BRD7 x BRD9

近期，密歇根大学王少萌团队在Journal of Medicinal Chemistry杂志上发表了题为“Discovery of CW-3308 as a Potent, Selective, and Orally Efficacious PROTAC Degrader of BRD9”的研究论文。该研究报道了一个高效的靶向降解BRD9的PROTAC分子CW-3308，该分子在小鼠体内实现了91%的口服生物利用度，单次口服剂量有效地将滑膜肉瘤HS-SY-II异种移植肿瘤组织中的BRD9蛋白降低了>90%，并有效抑制小鼠HS-SY-II异种移植瘤的生长。 背景 BRD9在非小细胞肺癌，肝细胞癌，小儿横纹肌瘤，前列腺癌，宫颈癌等多种癌症中过表达，是一个潜在的癌症治疗靶点。研究表明，SMARCB1缺失的滑膜肉瘤和恶性横纹肌样瘤细胞的存活能力对BRD9的依赖性提高。目前针对滑膜肉瘤和恶性横纹肌样肿瘤的治疗方案是有限的，通常涉及蒽环类药物和帕唑帕尼，迫切需要新的治疗方法。因此，靶向BRD9是治疗滑膜肉瘤和恶性横纹肌瘤的一种有前景的治疗策略。 目前已有多类靶向BRD9溴结构域的高亲和力小分子抑制剂被研发出来，然而，这种抑制剂不能够完全消除由BRD9调控的基因转录功能并且不能完全抑制滑膜肉瘤细胞的生长。由于序列同源性紧密，BRD9的溴域抑制剂也会与BRD7和BRD4表现出结合亲和力。为了克服这些缺点，多种靶向降解BRD9的PROTAC被报道，如：dBRD9、VZ185、QA-68、CFT8634、FHD-609、C6。其中CFT8634（口服，NCT05355753）和FHD-609（静脉注射，NCT04965753）进入临床研究阶段用于研究滑膜肉瘤和SMARCB1缺失的实体瘤患者。然而，Ⅰ期临床研究中发现，FHD-609引发了四级QTc延长，并在2023年4月被提出暂停临床研究。CFT8634作为单药治疗药物因在Ⅰ期临床阶段缺乏足够的效力也处于暂停状态。因此，目前需要开发新的BRD9降解剂。 设计优化思路 考虑到目前进入临床研究阶段的可口服的PROTAC分子选用的是CRBN作为E3连接酶，为了实现开发口服可利用的小分子，作者依旧采用CRBN配体作为E3连接酶配体设计PROTAC。因此，作者对其之前开发的两种新的CRBN配体TX-11-Me和TX-16-Me进行评估，发现其保持了与传统的CRBN配体沙利度胺和来那度胺相似的亲和力，其细胞渗透性良好，并且表现出优秀的药代动力学特性。于是，作者选择TX-11-Me和TX-16-Me作为CRBN配体进一步开发可口服的BRD9降解剂。 作者选用抑制剂BI-7273作为BRD9降解剂的另一个靶蛋白招募配体，通过共晶结构确定了BI-7273的二甲基胺基基团为溶剂暴露区，是一个合适的连接位点。 作者首先利用TX-11-Me和BI-7273作为靶蛋白招募配体设计了化合物15-18。其中，化合物18和降解剂dBRD9相比提升了近三倍的降解活性。但是18在口服给药条件下的血浆暴露量极低（< 5 ng/mL）。这可能由于化合物18由两种碱性氨组成，这导致其大体积分布和高清除率，从而限制其口服血浆暴露。 因此，作者将其中一个氨基转化成酰胺，并设计合成了19-22。酰胺键的引入在化合物18的基础上进一步提升了化合物的降解效果。但是，以化合物20为例，其血浆暴露量仍然很低并且微粒体稳定性差。 考虑到相对于TX-11-Me的中等外排率，TX-16-Me则没有外排问题，因此，作者将TX-16-Me作为新的CRBN招募配体设计合成了化合物23-26。虽然化合物的降解效力有所降低，但是以23和26为代表的化合物表现出了较好的微粒体稳定性和半衰期。并且在剂量为10 mg/kg的小鼠中，化合物26表现出良好的口服血浆暴露，而化合物23表现出极低的口服血浆暴露。 综上，作者选用化合物26，对其BRD9蛋白质招募结构BI-7273进行了进一步结构优化。共晶结构显示BI-7273的N-甲基周围还有额外的空间可供进行结构修饰。因此作者设计合成了化合物27-42。 根据化合物的降解效力，作者挑选了27，29，37进行了口服暴露量的评估。其中化合物27（CW-3308）达到了更优的口服血浆暴露量。 进一步的微粒体和血浆稳定性以及体内PK测定表明，化合物CW-3308可作为候选化合物进行后续研究。 CW-3308的生物活性评估 CW-3308在横纹肌样肿瘤细胞系G401和滑膜肉瘤细胞系HS-SY-II中以浓度依赖的方式实现了对BRD9的选择性降解。 CW-3308能够以时间依赖的方式实现对BRD9的快速降解，在1 h内实现> 90%的降解效果，并且是通过PROTAC作用机制实现的降解效果。 作者测试了CW-3308对BRD9的亲和力：CW-3308与抑制剂BI-7273对BRD9表现出相似的亲和力，并且在10 微摩尔浓度条件下对BRD4没有表现出明显的亲和力。 CW-3308在细胞培养基中的稳定性较低。这表明CW-3308的降解效果是在极短的暴露时间下实现的，体现了CW-3308作为PROTAC的高效性。 相较于抑制剂BI-7273和来那度胺，CW-3308能够有效抑制G401细胞和HS-SY-Ⅱ细胞的生长。即使CW-3308在细胞培养基中的稳定性低，也能实现对肿瘤细胞有效的生长抑制。 药效学研究表明，CW-3308以50 mg/kg口服给药条件下在3 h实现了92.5%的降解，而在24h 只实现了45%的降解。药物浓度分析显示，CW-3308在3 h的血浆和肿瘤暴露量较高，而在24 h较低，与肿瘤组织中BRD9降解数据一致。 CW-3308以25 mg/kg和50 mg/kg的给药剂量下分别实现了57%和60%的肿瘤生长抑制，并且表现出良好的耐受性。 最后作者预测了CW-3308与BRD9和CRBN形成的三元复合物之间的相互作用。其中，BRD9蛋白上ZA环的ILE53的主链羰基与CRBN蛋白上TYR357的羟基之间距离为1.91 Å，揭示了强烈的蛋白质-蛋白质相互作用。预测得到的CW-3308:BRD9:CRBN三元复合物为新型BRD9降解剂的设计提供了结构模型。 综上所述，CW-3308是一种有前景的靶向降解BRD9的先导化合物，可用于广泛评估和优化BRD9降解物的开发，用于治疗滑膜肉瘤和横纹肌样肿瘤，以及其他BRD9依赖性人类疾病。 原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.4c00971 药物筛选中心（暨南大学）对外提供新药筛选服务 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

PRESS RELEASE Amphista Therapeutics unveils new differentiated mechanism of action for BRD9 degradation at 2024 Protein Degradation in Focus Symposium First presentation of a novel mechanism of action for the degradation of BRD9 – completely differentiated from cereblon- or VHL-based PROTACs Amphista’s bifunctional BRD9 degraders selectively induce BRD9 to DCAF16 proximity and serve as molecular glues, leading to strong and rapid degradation of BRD9 Discovery further underscores Amphista’s proprietary chemistry and high-quality science which is being applied to the discovery and development of additional targeted glues beyond BRD9 Cambridge, UK, May 23, 2024 – Amphista Therapeutics (“Amphista”), a leader in next generation targeted protein degradation (TPD) approaches, today announces the unveiling of a new mechanism of action for the degradation of BRD9, an emerging target in oncology, that is differentiated from cereblon- or VHL-based PROTACs, during an oral presentation at the 2024 Protein Degradation in Focus Symposium held in Dundee, UK. This significant news for the TPD field builds upon an earlier announcement by Amphista of two compelling data sets demonstrating in vivo efficacy and central nervous system (CNS) activity of its mechanistically differentiated protein degraders. At today’s presentation titled “Degradation of BRD9 by a novel targeted glue”, Dr Andrea Testa, Scientific Co-Founder and Senior Director, Discovery Chemistry showed data from proteomic and genetic validation studies which demonstrate that Amphista’s bifunctional degraders induced degradation of BRD9 by target-assisted E3 ligase recruitment. This novel mechanism selectively induces the proximity of BRD9 to DCAF16 and serves as a molecular glue. DCAF16 is a cullin-RING E3 ligase which can facilitate degradation of proteins of interest via ternary complex formation. Induction of this complex leads to deep and rapid degradation of BRD9 in vivo. Louise Modis, Chief Scientific Officer of Amphista Therapeutics, said: “The discovery of a novel mechanism for BRD9 degradation, differentiated from cereblon- or VHL-based PROTACs, is a testament to Amphista’s proprietary chemistry and know-how. Our ability to translate this novel approach into high-quality, drug-like compounds with oral bioavailability and activity in vivo is truly exciting. As we continue to spearhead our efforts to advance new TPD approaches, our goal remains clear – to expand the offering of TPD medicines beyond CRBN and VHL-based agents and bring effective treatments to patients in areas of high unmet need.” In the results presented, Amphista’s sub-nanomolar BRD9 degraders showed activity in both solid and liquid cancer cell lines and demonstrated a high degree of selectivity over 8,000 proteins quantified by proteomics, including the closely related proteins BRD7 and BRD4. Notably, these compounds induced BRD9 degradation in a mouse xenograft model illustrating Amphista’s BRD9 degraders are orally bioavailable and active in vivo. This is the first-time in vivo degradation of BRD9 has been demonstrated via DCAF16, underscoring the potential therapeutic application of Amphista’s bifunctional degraders. Building on this knowledge, Amphista is applying its proprietary scientific know-how and expertise to the development of targeted glues which induce degradation of different targets, expanding the opportunity beyond BRD9. Future announcements will provide details of additional pipeline targets as part of Amphista’s ambitions to develop a first- and/or best-in-class portfolio of degraders with leading physicochemical properties. About Amphista Therapeutics Amphista Therapeutics is focused on transforming the lives of patients with severe diseases, including cancer and neurodegenerative disease, through the advancement of next generation targeted protein degradation (TPD) medicines. Amphista is applying its proprietary warhead chemistry and mechanistic know-how to generate bifunctional targeted glues with a differentiated mechanism and leading physicochemical properties. Its portfolio offers the potential for first- and/or best-in-class assets and expanding the offering of TPD medicines beyond CRBN and VHL-based agents. Founded by Advent Life Sciences, Amphista is a spin-out of TPD expert Professor Alessio Ciulli’s laboratories at the University of Dundee. Amphista is funded by leading life science investors including Forbion, Gilde Healthcare, Novartis Venture Fund, Advent Life Sciences, Eli Lilly & Company and The Dementia Discovery Fund, and also has strategic collaborations with Bristol Myers Squibb and Merck. For more information, please visit: Amphista and the Amphista logo are all trademarks or registered trademarks of Amphista Therapeutics Limited. For more information please contact: ICR Consilium Amber Fennell, Namrata Taak Email: Amphista@consilium-comms.com Tel: +44 (0)20 3709 5813

近日，来自诺华公司的Claudio R. Thoma和Martin Schröder 在 Nature Communications上发表了一篇题为《DCAF1- based PROTACs with activity against clinically validated targets overcoming intrinsic- and acquired-degrader resistance》的文章。报道了一种基于E3连接酶受体DCAF1的非共价PROTACs分子开发，DCAF1是CRL4连接酶亚家族中包含WD40重复结构域（WDR）的E3连接酶，作者以核蛋白BRD9和酪氨酸激酶BTK作为降解对象，证明了DCAF1的PROTACs可用于靶向降解，并提供了一种替代策略来解决VHL和CRBN耐药。 靶向蛋白质降解 (TPD) 通过小分子诱导的 E3 连接酶重定向来泛素化新底物并标记它们进行蛋白酶体降解，从而调节蛋白质水平。TPD最近已成为药物发现的关键模式。到目前为止，人类基因组编码超过600种E3连接酶，只有少数E3连接酶被用于TPD，包括 CRBN、VHL、cIAPs、MDM2、DCAF15、DCAF16和KEAP1等，基于这些E3连接酶已经开发了一些E3连接酶配体，包括常见的VHL配体VHL-7, CRBN配体免疫调节抑制药物 （IMiD）泊马度胺、来那度胺及其衍生物等。在TPD应用中，很少有其他非共价配体能与这些E3酶的效果相匹配。E3连接酶的共价配体具有一定的缺点：降低了PROTAC分子的催化性质、可能会阻断天然底物的降解、更容易产生靶向毒性。共价E3配体的不可逆性质也可能使高特异性连接酶配体产生复杂化。用于TPD最广泛的免疫调节药物是沙利度胺及其衍生物，它们已被批准用于治疗多发性骨髓瘤（MM），它是一种依赖IKZF转录因子的浆细胞恶性肿瘤。但IMiD治疗的MM患者中，大约30%的难治性患者的CRBN水平发生了改变，在大多数情况下会出现拷贝丢失，而较低的CRBN含量会导致IMiD介导的IKZF降解减少，进而出现耐药。CRBN是一种基于全基因组CRISPR KO研究的非必需基因，因此，靶向必需的E3连接酶是一种潜在的策略，可以避免或至少延缓治疗耐药性的出现。 近期WDR配体的发现（EED27和WDR52）表明WDR是可靶向的，23年一篇文章报道了DCAF1的WD40 domain的可逆配体，进一步强调了开发基于非共价DCAF1的PROTACs的潜力。在约600个E3连接酶中，作者重点研究了48个含有WDR结构域作为推定识别基序的E3连接酶。DCAF1是CRLDAF1和EDVP复合物的一部分，显示出与DDB1相似的肿瘤重要性。此外，DCAF1已被证明是Cullin4连接酶组合中的首选受体，并且是CRL4 E3连接酶中第二丰富的CRL4受体，仅次于CRBN（图1）。 利用核磁共振、计算机辅助药物设计、生物物理学和结构-活性关系等方法，作者筛选和优化了EED27的WDR配体，发现了化合物13通过伯胺占据DCAF1 WDR donut-hole口袋的支架，另一端的哌嗪位于口袋出口，可以用于后续的衍生。作者于是构建了炔基衍生的化合物16并进行了化学蛋白质组学实验，实验结果表明化合物16可以成功富集到整个CRL4-DCAF1复合物（包括CUL4A/B，DDB1，DDA1和RBX1）（图1）。 考虑到DCAF1主要定位在核质中，作者首先测试了DCAF1 PROTAC能否靶向降解BRD9。作者将已知的BRD9溴结合域配体与化合物13的哌嗪部位偶联，得到了PROTAC分子DBr-1，并通过TR-FRET和SPR评估了其对DCAF1的结合力，结果成功证明了DCAF1- DBr-1-BRD9三元复合物的形成。随后作者在细胞内验证了DBr-1的降解能力，结果显示在HEK293细胞中1000 nM的DBr-1在6 h后成功降解了90%的BRD9，且该过程可以被蛋白酶体抑制剂所抑制。浓度为1000 nM DBr-1的时间梯度降解实验显示，30 min后降解90%并保持6h以上，24h和48h后缓慢反弹。选择性实验也表明，DBr-1在降解BRD9的同时仅对BRD7有微弱的影响（图2）。 基于VHL的BRD9 PROTAC VZ185也可以降解BRD7和9，而CRBN的PROTAC dBRD9可以选择性地降解BRD9。为了评估DCAF1 PROTAC的选择性并对其性能进行测试，作者直接比较了DBr-1与VZ185、dBRD9在HEK293细胞中降解BRD9和BRD7的能力。结果显示，DCAF1的降解效果与CRBN和VHL基本相当（图3）。 在成功降解BRD9之后，作者探索了DCAF1 PROTACs是否也可以介导核外蛋白的降解。dasatinib结合超过30种激酶，并在低纳摩尔浓度下抑制ABL、DDR、TEC、SRC和EPH亚家族的57种酪氨酸激酶。作者将dasatinib偶联到DCAF1配体上，合成了另一个的PROTAC DDa-1。首先通过WB测试DDa-1对四种非受体酪氨酸激酶的作用：C-Src酪氨酸激酶（CSK）、Lck/Yes相关蛋白酪氨酸激酶（LYN）、LIM结构域激酶2（LIMK2）和Abelson蛋白酪氨酸激酶1（ABL1）。结果显示CSK和LIMK2蛋白水平在6小时后以蛋白酶体（26Si）和CRL依赖方式（NAE1i）显著降低，但LYN或ABL1蛋白水平没有下降。与CRBN-dasatinib降解剂CDa-1相比，DDa-1对这两种降解激酶的降解能力有所降低（图4）。 为了深入了解全局蛋白丰度的变化，作者利用蛋白质组学的方法分析了DDa-1处理6小时后的HEK293T细胞。证实了两种激酶CSK和LIMK2的下调，并进一步发现了另外两种非受体酪氨酸激酶TEC和TNK2显示出显著的蛋白水平降低。据报道，TEC和TNK2都优先定位于质膜。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是TEC家族的另一个成员，已被证明是PROTAC介导的劫持CRBN降解的一个有吸引力的靶标。因此作者后续构建了一个BTK筛选系统，在该系统中测试DDa-1验证了内源性BTK降解的发现（图4）。 随后作者使用一个特异性的BTK配体合成了不同的DCAF1-BTK PROTACs。选择了两个分子进行进一步的表征，DBt-5是通过一个长的聚乙二醇linker连接，而DBt-10通过一个更刚性的linker连接DCAF1和BTK配体。通过TR-FRET和SPR评估这两种PROTAC的DCAF1二元亲和性。DBt-5对DCAF1的亲和性略高于DBt-10。在TR-FRET和SPR实验中，额外的BTK增加了DBt-10对DCAF1的亲和力，而降低了更柔性的DBt-5对DCAF1的亲和力（图5）。 作者进一步评估了DCAF1-PROTAC-BTK三元复合物的形成以及两种PROTAC处理后BTK的体外泛素化。DBt-10的初始速度和最大SPR响应高，说明稳定的三元配合物可以提高泛素化效率。尽管DBt-5和DBt-10表现出不同的二元和三元配合物稳定性和细胞渗透性，但DBt-5和DBt-10都能有效降解BTK-GFP。DBt-10的毒性比DBt-5小，因此选择DBt-10进行后续实验，结果表明DBt-10具有高选择性并能显著降解BTK（图5）。以上结果证明DCAF1配体也可以用于开发高选择性的PROTACs。 作者选择缺乏VHL表达的768-O细胞作为模型。基于VHL的降解剂VZ185并不能有效降解BRD9。在相同的实验环境下，DCAF1和基于CRBN的BRD9降解剂DBr-1和DBRD9对BRD9的降解效率基本一致。这些结果证实，在VHL不表达的生物学环境中，DCAF1是PROTACs应用的另一种必需连接酶（图6）。 随后作者又测试在基于CRBN的PROTACs失去降解能力的情况下，必需的连接酶DCAF1是否可以作为替代品。DCAF1和CRBN都需要相同的结合伙伴（如DDB1和CUL4A）来形成活性E3连接酶复合物。使用CRBN-BTK PROTAC敏感和耐药的TMD8细胞来进行研究，研究结果显示用DBt-10检测TMD8 CBt敏感和耐药的细胞，结果显示BTK的降解没有差异，而使用CBt处理这两种TMD8细胞系导致了100倍的增殖抑制差异。以上实验数据表明DCAF1是一种极具潜力CRBN和VHL的替代物（图6）。 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。