过修改非编码突变并添加或删除某些功能、基因和非编码元素，专门为相应的肿瘤类型和肿瘤突变量身定制，以赋予它们额外的有益特性。癌症治疗使用OVs的三个研究方向是：病毒复制、肿瘤生长和免疫激活。因此，OVs的主要靶标是肿瘤细胞、宿主免疫和肿瘤微环境。大多数病毒载体通过释放肿瘤相关抗原引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后引发抗肿瘤免疫反应。通过激活抗肿瘤免疫，OVs超越了ICIs和其他精确靶向药物的表现。OVs表现出广泛的抗肿瘤免疫增强特性。必须识别具有适当分子特征的患者，以从OV治疗中受益。因此，发现OV治疗的预测性生物标志物很重要。 2.溶瘤病毒治疗的有吸引力的病毒  病毒治疗是一种基于将OV感染的细胞引入被诊断出恶性肿瘤的宿主的治疗方法，可能是一种创新的未来癌症治疗方法。最近的研究揭示了使用OVs通过诱导系统性抗肿瘤免疫来特异性破坏肿瘤细胞。然而，这个过程并不像看起来那么简单，因为并非所有细胞类型和病毒都可用作此目的。了解不同类型病毒对选定肿瘤的肿瘤趋向性，以及它们可以包含的联合疗法，决定了选择适当和准确的病毒肿瘤治疗选项，以增加治疗的整体有效性。OVs可以是单链或双链RNA或DNA病毒，分为自然病毒株和基因修饰病毒。下面描述了合格的病毒肿瘤治疗候选病毒的主要类型，主要特征（表1）以及益处和问题（表2）： 单纯疱疹病毒（HSV），包括两个血清型（HSV-1和HSV-2），是一种带有核衣壳的包膜病毒，保护着双链DNA。HSV作为溶瘤病毒的优势如下：（i）大基因组和复杂结构，使得插入大片段和多个转基因成为可能，而不影响病毒效率；（ii）能够感染大多数类型的恶性细胞；（iii）插入多个转基因的灵活性；（iv）尽管在大部分人群中存在高频率的抗病毒抗体，但它们并不阻止病毒复制。HSV通过四种病毒糖蛋白，即gB、gD、gH和gL，与各种细胞受体结合。基于基因修饰HSV的Talimogene laherparepvec（T-VEC），编码人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），是唯一获得FDA和EMA批准用于治疗IIIB/C–IVM1a黑色素瘤的七个溶瘤HSV之一。T-VEC刺激局部和系统性抗肿瘤免疫反应。T-VEC已在两项II期临床研究中进行了评估——一项是与放射疗法联合治疗局部晚期皮肤血管肉瘤（NCT02923778），另一项是软组织肉瘤。OH2是另一种基因工程2型溶瘤HSV，表达GM-CSF以促进抗肿瘤免疫反应。G207是一种基因工程单纯疱疹病毒，缺失ICP 34.5和ICP 6区域的基因，具有直接溶瘤效应，也可以刺激系统性抗肿瘤免疫反应。G207衍生的三种基因组修饰的工程病毒是G47∆，在肿瘤中高度复制，并具有更多的细胞病理效应。 腺病毒（Ad），具有双链DNA基因组和二十面体衣壳，其C末端负责识别细胞受体。腺病毒溶瘤疗法的优势如下：病毒还破坏了癌症干细胞，触发了各种细胞死亡信号，并释放了许多损伤相关分子模式分子（DAMPs），如高迁移率盒1（HMGB1）、热休克蛋白（HSPs）和核酸。腺病毒诱导局部炎症反应，产生大量病毒颗粒，并释放肿瘤抗原，具有直接和间接溶瘤效应。 大多数溶瘤腺病毒（oAds）与柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）结合感染细胞。Ad是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒，并且由于其高遗传稳定性和可用性，是该领域研究最多的病毒之一。遗传稳定性指的是病毒保持其遗传物质，特别是治疗或所需基因，而不会随着时间的推移发生显著突变或改变的能力。2005年，中国FDA批准了第一种oAd Oncorine与化疗联合用于治疗鼻咽癌。截至2021年，人类腺病毒工作组已识别出104种注册的腺病毒基因型，其中18种目前正在进行病毒肿瘤治疗测试，自2005年至2021年共进行了59项试验。为了使溶瘤治疗有效，病毒需要基因工程改造，非必需基因必须被其他增强治疗效果的基因所取代。 正在研究的三种基因工程腺病毒，也称为条件复制腺病毒（CRAd），如下所示。第一代CRAd由Onyx-015代表，它结合并灭活p53和Ixovex-1，阻止肿瘤生长，并参与不同的临床试验。第二代CRAd包含一个工程化腺病毒Delta-24-RGD（DNX-2401），针对视网膜母细胞瘤（Rb）的肿瘤抑制途径。第三代CRAd由一种与DNX-2401相似的病毒代表，E1A启动子发生变化，以提高肿瘤抑制性能。 Maraba，一种弹状病毒，最近被认为是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒。使用这种病毒的想法源于在溶瘤病毒治疗试验中使用类似病毒——水泡性口炎病毒，这种病毒具有更强的溶瘤活性。体外实验中，Maraba病毒对正常细胞表现出非常广泛的肿瘤趋向性，良好的肿瘤选择性和低毒性。此外，在异种移植模型中进行的体内研究显示了强大的抗肿瘤活性和优越的治疗效力。 麻疹病毒（MeV）是一种RNA副黏液病毒，对包括卵巢癌和乳腺癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤和胶质母细胞瘤在内的广泛癌症类型具有趋向性。MeV溶瘤治疗正在与其他疗法（如化疗）联合测试，用于腹膜或卵巢癌的治疗。MeV与宿主细胞的相互作用是通过三种受体介导的，即Nectin-4、CD46和SLAM/CD150。由于存在预先存在的抗麻疹抗体，系统性给药MeV可能很困难，因此开发了几种策略，如使用细胞载体运输病毒，编码抑制免疫系统的基因，用非反应性糖蛋白替换某些糖蛋白，或与免疫抑制药物联合给药。MeV具有有利的安全性概况和有限的毒性，MeV特异性T细胞反应可能增加溶瘤病毒治疗的有效性。 新城堡病病毒（NDV）是一种在鸟类中自然发现的1型禽类副黏液病毒。它已经被用于溶瘤治疗研究五十年了；因为它不通过重组进行基因交换的过程，所以它是高度安全的。 这一点从人类是非许可宿主这一事实上可以看出。NDV通过其RIG-I受体，可以减缓肿瘤活性，并且具有非常广泛的肿瘤趋向性，包括对乳腺癌、结直肠癌和头颈部癌的趋向性。 呼肠孤病毒在环境中很常见，通过根除病毒感染的肿瘤细胞，其抗癌活性可以得到增强。尽管呼肠孤病毒已被作为治疗黑色素瘤、骨髓瘤和胶质瘤的治疗选择进行研究，但也在进行其他恶性肿瘤的试验（表3），如胰腺癌、肺癌和结直肠癌（与pelareorep和atezolizumab联合进行的GOBLET研究）。 柯萨奇病毒对膀胱癌有肿瘤趋向性，特别是。一些研究人员已经研究了柯萨奇病毒B3对结直肠癌治疗的溶瘤活性，并显示出显著的肿瘤生长抑制作用，但也出现了一些严重的副作用，如心肌炎和胰腺炎。在一项II期临床试验中，对无法切除的黑色素瘤患者进行柯萨奇病毒A21（V937）瘤内注射，6个月无进展生存率为38.6%（95% CI，26.0至52.4）（表3）。 小病毒是临床上研究用于癌症病毒治疗的最小病毒。已经研究了三种重要的方法来提高这种病毒的溶瘤活性，即与其他各种抗癌剂结合，制备具有升级的溶瘤和免疫调节功能的新型小病毒，以及使用细胞复合物作为生物标志物来监测对小病毒治疗的反应（表3）。 3.溶瘤病毒治疗的抗癌机制  3.1.选择OV  理想的OV必须满足以下要求：（i）高度靶向肿瘤细胞；（ii）快速复制和扩展；（iii）低免疫原性，减弱抗病毒反应；（iv）强烈激活免疫反应。 病毒复制和扩展涉及一系列过程，病毒在宿主生物体内复制自身并增加数量。不同类型病毒的具体机制可能有所不同，但这里是一般概述： 1. 附着和进入，病毒首次使用表面蛋白附着在特定宿主细胞上，然后通过与细胞膜直接融合或通过内吞作用进入宿主细胞。2. 释放病毒基因组。一旦进入宿主细胞，病毒将其遗传物质（DNA或RNA）释放到细胞中。3. 复制和转录。病毒基因组控制宿主细胞的机制以复制和转录其遗传物质。DNA病毒通常在宿主细胞核中复制，而RNA病毒在细胞质中复制。4. 翻译和蛋白质合成：宿主细胞的核糖体被劫持以使用病毒RNA或DNA中的指令合成病毒蛋白。5. 组装。新合成的病毒组分（蛋白质和遗传物质）被组装形成完整的病毒颗粒。6. 成熟，组装好的病毒颗粒经历成熟并获得感染其他细胞的能力。7. 释放。成熟的病毒从宿主细胞中释放出来，要么通过细胞溶解（细胞破裂），要么通过从细胞膜出芽。8. 传播和扩展。释放的病毒可以感染邻近的细胞，重复复制周期，并导致宿主内病毒种群的扩展。 低免疫原性，减弱抗病毒反应，指的是免疫系统对病毒表现出减少或弱反应的情况，特别是当病毒已经被减弱或削弱用于各种目的时，如疫苗开发。减弱的抗病毒反应涉及使用弱化的病毒形式作为疫苗。病毒被修改以减少其毒力，使其更不有害，同时仍然保留刺激免疫反应的能力。这种方法旨在诱导提供针对自然更强病毒形式的保护的免疫反应。T-VEC就是一个减弱的溶瘤病毒的例子。 在确定破坏恶性细胞的OV时，首先要考虑的是病毒骨架。DNA病毒具有多重优势，因为它们具有更稳定的基因组，并且比RNA病毒更容易进行基因工程。DNA病毒的免疫原性低于RNA病毒，并且具有更多的修复机制，减少了复制过程中错误的可能性。一些DNA病毒，如逆转录病毒，具有将其遗传物质整合到宿主基因组中的能力。RNA病毒体积较小，可以穿过血脑屏障，并且比DNA病毒具有更恒定的复制能力；然而，它们的遗传不稳定性和突变率高于DNA病毒。最常用的平台是那些带有DNA病毒的平台，如HSV-1和Ad。基因工程是增强OVs某些特性的替代方法。据报道，临床试验中有三分之二的病毒已经被基因工程改造。1991年首次尝试使用HSVs对OVs进行基因工程改造。今天，第四代基因工程溶瘤病毒可用于肿瘤免疫治疗。基因工程OVs的研究重点是提高它们的效力和安全性，主要是促进选择性复制，减少免疫原性，促进肿瘤破坏，并减弱病毒致病性。迄今为止，已有20多个病毒家族经过基因工程改造；这些包括MeVs、NDVs、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒（VVs）、HSVs、Ad、痘病毒、粘液病毒和水泡性口炎病毒（VSVs）。这些转变的目的是针对病毒复制、免疫刺激的启动和肿瘤相关抗原的释放。一些临床前研究表明，工程化的OVs通过诱导所需的免疫反应发挥免疫调节作用。一个例子是通过添加GM-CSF或ICAM-1转基因来刺激宿主免疫反应。一个代表性的例子是VSV，其包膜中的糖蛋白已经被修改以减少病毒的神经毒性。已经为OVs的基因工程开发了各种策略。必须了解病毒的生物学和遗传学，以了解病毒与宿主之间的关系，并理解细胞如何防御病毒感染。基因工程使用具有不同机制的转基因来破坏肿瘤细胞。采用不同的策略替换病毒中的不同蛋白质以增加肿瘤靶向。许多病毒受体在癌细胞中高度表达，允许病毒在癌细胞中的摄取量高于正常细胞。一些受体，如层粘连蛋白、CAR、CD 46和CD155，在不同的癌细胞中表达过多，导致Ad、Sindbis病毒和Poliviruses的摄取量增加。一些病毒蛋白对肿瘤细胞有毒，并可以在病毒暴露时直接杀死细胞，而在病毒复制之前，如Ad编码的E3死亡蛋白和E4或f4蛋白。在一项研究中，VSV的糖蛋白G被一种脑膜炎病毒的变异蛋白替换，以增加VSV对恶性细胞的选择性。另一种策略是增加宿主对肿瘤的反应。T-VEC疫苗包含一个被基因改造以表达GM-CSF的Ad，增加了抗原呈递细胞（APCs）进入肿瘤免疫抑制微环境的招募，导致招募各种细胞因子，放大抗肿瘤活性。药物递送的效力与将药物递送到肿瘤床而不损害正常细胞有关，并将药物保持未降解直到它到达肿瘤。在一项研究中，用人血清白蛋白包裹的溶瘤Ad延长了病毒的存活率。在另一项研究中，人血清白蛋白涂层的腺病毒保护它免受中和抗体的侵害。 3.2.OVs的抗肿瘤机制 已经描述了OVs对肿瘤细胞作用的各种机制（图1）。 图1. 溶瘤病毒的作用机制。肿瘤细胞内病毒的复制引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后释放肿瘤抗原激活免疫系统，重塑肿瘤微环境（TME），激活抗血管生成机制，增加肿瘤突变细胞中病毒复制，并传播病毒感染到其他肿瘤细胞。 OVs，无论是自然产生的还是由于基因工程修改，都表现出肿瘤选择性，通过靶向恶性细胞表面的受体，在癌细胞中优先复制，并引起癌细胞内途径和基因表达的细胞内异常，但不影响健康细胞。OVs可以感染健康细胞，但它们展现出抑制病毒传播的机制，这些机制在癌细胞中通常缺失。因此，在VSV感染中，正常细胞可以产生I型干扰素来阻止病毒复制，但大多数癌细胞I型干扰素信号传导有缺陷。研究表明，Semliki病毒感染在肿瘤细胞中诱导分泌WNT配体（WNT2B和WNT9B）和β-catenin（CTNNB1）的稳定，并以反馈机制减少IFNB1的表达，有利于减弱宿主的抗病毒反应。一些研究报告称，两个小鼠细胞系（NR6和B82），不表达表皮生长因子受体（EGFR），对呼肠孤病毒感染相对有抵抗力，但转染了编码EGFR基因的相同细胞系表现出显著更高的敏感性。这种感染效率的提高需要功能性EGFR，因为在表达突变EGFR的细胞中没有观察到，就像在肿瘤细胞中一样。诸如HPV、HCV和KSHV等致瘤病毒感染，已经发展出在感染期间减弱肿瘤抑制基因（如p53和RB）的机制，以促进病毒增殖，强调了这些守门人基因在控制病毒感染中的重要性。 OVs采用的主要抗肿瘤机制如下：(i) 直接肿瘤裂解；(ii) 通过激活抗肿瘤活性重塑TME；(iii) OVs的基因靶向；(iv) 破坏和重塑肿瘤部位的血管系统；(v) 肿瘤细胞的代谢重编程；以及(vi) OVs诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）。3.2.1.直接肿瘤裂解 OVs采用的经典抗肿瘤机制是在癌细胞内复制，随后直接裂解这些细胞；这种机制被称为直接病毒诱导的溶瘤作用（图2）。因此，转基因表达并触发宿主免疫反应，从而激活抗肿瘤免疫。 图2. 溶瘤病毒（OVs）通过内吞作用或靶向一个或多个受体进入肿瘤细胞。OVs直接溶瘤作用的机制如下：(A) 大量OV复制，随后破坏溶酶体、自噬和细胞溶解；(B) OV改变通透性和线粒体代谢，随后发生细胞溶解；(C) OV决定肿瘤细胞应激反应，触发JNK途径和caspase级联反应，随后发生细胞溶解；(D) OV表面的蛋白质与TRAILR1和TRAILR2受体结合，激活TRAIL介导的凋亡（BioRender.com）。 有报道称，经过工程改造的新城堡病病毒导致肿瘤细胞线粒体膜通透性丧失，随后发生ICD。M1病毒诱导内质网应激介导的凋亡，随后肿瘤细胞溶解。携带TRAIL基因的工程病毒A4，可在病毒表面诱导TRAIL蛋白的表达，能够与肿瘤细胞上的TRAILR1或TRAILR2受体结合，并促进凋亡。这一机制通过直接肿瘤裂解在局部诱导肿瘤细胞死亡，但它也通过激活免疫系统（图2D）触发系统性反应，并激活参与肿瘤血管化的内皮细胞，减少肿瘤血管生成。3.2.2.通过激活抗肿瘤活性重塑TME OVs的抗肿瘤活性的一个复杂机制是TME重塑，激活抗肿瘤活性，局部OV诱导的炎症，以及对感染和未感染肿瘤细胞的间接介导凋亡。 肿瘤细胞的溶解释放肿瘤抗原，并在宿主中引发系统性抗肿瘤免疫反应。TME是一个由免疫细胞、血管和功能障碍的代谢途径组成的活跃的支持网络，这些途径刺激肿瘤细胞的增殖。一些环境由于肿瘤抗原水平降低和肿瘤抑制免疫细胞的浸润而被认为是免疫学上的“冷”。OVs是强大的免疫疗法剂，能够影响免疫抑制环境，创造一个有利于宿主免疫系统作用的免疫学上的“热”环境。OVs介导TME的重塑，创造一个有利于抗肿瘤免疫细胞的涌入和激活的环境，有利于肿瘤的消除（图3）。 图3. 冷TME包含基质和免疫抑制细胞。OVs引起细胞死亡。将抑制性免疫和代谢环境重塑为热TME。CAF，癌相关成纤维细胞；DC，树突细胞；IFN，干扰素；IL，白介素；MDSC，髓源性抑制细胞；NK，自然杀伤细胞；OV，溶瘤病毒；TME，肿瘤微环境；Treg，调节性T细胞（Biorender.com）。 OVs经历复制和扩增，这是肿瘤破坏的主要因素，导致新的肿瘤细胞被感染。这些复制和扩增过程是OVs特有的，并不在其他非生物癌症治疗中发现。 DC/T细胞激活 OVs通过包括先天免疫和适应性免疫以及诱导ICD在内的各种机制触发抗肿瘤免疫活性。 释放DAMPs。溶瘤病毒(OVs)导致内质网(ER)应激，随后是凋亡，病毒病原体相关分子模式(PAMPs)的释放，肿瘤相关抗原，损伤相关分子模式(DAMPs)的释放，以及先天免疫的激活。PAMPs与病毒元素一起结合到Toll样受体(TLRs)上，诱导树突状细胞(DCs)的成熟和细胞因子的释放。OVs激活的ICD可以随后释放其他DAMPs，如钙网蛋白(CRT)，ATP，热休克蛋白(HSPs)，尿酸，高迁移率族蛋白盒1(HMGB1)，以及细胞因子(IFN-α，IFN-γ，肿瘤坏死因子-α和白介素1,6,8和12)。DCs的激活。DAMPs也可以在DCs的TLR4配体(HMGB1和CRT)的支持下启动DCs的成熟。DCs在肿瘤中很少见，但代表与适应性和先天免疫系统相关的强大的专业抗原呈递细胞(APCs)。通过溶瘤效应调节肿瘤微环境中的DC群体提供了新的肿瘤抗原，并支持DCs的渗透和成熟。抗原呈递给CD4+和CD8+ T细胞后，激活效应T细胞反应，这些细胞记忆信息，在淋巴结中增殖，并迁移到肿瘤。遗传工程被用来通过删除或添加有效载荷(单克隆抗体，细胞因子和趋化因子)来修改溶瘤病毒，以增加肿瘤微环境中的免疫反应并限制不良反应。其中一个例子是添加GM-CSF，这是一种触发DCs转化为强大的APCs的细胞因子。临床前数据证明了GM-CSF武装HSVs的远隔效应。IL12也参与了DCs，T细胞和自然杀伤(NK)淋巴细胞在肿瘤微环境中的成熟，抑制调节性T细胞(Tregs)和MDSC活性，并诱导M1型巨噬细胞的极化。关于IL12的一个主要问题是其与致命炎症综合征的关联，这是由于IL12在全身的积累。为了避免这些毒性，工程化了一种表达IL12突变形式的oAd，以安全给药。 巨噬细胞的参与 TME中M2型巨噬细胞的存在是大多数癌症低总生存率的强大预后因素。在TME水平上，OVs作用于M2型巨噬细胞，这些细胞被重极化为M1表型，并表达各种促炎细胞因子和趋化因子(IFN-γ，CXCL10，各种白介素)，等等，这些因子加强了抗肿瘤免疫环境；这种效应已在一些OVs的研究中显示，包括VSVs，HSVs，呼肠孤病毒(RV)，副黏病毒(MeV和MuV)，GLV-1h68和Ad5 D24-RGD。 NK细胞的参与 NK细胞是溶瘤病毒疗法的重要介导者。此外，NK细胞参与对抗病毒感染，因此，它们可能对OVs的效力产生不利影响。OVs对NK细胞的影响包括促进NK细胞从循环中招募到肿瘤，增强NK细胞激活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。OVs有能力裂解肿瘤细胞并触发免疫原性细胞死亡，随后释放DAMPs，被DCs检测到，促进炎症。此外，OVs感染DCs，作为对感染，肿瘤和髓样细胞的反应，产生趋化因子，招募NK细胞进入肿瘤。此外，DCs和其他髓样细胞产生各种细胞因子，增强NK细胞存活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。当NK细胞被激活时，它们产生大量的IFN-γ并杀死肿瘤细胞。NK细胞配体在癌细胞表面的配体也由OVs调节。此外，OVs感染的细胞释放病毒蛋白，被NK细胞识别，增加激活受体的表达，并增强杀死肿瘤细胞。一些OVs介导增加细胞因子和趋化因子的产生，随后表达NK细胞抑制配体，如肿瘤细胞中的MHC-I。 已经证明，IL2武装的仙台病毒在血管肉瘤小鼠模型中增加了NK细胞的招募。在另一项研究中，表达IL-2的细小病毒(H-1PV)在胰腺导管腺癌模型中增加了NK细胞的激活。工程化的天花病毒(VV)，VV∆TK∆N1L，武装有IL12，并删除了胸苷激酶和N1L基因，作为新辅助治疗在各种小鼠和仓鼠手术癌症模型中使用时延长了存活时间。 中性粒细胞的参与 已经证明了基于VV和VSV的病毒促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤效应。在临床前实验中，发现TGF-β极化的N2中性粒细胞具有促肿瘤效应，而1型IFN极化的N1中性粒细胞具有促免疫和抗肿瘤结果。N1促进CD8+ T细胞的招募和激活以及细胞因子的产生，如VGF，TNF-α，GM-CSF和IL12。一种名为PVSIPO的重组脊髓灰质炎病毒疫苗株，包括一个异源内部核糖体进入位点，被证明可以促进前列腺和乳腺癌中中性粒细胞的积累，并与改善存活相关。 Tregs的参与 Tregs也通过高表达转录因子Foxp3诱导强烈的免疫抑制活性。已经证明，感染AdCMV∆24可以降低TME中的Treg水平。最近的研究报告说，溶瘤VV可以直接感染并减少小鼠癌症模型中的Treg数量，随后产生抗肿瘤效应。 基质修饰 一些OVs针对肿瘤基质并重塑细胞外基质(ECM)以改善其抗肿瘤效应。一种表达松弛素的oAd与各种调节剂结合形成平台oAd/IL-12/GM-RLX，导致ECM降解，增强治疗性单克隆抗体的渗透，并在胰腺癌模型中促进抗肿瘤效应。此外，一种表达PH20透明质酸酶的oAd导致ECM中透明质酸的降解，从而改善了其传播。癌症相关成纤维细胞(CAFs)在许多癌症中上调，并通过成纤维细胞激活蛋白(FAP)激活基质中的成纤维细胞。肿瘤相关周细胞是胶质母细胞瘤模型中的主要基质细胞亚群。一种oAd，ICOVIR15，减少了FAP+周细胞，胶质母细胞瘤细胞和GMP相关基质FAP+小鼠细胞的数量。另一种溶瘤VV，Western reserve double-deletion (WRDD)，已被证明针对CAFs并在黑色素瘤中具有抗肿瘤效应。 3.2.3.OVs的基因靶向 基因靶向是OVs的主要抗肿瘤机制。例如，呼肠孤病毒利用通常在癌细胞中改变的特定细胞特征。在肿瘤细胞中，癌基因被激活，肿瘤抑制基因被灭活，导致特定蛋白的信号传导调节，如TP53，PTEN，RB1和RAS，并激活肿瘤形成，血管生成，抑制凋亡，侵袭和转移。这些信号级联被OVs靶向，调节肿瘤细胞中的各种信号通路。已经研究了呼肠孤病毒对肿瘤细胞培养的作用，并确定了病毒在肿瘤细胞内的有选择性复制步骤—Ras突变可以促进呼肠孤病毒进入和肿瘤转化，增强OVs的产生，诱导凋亡，并在呼肠孤病毒感染后防止干扰素产生，允许病毒由于有缺陷的抗病毒反应而扩散。呼肠孤病毒通过与特定细胞表面受体相互作用进入细胞。癌细胞上这些受体的表达或可及性的变化可能增强病毒进入和感染它们的能力。溶瘤VVs和VSVs只能感染肿瘤细胞并促进由于ras/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的高表达而破坏内皮细胞。有些病毒，如呼肠孤病毒，对肿瘤细胞有天然的偏好，而其他病毒，如Ads，VSVs和HSVs，必须适应这种对肿瘤细胞的选择性。 被OVs感染的健康细胞通过不同的机制抑制病毒的传播，这些机制在肿瘤细胞中通常不足。细胞的I型IFN相关抗病毒潜能与其对VSV对癌细胞的选择性相关。正常细胞产生I型IFN以防止病毒复制；然而，大多数肿瘤细胞的I型IFN产生有缺陷，因此，它们被提议用于VSV感染。3.2.4.破坏和重塑肿瘤部位的血管系统 影响肿瘤血管生成的因素由癌基因介导的蛋白的表达和诱导细胞条件的因素组成，如低pH值、缺氧、营养缺乏或诱导活性氧(ROS)。OVs的抗血管生成方式如下：(i) 直接感染肿瘤细胞，随后裂解新形成的血管的血管内皮细胞；(ii) OVs触发的免疫反应，导致细胞聚集和血流减慢；(iii) 表达病毒蛋白，阻断肿瘤诱导的促进血管生成的因子的合成（图4）。 图4. 溶瘤病毒(OVs)诱导的抗血管生成机制。(A) OVs促使中性粒细胞的招募，发展为微血栓和缺血，随后发生凋亡。(B) 工程化病毒可以诱导内皮细胞的直接裂解。(C) OVs可以调节转录因子，减少IL8的产生，从而刺激凋亡。(D) OVs与血管生成蛋白相互作用，下调VEGF的表达。(BioRender.com)。 许多OVs具有直接的抗血管特性。一种含有人类端粒酶逆转录酶元素的腺病毒，OBP-301，被设计用来调节E1基因的表达，产生具有抗血管生成效应的IFN-gamma，选择性地破坏小鼠结肠肿瘤中的癌细胞。在血管内，VSVs刺激血栓形成和炎症。 最重要的因素包括CRT、ATP、HMGB1、热休克蛋白（HSPs）和annexins[135]。增强树突细胞吞噬抗原的DAMPs之一是CRT。ATP从凋亡细胞释放并结合到巨噬细胞和单核细胞上的P2Y2受体，加速凋亡细胞的清除。HMGB1激活未成熟树突细胞中的TLR4，导致树突细胞成熟并加速树突细胞对肿瘤抗原的摄取。热休克蛋白（HSPs）能够结合到树突细胞受体上，刺激抗原肽；它们也刺激内在的促炎级联反应。Annexin A1（ANXA1）在解决炎症过程中和协助树突细胞活动方面发挥着重要作用。参与ICD发展的其他因素包括细胞因子、趋化因子、核酸和转录因子。一些溶瘤病毒（OVs）对肿瘤组织有天然的趋向性，而另一些则经过基因改造在肿瘤细胞中复制以检测特定目标并传递某些基因（图5）。 图5. 由天然溶瘤病毒（OVs）诱导的免疫原性细胞死亡途径。一些天然OVs，包括新城疫病毒（NDVs）、柯萨奇病毒（CVs）、麻疹病毒（MVs）、单纯疱疹病毒（HSVs）、牛痘病毒（VVs）、腺病毒（Ads）、森林塞姆利基病毒（SFVs）和绵羊痘病毒（ORFVs）可以诱导特定模式的免疫原性细胞死亡。NDV、HSV和Ad可以诱导多模式细胞死亡，调节濒死恶性细胞中损伤相关分子模式的暴露，随后招募先天免疫应答者并触发强烈的免疫反应。VV诱导坏死性凋亡，而CV、MV、SFV和ORFV诱导免疫原性凋亡（BioRender.com）。 免疫原性凋亡是OV诱导的细胞死亡的最常见类型。受体，如TRAIL-R、TNF-R和Fas，形成死亡诱导信号复合体（DISC），被病毒感染调节，并调节激活caspase-8，诱导凋亡。这些受体过度表达并触发caspase级联反应，启动外源性凋亡。腺病毒在肿瘤细胞中诱导凋亡，这是其自然特征。表达三聚体肿瘤坏死因子的H5CmTERT-Ad株（H5CmTERT-Ad/TRAIL）在对照组中比天然腺病毒具有更强的肿瘤杀伤效果。HSV也参与凋亡。一种工程化的oHSV-2配备了凋亡激活因子Her2-COL-sFasL，以增强感染细胞中caspase的激活并放大凋亡。坏死代表细胞通过自溶的过早死亡，包括细胞膜完整性的丧失、细胞器的肿胀和细胞死亡产物不受控制地释放到细胞外空间。坏死性凋亡是一种程序性坏死细胞死亡过程，可以诱导或增强抗肿瘤免疫。它经常与由于DNA、ATP、尿酸、核蛋白和HSPs的释放而激活的级联炎症体激活相关，这些物质激活类激酶蛋白（MLKL），随后膜通透性增加并释放DAMPs。OVs还触发目标肿瘤细胞中的多种细胞死亡过程。例如，野生型Ad血清型5诱导自噬、焦亡和坏死性凋亡细胞死亡途径。NDV触发凋亡并被发现激活内在和外在凋亡途径。溶瘤NDV株FMW（NDV/FMW）是肺、黑色素瘤和前列腺癌细胞中的ICD诱导剂，显示HSP70/90和ATP分泌，并在黑色素瘤细胞中触发凋亡、自噬和坏死性凋亡。NDV/Hitchner B1促进胶质瘤细胞中的凋亡和坏死性凋亡。 4.OVs的递送系统  4.1.溶瘤病毒的直接递送  4.1.1.瘤内递送  瘤内给药是临床试验中用于递送OVs的最常用途径。各种试验已经建立了瘤内给药的有效性，并研究了其通过避免循环洪流来保持OVs足够生物利用度的能力。瘤内局部给药方法通过减少病毒失活来利于这一过程。有限的病毒与先天免疫系统的相互作用降低了系统毒性的可能性，并通过对独特给药途径的期望病毒载量进行转移。限制因素包括由于密集的ECM而在肿瘤中达到的非治疗水平，以及由于新生血管生成而导致的瘤内灌注不足。瘤内给药的OVs可以诱导全身反应。肿瘤抗原的产生是对OVs和肿瘤细胞之间相互作用的反应。对T-VEC给药的研究显示，研究的黑色素瘤病变大小都有所减小，无论是注射的还是未注射的。 4.1.2.静脉内递送 静脉给药对于转移性癌症有益，当需要感染不同大小和位置的多种肿瘤时，以及由于肿瘤位置原因无法进行瘤内给药时。这种类型的给药可以确保OVs在肿瘤质量中更好地分布；然而，最佳OV剂量尚不确定。一些OVs在静脉给药时可以刺激更明显的免疫反应。免疫系统可以使用不同策略阻止OVs成功传播到目标组织。OVs可以非特异性地连接到血清蛋白或循环流中的循环细胞，随后被破坏。由于这些机制是先天免疫系统的一部分，它们在未暴露于特定病毒的患者中也有效，暴露史可以通过存在精确而有力的免疫反应通过抗体的存在显著破坏病毒。通过与病毒颗粒结合，抗体可以通过补体作用或被位于不同器官的巨噬细胞破坏而消除。肝脏、脾脏和肺是中和OVs的主要器官。另一个有效静脉给药OVs的障碍是肿瘤ECM和间质流体压力。高间质流体压力限制了进入肿瘤中心的通道，其中由于其周边的流体流动而具有最高值，但它也减少了大分子的通过。 4.2.通过OVs的货物系统递送 在OVs货物递送到肿瘤的领域已经进行了众多且多样的研究，可以分为生物和非生物递送系统。生物载体包括细胞、细胞膜介导的和血清白蛋白介导的OVs载体。非生物载体的OVs包括矿化纳米结构、磁性纳米结构和基于聚合物的纳米载体。 4.2.1.OVs的有机载体 细胞载体 间充质干细胞（MSCs）因其独特的生物学特性、广泛的治疗应用以及对组织工程的影响而在科学研究中受到越来越多的关注。MSCs通过分化成成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞来展示这种能力，并且具有广泛的分泌网络，包括多种介质、细胞因子和信号分子，除了它们显著的自我更新和多能性特征。这种分泌塑造了炎症反应，并控制了组织再生和修复所需的关键渗透过程。MSCs的调节行为是由MSC分子-靶细胞轴内的反馈驱动的。MSCs无法显示共刺激粒子，因此与较低的免疫活性有关，有机会用于肿瘤的基于细胞的免疫疗法。MSCs可能促进体外oAds的病毒复制，通过防止大鼠模型中的病毒特异性免疫反应，使运输和提高病毒的长期存活率成为可能。此外，与体内单独病毒接种相比，CR-MSCs可能减少刺激T细胞合成的IFN的数量，并导致oAds在扩散和存活方面的增加更大。全身给药的MSCs感染了肝细胞癌异种移植标本中的oAds，增强了病毒粒子的积累，并显著抑制了肿瘤增殖。另一项涉及由人类MSCs携带的复制Ad的研究，其中包括由甲胎蛋白启动子调节的E1A基因，显示在正位和皮下肝异种移植癌小鼠模型中显著限制了生长。经过全身给药后，MSCs被oAd污染，在肺和乳腺恶性肿瘤的正位小鼠模型中显示出治疗特性，提高了存活率。在转移性乳腺癌的实验模型中，全身注射工程化的人类MSCs，携带可复制病毒的副本，如Ad5/3.CXCR4和Ad5R6D.CXCR4 Ads，增加了动物的存活率。全身输注感染了HER2重定向溶瘤HSV的MSCs，在实验室模型中将感染传播到乳腺和卵巢癌细胞，随后减少了肺部和大脑的转移。对SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植的研究显示，腹腔内给药的MSCs装载了溶瘤MeVs在SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植可以进入肿瘤病变，并最终在小鼠中传播病毒感染，增加了平均寿命。针对MSCs的CRAd5/F11嵌合oAds显著抑制了结直肠癌细胞的生长。 神经干细胞（NSCs） 一些研究表明，NSCs具有迁移到脑肿瘤细胞的能力，并可能为各种抗癌剂提供运输平台。Ad（CRAd-Survivin (S)-pk7病毒）可以针对NSCs上的CD46受体。感染的NSCs迁移到胶质瘤细胞，从而减少肿瘤生长。NSCs和MSCs被用作载体在胶质瘤模型中运输oAd，观察到NSCs和MSCs都允许病毒复制并减少神经炎症。然而，NSCs释放的Ads数量多于MSCs，并且使用病毒载NSCs在肿瘤携带动物中注射瘤内，存活时间延长，这表明NSC细胞系中CXCR4的高表达是原因。Kim等人报告说，CRAd-S-pk7和NACA的组合提高了NSCs中oAds的复制，从而提高了OV的效率。 细胞膜介导的OVs系统递送 作为载体的某些实体在来自几种细胞类型的细胞外载体的多样化保护伞下共同可用。使用这些载体的好处，由生物模拟技术作为PEG化替代品，包括在环境中的安全性和耐用性，从而克服了药物递送系统的局限性。 整合来自细胞膜的运输者的主要优势在很大程度上是由于保留了它们来源的细胞内的固有功能和信号传导途径。结合这些纳米载体只包含来自单一来源的膜部分，如红细胞、血小板、癌细胞和负责免疫防御的细胞的膜，或者是从几种不同的细胞类型生成的，结果是有价值的载体选择，它们具有靶向肿瘤细胞的能力，是细胞膜的生物工程过程的结果，并且可以携带小分子，如遗传物质、特定药物和疫苗抗原。这些由细胞的基本组成部分生成的囊泡在肿瘤学试验中使用，主要是通过在它们内部运输实体或通过包裹纳米粒子-药物复合物。在所有细胞来源替代品中，红细胞为所讨论的目标提供了一些最有用的特征。可以相当容易地获得这些细胞，它们在血管系统中的平均存活时间很长，并且由于这些细胞缺乏天然细胞器，因此还有潜力封装额外数量的产品。依赖于具有混合涂层的囊泡的新模型，称为红细胞脂质体，由人工成分与红细胞膜的组合生成，对分布有益。随后，在体外和体内检查了肿瘤细胞膜，以评估病毒感染的程度及其破坏性影响。因此产生的颗粒，称为ExtraCRAd，被瘤内给药，并显示出通过clathrin介导的内吞作用的适当吸收，考虑到oAds感染需要表达CAR的需求，这是一个重要的好处。此外，这种设置对于体内抗体识别和灭活是一个重要的限制。 血清白蛋白介导的OVs系统递送 用不同材料包裹OV颗粒是一种保护它们免受免疫系统作用的策略。Ads和血清白蛋白之间的关联阻止了针对OVs的抗体的作用。抗体识别病毒的衣壳蛋白，并通过吞噬作用对它们进行涂层。因此，它们使OVs成为免疫效应细胞的目标；然而，它们也可以在细胞水平上阻止转导。白蛋白是血浆中浓度最高的蛋白质，并且具有长的半衰期。 经过基因工程改造后，白蛋白自然地结合到Ad的表面。形成病毒衣壳的最常见蛋白质具有高变区域，可以促进白蛋白和病毒之间的相互作用，但也是抗OV抗体的主要目标。使用降解ECM的蛋白酶可以增加肿瘤床中的病毒载量。透明质酸是ECM的组成元素之一。它是一种复杂的多糖，在某些癌症中以高浓度存在。透明质酸的积累可能发生在消化道癌症的上皮中，如结肠和胃。在卵巢、乳腺和前列腺癌症的肿瘤基质中，聚集是明显的。有些器官具有富含透明质酸的多层上皮和基质。在这些情况下，变化是可见的，并且与癌症进展相关。在头部、颈部和皮肤的鳞状细胞癌中，透明质酸水平降低，与肿瘤阶段有关。增加的浓度与侵袭性肿瘤和预后不良有关。透明质酸酶降解ECM并降低间质流体压力。因此，抗肿瘤剂对靶细胞的作用增加。透明质酸酶的表达增加了OVs的有效性。Hexon是Ad包膜中发现的一种重要蛋白质。衣壳蛋白与白蛋白的结合域结合。透明质酸酶的蛋白水解作用和基于白蛋白与病毒表面结合的递送机制决定了OVs的溶瘤效力。VCN-11是一种修饰的腺病毒，表达透明质酸酶和白蛋白结合域。目前正在研究其细胞毒性和逃避免疫系统的能力。这些OVs对肿瘤细胞的作用最强，并且细胞毒性是450倍。在体内，含有白蛋白结合域的OVs组中存在高滴度的中和抗体，表明它们没有作用。VCN-01是一种oAd，其透明质酸酶作用于胰腺间质基质。它可以增强化疗药物的效果。HAdV5是最好表征的Ad类型之一，靶向呼吸道上皮细胞。在具有健全免疫系统的个体中，可以轻松控制这种病毒的感染。这种病毒是溶瘤治疗的良好候选者，考虑到其个体性。这种病毒确保有效地转导到感染的细胞中。因此，在感染靶细胞后，遗传物质被转移到细胞核中。在将核酸释放到细胞核后，细胞使用病毒提供的遗传物质产生所需的蛋白质。此外，这种方法用于分裂细胞系和难以接近的细胞，如原代细胞。另一个优点是大规模生产的可能。适应悬浮培养的细胞确保了细胞培养的简便程序，从而提高了安全性并降低了生产成本。通过将白蛋白层适应病毒，可以减少OVs在肝脏中的清除。通过将适配蛋白附加到这个复合物上，可以将遗传物质传递给表达HER2或EGFRs的肿瘤细胞。此外，这种适应减少了免疫介导的清除。免疫中和可以通过阻断特定受体或将其暴露于蛋白酶体降解的抗体发生；这被称为抗体依赖性细胞内中和。先天免疫系统通过IgM抗体和补体系统与OVs相互作用。 细胞外囊泡（EVs） 细胞外囊泡是各种类型细胞释放的膜囊泡，通过携带脂质、蛋白质、RNA、DNA和碳水化合物参与细胞间信号传导，并根据其大小被分类为外泌体、微囊泡、凋亡小体和肿瘤小体。它们通常用于携带抗癌药物，如OVs。Garofalo等人报告说，Ad5D24-CpG和PTX封装在EVs中在体外和体内诱导了肺癌模型中的肿瘤周围炎症，提高了疗效和细胞毒性。来自肿瘤细胞的外泌体通常具有免疫抑制功能；然而，感染OVs的肿瘤细胞的外泌体可能具有免疫刺激功能。Labani-Motlagh等人表明，感染OVs的黑色素瘤细胞，装备有CD40（CD40L）和4-1BB（4-1BBL）配体，增强了树突细胞的激活和TME中的响应。OVs可以包含选择性在肿瘤中积累的外泌体，局部或在远处肿瘤中表达抗肿瘤效应。它们被设计成带有免疫刺激转基因的LOAd溶瘤腺病毒。LOAd感染的肿瘤细胞表达转基因包装到内体区室并作为外泌体释放。此外，mRNA在外泌体中的表达在LOAd700和LOAd703感染的细胞中显著增加。观察到任何感染的细胞都可以表达转基因，即使病毒只在肿瘤细胞中复制。然后未成熟的树突细胞被LOAd病毒感染，并在体外被外泌体激活。OVs用其免疫刺激转基因武装肿瘤衍生的外泌体，这可能部分解释了为什么局部治疗可以导致全身免疫。还证明了感染细胞中外泌体中微小RNA（miRNA）的转运发生了变化。 微粒子（MPs） 另一种用于OVs系统运输的车辆是微粒子（MPs），它们是通过外泌作用从细胞释放的直径最大为1微米的囊泡。微粒子提供免疫保护并延长oAds的释放。封装在微粒子或PLGA中的Ads为oAds提供了免疫保护。使用MPs的总循环系统对oAds的高保护增加了oAds的释放。肿瘤细胞衍生的MPs被用作oAds的货物，被运送到肿瘤细胞的细胞核，并保护Ads免受抗体的影响；由MPs携带的oAds比用游离oAds治疗肿瘤更有效。 4.2.2.无机载体介导的OVs系统递送 包括脂质体、树状分子、金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子和氧化铁纳米粒子在内的各种类型的纳米粒子（NPs）可以与OVs链接。使用NPs递送OVs有两种策略。第一种是屏蔽和表面修饰，第二种是OV-NPs的联合疗法。将NPs递送到肿瘤部位有两种机制，即主动和被动。在被动机制中，EPR效应增加了肿瘤血管的通透性，NPs在肿瘤区域集中。主动递送涉及NPs对目标细胞的选择性结合，目的是在减少副作用的情况下增加治疗剂在肿瘤中的浓度。各种生物配体，如肽、蛋白质、核酸适体和多糖，对肿瘤细胞中的分子或受体表现出亲和力和特异性。 药物递送中的屏蔽 聚乙二醇（PEG）最常用于屏蔽NPs的表面，因为它在极端pH溶液中的生物相容性、稳定性和亲水性。PEG成功地与Ad载体结合，延长了循环时间并减少了肝脏毒性。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）是另一种通过内吞作用进入细胞的配体。阳离子脂质体（DOTAP/DOPE）被报道可以增强病毒基因组在肿瘤细胞中的转移，并增加肿瘤的通透性和优先靶向。 OV-NP联合疗法 金纳米粒子（AuNPs）在溶瘤病毒疗法中广泛使用，有助于DNA进入肿瘤，尽管存在抗体。设计了一种含有Ad的微胶粒包被的粒子，并与紫杉醇结合，显示出对肿瘤的高效性。我们测试了聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）与聚合物微胶粒的结合，携带紫杉醇到特定目标，比紫杉醇诱导了更高的抗肿瘤效应。另一种聚合物，聚半乳糖基-b-agmatyl二嵌段共聚物（Gal32-b-Agm29），涂覆了oAd，对肝肿瘤细胞表面表达的糖蛋白受体表现出非常强的亲和力。oAds也可以与水凝胶系统结合，提供决定恶性细胞细胞毒性影响的保护环境。oAds可以装载在海藻酸盐凝胶中并瘤内给药，与裸oAds相比，在肿瘤异种移植模型中显示出oAds的长效性。Almstätter等人将磁技术与OV递送结合起来，以改善OVs的递送。设计了四种磁性病毒复合模型，被证明可以提高OVs的疗效并减少系统毒性。 5.当前溶瘤病毒治疗策略  5.1.对溶瘤病毒治疗的耐药性  并非所有患者和癌症类型对病毒治疗都有相同的反应。这种治疗方法的局限性和挑战，以及治疗耐药性的存在，已经被描述。宿主对病毒的免疫反应是病毒治疗中的关键挑战。在几项临床前研究中，宿主免疫反应被证明在减少OVs的复制和更快的清除中发挥重要作用，并对降低抗肿瘤效力负责。在这种情况下，涉及OVs的新的治疗策略集中在调节宿主免疫系统以最大化抗病毒反应，从而改善肿瘤破坏[9]。已经描述了不同的耐药机制；这些包括抗病毒免疫、肿瘤细胞介导的、基质细胞和系统反应。对病毒感染的抵抗力可以在四个阶段完成：（i）病毒的进入和结合；（ii）病毒转录和翻译；（iii）细胞存活；（iv）细胞信号传导。包括中和抗体、正常细胞受体和ECM中的蛋白酶在内的多种因素影响病毒的结合和进入。在上皮-间质和间质-上皮转换期间，据报道细胞间连接得到加强，这使得OVs的渗透变得困难。 为了执行其自身基因组的转录和翻译，病毒的下一个关键步骤是适当调节宿主转录和负责将mRNA翻译成蛋白质的机制。例如，肿瘤细胞可以通过表观遗传修饰和表达几种蛋白质（如载脂蛋白B mRNA编辑酶）来影响病毒转录。几种存活蛋白保护肿瘤细胞免受病毒感染。除了表观遗传修饰外，对OVs的耐药性被发现与调节自噬、肿瘤细胞中的凋亡和促进细胞存活有关。Li等人证明了病毒治疗溶瘤活性的增加，其中Ads中的beclin-1活性促进了肿瘤细胞的凋亡。此外，对病毒感染和肿瘤细胞中的增殖的抵抗力与几个细胞存活调节因子（MEK、MAPK、MYCN、MDR1和SMAC）有关。感染的细胞释放可溶性信号，保护周围细胞免受各种病毒感染。此外，通过分泌干扰素在OVs感染的背景下触发肿瘤细胞中的干扰素受体（IFNR）基于Janus激酶（JAK-STAT）途径在抗病毒耐药性中发挥重要作用。基质细胞的抗病毒活性比肿瘤细胞更强，这影响了对OVs的治疗反应。Arwert等人表明CAFs通过干扰素调节转录因子3（IRF3）和干扰素基因刺激因子（STING）阻止病毒感染。类似地，在卵巢和乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞通过分泌IFN促进对OVs的耐药性，从而创造了保护性的抗病毒状态。OVs也可以诱导局部免疫反应，随后将免疫学上“冷”的TME转化为“热”的，被免疫细胞浸润，其中干扰素信号通路发挥重要作用。干扰病毒治疗效力的机制存在于不同的水平，并涉及TME中不同细胞的相互作用。因此，上皮细胞代表了控制肿瘤中病毒传播的物理屏障。此外，肿瘤血管生成是病毒传播和感染的调节组成部分。对oncoviral治疗产生耐药性的另一个因素是肿瘤中存在缺氧区域。缺氧可以减少OVs在肿瘤细胞中的增殖并干扰肿瘤细胞的裂解机制。缺氧诱导因子1（HIF-1α）是缺氧中的主要因素，促进肿瘤细胞的血管生成和转移。除了物理限制外，前列腺素和VEGF与TME中的耐药性有关。使用病毒载体开发新疗法的困难与无效分布、肿瘤中的缺氧、血管屏障、亚优免疫反应和在细胞间水平发生的抗病毒分子机制有关。总而言之，某些机制对病毒治疗施加了一定程度的耐药性，并负责随后杀死肿瘤细胞。尽管如此，这种机制在赋予OVs耐药性方面的作用仍然不清楚。 这些数据表明需要鉴定新的因素，如肿瘤缺氧和表观遗传修饰，这些因素被认为是对溶瘤病毒治疗产生耐药性的组成部分。关于这一机制的额外数据将为研究人员和临床医生提供完美的工具，以合理设计OVs并制定适当的治疗策略。 5.2.当前将溶瘤病毒治疗与其他协同疗法结合在癌症治疗中的现状 如前所述，已经描述了在单药治疗中对OVs产生耐药性的几种因素。已经考虑了联合疗法来克服这个问题。这种方法在临床前和临床环境中的各种类型的肿瘤中证明了其有效性。 5.2.1.与化疗的结合 化疗仍然是传统的抗癌疗法。OVs与化疗在多个层面上协同作用，包括抑制免疫介导的病毒降解和中和。化疗通过多种机制补充病毒治疗，如通过增强肿瘤细胞的免疫原性、直接杀死癌细胞和阻断抗病毒免疫反应（NCT00006106、NCT00634595、NCT01584284）。环磷酰胺是一种烷化剂，可以提高使用不同病毒的病毒治疗的疗效。这种化疗药物触发的免疫调节被认为可以改善病毒的复制、传播和溶解活性。在临床前和I/II期研究（NCT00006106）中取得了有希望的结果，一种工程化的Ad载体，ONYX-015，与5-氟尿嘧啶和顺铂联合用于治疗头颈部或食管鳞状细胞癌的III期试验。联合治疗的患者反应率为79%，而单独接受化疗的患者为40%。此外，当Ad与不同的药物如阿霉素、吉西他滨、紫杉醇、伊立替康和环磷酰胺联合给药时，抗肿瘤效应得到加强。此外，在临床前研究中，对胶质瘤患者测试了替莫唑胺与OV的联合使用，并显示出良好的毒性剖面和提高的存活率。然而，OVs与化疗的结合效果仍然存在争议，需要进一步研究。尽管一些临床试验显示出有希望的结果，但其他涉及大样本的研究报告了这种联合方案的无效性。例如，Eigl等人在用多西他赛和pelarorep联合治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌患者中，中位生存时间为19.1个月，而接受多西他赛治疗的患者为21.1个月（NCT01619813）。 5.2.2.OVs与放疗的结合 一些研究表明，病毒治疗和放疗的结合导致了有希望的治疗结果。尽管存在强有力的临床前数据，但由于缺乏一个完善的机制，这种效应是由于这两种疗法之间的协同活动。这种结合导致了改善的抗癌活性。放疗诱导的细胞修饰可以增加病毒在肿瘤中复制和传播的能力。Pokrovska等人证明，当OV与放疗结合时，通过增加病毒产生诱导了肿瘤特异性细胞毒性。在一项I期试验中，一种突变的HSV（G207）与复发性恶性胶质瘤的放疗结合，显示出临床反应的潜力。在这项研究中，9名患者中有6名显示出部分反应或稳定疾病，这被证明具有协同效应。另一种方法是，病毒治疗可以增加肿瘤对放疗的敏感性。表达p53的Ad诱导感染的p53缺陷肿瘤细胞对辐射诱导的凋亡更敏感，随后比未从放疗中受益的肿瘤细胞的凋亡减少，导致更大的肿瘤抑制。 5.2.3.OVs与免疫治疗的结合 尽管文献中关于免疫治疗和病毒治疗的结合的报告很少，但将针对PD-1和/或细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）的免疫检查点抑制剂与OV结合在癌症治疗中提供了新的视角，特别是在具有免疫抑制微环境的癌症中，其中PD-1/PD-L1抑制剂的单一疗法可能变得无效。这种疗法的溶瘤活性决定了细胞因子和其他分子的释放，这些分子具有将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的效果，这种修改可以改善免疫治疗对易感目标的效果。除了PD-1，一些也表达在TIL上的免疫检查点分子也被证明可以诱导免疫抑制微环境并减少活化的CD8+细胞。这一类包括CTLA-4、TIGIT、TIM-3和LAG-3。OVH-aMPD-1与抗TIGIT协同作用，并在MC38和Hepa 1-6肿瘤模型中显著改善免疫反应。然而，在难治性肺癌中，vvDD单一疗法与抗PD-1和抗TIM-3 mAbs的结合未能显示出治疗优势。重要的是，将超过两种ICIs作为治疗策略结合使用可以产生更好的抗肿瘤结果。T-VEC是一种瘤内疗法，是免疫疗法的领先组合。GM-CSF在这种结合中的作用是增强细胞免疫。T-VEC的作用来自于病毒载体的直接溶瘤效应和免疫反应触发的结合。在将T-VEC与抗CTLA4，ipilimumab联合用于治疗IIIB-IV期黑色素瘤的I期试验中，观察到了客观和持久的反应率的有希望的结果。此外，在一项开放标签的II期试验中，无论是原发性还是转移性肿瘤，与ipilimumab单一疗法相比，T-VEC与ipilimumab联合使用的目标反应率显著增加。在T-VEC与ipilimumab与ipilimumab单独用于晚期黑色素瘤的II期试验中，在5年分析中，联合治疗的中位PFS为13.5个月，ipilimumab为6.4个月，估计的5年OS在联合治疗组为54.7%，ipilimumab组为48.4%（NCT01740297）。Pexastimogene Devacirepvec（Pexa-VEC）是一种溶瘤牛痘病毒，与抗PD-1抑制剂，cepilimumab联合在肾肿瘤患者中在Ib期试验中显示出令人鼓舞的结果。这种联合疗法报告了37.5%的总体反应。腺病毒DNX-2401是一种OV，在接受恶性胶质瘤诊断的患者中进行了剂量递增研究。在那项研究中，单剂量的DNX-2401，瘤内给药，获得了不同的肿瘤反应。目前，这种OV正在与pembrolizumab联合用于胶质母细胞瘤患者的II期试验中进行研究。中期分析显示，48名接受联合治疗的患者中位总生存期为12个月，反应率为47%。将抗PD1/PD-L1与抗CTLA4和OV结合使用的三重疗法的想法最近变得非常吸引人，在其中一项研究中，Ad与抗PD-L1和抗CTLA4的结合在TNBC正位小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长并延长了存活。通过增加CD8+ T和T记忆细胞的比例以及耗尽Tregs和极化为M1表型的肿瘤相关巨噬细胞，增强了抗肿瘤效应的协同增加，调节了TME。这种联合疗法具有很大的潜力，代表了一种有前景的治疗策略，用于改善癌症细胞治疗，应该很快就会可用。考虑到安全性、毒性剖面和有希望的结果，越来越多的ICIs和OVs正在进入临床试验。 5.2.4.激酶抑制剂的作用 药物病毒方法是用来克服对OVs的耐药性的策略之一，它将病毒治疗与针对激酶的分子治疗相结合。在临床前模型中，已经获得了重要的协同结果，明显的表现是在肿瘤组织中OVs的复制和传播显著增加。受体酪氨酸激酶（RTKs），位于细胞表面，控制大多数情况下介导细胞生长和存活的细胞内反应。一些途径，如MAPK级联或PI3K/Akt/mTOR途径，通过受体特异性配体结合在下游激活。RTKs的超激活导致细胞生长不受控制，是一个重要的药物靶标。最近，病毒治疗与RTK抑制剂的结合已经取得了一些有吸引力的效果。肿瘤间质液压力（IFP）高是有效药物递送的障碍，被认为通过阻碍病毒在整个肿瘤微环境中的接触和侵入，限制了OVs的临床效益。肿瘤组织中IFP增加的原因尚有争议。一个被认为对此有贡献的机制是异常的VEGF介导的血管化增强。Kottke等人指出，当将VEGF配体VEGF165与oReoV结合时，OV给药前给予VEGF165可以改变肿瘤血管并改善OV递送到肿瘤组织。两种酪氨酸激酶抑制剂，厄洛替尼和阿西替尼，与oHSV1结合，通过抑制oHSV1血管生成刺激病毒递送，并被报告影响小鼠胰腺肿瘤的肿瘤生长和血管生成。总的来说，这些观察结果证实了与不同的激酶抑制剂结合治疗的合理性，在临床前研究中取得了有希望的结果。此外，临床前研究的结果与药物病毒结合使用OVs与这些分子可以刺激病毒治疗在癌细胞中溶瘤效力的观点一致。 5.2.5.与细胞治疗的结合 嵌合抗原受体（CAR）-T疗法是治疗癌症的一种新颖且有前景的治疗方法，产生了有效和持久的临床反应。合成受体主要重新定向T细胞，消除表达特定靶标抗原的细胞。2017年，FDA批准了针对B细胞恶性肿瘤的抗CD19 CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法存在一些限制，包括主要毒性，限制了其对实体瘤的疗效，抗原逃逸，持久性有限，以及肿瘤渗透性差。这些都导致了新的方法，在这些方法中，CAR-T疗法与其他抗癌治疗相结合，以提高抗肿瘤效力并减少毒性。抗CD19 CAR-T细胞疗法彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗。一些研究表明，CD-19在多种OV感染的肿瘤细胞类型表面表达，携带CD19-T编码基因（OV19T）。因此，CD-19刺激CAR-T细胞并触发肿瘤溶解，刺激来自死亡肿瘤细胞的OV19T的释放，可以激活内源性抗肿瘤免疫。此外，病毒治疗可以与免疫治疗和CAR-T细胞同时结合，增加TME中的免疫细胞数量并改善抗肿瘤反应。例如，可以同时给予表达IL12的Ad和全身HER-2和PD-L1阻断抗体。在临床前肿瘤模型中，这种结合显示出增强或协同效应。此外，抗CTLA4、病毒治疗、抗PD-(L)1抗体和新兴ICI抗体给药的时间是另一个需要进一步观察的重要领域。为了提高疗效并改善肿瘤反应性，需要系统探索免疫治疗在OVs和CAR-T细胞之前、之后和同时给药的效果。 6.结论及展望  溶瘤病毒在破坏肿瘤细胞方面的优势源于其本身的品质，包括直接细胞溶解、针对免疫系统、调节TME和直接特性，如调节肿瘤细胞中的特定途径、抗血管生成作用和调节肿瘤细胞代谢。基因工程在增强细胞溶解作用和肿瘤细胞攻击的多样性方面提供了巨大的优势。将病毒运送到肿瘤细胞的方法仍然是一个挑战，有多种可能性获得表现出更有效作用的OVs。在过去的几年中，许多研究已经使用非生物或生物纳米载体将OVs运送到肿瘤细胞中，并显示出有希望的结果。OVs作为单一药物疗法或与其他治疗策略结合在临床前和临床研究中都已得到证明。OVs具有抗肿瘤潜力；然而，作为一类新的抗癌治疗，它们的发展仍然存在一些特定的障碍。导致溶瘤病毒治疗失败的障碍包括OVs渗透和扩散不足、宿主抗病毒免疫、患者之间的个体差异、溶瘤病毒与病毒耐药或病毒敏感肿瘤细胞的相互作用，以及作为单一药物使用时的低或中等效力。单一OV给药的效力低是因为宿主免疫系统可能将其从血流中清除，病毒可能只在短时间内表达转基因，或者病毒传播可能受到限制。已经在用oHSV或oAds治疗的小鼠中进行了研究，在这些小鼠中，病毒颗粒被迅速清除。此外，oAds在目标组织中的效力有限且持久性低。为了克服这些限制，溶瘤病毒治疗可以与其他抗癌治疗结合使用，如化疗、放疗、靶向治疗或免疫治疗。治疗效果与宿主的抗病毒反应和OV诱导的抗肿瘤免疫之间的平衡有关；然而，影响这种平衡的生物学机制仍然不清楚。各种类型的肿瘤和癌症的不同阶段在选择OVs、运输方式及其与各种系统治疗的结合方面仍然具有挑战性。

02月26日的《热心肠日报》，我们解读了 15 篇文献，关注：机器学习，大肠癌，预后，癌症筛查，药物研发，治疗靶点，肺腺癌，模拟禁食饮食，迈威生物，JUZTLAB草本未来，Leucine Rich Bio，北极星药业，赛诺菲。 ​​ 该篇日报由R·AI辅助创作生成，人工审核校对。 AI提升结肠癌化疗用药准确性 Journal of Clinical Oncology——[45.3] ① 匹兹堡大学鲁兴华和孙旻教授与团队训练了一个名为COLOXIS的AI模型，用来预测结肠癌患者对奥沙利铂的反应；② 在1065名患者中，有526名被预测为COLOXIS+（奥沙利铂响应者），而539名被预测为COLOXIS-（非响应者），COLOXIS+组的病人显著受益于奥沙利铂，而COLOXIS-组的病人则不受益；③ 建议在结直肠癌辅助治疗中仅对COLOXIS+患者使用奥沙利铂，但需要进一步验证；④ COLOXIS可以让约半数接受辅助治疗的结肠癌患者避免不必要的奥沙利铂诱发的毒副作用，并大幅度提高总体获益风险比；⑤ COLOXIS是目前唯一用逾一千病人的大规模的临床试验数据证明化疗药物疗效可以用AI的方法来推算的模型，证实了用AI指导化疗药物的可行性。 【原文信息】 Machine Learning Predicts Oxaliplatin Benefit in Early Colon Cancer 2024-02-05 , doi: 10.1200/JCO.23.01080 Lancet子刊：多靶点粪便免疫化学检测改善结直肠癌筛查效果 The Lancet Oncology——[51.1] ① 这项研究显示相较于传统粪便免疫化学试验（FIT），多靶点粪便免疫化学试验（mtFIT）在检测高级别前癌病变方面具有更高的灵敏度；② 在结直肠癌筛查项目中，15283人提交了同一次排便收集的FIT和mtFIT样本，FIT的阳性率和高级别腺癌检出率分别是4.08%和1.21%，而mtFIT分别是9.11%和2.27%；③ mtFIT和FIT对结直肠癌、高危腺瘤、晚期锯齿状息肉的检出率分别0.20% vs 0.17%、1.64% vs 0.86%、0.43% vs 0.17%；④ 建模显示，基于mtFIT的筛查可将结直肠癌发病率降低21%，并将相关死亡率降低18%，与当前的荷兰结直肠癌筛查计划相比，成本可行；⑤ 在相同的阳性率下，mtFIT在诊断产出方面优于FIT；⑥ 在同样低的阳性率下，基于mtFIT的筛查将使结直肠癌发病率进一步降低5%，相关死亡率降低4%。 【原文信息】 The multitarget faecal immunochemical test for improving stool-based colorectal cancer screening programmes: a Dutch population-based, paired-design, intervention study 2024-02-09 , doi: 10.1016/S1470-2045(23)00651-4 Lancet子刊：CD8+细胞和FoxP3+细胞预测结直肠癌患者预后 The Lancet Oncology——[51.1] ① 本研究通过对SCOT和QUASAR 2临床试验中II-III期结直肠癌患者肿瘤样本进行多重免疫荧光染色分析，发现综合评估上皮内CD8（CD8IE）和基质内FoxP3（FoxP3IS）细胞的密度能更精准地进行风险分层；② 在SCOT试验中，CD8IE和FoxP3IS作为连续变量显示出强烈的预后价值，而且与单独标记相比，CD8IE-FoxP3IS复合标记在作为连续变量和分为低、中、高密度组时表现更优越；③ 在QUASAR 2试验中，CD8IE-FoxP3IS的预后价值得到验证，尤其是在将其作为连续变量以及作为低密度与高密度的分类变量；④ CD8IE和FoxP3IS的联合评估有助于在结直肠癌中进行更精细的风险分层，同时也提示了将FoxP3IS细胞作为免疫治疗靶点的可能性。 【原文信息】 Multiplex analysis of intratumoural immune infiltrate and prognosis in patients with stage II-III colorectal cancer from the SCOT and QUASAR 2 trials: a retrospective analysis 2024-02-01 , doi: 10.1016/S1470-2045(23)00560-0 Nature子刊：基于通路进行结直肠癌分型，揭示出缓慢增殖的生物学表型与较差的临床预后相关 Nature Genetics——[30.8] ① 本研究基于基因本体（GO分析）和生物激活状态信息对结直肠癌（CRC）进行分类，揭示了结直肠癌中与较差临床结果相关的缓慢增殖的生物表型；② 定义出三种亚型（PDS），PDS1肿瘤——经典/LGR5+干细胞丰富、高增殖并显示良好预后，PDS2肿瘤——再生/ANXA1+干细胞丰富，具有升高的基质和免疫肿瘤微环境谱系和PDS3肿瘤——CMS2中先前被忽视的缓慢增殖的肿瘤亚组，其干细胞数量减少，分化谱系增加，特别是肠细胞和肠内分泌细胞，然而在局部晚期疾病中显示出最差的预后；③ PDS3的表型特征在多个批量和单细胞数据集中均有体现，标志着一系列在临床前模型中尚未充分代表的生物状态，且不能使用现有的亚型分类器进行识别；④ 这些发现强调了使用通路级别信息进行分子分型的重要性，为结直肠癌的个性化治疗提供了新的视角。 【原文信息】 Pathway level subtyping identifies a slow-cycling biological phenotype associated with poor clinical outcomes in colorectal cancer 2024-02-13 , doi: 10.1038/s41588-024-01654-5 Nature子刊：多巴胺转运体拮抗剂vanoxerine或可治疗结肠肿瘤 Nature Cancer——[22.7] ① 本研究发现多巴胺转运体（DAT）拮抗剂vanoxerine通过抑制G9a表达，有效阻断结肠癌干细胞（CSCs）的功能，为治疗结肠肿瘤提供了新策略；② 通过基于干细胞的表型药物筛选，确定vanoxerine能特异性降低G9a表达；③ 基因沉默和化学拮抗DAT通过抑制G9a表达以阻碍结肠CSC的功能；④ 拮抗DAT还通过激活内源性转座元件和I型干扰素反应，增强肿瘤淋巴细胞浸润，从而改善抗肿瘤免疫应答；⑤ 本研究揭示了DAT-G9a轴直接参与CSCs的维持，并提出了一种改善结肠肿瘤抗肿瘤免疫应答的新策略。 【原文信息】 The dopamine transporter antagonist vanoxerine inhibits G9a and suppresses cancer stem cell functions in colon tumors 2024-02-13 , doi: 10.1038/s43018-024-00727-y 国内团队：脂质纳米粒子传递IFNβ编码质粒，增强结肠癌抗肿瘤免疫 ACS Nano——[17.1] ① 天津大学吕春婉团队发现通过阳离子脂质纳米粒子传递干扰素β（IFNβ）编码质粒，能有效恢复结肠癌中IFNβ的表达，增强抗肿瘤免疫；② IFN-I通过激活Cxcl9和Cxcl10的表达，增强T细胞对肿瘤的浸润；③ 在结肠肿瘤组织中，通过强制表达IFNα13和IFNβ可提高MHC I的表达并抑制肿瘤生长；④ IFNβ表达与患者HLA的表达、与患者对PD-1阻断免疫疗法反应相关的IFN-I信号激活正相关；⑤ 通过1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）-胆固醇包裹的IFNβ编码质粒（IFNBCOL01）治疗，可激活MHC I和颗粒酶B的表达，抑制小鼠中的结肠肿瘤生长。 【原文信息】 Delivery of Interferon β-Encoding Plasmid via Lipid Nanoparticle Restores Interferon β Expression to Enhance Antitumor Immunity in Colon Cancer 2024-02-06 , doi: 10.1021/acsnano.3c10972 Nature子刊：卡博替尼与杜瓦伦单抗联用或可治疗化疗难治性结直肠癌 Nature Communications——[16.6] ① CAMILLA CRC队列的II期试验结果显示，卡博替尼与杜瓦伦单抗联合治疗化疗耐药的结直肠癌（CRC）患者表现出了抗肿瘤活性和可管理的毒性；② 29名可评估患者中，100%的患者确诊为pMMR/MSS型肿瘤，客观缓解率（ORR）为27.6%，4个月无进展生存率（PFS）为44.83%，中位总生存期（OS）为9.1个月，39%的患者发生≥3级治疗相关副作用；③ 对于RAS野生型肿瘤患者，客观缓解率提高到50%，中位PFS和OS分别为6.3个月和21.5个月；④ 治疗前进行肿瘤空间转录组分析，发现在反应者与非反应者中，VEGF和MET信号通路上调、细胞外基质活性增加以及抗肿瘤免疫反应与免疫抑制特征（如T细胞迁移障碍）共存；⑤ 此项临床试验的结果支持STELLAR-303三期试验的启动。 【原文信息】 Clinical and biomarker results from a phase II trial of combined cabozantinib and durvalumab in patients with chemotherapy-refractory colorectal cancer (CRC): CAMILLA CRC cohort 2024-02-20 , doi: 10.1038/s41467-024-45960-2 浙大Cell子刊：巨噬细胞导向模块可作为大肠癌潜在治疗靶点 Cell Reports Medicine——[14.3] ① 浙江大学的赵鹏、阮健、盛剑鹏及包暄文作为共同通讯在Cell Reports Medicine发表最新研究，通过多组学分析辅以深度学习模型，在结直肠癌（CRC）中鉴定出一个以巨噬细胞为中心的模块；② 该CRC免疫模块（CCIM）包括FOLR2+巨噬细胞、耗竭的CD8+ T细胞、耐受的CD8+ T细胞、耗竭的CD4+ T细胞和调节性T细胞等；③ 通过多重免疫组化技术描绘了CCIM，并利用深度学习技术建立了空间交互图以预测化疗反应；④ CCIM-Net展示出良好的化疗反应预测性能，并且通过靶向FOLR2+巨噬细胞的治疗手段在体内打破了免疫抑制的CCIM，增强了化疗反应。 【原文信息】 A multiomics analysis-assisted deep learning model identifies a macrophage-oriented module as a potential therapeutic target in colorectal cancer 2024-01-30 , doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101399 郑心+黄适等：肠道菌群可介导肺腺癌治疗疗效 Experimental Hematology and Oncology——[10.9] ① 哈佛医学院Zheng Sun、青岛市中医特色卫生院郑心、香港大学黄适与团队发表研究，对携带PC-9肿瘤的小鼠进行不同治疗的肠道菌群变化纵向研究；② 与吉非替尼单独治疗相比，联合使用益生菌或中药的治疗方案能更有效地减小肿瘤体积、改善体重和肿瘤标志物测试结果，而使用抗生素可抑制吉非替尼的抗肿瘤效果；③ 肠道菌群的时间变化与不同治疗强相关；④ 无论何种治疗，13种介质（扩增子序列变体，ASVs）调节吉非替尼的抗肿瘤效果，即肠道菌群与吉非替尼治疗效果之间存在因果关系；⑤ 本研究揭示了肠道菌群在提高肺腺癌靶向治疗（吉非替尼治疗）效果中的重要作用，为抗肿瘤药物开发提供了新策略。 【原文信息】 Revealing the role of the gut microbiota in enhancing targeted therapy efficacy for lung adenocarcinoma 2024-02-09 , doi: 10.1186/s40164-024-00478-7 模拟禁食饮食辅助治疗慢性淋巴细胞白血病 Cancer Research——[11.2] ① 周期性模拟禁食饮食（FMD）是一种在实体恶性肿瘤模型中具有强大抗肿瘤活性的实验性营养干预措，这项研究发现FMD联合蛋白酶体抑制剂和抗CD20抗体对慢性淋巴细胞白血病（CLL）具有显著的治疗效果，延缓CLL的进展并显著延长小鼠的生存期；② 2名CLL患者接受FMD，可逆地减少外周血淋巴细胞的数量；③ 小鼠CLL模型中，禁食模拟条件显示轻微的细胞毒性作用，导致胰岛素和IGF-1降低介导的凋亡激活；④ CLL细胞中，禁食促进蛋白酶体活性的增加，添加蛋白酶体抑制剂硼替佐米（BTZ）可显著增强饥饿条件的促凋亡效果；⑤ CLL模型中，FMD/BTZ/利妥昔单抗（RTX，anti-CD20）联用延缓CLL的进展，并显著延长小鼠的存活时间；⑥ 蛋白酶体抑制剂与FMD相结合促进CLL死亡，这为以饥饿逃逸途径为靶点的治疗策略提供新的思路。 【原文信息】 Cyclic fasting-mimicking diet plus bortezomib and rituximab is an effective treatment for chronic lymphocytic leukemia 2024-01-19 , doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-0295 迈威生物Nectin-4 ADC新药获FDA快速通道认定 ① 2月25日，迈威生物宣布其自主研发的靶向Nectin-4 ADC创新药（9MW2821）获FDA快速通道认定，用于治疗晚期、复发或转移性食管鳞癌（ESCC）；② 9MW2821为靶向Nectin-4的定点偶联ADC新药，是国内企业同靶点药物中首个开展临床试验的品种；③ 截至2024年2月20日，在2期临床试验1.25mg/kg剂量组下中，9MW2821单药治疗并完成至少一次肿评的30例晚期食管癌患者的ORR和DCR分别为30%和73.3%；④ 9MW2821是全球首款针对食管癌适应症披露临床有效性数据的靶向Nectin-4治疗药物。 【原文信息】 迈威生物Nectin-4 ADC新药获FDA快速通道认定 2024-02-25 , 医药魔方Info 药食同源品牌JUZTLAB获若羽臣千万级融资 ① 近日，JUZTLAB草本未来获得若羽臣千万元天使轮融资；② 资金将主要用于供应链布局及团队建设；③ JUZTLAB草本未来是基于中医药食同源的高附加值健康养生品牌，以中医草本为核⼼，针对25-34岁年轻人群的生活场景提供养生产品解决方案；④ 品牌由康奈尔大学团队成立于2021年末，携手浙江大学茶叶研究所和浙江中医药大学，致力于发扬中国传统古方；⑤ JUZTLAB草本未来种子轮由小一创投独家投资，当前已建立起多元销售网络，在上线不到一年时间内，销售额突破千万。 【原文信息】 加码大健康赛道，“新中式”养生品牌JUZTLAB获若羽臣千万级融资 2024-02-23 , FoodTalks Leucine Rich Bio公司公布旗下个性化营养试剂盒BugSpeaks临床积极数据 ① 2月23日，Leucine Rich Bio公司宣布，其微生物组分析试剂盒BugSpeaks在临床试验中取得显著成效，能够有效改善糖尿病患者的血糖、炎症标志物和血压参数；② BugSpeaks是一种肠道微生物组分析试剂盒，可根据个体肠道微生物组提供营养建议；③ 该临床试验招募了42-65岁、患有高血糖和高胆固醇的印度成年男女；④ 受试者被随机分为两组，一组接受基于BugSpeaks的个性化饮食，另一组接受常规饮食，为期3个月；⑤ 结果显示，接受BugSpeaks个性化饮食的患者在研究的第90天显示出优异的结果，受试者的HbA1c水平从8.30降至6.67，收缩压降低了14%，炎症标志物CRP降低了20%。 【原文信息】 Leucine Rich Bio announces clinical trial results of microbiome profiling kit on diabetes patients 2024-02-23 , Pharmabiz 强攻减肥药，北极星药业斥资6.7亿元扩厂 ① 2月25日，北极星药业-KY宣布，通过子公司北极星生医以6.7亿元购得约8000平方米的中国台湾竹南厂房，计划改建为GLP-1多肽药物生产基地；② 该厂房预计今年第4季投产，未来可建设三条生产线，年产5亿剂GLP-1多肽药物；③ GLP-1多肽药物主要用于调节2型糖尿病患者血糖，同时具有减重效果；④ 北极星药业锁定的市场包括东南亚、俄罗斯、中东及非洲等国家；⑤ 此外，北极星药业计划在大陆再投资近10亿元扩产，加强其在癌症代谢疗法新药和多肽药物领域的发展。 【原文信息】 强攻减肥药！北极星药业扩厂 2024-02-25 , GLP减重宝典 赛诺菲消费者保健业务或被收购，金额高达200亿美元 ① 近日，据彭博社报道，安宏资本和黑石集团考虑以高达200亿美元收购赛诺菲消费者保健业务；② 贝恩资本、CVC Capital Partners、殷拓和KKR & Co也对收购感兴趣；③ 赛诺菲自2019年12月起，计划分拆消费者保健业务，以专注于原研药和疫苗开发；④ 2023年，赛诺菲消费者保健业务收入增长至51.8亿欧元；⑤ 大型制药公司近年来趋向于剥离消费者保健业务，聚焦创新药物开发。 【原文信息】 赛诺菲消费者保健业务或被收购，金额高达200亿美元 2024-02-21 , 医药魔方 感谢本期日报的审核者：RZN，章台柳，圆圈儿，九卿臣，617 点击阅读过去10天的日报： 0225 | 65分综述详解：超加工食品和食品添加剂如何影响肠道健康？ 0224 | 陈思凡等Cell子刊新发现：促血栓的新型肠菌代谢物 0223 | 膳食纤维怎样影响代谢健康？18页综述一文讲透 0222 | 65分综述详解跨越菌群-肠-脑轴的"通讯之门" 0221 | Cell子刊新发现：肠菌藏身"安全屋"躲避抗生素 0220 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