VEGF x c-Kit

摘要：基因治疗的关键挑战在于传递基因编辑剂。与DNA相比，虽然RNA的稳定性较差且更容易降解，但它的好处是较低的脱靶效应，因为不涉及永久性插入。这篇综述聚焦于基于mRNA的基因编辑剂传递，突出了新型mRNA传递系统。为了提供背景，比较了三种主要的基因编辑剂：可编程核酸酶、碱基编辑器和引导编辑器。这篇综述还讨论了Casπ和转座子的潜力。此外，提供了mRNA基于体内传递的四个主要障碍的总结。此外，这篇综述详细介绍了不同的传递系统，包括病毒性（慢病毒）和非病毒载体（通过输卵管核酸传递、脂质纳米颗粒、基于聚合物的纳米颗粒、病毒样颗粒、细胞外囊泡和迁移体）。通过比较每种传递策略的优缺点，提供了一个全面和客观的传递系统概述。此外，我们强调了蛋白质冠层作为纳米传递的关键调节器的至关重要的作用。最终，我们总结了基于mRNA的基因编辑策略的挑战（RNA稳定性、靶向性、潜在的免疫原性、细胞毒性、异质性和合理设计）。这篇综述的目的是指导进一步的研究，并在这个有前途的领域提供对基于mRNA的体内基因编辑剂传递的全面分析。 1.引言 数十年来，全球有大量人因遗传病而受苦，几乎找不到出路。在三级护理中心住院的儿童中，近34.4%的死亡可以归因于先天性异常。得益于人类基因组计划的成就以及分子生物学、生物信息学和生物技术的相关进展，我们现在可以检测、预防甚至消除一些遗传病，如血友病。然而，基因治疗的临床应用案例仍然很少。开发更好的基因编辑剂和传递系统一直是基因治疗的两个关键问题。许多科学家致力于创造新的基因编辑剂或建立先进的传递系统。 基因编辑技术的出现为生物和医学科学领域开辟了一个全新的前沿。其核心是一系列技术，允许科学家修改一个生物体的DNA，包括可编程核酸酶、碱基编辑器和引导编辑器。通常，基因编辑始于在DNA分子中引入双链断裂（DSB），这可以自然发生或由核酸酶催化。当DSB形成时，它将主要通过非同源末端连接（NHEJ）或微同源介导的末端连接（MMEJ）进行修复，这两种方式都可能导致不可控的DNA修改。另一种修复DSB的方式是通过同源定向修复（HDR），它提供了更好控制的DNA修改。然而，HDR在基因组中的DNA修改事件的频率，特别是在非分裂细胞中，太低而无法得到很好的利用，这促进了上述基因编辑技术的发展。可编程核酸酶，包括巨型核酸酶、锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子效应器核酸酶（TALENs），对靶向基因编辑做出了重大贡献。然而，基于其基于蛋白质的DNA识别，设计针对特定基因组位点的核酸酶是艰巨和耗时的。直到2012年，Doudna和Charpentier展示了如何利用CRISPR/Cas9（成簇的规律间隔短回文重复序列/Cas9）系统进行精确的基因编辑。CRISPR/Cas9系统基本上是一个核酸酶加上一个导向RNA，可以靶向特定的DNA位点。由于它使用RNA进行靶向，定制起来会更容易。CRISPR/Cas9系统对基因编辑产生了革命性的影响，进一步推动了像碱基编辑器（BEs）和引导编辑器（PEs）这样的高级基因编辑剂的进展。其他自然编辑系统，如Casπ、转座子和逆转录转座子，也有很大的潜力成为下一代基因编辑工具。 基因编辑剂不能独自完成整个基因治疗过程；它们需要一个建立良好的传递系统的帮助，无论是体外还是体内。一个合适的传递系统应该将基因编辑剂包装起来，以避免恶劣的环境并克服不同的障碍，以到达目标。大多数当前的基因编辑临床试验都是基于体外传递，在这种方法中，细胞从生物体中移除，在实验室环境中进行基因修饰，然后重新引入生物体。这种方法允许精确控制编辑过程，因为它发生在体外。这对于影响特定细胞类型的疾病有益，例如造血干细胞（HSCs）。然而，这种方法可能复杂且耗时，确保重新引入后编辑的细胞正确运作可能是具有挑战性的。相比之下，体内传递可以更方便地进行，因为遗传修饰是直接在生物体内进行的，显示出治疗更广泛疾病，特别是一些系统性疾病的潜力。然而，直接在生物体内的编辑也意味着要克服体内装备的障碍，例如免疫系统，这对安全有效地将基因编辑剂传递到目标细胞提出了重大挑战。 体内传递基因编辑剂有多种策略。由于大多数基因编辑剂可以被视为核酸酶或核酸酶-RNA复合物，人们可以选择以蛋白质、DNA或mRNA的形式传递核酸酶，并在需要时以DNA或RNA的形式传递导向RNA（图1）。这里，基于mRNA的传递指的是传递核酸酶mRNA和必要时的导向RNA，无论是在同一包裹还是不同包裹中。直接将蛋白质引入细胞可能会触发不想要的免疫反应，包括特异性和非特异性。除此之外，以蛋白质形式传递核酸酶比以核酸形式传递效率更低、成本更高，且没有细胞内放大。纯化蛋白质的挑战性工作也阻碍了其发展。与基于DNA的策略不同，基于mRNA的传递显示出更弱的脱靶效应，并避免了更多错误，因为它导致短暂表达。由于mRNA在细胞质中翻译，因此无需将其传递到细胞核，这节省了大量努力。 图1 每种基因编辑剂的不同传递策略。(a) ZFN可以通过DNA质粒、mRNA和蛋白质进行传递。(b) 与ZFN类似，TALEN可以通过DNA质粒、mRNA和蛋白质进行传递。(c) 在CRISPR/Cas9系统的分离传递策略中，sgRNA和Cas9是分别传递的。(d) 在CRISPR/Cas9的一体化传递策略中，sgRNA和Cas9在单个载体中传递。图表由Figdraw绘制。 近年来，病毒载体和非病毒载体都得到了很好的发展。病毒载体，包括腺相关病毒、慢病毒和腺病毒，自然进化以克服体内传递的障碍，并将核酸货物传递到许多细胞类型。然而，货物的大小和类型受到病毒的大小和类型的严格限制，因此限制了其在基于mRNA传递中的应用。非病毒传递可以分为物理传递和化学传递，两者都可以克服大小和类型限制。物理传递，使用微注射、电穿孔和水动力注射方法，主要用于体外基因编辑，几乎不能应用于体内DNA修饰。化学传递涉及合成载体，如脂质纳米颗粒（LNPs）、基于聚合物的纳米颗粒和病毒样颗粒（VLPs），包括最近开发的用于细胞传递的选择性内源性包装（SEND）和细胞外囊泡。此外，微针和迁移体是两个有前景的载体。这些载体在某些情况下显示出比病毒载体更高的效率，并表现出更低的免疫原性。然而，这些载体的稳定性和靶向性仍然需要巨大的努力。纳米传递的一个关键调节器是蛋白质冠层，已被证实影响NPs的不同属性，包括颗粒稳定性、生物相容性、细胞摄取和循环寿命。 这篇综述全面检查了三种不同的用于治疗性体内基因编辑的基因编辑剂。它提供了与基于mRNA传递相关的优缺点的比较分析。它还阐明了在体内将基因编辑剂引入细胞时遇到的四个主要障碍。随后，重点转向当前基于mRNA传递核酸酶的方法，包括病毒和非病毒载体，并对其优缺点进行了彻底评估。此外，综述深入探讨了基于mRNA的体内基因编辑剂传递的潜在进展。在本文中，提出了基因编辑和mRNA传递的潜在工具，同时提出了重大挑战和解决方案，希望能够作为这一领域进一步发展的指南。 2.有前景的基因编辑剂 2.1 核酸酶 至今，核酸酶已经成为基因编辑中使用最广泛的剂。传统的核酸酶包括ZFN和TALEN，它们是首次用于哺乳动物细胞基因编辑的酶。这些核酸酶是简单的蛋白质，具有DNA结合域（ZFP/TALE）和DNA切割域（Fok I），能够执行精确高效的基因编辑（图2）。然而，由于它们依赖于蛋白质和核苷酸之间的分子间力进行靶向编辑，因此很难进行合理设计以编辑任何所需的序列。 图2 不同基因编辑剂的总结和比较。表达盒反映了装载能力。不同的代理有不同的目标识别机制，导致专业设计的不同过程。编辑能力也各不相同，因此它们有不同的应用。提到的所有五种代理都面临需要解决的问题，新型基因编辑剂仍然非常需要。图表由Figdraw绘制。 相比之下，CRISPR/Cas系统是一个简单的RNA-蛋白质复合物，可以根据DNA-RNA识别实现靶向编辑。自从Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna揭示了它们的功能机制以来，这种细菌的特定免疫系统已经吸引了大量关注。设计一个RNA来靶向一个DNA位点比设计具有相同功能的蛋白质要容易得多，这是CRISPR/Cas系统的最大优势。CRISPR/Cas系统中一个强大的系统是CRISPR/Cas9系统，其效应域源自化脓性链球菌（SpCas9），这是一个大型核酸酶，质粒的总大小通常超过7 kb，包括表达盒（> 4 kb）、质粒骨架和其他表达辅助元素。第一个基于CRISPR/Cas9治疗镰状细胞病（SCD）的药物在2023年底获得FDA批准，标志着临床基因编辑的新阶段。 尽管上述CRISPR/Cas9系统的所有优势，该系统的局限性也已被揭示。可能的脱靶效应和使用HDR进行基因组编辑的低效率以及传递的困难都阻碍了它在临床应用中的广泛使用。传递CRISPR/Cas系统是具有挑战性的，不仅因为其大型表达盒，而且还因为sgRNA的额外传递。从内体释放后，sgRNA必须得到很好的保护，直到Cas9蛋白转录完成，这通常需要几个小时。对于上述三种核酸酶编辑方法，引入DNA中的DSB是必要的，但可能会产生不想要的结果，如大片段缺失、染色体易位和其他染色体异常。尽管共传递模板DNA可以大大提高编辑效率，但额外传递模板DNA也带来了进一步的问题，因为它不能以mRNA的形式包装。仍然需要新的基因编辑剂。 2.2 碱基编辑器 与核酸酶类似，碱基编辑器主要由DNA结合域和功能域组成。DNA结合域通常是失活的Cas9蛋白，可以在携带单导向RNA时识别并结合目标DNA位点，但不能切割DNA。与核酸酶不同，碱基编辑器中的功能组是DNA修饰酶，可以在不产生双链断裂(DSBs)的情况下化学诱导精确的单核苷酸变异。BEs的表达盒与导向RNA一起大约是6 kb。在两种发展成熟的碱基编辑器中，胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)使用胞嘧啶脱氨酶作为功能域，催化C-U转换，导致C,G到T,A的转换。CBEs的选择性取决于尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGIs)。UGIs通常与核酸酶融合，并阻碍尿嘧啶的糖苷化，从而保护它不被细胞的修复机制移除。否则，碱基编辑的结果通常是C,G到G,C的转换，而不是C,G到T,A的转换，这也可以用来诱导C,G到G,C碱基编辑器(CGBEs)。同样，ABEs携带实验室进化的脱氧腺苷脱氨酶进行A,T到G,C的转换，因为从未发现过催化脱氧腺苷脱氨的天然酶。ABEs的价值在于它们能够逆转最常见的病理点突变(C,G到T,A)。这种突变占所有记录的病理单核苷酸多态性的大约一半，突显了ABEs的重要性。目前，ABEs是最先进的碱基编辑器，有许多成功的传递和编辑报道。相反，CBEs的传递面临着UGIs融合的挑战。UGIs的浓度必须达到阈值才能发挥作用，而最佳浓度以及是否可以通过基于mRNA的体内传递实现仍然未知。尽管如此，也有报道成功通过基于mRNA的体内传递CBEs进行基因编辑。到目前为止，许多实验室报告开发了数百种具有不同特性的碱基编辑器，继最初的CBE和ABEs之后，扩大了BEs的价值。然而，当前的碱基编辑器仍然无法实现所有可能的核苷酸转换，也不能介导目标插入或删除。还有很长的路要走。 2.3 引导编辑器 与BEs类似，引导编辑器(PEs)也是从CRISPR/Cas9系统发展而来，由催化缺陷的Cas9核酸内切酶与逆转录酶融合，以及特别设计的引导编辑导向RNA(pegRNA)。PEs的表达盒比相应的BEs大约大1 kb，这意味着BEs和PEs都要求比SpCas9系统更大的传递载体，并面临与CRISPR/Cas系统相同的gRNA保护问题。然而，由于不需要DSBs，它们可以绕过引入模板DNA的问题。pegRNA不仅将引导编辑器导向目标DNA，还含有所需的编辑序列。Cas9在DNA分子的一个链上制造缺口（而不是产生DSB），导向RNA结合到另一个未切割链上的互补DNA序列。逆转录酶使用导向RNA作为模板合成包含所需编辑的新DNA链。然后细胞自身的修复机制用编辑过的序列替换原始DNA序列。通过在DNA的两条链上执行这一过程，PEs可以进行精确编辑，包括插入、删除和所有12种可能的碱基到碱基的转换，副产品更少。尽管如此，尽管已经有多个使用PEs进行体内基因编辑的报道例子，但需要更多的实验室实验和临床试验来证明这种新型基因编辑剂的安全性和效率。 2.4 基因治疗的其他潜在工具 当CRISPR/Cas系统应用于临床试验时，由于其在传递中更好的性能，较小表达盒的新系统更受青睐。Casπ由刘和他的同事发现，只有大约860个氨基酸，这比Cas9小得多，显示出最多一半的编辑效率。随着生物信息学的发展，寻找新的CRISPR类系统变得越来越高效。张和Koonin最近开发了基于快速局部敏感哈希的聚类(FLSHclust)算法来搜索新的CRISPR系统，识别出188个系统并对其中的4个进行了表征。 除了CRISPR/Cas系统，这个领域的另一个新星是转座子和逆转录转座子。这些普遍存在的跳跃元件通常被认为是由于它们在基因组上的复制和粘贴行为而成为基因组进化的重要驱动力。这一独特的特性也表明它们具有DNA切割和插入的潜力。在2023年，张和他的同事证明了R2非LTR逆转录转座子和真核转座子Fanzor作为新的基因编辑工具的潜力。刘实验室进一步证明了R2的RNA组分对顺序DNA切割的监督功能。值得注意的是，刘进一步比较了不同的逆转录转座子，并得出结论：“从原核生物到真核生物，逆转录转座子机械中的RNA组分的结构复杂性逐渐稀释，其催化活性和DNA识别功能在很大程度上被蛋白质酶所取代”。这一结论，结合Cas9可能起源于转座子的想法，表明以逆转录转座子形式存在的仅RNA基因编辑元素可能是可能的。就在最近，他们通过发现水解性核酸内切酶(HYER)，一种来自细菌逆转录转座子的基于RNA的核酸酶，完全自身执行目标基因编辑，证实了这一假设。因此，核酸酶正式加入了作为新兴明星的更好的核酸操作工具的竞争。 3 通过基于mRNA传递将基因编辑剂引入细胞的障碍 3.1 进入细胞前的隔离和降解环境 第一道障碍是mRNA进入细胞前严峻的隔离和降解环境（图3）。血液和细胞外液充满了不同的酶和与免疫相关的分子，这些都对基因编辑剂构成威胁。体内系统循环中的裸露蛋白的半衰期从几分钟到几小时不等，而裸露的pDNA的降解在几分钟内就会发生，mRNA在几秒内就会分解。由于裸露RNA的极端不稳定性，需要对基于mRNA的体内传递进行化学修饰。通过修改sgRNA的5'和3'端，包括2'-O-甲基(M)、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)和2'-O-甲基3'硫代PACE(MSP)，Hendel等人发现这些sgRNA的稳定性大大提高，使用编码Cas9的质粒/mRNA或Cas9蛋白的基因编辑效率得到改善。此外，为了保护其载体在进入细胞前免受降解或隔离，大多数强大的体内传递载体将mRNA包裹在蛋白质或脂质壳内，如病毒衣壳和合成纳米颗粒。然而，尽管被蛋白质或脂质载体从恶劣的化学环境中保护，它们仍然面临免疫系统问题。已经发现补体系统对某些载体构成威胁，载体的抗体识别也可能导致被巨噬细胞不当地清除。因此，开发能够承受恶劣环境且不具有免疫原性的先进传递系统至关重要。 图3 mRNA基因为基因编辑剂传递的四个主要障碍。(a) 障碍1：mRNA进入细胞前的隔离和降解环境。(b) 障碍2：精确靶向细胞。(c) 障碍3：跨膜运输。(d) 障碍4：从内体逃逸。(e) 可用于基因治疗的不同基因编辑剂。(f) 基因治疗的不同传递策略。图表由Figdraw绘制。 3.2 精确靶向细胞 第二道障碍在于精确传递到目标细胞和选择性编辑（图3）。基因编辑涉及修改细胞的DNA，这可能产生永久性的影响。因此，必须确保这些变化只发生在预期的细胞中，以避免脱靶效应，可能导致非目标细胞中不需要的遗传变异。通过将基因编辑剂定向到特定细胞，也可以提高治疗效果的效率。精确传递有助于最小化有效治疗所需的基因编辑剂的剂量，从而减少潜在的毒性和副作用，并节省时间和金钱。实现目标传递的常见方法包括使用特定的识别分子（主动靶向）或改变载体的组成、大小、形状和电荷（被动靶向）。例如，通常利用膜蛋白与相关抗体之间的特异性结合进行靶向。在LNP传递中，靶向传递尤为重要，因为这些脂质纳米颗粒自然倾向于聚集在肝脏。另一个关键问题是将基因编辑剂精确地传递到细胞的内在生物学障碍，如血脑屏障(BBB)，它强烈限制了体内载体的进入。利用细胞的天然传递系统可能有助于解决问题。例如，外泌体已经证明能够穿越BBB。通过融合修饰有载脂蛋白E(ApoE)肽的红细胞膜(AB)囊泡，刘和他的同事获得了ABNPs@mRNA仿生纳米颗粒，这可以显著增加大脑中的药物积累。结合主动靶向、被动靶向和细胞穿越天然屏障的能力，可能实现对任何目标细胞的精确传递。 3.3 跨膜运输 跨膜运输是完成传递的第三道障碍（图3）。细胞膜已经进化到可以进行选择性的跨膜运输，这对将基因编辑剂传递到细胞内构成了挑战，因为大多数基因编辑剂是带负电的大分子。对于体外传递，可以通过各种物理方式轻松实现基因编辑剂的跨膜运输，如微注射、电穿孔和磁感染。然而，当涉及到体内传递时，尽管病毒载体本质上已经进化到可以通过细胞膜，但非病毒载体的情况就不同了。关键问题应该是优化内吞作用，这是载体跨膜运输的主要模式。这些过程可以通过多种方式进行调整，包括结合与膜受体相对应的蛋白质或改变形状、大小、组成和电荷。例如，泡状口腔炎病毒包膜蛋白(VSVg)可以促进生物膜的融合。通过向囊泡中添加VSVg，张和他的同事通过MmPEG10 VLP实现了大约25%的mRNA传递效率，而在没有VSVg的情况下几乎没有观察到成功的传递。 3.4 从内体逃逸 最后，通过内吞作用成功进入细胞后，基于mRNA的基因编辑剂必须从内体逃逸才能被翻译和发挥作用，这是基于mRNA的体内基因编辑剂传递的最后一道障碍（图3）。观察到，对于聚合物复合物，内体的缓慢解包可能影响转染效率。有四种主要的内体逃逸机制被广泛讨论：(1) 内体逃逸可能通过膜融合进行。这种机制通常在病毒载体和基于脂质的载体中观察到。关键挑战是控制这种膜融合只在内体环境中发生，避免非目标融合。(2) 内体逃逸可能通过渗透破裂进行。这种机制表明，随着内体的酸化，具有缓冲能力的聚合物阻碍了pH的降低，促使细胞持续向内体泵入质子以达到所需的pH。因此，这导致氯离子和水分子的流入增加，压力升高，最终导致内体发生裂解。(3) 内体逃逸可能通过纳米颗粒膨胀进行。在许多传递案例中观察到纳米颗粒膨胀，但对其效果一直存在争议。(4) 内体逃逸可能通过膜不稳定化进行。这种策略通常用于基于聚合物的纳米颗粒，可以设计成不稳定化和破坏内体膜以诱导内体逃逸。对于不同的机制，有一种相似的方法是利用内体的酸性环境触发载体结构的变化，从而促进内体逃逸和货物释放。 4.基于mRNA的体内传递核酸酶的当前策略 4.1 病毒传递 由于天生能够克服上述体内传递的障碍并传递核酸货物，病毒载体在体内传递基因编辑剂方面很受欢迎。围绕体内基因编辑，已经进行了1000多项临床试验。腺相关病毒(AAV)、腺病毒(ADV)和慢病毒(LV)是三个最被理解和开发的病毒载体（图4）。然而，AAV和ADV是DNA病毒，这表明它们适合作为DNA载体而不是RNA。尽管大多数现有的病毒载体是为传递DNA货物而开发的，但一些基于mRNA传递的病毒载体已经通过生化工程开发。 图4 不同病毒载体的总结和比较，包括病毒类型、病毒大小、基因组大小和传递能力。图表由Figdraw绘制。 慢病毒(LVs)，源自HIV-1的包膜病毒，通过在3' LTR中的缺失使其无法复制。这通过将病毒生产的必要组分分布在多个构建中进一步确保。慢病毒的RNA基因组大约长9-10千碱基，这表明了类似的RNA传递大小容量。尽管慢病毒是逆转录病毒，这意味着货物最终将被整合到细胞基因组中，使它们确实是很好的DNA载体，但可以通过灭活逆转录酶来避免。由于LVs不是原生mRNA载体，它不打算直接翻译，货物已经显示出弱的依赖帽子的翻译启动。然而，通过包括来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)，翻译可以大大改善。此外，通过改变用于伪型病毒的包膜糖蛋白，人们可以轻松调节慢病毒的趋向性。 有一些基于mRNA的慢病毒传递基因编辑剂的例子。使用非逆转录慢病毒载体(NRTLV)，通过整合突变的HIV-1逆转录酶生成，Ulrike及其同事通过传递CCR5特异性TALEN，在非浓缩慢病毒上清中实现了高达12%的CCR5敲除在CCR51/293T报告细胞中。基因编辑率可以通过引入聚(A)信号进一步提高到30.5%，突显了化学修饰对基于mRNA传递的重要性。基于mRNA传递的一个关键优势是，对于CRISPR/Cas系统，Bes和PEs，蛋白编码mRNA和gRNA可以包装在同一个载体中。在一个湿性年龄相关性黄斑变性的小鼠模型中，Felix Bubeck和Dirk Grimm使用慢病毒进行视网膜下传递Cas9 mRNA和一个靶向Vegfa基因的导向RNA，导致脉络膜新生血管发育减少。也有报道慢病毒成功体内传递编码腺嘌呤碱基编辑器和sgRNA的mRNA。 作为一个病毒载体，尽管慢病毒的装载能力几乎是AAV的两倍，但仍然受到货物最大尺寸的限制。它们还面临免疫原性问题，这通过产生抗体防止重复给药。此外，已经发现有效的、针对性的基因组编辑需要设计核酸酶的阈值水平，这在不同类型的细胞中是不同的。LV在DNA货物的体内传递中的使用已经引起了关于基因毒性、免疫原性和制造成本高的担忧，这也可能对基于mRNA的传递构成威胁。显然，需要更多的改进才能安全有效地临床使用基于mRNA的慢病毒传递。 4.2 非病毒传递 4.2.1 物理传递 物理传递是引入mRNA最直接的方式之一。通常没有mRNA的大小限制。此外，由于物理传递通常在一秒钟内发生，mRNA载体可以免于在血液中持续过长时间并避免剧烈的免疫反应。迄今为止，已经在基于mRNA的基因编辑剂传递中采用了多种物理传递策略，包括微注射、电穿孔和水动力注射。尽管这些物理传递策略大多数在体外或离体进行，但仍有一些先进的策略用于体内传递。 大冢及其同事开发了一种名为通过输卵管核酸传递基因组编辑（GONAD）的方法，它绕过了创建基因工程小鼠的体外受精或对合子进行微注射的需要。GONAD方法包括将CRISPR组分，即Cas9 mRNA和导向RNA（gRNA），注入受孕1.5天的女性的输卵管中。随后进行体内电穿孔程序，确保这些组分直接传递到合子中（图5）。通过GONAD，观察到中期胚胎中eGFP的成功破坏。他们进一步测试了不同的妊娠阶段（第1.5天、第0.7天和第0.4天）、不同的电穿孔器和电穿孔条件，以及不同的CRISPR试剂格式（Cas9 mRNA、Cas9蛋白或Cpf1蛋白）。当CRISPR试剂以RNA形式在受孕后第0.7天传递时，观察到更高的基因编辑效率。最后，通过改进的GONAD（i-GONAD）实现了52%的敲入效率。 图5 GONAD/i-GONAD过程。首先，选择怀孕1.5天（GONAD）/0.7天（i-GONAD）的雌性。然后进行背部切口以进行输卵管内微注射，随后进行体内电穿孔。图表由Figdraw绘制。 然而，由于大多数物理传递策略包括通过力量（GONAD中的电压或水动力注射中的压力）在细胞膜上创建一个瞬时孔，这些方法会留下对转染细胞的损伤。此外，这些物理方法通常限于特定生物体，并且难以用于治疗系统性疾病。此外，这些方法通常是空间或器官特异性而非细胞类型特异性，这可能导致脱靶效应。至于GONAD，仅限于胚胎传递和近交品系中低出生率的限制阻碍了其进一步应用。这些缺点促进了化学传递载体的发展。 4.2.2 脂质纳米颗粒 脂质纳米颗粒（LNPs）的出现彻底改变了基因治疗领域，特别是在传递基于mRNA的基因编辑工具方面。这项新技术在基于mRNA的传递中显示出巨大的潜力，证明了高效和精确的传递、降低的免疫原性和改善的稳定性。这些优势有助于其在mRNA治疗的临床试验中占据主导地位（表1）。迄今为止，已经开发了20多种不同的LNP系统，而DLin-MC3-DMA、ALC-0315和SM-102基础脂质纳米颗粒已获得FDA和EMA批准用于临床使用。辉瑞-BioNTech和Moderna COVID-19疫苗，这两种高效的COVID-19 mRNA疫苗，也使用LNPs传递编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA。 表1 mRNA治疗临床试验 自从20世纪60年代发现脂质体以来，人们一直致力于实现它们在科学研究和临床试验中的广泛应用，并导致现在LNPs的基本结构。在20世纪90年代，Blume和Klibanov合成了PEG脂质以保护LNPs免受降解环境的影响。原岛及其同事进一步提出了多功能包封型纳米装置（MEND）以克服PEG困境。在21世纪初，黄及其同事开发了脂质体-阳离子-DNA（LPD）和脂质包覆的磷酸钙（LCP），以扩大LNP装载DNA和RNA的能力。王等人专注于阳离子脂质辅助的纳米颗粒（CLAN）的开发，强调了LNP中阳离子脂质的影响。 LNPs是完全合成的，通常由四种组分组成：阳离子或离子化脂质、聚乙二醇（PEG）-脂质、辅助脂质（磷脂）和胆固醇（图6）。图7显示了用于LNP的典型分子的化学结构。mRNA的包裹和逃逸主要由环境的pH值改变。在低pH值下，离子化脂质离子化并带正电荷。在低pH值下混合时，带正电荷的阳离子脂质自发与带负电荷的RNA结合，并可以在内体成熟期间pH降低时进一步促进细胞内释放。值得注意的是，正电荷也可能导致潜在的细胞毒性，这要求在将阳离子脂质注入血流之前进行进一步的修饰。 图6 常规脂质纳米颗粒(LNP)、聚合物纳米颗粒(ZNP)、类脂质纳米颗粒(LLN)和主动靶向脂质纳米颗粒的组成。 图7 用于脂质纳米颗粒(LNP)或基于聚合物的纳米颗粒的分子化学结构。(a) LNP的阳离子/离子化脂质：二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTMA)，四氢氯化物(DOSPA)，N1, N3, N5-三(3-(二十二烷氨基)丙基)苯-1,3,5-三羧酰胺(TT3)；(b) LNP的辅助脂质：2-(二辛氨基)乙基壬基氢磷酸酯(9A1P9)，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；(c) LNP的胆固醇：胆固醇，β-谷固醇，20α-羟基胆固醇，25-羟基胆固醇；(d) 脂质-聚合物混合：2-[聚乙二醇]-2000-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)，1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-氨基(聚乙二醇)–2000(DSPE-PEG2000)；(e) 基于聚合物的纳米颗粒的阳离子聚合物：聚乙烯亚胺(PEI)，聚精氨酸，聚-L-赖氨酸，聚(N-甲基二乙醇胺)(PMDET)，PBAE和聚酰胺胺(PAMAM)；(f) 基于聚合物的纳米颗粒的非阳离子聚合物：聚酯和PEG；(i) pH响应性聚合物：聚(乙二醇丙烯酸酯磷酸酯)(PEGAP)，聚(磷酸乙烯)(PVPA)，聚(丙烯酸)(PAAc)，聚(乙烯磺酸)(PVSA)，聚(天冬氨酸)(PASA)；(ii) 氧化还原响应性聚合物：氧化还原响应性聚合物通常是二硒化物、二碲化物、二硫化物和硫酮。一个例子是FA-PEG-TeTe-PCL，一个叶酸(FA)修饰的聚乙二醇化的含有二碲键的聚己内酯。 PEG化通过减少免疫系统的清除增加了LNPs的循环时间。然而，它也可能降低细胞摄取和内体逃逸，因此必须仔细优化PEG-脂质的量。磷脂有助于形成纳米颗粒的结构并提供稳定性。它们还有助于LNP的流动性和柔韧性，这可能影响其与细胞和免疫系统的相互作用。与细胞膜中的相同特性一样，胆固醇作为维持LNP结构完整性的关键组分，有助于维持纳米颗粒的大小和形状，并增强其稳定性。由于LNPs是完全人工合成的，它们不受货物大小的限制。此外，通过Lipofectamine介导的Cas9 mRNA的转染已被证实在大多数研究的细胞系中产生最高的基因编辑效率，与Cas9质粒和蛋白的配置相比。 LNPs已经被应用于传递各种基因编辑剂。Lee及其同事通过LNP将编码ZFN的mRNA引入小鼠体内，并通过针对转甲状腺素（TTR）或前蛋白转化酶枯草杆菌/胰蛋白酶9型（PCSK9）基因，实现了小鼠中超过90%的基因敲除效率，且使用的mRNA剂量是以前报道的10倍以下。他们还发现，通过共同传递含有针对白蛋白（ALB）基因内含子1的ZFN的mRNA-LNP和AV，可以实现小鼠中高水平的靶向整合和随后治疗相关水平的蛋白表达，这些AV包装有无任何启动子的人类艾杜糖酸2-硫酸酶（IDS）或因子IX（FIX）治疗性转基因。2017年，Daniel及其同事首次报道了脂质类材料——两性离子氨基脂质（ZALs）的体外和体内共同传递Cas9 mRNA和sgRNA（图6）。ZALs专门设计用于传递长核酸，包括Cas9 mRNA（约4500 nt）和sgRNA（约100 nt）在单个纳米颗粒中。2020年，为了提高非病毒mRNA基交付的安全性和效率，Dong及其同事报道了一系列脂质类纳米材料（LLNs），命名为功能化TT衍生物（FTT），其中TT指的是以前报道的化学化合物N1,N3,N5-三(2-氨基乙基)苯-1,3,5-三酰胺（TT）（图6）。在这些LLNs中，FTT5 LLNs被认为具有最大的潜力，它不仅可以传递CRISPR/Cas9系统，而且在低剂量下还展示了体内强大的碱基编辑能力。2021年，Song及其同事通过优化的LLNs（O-LLNs）使用中心组合设计（CCD），一种用于实验设计的统计技术，成功传递了胞嘧啶碱基编辑器mRNA和sgRNA，在小鼠模型中实现了超过8%的苯丙酮尿症（PKU）校正率。2023年，Herrera及其同事首次报道了基于mRNA的PEs的LNP和LLN封装传递，使用含有胆固醇类似物β-谷固醇的增强LNPs（eLNPs），实现了高达54%的主要编辑率。 尽管LNPs在基于mRNA的传递方面具有巨大潜力，但关键问题之一是大多数静脉注射的LNPs自然在肝脏中积累，这是由于ApoE-LDL和其他未知因素的影响。这为非肝脏传递带来了挑战。已经确认，载体的组成、大小、形状和电荷都影响LNPs的生物体选择性，称为被动靶向。相反，主动靶向涉及向LNPs表面引入靶向基团，如抗体片段。已经开发了主动和被动靶向策略来克服肝脏限制。Dahlman及其同事在体内筛选了数百种不同的LNPs，以寻找更好的组成用于器官靶向。使用这种策略，他们在小鼠模型的脾脏和肝脏中实现了基于mRNA的CRISPR/Cas9系统的器官靶向传递。此外，在2020年，Daniel及其同事报道了选择性器官靶向（SORT）纳米颗粒，用于组织特异性mRNA传递。通过向LNPs添加补充成分（SORT分子），SORT纳米颗粒可以准确地将RNA货物传递到小鼠的肺部、脾脏和肝脏。在2021年，Daniel及其同事报道了多尾离子化磷脂（iPhos）的组合合成，由一个pH可切换的两性离子和三个疏水尾部（烷基链）组成。iPhos脂质由一个可离子化的胺、一个磷酸基团和三个疏水烷基尾部组成。进入酸性内体/溶酶体时，叔胺的质子化诱导了一个两性离子头基，促进其插入膜中，并帮助内体逃逸。尽管机制仍不清楚，但也报道了iPhos的长度也可能引起器官选择性，短链（9-12碳）靶向肝脏，长链（13-16）靶向脾脏。不同的辅助脂质与iPhos脂质协同工作，创建多组分脂质纳米颗粒，也称为iPLNPs，用于SORT。例如，发现烷基链长度极大地影响了功效和器官选择性，短链（9-12碳）在肝脏中显示mRNA翻译，而长链（13-16碳）将蛋白表达转移到脾脏。除了这些被动靶向策略外，Epstein及其同事将抗CD5抗体结合到LNPs表面，并成功实现了体内T细胞的靶向传递CAR编码mRNA，并治愈了小鼠的心脏损伤，展示了主动靶向的能力（图6）。在一篇非常近期的文章中，Laura Breda及其同事将抗CD117抗体附着在LNPs表面，以靶向造血干细胞（HSCs）。他们成功地以mRNA形式引入了环磷酸腺苷反应元件（Cre）重组酶，CRISPR-Cas9腺嘌呤碱基编辑器融合基因，或促凋亡BH3-only基因PUMA（p53上调的凋亡调节因子），分别针对遗传改变HSCs，纠正疾病突变或通过非遗传毒性条件耗尽HSCs。 然而，LNPs仍然面临热稳定性问题、潜在的免疫原性和细胞毒性问题，以及在血液中的稳定性和传递效率，显然需要更先进的策略进行靶向传递。尽管如此，尽管存在这些缺点，LNPs仍然彻底改变了基于mRNA的非病毒传递，为体内基因编辑提供了新的可能性。 4.2.3 基于聚合物的纳米颗粒 基于聚合物的纳米颗粒是另一种能够传递基于mRNA的基因编辑剂的合成载体。已经使用了各种聚合物进行mRNA包装，包括PEG、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚(b-氨基酯)（PBAE）、聚乙撑亚胺（PEI）及其衍生物。如前所述，LNPs必须面对热稳定性问题，以及昂贵的冷链和物流。相比之下，基于聚合物的纳米颗粒具有在水基条件下组装各种纳米结构的能力，并具有冻干和长期储存的潜力。此外，不同的基于聚合物的传递系统具有不同的药代动力学特性，这可能对开发先进的mRNA疗法很有用。 据报道，基于聚合物的纳米颗粒的传递效率与其纳米属性密切相关。CLAN是一种基于PEG-b-PLGA的纳米颗粒，由阳离子脂质BHEM-Chol辅助。2018年，王及其同事筛选了一堆CLANs后选择了CLAN42用于巨噬细胞靶向传递。通过封装CRISPR/Cas9系统，他们实现了高达48.4%的编辑率和低脱靶效应。2019年，张及其同事报道了通过基于CLAN的CRISPR/Cas9传递在体内重新利用树突状细胞（DCs）诱导移植耐受。在CLANmCas9/gCD40注射后观察到11.2%的总indels频率。2021年，Blanchard及其同事报道了通过基于PBAE的纳米颗粒传递mRNA编码的Cas13a治疗啮齿动物SARS-CoV-2感染。同样在2021年，Abbasi及其同事报道了通过PEG化的多聚体胶束（PM）共传递Cas9 mRNA和gRNA，绕过BBB，在小鼠大脑中成功进行基因组编辑。同年，郭及其同事通过开环聚合合成了一系列聚(二硫键)，为CRISPR/Cas9基基因编辑剂提供了一种新的有效传递平台。最近，夏报道了一种新颖的仿生纳米系统构建，用于精确传递mRNA。他们首先合成了类似病毒的介孔硅(V-SiO2)纳米颗粒，以有效传递治疗性RNA，然后通过PEI修饰以促进mRNA结合和细胞内溶酶体逃逸(V-SiO2-P)。然后，V-SiO2-P通过带负电荷的mRNA和阳离子聚合物PEI之间的静电相互作用在表面装载mRNA(m@V-SiO2-P)。最后，m@V-SiO2-P/LB被支持的脂质双层覆盖((m@V-SiO2-P/LB)。该传递系统显示出GFP mRNA的高传递效率，在组间血液中的细胞因子或趋化因子水平没有波动。尽管其传递基于mRNA的基因编辑剂的能力需要进一步证明，但了解这个系统将启发下一代高效和有效的mRNA疗法。 4.2.4 类病毒颗粒 类病毒颗粒(VLPs)是由病毒衍生的结构抗原自组装成高度组织化的病毒衣壳蛋白的结果。VLPs是无病毒遗传物质的非传染性病毒蛋白组装体。这些VLPs模仿病毒颗粒的整体结构，从而保持免疫原蛋白的天然抗原构象。由于它们与病毒载体具有相似的体内运输能力，因此受到了广泛关注和发展。它已经被用于乙型肝炎疫苗，并且对其在体内传递mRNAs、蛋白质或RNPs的潜力寄予厚望。 VLPs可以分为外源性VLPs和内源性VLPs。迄今为止，大多数VLPs是从慢病毒发展而来的，即外源性VLPs。它们使用约5000个Gag（群特异性抗原）前体蛋白的衣壳包装两条RNA链。Gag基因负责编码蛋白前体p55。然后，由Pol基因产生的蛋白酶将这个前体分解成几个组分。这些包括内膜基质蛋白（MA, p17）、衣壳蛋白（CA, p24）和核衣壳蛋白（NC, p7），以及其他一些肽段。幸运的是，已经确认Gag多肽是唯一需要组装和释放未成熟病毒颗粒的病毒蛋白。MA包含一个对Gag多聚体运输到质膜至关重要的结构域，它还有一个将Gag连接到质膜的肉豆蔻酰化位点。CA由对Gag-Gag相互作用至关重要的残基组成，是衣壳构建块。NC蛋白对病毒基因组的包装至关重要，具有两个锌指基序（ZF1, ZF2），这使得NC与病毒RNA上的Ψ信号之间发生相互作用（图8）。Ψ信号还可以保护mRNA不受逆转录酶的影响，这为基于VLPs的mRNA传递提供了重要的化学修饰方法。 图8 不同VLP传递系统的总结和比较。所有的VLPs通过病毒蛋白包装RNA，并进一步被脂质包膜包裹，通常装载有促进融合的因子。基于慢病毒的VLP通过gag的NC部分与RNA上的Ψ信号之间的相互作用包装RNA，这使其只能包装最多2条RNA链。基于小鼠白血病病毒的VLP通过MS2衣壳蛋白和MS2寡核苷酸之间的识别包装RNA，这大大扩大了装载能力。SEND系统通过与PEG10及其mRNA两端的UTR相互作用包装RNA。图表由Figdraw绘制。 然而，由于Ψ信号介导的包装，每个VLP只能包装多达两条mRNA，由于病毒基因组RNA副本的数量有限。为了绕过这个限制，Basyuk及其同事利用了MS2衣壳蛋白（MS2cp）与MS2寡核苷酸（MS2apt）之间的相互作用，这需要一个最小长度为19个核苷酸的茎环结构（图8）。通过这种方法，他们已经在每个VLP中封装了5-6个mRNA拷贝，并成功地将各种mRNA传递到哺乳动物细胞中，包括诱导多能干细胞和人类CD34+细胞，为基因编辑剂的传递铺平了道路。通过进一步优化这种策略，陆已经开发了一种能够在每个慢病毒样生物纳米颗粒(LVLP)中包装多达100个金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）mRNA的系统，在HEK293T细胞和淋巴母细胞中实现了超过85%的Indel率，每细胞1.2-2.5 pg p24 LVLP。除了基于慢病毒的VLPs外，其他形式的VLPs也值得高度关注。在2018年，Yvonne Knopp及其同事报道了一种基于γ-逆转录病毒小鼠白血病病毒(MLV)的VLP（图8）。同样，他们利用MS2cp和MS2apt之间的相互作用，而不是Ψ信号进行货物装载。通过CRISPR/SpCas9的mRNA传递，观察到高达50%的目标基因敲除。这些外源性VLPs已经被用于临床试验，并证明了它们能够有效地传递基于mRNA的基因编辑货物，并且具有最小的脱靶编辑。例如，刘及其同事报道，v4 BEeVLPs显示出超过100倍的Cas独立脱靶编辑的减少，降低到几乎无法检测到的水平。这意味着，虽然正常策略导致大约10%的错误编辑，这种传递方法只会导致不到0.1%的脱靶效应。然而，VLPs的一个主要障碍是，由于病毒衣壳，它们倾向于引发免疫反应，这对基于VLP的疫苗是好消息，但对其作为传递系统的进一步应用构成了挑战。 最近，一些基于非病毒的内源性VLPs已经进入视野。2021年，张及其同事鉴定了几种形成类似病毒颗粒的哺乳动物Gag同源物，其中PEG10，一种LTR逆转录病毒同源物，被观察到对结合并促进其自身信使RNA（mRNA）的囊泡分泌具有亲和力，表现出VLP潜力。研究发现，这种亲和力是由NC域中核酸结合锌指CCHC基序与其编码mRNA的非翻译区（UTR）之间的相互作用引起的。基于工程化PEG10，他们开发了一种新的VLP系统，称为选择性内源性封装用于细胞传递（SEND）（图8和10（a））。通过SEND基于传递SpCas9 mRNA进入表达MmKras sgRNA的N2A细胞系，借助VSVg（泡状口腔炎病毒包膜蛋白，一种促进生物膜融合的蛋白），在受体细胞中观察到大约60%的插入和删除（indels）。值得注意的是，PEG10完全是内源性的，表明免疫原性极低。目前的SEND无法像慢病毒那样高效地实现基因转移，这并不奇怪，考虑到其发展阶段。需要进一步的工作来确认它们作为传递工具的最终效率。 4.2.5 细胞外囊泡 前述PEG10的天然mRNA封装被观察到在细胞外囊泡（EVs）内，它们在结构和功能方面类似于包膜病毒，如逆转录病毒和VLPs。EVs是细胞释放的微小颗粒，作为细胞间通信的一种形式，包括亚微米大小的微颗粒和纳米大小的外泌体（图10（b））。它们可以在许多或许所有的生物液体中找到，包括血液、尿液和细胞培养的培养基。这些囊泡携带其原始细胞的各种分子成分，包括核酸（DNA、RNA）、脂质和蛋白质。由于EVs天生用于细胞间运输，它们可以很好地被利用作为传递系统。由于它们天然存在于我们的身体中，它们是无毒的、无免疫原性的，并且可以轻松地跨越体内传递的障碍，甚至是血脑屏障。基于EV的阿霉素和紫杉醇传递已被用于靶向癌症治疗，表现出最小的免疫原性和毒性。 建立基于EV的传递系统通常包括两个主要步骤：（1）从培养细胞中分离和纯化EVs；（2）将货物转染到EVs中。通过EVs的特定特征，如它们的表面蛋白、大小、形状和密度，从细胞中分离出来，然后通过外泌体沉淀、超滤、蔗糖密度梯度超速离心和差速超速离心进一步纯化。然后它们通过不同的方法被转染货物，包括引导特征序列、电穿孔、用特定试剂转染、脂质体-外泌体混合物和细胞纳米孔。 2018年，Le及其同事报道了使用红细胞细胞外囊泡（RBCEVs）成功传递基于mRNA的CRISPR/Cas9基因编辑系统。通过电穿孔，他们实现了大约18%的Cas9 mRNA装载率，并且在体外传递到MOLM13细胞后48小时观察到近50%的编辑率。体内传递mRNA基CRISPR/Cas9系统也已实现，没有检测到细胞毒性。2019年，Li及其同事报道了一种替代方法，通过将RNA结合蛋白HuR融合到EVs膜蛋白CD9上来增加封装。这种方法提高了Cas9 mRNA的封装能力八倍，并在小鼠肝脏中成功实现了体内基因编辑。最近，Cheng及其同事开发了一种含有IL-12 mRNA的可吸入细胞外囊泡，用于治疗肺癌并促进系统免疫。观察到改善的肿瘤微环境和轻微的细胞毒性。尽管EVs已广泛用于癌症治疗，但基于EVs的mRNA传递基因编辑剂的发展受到各种因素的限制，包括建立系统的繁琐和低效以及与大型RNA货物的兼容性差。然而，其无毒和无免疫原性的特点仍然具有吸引力，一些团队正在努力克服上述问题。 4.2.6 无机和混合纳米传递系统 许多无机纳米材料因其高表面积体积比、长期稳定性和光学响应性而有望用于药物装载和靶向释放。通过与聚合物的有机改性，这些传递系统的功能可以扩展。已经有成功的例子通过金纳米颗粒（AuNPs）、硅纳米颗粒（SiNPs）、硒纳米颗粒（SeNPs）和金属-有机框架（MOF）传递mRNA（图9）。 图9 无机/混合传递系统和核酸纳米结构。(a) 四种主要的无机/混合传递系统：金纳米颗粒(AuNPs)、硅纳米颗粒(SiNPs)、硒纳米颗粒(SeNPs)和金属-有机框架(MOF)。(b) 通过滚环扩增形成核酸纳米结构并封装mRNA。图表由Figdraw绘制。 金纳米颗粒能够形成具有卓越特异性的单分散纳米结构。它们在化学上是惰性的，基本上无毒，并且可以被多种配体物种和化学基团功能化。金纳米颗粒可以很容易地通过硫醇基团与DNA结合。这种DNA-金复合物被Lee及其同事进一步用作高效传递B细胞淋巴瘤2（BCL2）相关X（BAX）mRNA的载体。将BAX mRNA装载在AuNP-DNA共轭物上注射到异种移植肿瘤中，成功抑制了肿瘤生长。 硅纳米颗粒提供了几个独特的优点，包括可调节的纳米多孔结构、高稳定性和直接功能化，并且可以冻干以简化分发，甚至在偏远地区。Min及其同事最近报道了一种基于聚乙撑亚胺改性的多孔硅纳米颗粒（PPSN）的传递平台，用于体内局部免疫疗法，该平台携带细胞因子mRNA。这个平台被发现比FDA批准的脂质纳米颗粒在局部mRNA翻译方面显著更有效。 与其他系统相比，SeNPs具有更低的毒性、更高的生物利用度、生物可降解性和抗氧化活性。SeNPs的官能化表面能够安全稳定地传递mRNA货物。在2021年，Singh及其同事用壳聚糖（CS）修饰SeNPs，并在体外实现了使用功能化的SeNPs进行肝细胞靶向mRNA传递。 MOFs，多孔配位聚合物，是通过金属离子如锆(IV)、铁(III)和锌(II)与具有从烷基骨架或基于环状结构伸出的多个氨基和羧基的有机配体自组装构建的。最近，Zheng及其同事部分解决了MOF封装mRNA的问题。确定了使用沸石咪唑框架-8（ZIF-8）封装和传递mRNA的合适合成条件。然而，其体内传递能力，特别是基于mRNA的基因编辑剂仍需要更多的验证。 4.3 其他有前景的载体 4.3.1 微针 作为经皮药物传递工具，微针是口服传递和静脉注射的良好替代品，大大减轻了患者的痛苦。在mRNA传递方面，它通常作为mRNA载体的载体。2022年，徐及其同事提出利用冷冻微针（CryoMNs）包装含有COVID-19 Comirnaty mRNA疫苗的聚乙撑亚胺（PEI），并成功触发了强烈的免疫反应。2023年，罗伯特·兰格和安娜·雅克伦进一步开发了一种微针疫苗打印机，可以快速打印含有mRNA-LNP的微针。迄今为止，微针一直是mRNA传递的“第二载体”，但它有成为“第一载体”的前景，特别是用于皮下传递。在保持mRNA活性的同时直接将mRNA包装成微针应该是一个主要挑战。 4.3.2 迁移体 迁移体是由Yu及其同事首次发现的新细胞器，根据其依赖细胞迁移形成的机制命名（图10（c））。迁移体作为细胞稳态的维持者，细胞废物清除者以及物质和信息的细胞间转运者。它们传递蛋白质和mRNA的能力使它们成为mRNA药物的潜在载体。与外泌体类似，这些囊泡是完全内源性的，当用于药物传递时可能避免免疫反应。值得注意的是，与外泌体相比，迁移体要大得多，通常超过0.5微米。这表明迁移体有潜力作为mRNA传递的“第二载体”。它们可以被制造成定向迁移到目标器官，并释放“第一载体”以实现mRNA的靶向传递。 4.3.3 蛋白质冠 蛋白质冠（PC）是围绕体内纳米颗粒（NPs）的蛋白质层，已被证实对NPs的不同属性产生影响，包括颗粒稳定性、生物相容性、细胞摄取和循环寿命。一旦含有mRNA的纳米颗粒暴露于生物环境，就会在表面发生蛋白质吸附，导致PC的形成。NPs和PC之间的这种耦合关系突出了PC作为体内纳米颗粒药物传递的关键调节器的重要性，特别是对于靶向传递（图10（d））。 图10 SEND系统、外泌体、迁移体和蛋白质冠。(a) SEND系统在细胞内产生并组装，然后被释放。(b) 外泌体由细胞本身从内体产生，然后被传递到细胞外。(c) 迁移体由迁移的细胞释放，成为细胞外囊泡。这些新的细胞器呈现出类似石榴的结构，包含mRNA、蛋白质和其他信号因子。(d) 覆盖在纳米颗粒上的蛋白质冠通过蛋白质-蛋白质相互作用介导转染过程。图表由Figdraw绘制。 研究表明，当免疫球蛋白（IgM和IgG）结合到NPs时，它们可以通过识别NP-蛋白质复合物的表面表位来启动免疫细胞的吞噬作用。补体系统的蛋白质也会触发免疫细胞对NP的摄取。用ApoE装饰NPs甚至可以帮助传递到大脑，因为血脑屏障（BBB）处表达有高密度的低密度脂蛋白（LDL）受体。尽管一些PC可能通过受体介导的内吞作用诱导血液清除，例如纤维连接蛋白、纤维蛋白原、C反应蛋白，这也为通过修饰PC来优化NPs的半衰期提供了机会。 然而，这种对NPs的强大调节器在应用于主动靶向时似乎无能为力。修饰NPs的靶向组分是否显示出更高的效率仍然存在争议。此外，生物环境过于复杂，无法完全理解PC如何影响NPs，需要解释更多的机制，以便为更好的载体进行真正的合理设计。 4.3.4 核酸纳米结构 核酸纳米结构是由DNA或RNA等核酸构建的，展现出基于其重复序列的独特三维结构，能够携带包括mRNA在内的多种货物。它已成为在纳米尺度上创建高度复杂和单分散形状的强大方法。 尽管在大多数情况下，核酸纳米结构被用于传递适体或siRNA，但也有一些应用于传递基因编辑工具。2015年，顾及其同事合成了一种通过滚环扩增部分互补于sgRNA的纱线状DNA纳米扣。利用这种载体，观察到了Cas9/sgRNA复合物的成功传递。这种DNA纳米扣进一步适应于运输针对PCSK9的Cas12a/crRNA复合物，成功降低了胆固醇水平以产生治疗效果。2017年，安和他的同事开发了一种基于多核糖核蛋白（RNP）纳米颗粒的聚合物CRISPR/Cas9系统，包括基于聚合物的sgRNA、siRNA和Cas9核酸内切酶，提高了传递效率。2019年，张及其同事利用DNA-grafted聚己内酯刷（DNA-g-PCL）通过DNA链接器装载Cas9/sgRNA复合物。这种策略进一步扩展到传递Cas9 mRNA。同年，丁及其同事基于分支DNA开发了一种自组装平台，用于Cas9/sgRNA/反义传递。 目前，基于核酸纳米结构的mRNA传递案例仍然很少。这些载体的体内应用应该面临巨大挑战。核酸纳米结构体内应用的一个重要障碍是它们易受核酸酶的影响。具体来说，血清含有如DNase I和各种外切核酸酶的内切核酸酶，而内体含有高浓度的DNase II。此外，RNA纳米结构易受核糖核酸酶的影响，RNase H针对DNA/RNA杂交纳米颗粒，切割杂合双链中的RNA。化学修饰对这些载体来说应该是困难的，因为它们大多依赖于生物合成。 5.挑战 5.1 RNA稳定性 与DNA不同，RNA极其不稳定，在血液中的半衰期仅为几秒钟。这为保护RNA在到达目标之前不被降解提出了挑战（图11（a））。对于同时传递CRISPR/Cas基剂的一体化传递系统来说，情况甚至更糟，它们同时传递mRNA和sgRNA。在成功从内体逃逸后，Cas mRNA翻译需要时间，在此期间sgRNA完全暴露在细胞质中，必须在核酸酶和溶酶体环境中存活。为了保护mRNA和sgRNA，已经进行了不同的化学修饰，包括核苷酸链间连接修饰、糖修饰和核苷酸修饰。例如，Hendel及其同事在sgRNA的3'和5'末端位置进行了三种修饰，并评估了它们对人类原代T细胞以及CD34+造血干/祖细胞（HSPCs）的基因组编辑效率的影响，包括2'-O-甲基（M）、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯（MS）和2'-O-甲基3'硫代PACE（MSP）。结果显示稳定性逐渐增加。然而，化学修饰的必要性给RNA合成带来了负担。目前固相合成RNA策略通常对长于120个核苷酸的RNA无能为力，这对PEGs的pegRNA尤其具有挑战性，其长度通常为125-130个核苷酸。Eric及其同事开发的一种有效解决方案是将pegRNA分割为sgRNA和单独的RTT-PBS序列，并共同传递它们。此外，RNA的精确修饰不仅麻烦，而且还影响RNA的包装，因为大多数载体利用RNA和载体化合物之间的相互作用进行封装，特别是VLPs。除此之外，mRNA上的化学修饰也可能影响翻译过程，不当的化学修饰也会导致增加的免疫原性。在2023年底，一篇文章提出N1-甲基伪尿苷修饰的mRNA可能导致+1核糖体移码，进一步引起了人们对mRNA药物的担忧。现在的问题已变成在RNA稳定性、包装能力、翻译效率和免疫原性之间取得平衡。了解序列和化学修饰如何影响mRNA属性是解决这个问题的关键。在2024年，Moore的研究团队得出了mRNA稳定性和生物活性的原则，强调了核苷酸序列、核苷酸修饰和二级结构对RNA的重要角色。 图11 基于mRNA的基因编辑剂传递面临的挑战。(a) RNA容易被核酸酶和溶酶体的恶劣环境降解。通过化学修饰、成环和RNA折叠可以提高RNA的稳定性。(b) 靶向传递是另一个挑战。借助人工智能，可以优化以往繁琐的实验过程。利用可控的物理信号，如磁场的方向和强度，远程控制纳米颗粒的移动，从而实现精确靶向，也是充满希望的。(c) mRNA可以通过TLR7/TLR8途径激活免疫系统，一些载体表现出细胞毒性。对mRNA和载体进行修饰可以帮助解决这个问题。(d) 异质性和缺乏合理设计极大地增加了工作量。建立专业数据库和开发预测模型可能有助于指导不同载体的设计，而异质性可以通过微流体学进行调控。图表由Figdraw绘制。 5.2 靶向传递 迄今为止，大多数基于mRNA的传递系统仍需要实验证明，以实现基因编辑剂的准确细胞靶向转移。被动靶向和主动靶向都遇到了障碍（图11（b））。被动靶向需要艰苦的工作来穿越所有可能的浓度梯度以找到最佳选择。只有器官特异性靶向而不是细胞特异性靶向是可行的。被动靶向的另一个障碍是，被动靶向可能无法覆盖所有器官。大多数被动靶向系统只关注几个器官并忽略了其他器官。SORT系统在肺部、肝脏和脾脏上表现良好，但需要进一步的靶向选择性改进。至于主动靶向，发现细胞特异性受体蛋白的缺乏可能是最大的挑战。此外，实现最佳优化结果需要结合被动和主动靶向。由于主动靶向改变了载体化合物，未修饰载体的最佳比例可能与修饰载体不同，这意味着必须进行额外的工作。实现靶向传递的另一种策略是局部注射，特别适用于局部疾病的基因治疗。在湿性年龄相关性黄斑变性的小鼠模型中，Cai及其同事使用慢病毒通过视网膜下注射传递Cas9 mRNA和靶向Vegfa基因的导向RNA，导致脉络膜新生血管发育减少。 5.3 潜在的免疫原性和细胞毒性 值得注意的是，基于mRNA的传递可能比基于DNA的传递具有更高的免疫原性，因为单链mRNA可以作为模式识别Toll样受体TLR7和TLR8的配体激活这些途径。除此之外，RNA的二级结构如发夹不仅作为包装信号，也是一些模式识别受体的活性信号，如TLR3、视黄酸诱导基因I（RIG-I）和蛋白激酶R（PKR）。此外，外源载体的吸收可能对细胞造成毒性。例如，带正电荷的阳离子脂质和PEI已显示出高细胞毒性。这些缺点要求具有新组成的先进载体（图11（c））。 5.4 异质性和合理设计 如前所述，对于纳米颗粒，不同的大小、电荷、组成和化合物比例都会导致不同的载体性能。寻找优化的尺寸、电荷、组成和化合物比例应该是一个复杂的多维非线性优化问题（图11（d））。迄今为止，仍然缺乏一个全面有效的理论或技术来指导载体设计的方向。优化过程通常既耗时又费力，就像上面提到的被动靶向过程一样。除此之外，由于纳米颗粒的异质性，合成的载体在误差范围内的微小差异可能会导致不同的属性，并模糊了传递过程的识别。如果无法以可复制和可扩展的方式制造，最终将阻碍任何纳米传递系统的转化。 6.结论 基因编辑广泛推动了生物研究和医学发展的进步。CRISPR/Cas系统的发现彻底改变了这一领域，它比ZFNs和TALENs更容易修改目标基因。从CRISPR/Cas系统发展而来的BEs和PEs进一步扩大了基因编辑的可操作性。Casπ、转座子和逆转录转座子等新型编辑系统也备受期待。在传递问题上，选择基于mRNA而非DNA传递基因编辑剂可以显著降低脱靶效应，因为基因编辑剂的短暂表达可以避免将货物引入细胞核的麻烦。然而，由于其激活TLR途径的特性，基于mRNA的传递可能具有更高的免疫原性。mRNA脆弱的结构要求先进的载体在进入细胞前保护其免受隔离和降解环境的影响，这是通过基于mRNA的体内传递引入基因编辑剂到细胞的第一个障碍，随后是精确靶向细胞、跨膜运输和从内体逃逸。各种病毒和非病毒载体被开发出来克服这四个障碍。作为病毒载体，NRTLV天生就是为了在这些障碍上传递核酸货物，但不可避免地会引发免疫反应。非病毒传递方法，包括物理方法（GONAD）和化学方法（LNPs、基于聚合物的纳米颗粒、VLPs和EVs），都是有希望的候选者，考虑到编辑效率、靶向、细胞毒性、免疫原性和包装能力，它们各有利弊。进一步的发展应该在于解决RNA稳定性、靶向传递、潜在的免疫原性、细胞毒性、异质性和合理设计的问题。为了提高mRNA稳定性，除了传统的化学修饰外，简单地制造mRNA的结构也是一个有前景的方法。尽管这种方法仍然不成熟，但在环状RNA和RNA折纸领域已经取得了一些进展。其他策略，如在RNA末端插入额外片段，也对RNA稳定化产生了积极影响。借助计算机科学，可能实现传递载体的合理设计。建立相关数据库是开始计算分析和优化指导的关键步骤，这可能通过机器学习和其他方法实现。一旦成功，整个过程将节省大量时间和精力，包括被动靶向过程。此外，为了更好的靶向，随着新材料和设备的开发，可以利用可控的物理信号，如磁场的方向和强度，远程控制纳米颗粒的移动，从而实现精确靶向。通过结构修饰的mRNA和新型载体组分，也可能提高免疫原性和细胞毒性。至于异质性问题，一个有前景的方法是将微流体学引入研究。通过一个接一个地分离载体，可以操作识别每个载体并选择所需的，从而更好地理解传递机制。也值得尝试结合不同传递系统的优势。前述m@V-SiO2-P/LB系统创造性地整合了病毒载体、基于聚合物的载体和LNPs的优势，应该是一个很好的样本。但也应该注意到，将不同的组分引入载体可能会导致体内不确定性的增加。系统越复杂，临床转化越困难。平衡理论功能和实际应用非常重要。未来，基于mRNA的基因编辑剂传递应该是安全、有效、可制造和负担得起的。随着更多的传递系统被创造和表征，计算机科学将帮助优化载体设计过程，从而获得更多的载体，然后是更好的计算机性能。这个循环将继续，并且随着新材料和新靶向方法的帮助，通过基于mRNA的体内传递可以实现个性化、细胞特异性的基因编辑。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表平台立场。任何文章转载需要得到授权。 非小细胞肺癌（NSCLC）作为肺癌中最常见的类型，其发病率和死亡率在全球范围内均居高不下，对人类的生命健康构成了严重威胁。随着医学科技的飞速发展，尤其是在精准医疗和免疫疗法领域的突破性进展，NSCLC的治疗策略正经历着前所未有的变革。 本文基于摩熵咨询发布的《市场研究专题报告——非小细胞肺癌药物》部分内容，旨在全面梳理NSCLC治疗领域的最新进展，特别是PD-(L)1抑制剂和VEGF抑制剂等关键药物在NSCLC中的应用与市场表现，以期为临床医生、研究者及政策制定者提供有价值的参考信息。 01 PD-(L)1抑制剂 在NSCLC中的应用与市场表现 1.无驱动基因的NSCLC治疗：免疫疗法成为首选 NSCLC按病理分型可分为鳞状和非鳞状，有确切驱动基因时优先使用靶向治疗药物。针对无驱动基因，首推免疫疗法。诊疗指南推荐的一线疗法单药为帕博利珠单抗和阿替利珠单抗（非鳞和鳞癌都适用）、PD-(L)1联合化疗、贝伐珠单抗联合化疗+贝伐珠维持治疗。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 IV期无驱动基因突变的非鳞NSCLC（2024版CSCO）诊疗指南： （1）将“纳武利尤单抗+伊匹木单抗（限PD-L1≥1%）”、“纳武利尤单抗+伊匹木单抗和2周期培美曲塞+铂类”降级为晚期一线治疗Ⅲ级推荐； （2）新增“特瑞普利单抗+含铂化疗新辅助+辅助治疗”为围手术期治疗Ⅰ级推荐； （3）新增“帕博利珠单抗、替雷利珠单抗或卡瑞利珠单抗+含铂化疗新辅助治疗+辅助治疗”为围手术期治疗Ⅱ级推荐； （4）新增“度伐利尤单抗或纳武利尤单抗+含铂化疗新辅助+辅助治疗”为围手术期治疗Ⅲ级推荐 鳞癌多为中央型，易于出血，因此抗血管生成药物贝伐珠单抗是禁忌，化疗药物也不推荐使用培美曲塞。鳞癌治疗选择有限，整体预后劣于非鳞癌。但鳞癌患者的 PD-L1 阳性比例显著高于非鳞癌，鳞癌患者接受免疫治疗可能具有更好的获益。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 IV期无驱动基因突变的鳞状NSCLC（2024版CSCO）诊疗指南： 在一线治疗方面，如果患者的一般状况较好（PS=0-1），I级推荐有（1）帕博利珠单抗单药(限 PD-L1 TPS ≥50%，PD-LI TPS 1%~49%)；（2）阿替利珠单抗（限 PD-L1 TC≥50% 或IC>10%）；（3）紫杉醇+铂类联合帕博利珠/卡瑞利珠/舒格利/派安普利单抗；（4）紫杉醇/白蛋白紫杉醇+铂类联合替雷利珠单抗；（5）白蛋白紫杉醇+铂类联合斯鲁利单抗；（6）吉西他滨+铂类联合信迪利单抗；（7）含顺铂或卡铂双药方案:顺铂/卡铂联合吉西他滨或多西他赛或紫杉醇或脂质体紫杉醇或紫杉醇聚合物胶束；（8）含奈达铂双药方案:奈达铂+多西他赛。如果患者的一般状况较差（PS=2），推荐单药化疗，可以包括吉西他滨、紫杉醇、长春瑞滨或多西他赛等药物。  在二线治疗方面，如果患者的一般状况较好（PS=0-2），首选纳武利尤单抗和替雷利珠单抗这两种免疫治疗药物。多西他赛也是一个可选的治疗方案。作为二线治疗的备选方案，可以考虑帕博利珠单抗，但其使用受限于PD-L1的表达水平（TPS≥1%），以及阿替利珠单抗。其他可选药物包括吉西他滨、长春瑞滨和阿法替尼（特别是不适合化疗及免疫治疗的患者）。 在三线治疗方面，对于PS=0-2的患者，可以考虑纳武利尤单抗和多西他赛这两种药物。另外，对于外周型鳞癌的患者，安罗替尼也是一个可选的治疗方案。 2.PD-(L)1国内整体销售额突破210亿元，百济神州和信达生物名列前茅 摩熵医药数据库显示，自2018年首款PD-(L)1在国内上市以来，截止2023年底，已有15款PD-(L)1相继获批上市，销售额一路高歌猛进，从2019年57亿元增长至2023年211亿元。增长的主要原因在于：1）显著的临床疗效；2）广泛的适应症范围，肺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤等多种肿瘤适应症都已获批上市。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 从2023年国内销售额竞争格局来看，在激烈的市场竞争中，百济神州的替雷利珠单抗以45亿元的销售成绩市占率第一（21%），信达生物的信迪利单抗以40亿元的销售额排名第二，市占率为19%，排名第三的为默沙东的帕博利珠单抗，32亿元（15%），未纳入医保能有这么好的成绩在于帕博利珠单抗先发优势，广泛获批的适应症和默沙东超强的销售能力。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 值得一提的是，PD-1四小龙中最晚上市的替雷利珠单抗一路逆袭，进入医保后更是“以价换量”成效突出。目前，替雷利珠单抗三大NSCLC适应症已全面纳入医保，成为唯一实现晚期NSCLC医保全程覆盖的PD-(L)1抗体。 02 VEGF抑制剂 在NSCLC中的应用与市场前景 （1）贝伐珠单抗12个厂家竞争，齐鲁制药拔得头筹 血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂是一类通过阻断肿瘤血管生成进而抑制肿瘤发展的药物。代表药物为贝伐珠单抗和安罗替尼。 贝伐珠单抗（Avastin）是罗氏旗下基因泰克开发的VEGF单抗，是全球第一款抗肿瘤血管生成药物，2010年首次在国内上市，目前已获批结直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌等多个实体瘤适应症。其国内的专利于2018年到期。由于大量生物类似药的上市，整体贝伐珠单抗的销售额近几年仍在快速增长，从2019年42亿元增长到2023年111亿元。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 从2023年国内销售额竞争格局来看，在激烈的市场竞争中，百济神州的替雷利珠单抗以45亿元的销售成绩市占率第一（21%），信达生物的信迪利单抗以40亿元的销售额排名第二，市占率为19%，排名第三的为默沙东的帕博利珠单抗，32亿元（15%），未纳入医保能有这么好的成绩在于帕博利珠单抗先发优势，广泛获批的适应症和默沙东超强的销售能力。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 贝伐珠单抗的原研药为罗氏的安维汀（Avastin），于2004年获FDA批准上市，用于治疗晚期结直肠癌，之后不断拓展多个实体瘤适应症，在全球上百个国家和地区获得批准。安维汀自上市以来经常进入全球畅销药品TOP10榜单，销售额一直保持稳定，体量在68亿美元左右。 不过，随着专利悬崖的到来（中国、欧洲和美国的专利于2018年-2019年到期），以及各国药企的贝伐珠单抗类似药围猎下，安维汀的全球销售额从2019年的74.9亿美元下滑至2022年的22亿美元，销量一下子跌回到十几年前。众多玩家的生物类似药轮番上阵，导致罗氏的市场份额被逐渐瓜分，从辉煌走向衰落。 齐鲁制药摘得国产首个贝伐珠单抗生物类似药，并在2023年实现销售额54亿元，市场占比近50%，大幅超越罗氏（17%），取得榜首。齐鲁制药之所以能取胜，一方面在于抢占了市场先发优势；另一方面，还要归功于价格优势，凭借不到原研80%的价格优势，让齐鲁制药的安可达得以快速入院，实现放量增长。 （2）安罗替尼多靶点抗肿瘤血管生成，销售峰值达46亿，2023年销售额仍有38亿元 安罗替尼是正大天晴研发的一款小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI），它能有效抑制VEGFR、PDGFR、FGFR、c-Kit等激酶，从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长。于2018年在国内获批上市，目前已获批三个适应症：三线晚期非小细胞肺癌、晚期软组织肉瘤、三线晚期小细胞肺癌。 凭借正大天晴优秀的销售能力，以及安罗替尼在2018年即被纳入国家医保目录，加之其治疗无需基因检测，相较于需伴随诊断的同类药物，使用上更显便捷等多重优势，使得安罗替尼在市场上备受青睐，并取得了不俗的销售成绩。2019年销售额达25.63亿元，2019年达到峰值45.87亿元，2022年由于医保谈判降价42%使得销售额下滑。 摩熵咨询（原药融咨询）深度报告 结语 随着精准医疗技术的不断进步和临床实践的深入探索，NSCLC的治疗方案日益丰富和完善。PD-(L)1抑制剂和VEGF抑制剂作为NSCLC治疗中的两大重要药物类别，其市场表现和竞争格局均呈现出积极的发展态势。未来，随着更多创新药物的研发与上市以及治疗指南的不断更新与完善，NSCLC患者将拥有更多个性化、精准化的治疗选择。 肺癌市场研究完整报告领取方式 识别二维码领取下载 END 本文为原创文章，转载请留言获取授权  联系我们，体验摩熵医药更多专业服务 会议 合作 园区 服务 数据库 咨询 定制 服务 媒体 合作 点击阅读原文，了解更多品牌升级详情！

点击蓝字 关注我们 本周，热点不少。首先来看审评审批方面，非常值得关注的就是两个，一个是强生一线治疗BRCA突变前列腺癌的PARP复方片剂获批上市，另一个就是首药控股肺癌1类新药康太替尼申报上市；其次看研发方面，也有多个药取得重要研发进展，其中，值得一提的是口服司美格鲁肽Ⅲ期SOUL研究成功，降低心血管风险14%。最后是交易及投融资方面，海和药物与三生制药就紫杉醇口服溶液达成合作。 本期盘点包括审评审批、研发、交易及投融资三大版块，统计时间为10.21-10.25，包含25条信息。  审评审批 NMPA 上市 批准 1、10月21日，NMPA官网显示，迈博药业旗下迈博太科的3.3类托珠单抗注射液生物类似药获批上市。托珠单抗注射液是一种抗人白介素-6受体（IL-6R）单克隆抗体，原研药由罗氏（Roche）研发（商品名：雅美罗，已经在中国获批类风湿关节炎（RA）、全身型幼年特发性关节炎（sJIA）、细胞因子释放综合征（CRS）等适应症。 2、10月21日，NMPA官网显示，罗欣药业的替戈拉生片新适应症获批，与适当的抗菌疗法联用根除幽门螺杆菌。替戈拉生片是一款钾离子竞争性酸阻滞剂类药物（P-CAB），此前已在中国获批治疗反流性食管炎和十二指肠溃疡。 3、10月21日，NMPA官网显示，强生的尼拉帕利醋酸阿比特龙片（商品名：泽倍珂）获批上市，用于联合泼尼松或泼尼松龙一线治疗携带BRCA1/2突变的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）成人患者。该复方片剂由尼拉帕利和醋酸阿比特龙组合而成。尼拉帕利是PARP抑制剂，阿比特龙是一种雄激素生物合成抑制剂。 4、10月21日，NMPA官网显示，百济神州PD-1抑制剂替雷利珠单抗新适应症获批，用于联合含铂化疗新辅助治疗，并在手术后继续本品单药辅助治疗，用于可切除的Ⅱ期或ⅢA期非小细胞肺癌患者的治疗。 5、10月24日，NMPA官网显示，百时美施贵宝的玛伐凯泰胶囊（商品名：迈凡妥）获批上市，用于治疗纽约心脏协会（NYHA）心功能分级Ⅱ-Ⅲ级的梗阻性肥厚型心肌病（HCM）成人患者，以改善运动能力和症状。这是全球首创，也是目前唯一获批用于治疗梗阻性肥厚型心肌病的心肌肌球蛋白抑制剂。 申请 6、10月22日，CDE官网显示，首药控股1类新药康太替尼颗粒（CT-707、商品名：首要泽）申报上市，用于单药治疗间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者。CT-707是一种全新结构的二代ALK抑制剂。 7、10月26日，CDE官网显示，荣昌生物的注射用泰它西普新适应症申报上市，推测本次适应症为全身型重症肌无力（gMG）。泰它西普是一款双靶抗体融合蛋白，可同时靶向BLyS和APRIL。该产品于2021年3月在中国获批系统性红斑狼疮（SLE）适应症，2024年7月在中国获批第二项适应症，用于治疗类风湿关节炎。 临床 批准        8、10月22日，CDE官网显示，百济神州1类新药注射用BGB-B3227获批临床，拟开发治疗晚期或转移性实体瘤。BGB-B3227是一款MUC1/CD16A双抗，是该公司在泛肿瘤领域布局的早期产品管线之一。本次为该产品首次在中国获批IND。 9、10月23日，CDE官网显示，中国生物制药下属企业正大天晴1类新药注射用TQB2029获批临床，拟开发用于治疗多发性骨髓瘤。TQB2029是一款同时靶向GPRC5D和CD3的双特异性抗体，可通过募集和激活T细胞来诱导T细胞杀伤表达GPRC5D的恶性浆细胞，达到抑制肿瘤形成与生长的目的。 10、10月23日，CDE官网显示，中国生物制药下属企业正大天晴1类新药TQB3002片获批临床，拟开发治疗晚期恶性肿瘤。TQB3002片是一款四代EGFR抑制剂，通过与胞内酪氨酸激酶结合域的ATP位点竞争性结合，抑制相关酪氨酸激酶活性和细胞内磷酸化过程，进而抑制EGFR下游的信号传导，最终导致肿瘤细胞死亡。 11、10月25日，CDE官网显示，石药集团1类新药SYS6020注射液获批临床，拟开发治疗难治性全身型重症肌无力。SYS6020为一款基于mRNA-LNP的嵌合抗原受体（CAR）-T细胞注射液，此前，该产品治疗系统性红斑狼疮适应症已经获批临床，本次是该产品再次获得自身免疫疾病IND许可。 申请 12、10月24日，CDE官网显示，赛诺菲（Sanofi）1类新药SAR442970注射液申报临床。SAR442970是一款靶向TNFα和OX40L的双特异性纳米抗体（VHH），目前正在国际范围内处于Ⅱ期临床阶段。本次是该产品首次在中国申报IND。 优先审评 13、10月24日，CDE官网显示，第一三共的盐酸吡昔替尼胶囊（PLX3397、pexidartinib）拟纳入优先审评，用于治疗伴有重度病变或功能受限且无法通过手术改善的症状性腱鞘巨细胞瘤（TGCT）成年患者。吡昔替尼是一种口服小分子，可抑制CSF1R（集落刺激因子1受体），CSF1R是滑膜中引起TGCT的异常细胞的主要生长驱动因子。该药还能抑制KIT和FLT3-ITD。 14、10月25日，CDE官网显示，科伦博泰的注射用芦康沙妥珠单抗拟纳入优先审评，用于经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗失败的局部晚期或转移性EGFR突变非小细胞肺癌成人患者。芦康沙妥珠单抗（sac-TMT）是科伦博泰与默沙东联合开发的一款靶向TROP-2的ADC，这是该产品第三次拟纳入优先审评。 突破性疗法 15、10月24日，CDE官网显示，翰森制药的HS-20093拟纳入突破性疗法，经标准一线治疗（含铂双药化疗联合免疫）后进展的广泛期小细胞肺癌（ES-SCLC）。HS-20093是翰森制药自主研发的B7-H3 ADC，由全人源化的B7-H3单抗与拓扑异构酶抑制剂有效载荷共价连接而成。 16、10月24日，CDE官网显示，宜联生物/再鼎医药的ZL-1310拟纳入突破性疗法，用于治疗经初始含铂治疗失败的复发性小细胞肺癌（SCLC）。ZL-1310是宜联生物基于TMALIN技术平台开发的DLL3 ADC，由全人源化的DLL3单抗与拓扑异构酶抑制剂有效载荷共价连接而成。2023年4月，再鼎医药与宜联生物达成协议，获得ZL-1310的全球开发及商业化独家权益。 FDA 上市 申请 17、10月22日，FDA官网显示，箕星药业合作伙伴LENZ Therapeutics的LNZ100（1.75%醋克利定滴眼液）申报上市，用于治疗老视（即老花眼）。LNZ100是一种不含防腐剂、使用频率为每日1次的醋克利定滴眼液，PDUFA日期定为2025年8月8日。 临床 批准 18、10月22日，FDA官网显示，艾尔普再生医学的HiCM-188获批临床，是首个在美国接受用于治疗终末期心力衰竭临床评估的iPSC衍生细胞创新药。HiCM-188是一款“现货型”细胞创新药，采用人外周血来源单个核细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC），制造出人工的心肌细胞，然后注射至患者心脏，以补充新鲜的心脏肌肉细胞，延缓甚至治愈心衰。 研发 临床状态 19、10月21日，ClinicalTrials官网显示，恒瑞医药子公司盛迪医药启动了GLP-1R/GIPR双激动剂HRS9531的一项多中心、随机、开放标签、平行对照的Ⅲ期研究（NCT06649344），在二甲双胍单药或联合钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）抑制剂治疗血糖控制不佳的2型糖尿病受试者中比较HRS9531与司美格鲁肽的有效性和安全性。 20、10月21日，药物临床试验登记与信息公示平台显示，恒瑞启动了注射用SHR-A2102单药治疗妇科恶性肿瘤的Ⅱ期临床研究。SHR-A2102为恒瑞医药自主研发且具有知识产权的靶向Nectin-4的抗体药物偶联物（ADC），其有效载荷是拓扑异构酶抑制剂（TOPi），治疗晚期尿路上皮癌、非小细胞肺癌、食管癌等癌种的临床研究正在进行当中。 临床数据 21、10月21日，信达生物公布了抗VEGF-抗补体双特异性重组全人源融合蛋白Efdamrofusp alfa注射液（研发代号：IBI302）在新生血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）的临床Ⅱ期数据。研究表明，高剂量IBI302展现出了积极的治疗效果，包括视力的提高，解剖结构的改善以及长间隔的给药潜力。其中IBI302 8.0mg组维持Q12W（每12周一次）给药间隔的受试者比例为88%。 22、10月21日，诺和诺德公布了一项口服司美格鲁肽（Rybelsus）对比安慰剂作为标准护理的辅助治疗方法以预防重大不良心血管事件（MACE）发生的双盲、随机心血管Ⅲ期SOUL试验主要结果。与安慰剂相比，接受口服司美格鲁肽治疗的患者的MACE减少了14%，在统计学上具有显著优势，从而实现了试验的主要目标。 23、10月22日，吉利德科学（Gilead Sciences）和默沙东公布了其长效HIV口服组合疗法islatravir（ISL）和lenacapavir（LEN）的Ⅱ期临床试验最新结果。分析显示，在48周时，这一组合疗法保持了高比率（94.2%）HIV患者的病毒抑制（HIV-1 RNA <50拷贝/毫升）。 24、10月23日，大冢制药公布了sibeprenlimab用于治疗免疫球蛋白A（IgA）肾病成人患者Ⅲ期临床试验VISIONARY的积极中期数据。分析显示，试验达成主要终点。Sibeprenlimab是一种在研人源化单克隆抗体，它能阻断细胞因子A增殖诱导配体（APRIL）的作用。 交易及投融资 25、10月24日，海和药物和三生制药共同宣布，三生制药子公司沈阳三生获得海和药物子公司诺迈西医药旗下产品紫杉醇口服溶液的独家商业化权利（中国大陆及中国香港地区）。根据协议，沈阳三生将向诺迈西医药支付包括首付款，以及研发及销售里程碑付款。诺迈西医药将继续负责已开展的Ⅲ期临床试验及产品后续的开发、临床及注册等工作。 END 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~