TOP1MT

在过去的20年里，拓扑异构酶抑制剂被广泛用作抗癌药物。喜树碱及其衍生物作为拓扑异构酶I(TOP1)抑制剂选择性地捕获TOP1裂解复合体，成为了极具潜力的抗癌药物。为了通过靶向肿瘤来增加TOP1抑制剂在癌细胞中的积聚，TOP1抑制剂类ADC (TOP1-ADC)被广泛开发。与T-DM1等典型抗癌ADC相比，一些TOP1-ADC已显示出更强的治疗效果。第一三共“神药”Enhertu（T-DXd，DS-8201）的大获成功，更是将TOP1-ADC的研发热潮推向顶峰，国内制药公司也纷纷布局各类TOP1-ADC药物。例如，恒瑞医药通过fast follow策略开发了多个DXd系列ADC药物，与第一三共DXd系列ADC药物具有近乎一致的linker以及payload（依喜替康类似物），区别仅在于在依喜替康类似物酰胺α位引入一个环丙基。正大天晴则布局了氘代DXd-ADC技术，通过氘代规避了第一三共对DXd的专利保护。这里，我们介绍下基于喜树碱的TOP1抑制剂的各种类型、TOP1-ADCs的进展以及新开发的最大化TOP1-ADC治疗潜力的方法。喜树碱及其衍生物DNA拓扑异构酶是稳定DNA超螺旋和解决缠结的关键酶，对细胞功能至关重要。在6种人类拓扑异构酶(TOP1、TOP1MT、TOP2a、TOP2b、TOP3a和TOP3b)中，TOP1对基因组稳定性至关重要，因为它催化DNA链的断裂和重新连接，否则可能会导致DNA断裂（图1）。图1. TOP1和TOP1抑制机制喜树碱是一种天然产生的TOP1抑制剂。喜树碱衍生的TOP1抑制剂，如拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan;CPT-11)、贝洛替康（belotecan），已被批准用于治疗非小细胞肺癌、卵巢癌和结直肠癌(表1)。表1. 已被批准的喜树碱衍生的TOP1抑制剂在喜树碱衍生物中，依喜替康（exatecan）显示出巨大的前景。它的活性分别是SN-38和拓扑替康(topotecan)的6倍和28倍。在发表在《Cancer Chemotherapy and Pharmacology》上的一项题为“Potent and broad antitumor effects of DX-8951f, a water-soluble camptothecin derivative, against various human tumors xenografted in nude mice”的研究中，在裸鼠人体肿瘤移植瘤实验中，比较了盐形式的依喜替康（exatecan）(DX-8951f)与FDA批准的其他喜树碱衍生物，如拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan;CPT-11)的治疗效果。总共检查了16种人类癌症：6种结肠癌，5种肺癌，2个乳腺癌，1个肾癌和2个胃癌细胞系。DX-8951f 用药组，16株癌细胞中15株的肿瘤生长抑制率(IR)≥58%，14株癌细胞的抑制率≥80%。相比之下，CPT-11只有11个细胞株的IR≥为58%，仅有8个细胞株的IR≥为80%。此外，依喜替康（exatecan）对CPT-11耐药的胃癌细胞SC-6/CPT-11有效。而且exatecan可以克服P-gp介导的耐药性，因为它是这种膜药物转运蛋白的不相容底物。然而,依喜替康（exatecan）具有显著的胃肠道毒性和骨髓毒性，是TOP1抑制剂临床应用的典型限制因素。第一三共开发的exatecan的衍生物deruxtecan(DXd)与exatecan相比，具有类似的TOP1抑制作用，但骨髓毒性更低。因此，DXd已被用于开发安全性更高的TOP1-ADC，如DS-8201。由于DM1与膜药物转运体的相容性以及由此增加的DM1从细胞的外流，癌症患者可能获得DM1耐药性，TOP1抑制剂由此成为了对由于P-gp介导而产生耐药性患者的有效药物。TOP1抑制剂靶向递送：TOP1-ADCTOP1抑制剂已经进行了大量的临床研究，其中几种已获得FDA批准。然而化学不稳定和血浆半衰期短等障碍阻碍了它们的疗效，正常细胞中TOP1的抑制决定了剂量限制，易导致严重的副作用。因此，肿瘤靶向给药策略，如ADC，正在临床开发中以克服这些限制。为了增加TOP1抑制剂在肿瘤中的特异性传递，从而增加它们在癌症中的积累，TOP1-ADC和纳米颗粒制剂已经开发出来。纳米颗粒制剂增加了药物的溶解度和延长了半衰期，然而由于它们的被动靶向效应，其肿瘤靶向效率仍然不理想。对于TOP1-ADC，由于特定的抗体-抗原结合，抗体介导的主动靶向提供了选择性和极高的亲和力，这可以根据抗原表达水平区分肿瘤和健康细胞。因此，TOP1-ADC是增强抗体和TOP1抑制剂抗肿瘤活性的十分有效方法(图2)。此外，由于抗体的选择特异性，减少了TOP1的非靶标副作用。图2. TOP1-ADC治疗机制示意图TOP1-ADC的优化策略为了提高TOP1-ADC的癌症治疗效果，必须优化ADC的所有三个组成部分：靶向抗体、连接子和TOP1抑制剂。其中linker更是成为了设计有效TOP1-ADC的关键因素。DAR从4到8的突破DAR是每个抗体的平均有效载荷数量，它影响ADC的稳定性和药物活性。如果抗体有很高的DAR，ADC的亲水性、生物分布和药代动力学都会受到很大的影响。研究表明，携带高DAR的ADC的细胞毒性降低是因为增强了血浆清除，主要是由肝脏细胞，如肝窦内皮细胞和Kupffer细胞。因此，当前大多数ADC的平均DAR为2到4，以保持亲水性和避免聚集。随着亲水性增强接头技术的发展，具有更高DAR的ADC已成为可能。第一三共成为该技术突破的引领者。为了克服DAR 4障碍，第一三共使用了亲水连接子(GGFG)成功开发了deruxtecan ADC系列(DS-8201，U3-1402)，旨在减少ADC的疏水性和聚集性。GGFG接头使ADC具有亲水性，使得ADC具有更高的稳定性和更慢的清除。因此，实现了DAR 8的关键突破。连接子抗体结合部位不稳定性的优化Top1-ADC经常利用半胱氨酸的巯基生成ADC。马来酰亚胺是一种常见的巯基连接策略。然而马来酰亚胺的一个局限性是其在存在含硫醇物质的情况下是不稳定的，因为它可以通过逆Michael反应断裂或与HSA和GSH等内源性硫醇交换，导致在药效学、药代动力学和安全性不理想。在 7-14 天内，血浆中含有硫代琥珀酰亚胺（马来酰亚胺-硫醇反应化学键）的 ADC 的有效载荷脱落率高达 50-75%。因此，目前正在努力提高基于巯基的共轭的稳定性（图3）。a. 硫醚键形成后，通过琥珀酰亚胺的水解来打开五元环，可以很好地避免亲核试剂。并且在马来酰亚胺附近引入额外的基团，如−CH2−NH2可以极大地提高偶联后的稳定性（图3a）。b. 使用其他官能团与半胱氨酸偶联。如 N-甲基-N-苯基乙烯基磺酰胺作为连接子上的反应性官能团，可以通过双键和自由巯基之间反应，其构建的ADC产物极大地降低了逆Michael反应的几率，从而提高了ADC产物的稳定性（图3b）。c. 金属离子通过与硫原子形成化学键，可以高效、特异地介导偶联反应。寻找一种好的金属络合物来调节巯基偶联将是产生稳定的硫醚键的一个很好的策略。由芳基卤化物或三氟酸盐氧化生成的钯配合物对蛋白质或多肽上的半胱氨酸残基具有很好的选择性，反应产生巯基和芳香环之间的偶联产物（图3c）。图3. 提高硫醚键稳定性的方法获得FDA批准/正在临床试验的代表TOP1-ADCTOP1抑制剂与抗体结合的快速发展反映了现代ADC治疗的方向(表2)。SN-38已使用CL2A连接子产生了IMMU-132和IMMU-130 ADC。IMMU-132是一种人源化TROP2抗体通过可切割连接子与SN-38偶联的ADC，最近被FDA批准用于转移性三阴性乳腺癌。IMMU-130，labetuzumab govitecan，是一种CEACAM5 ADC，目前处于治疗结直肠癌的I/II期临床试验中。表2. 获得FDA批准/正在临床试验的代表TOP1-ADCs在体内肿瘤异种移植模型中， Dxd比伊立替康更有效，包括伊立替康耐药肿瘤。临床试验中Dxd相关的ADC包括DS-8201（HER2 ADC）、U3-1402(HER3 ADC)、DS-1062(TROP2 ADC)和DS-7300 (B7H3 ADC)。所有四个ADC都使用一种GGFG多肽连接子，该连接子易被溶酶体蛋白酶切割。在乳腺癌患者来源的PDX模型中，DS-8201在10 mg/kg的剂量下对HER2低表达的肿瘤显示出令人印象深刻的抗肿瘤活性，而T-DM1在类似剂量下对其几乎没有细胞毒性。在使用Capan-1胰腺导管腺癌CDX模型也有类似的结果。更重要的是，DS-8201已被证明对HER2low和HER2异质性乳腺癌的癌症患者具有令人印象深刻的治疗效果。TOP1-ADC治疗效果仍有很大的提升空间尽管TOP1-ADC的TOP1抑制剂治疗癌症的疗效已经大大提高，但TOP1-ADC的治疗效果仍有很大的提高空间（表3）。表3. 增强TOP1-ADC治疗效果的策略DNA damage调节剂PARP可以促进DNA稳定和修复。因此，PARP抑制剂可以阻止DNA稳定，推测其会使癌细胞对TOP1抑制剂更为敏感。正在进行临床研究，以调查PARP抑制剂和TOP1-ADC(DS-8201a：NCT04585958和IMMU-132：NCT04039230) 可能的协同作用。DNA损伤激活了细胞周期检查点蛋白RAD3相关激酶(ATR)及其主要下游效应检查点蛋白1(CHK1)，通过阻止细胞周期进程并为修复提供时间来保护细胞。因此抑制ATR或CHK1可以增加癌细胞对TOP1抑制剂的敏感性，是提高TOP1-ADC抗癌效果的另一种策略。最近的研究考察了ATR抑制剂(M6620和AZD6738)与TOP1抑制剂(拓扑替康/伊立替康)的联合应用。M6620/伊立替康联合治疗肺癌的I期试验(NCT02595931)和M6620/拓扑替康的II期试验(NCT02487095)正在进行中。DS-8201a和AZD6238的组合处于I期试验，以测试对75种晚期实体肿瘤的可能疗效(NCT04704661)。此外，IMMU-132和M6620的组合正在进行I/II阶段试验(NCT04826341)。免疫疗法TOP1抑制剂介导的DNA损伤可通过多种机制刺激先天和获得性免疫反应：(1) DNA损伤后DNA片段的释放，激活干扰素基因(STING)途径的刺激因子；(2) DNA损伤诱导的肿瘤微泡释放，增加免疫激活；(3)DNA损伤通过肿瘤细胞MHC I类分子诱导抗原递送，增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别。研究发现，当DS-8201与PD-1抗体联合使用时，观察到了对表达HER2的癌细胞的协同抗癌作用，推测DS-8201a诱导的MHC I类和PD-L1的上调表达是联合应用协同作用的基础。这种组合正处于乳腺癌和非小细胞肺癌患者的I/II期试验(NCT03523572和NCT03334617)。将TOP1-ADC与免疫疗法相结合的另一种方法是使用TOP1 ADC武装免疫细胞。正在努力开发将免疫治疗和化疗与肿瘤靶向能力相结合的工程化免疫细胞。目前已经开发出了ADC介导的表面工程自然杀伤(SENK)细胞。ADC与聚乙二醇偶联，然后将ADC脂质包埋在NK细胞膜上，以武装NK细胞。一旦SENK细胞产生，ADC的抗体就会将NK细胞导向癌细胞。然后，SENK细胞通过ADC介导的化疗和NK细胞介导的免疫治疗相结合，共同完成肿瘤细胞的清除。此外，也可以使用单链DNA(ssDNA)连接子生成ADC武装的NK细胞。ADC和NK细胞分别用具有互补序列的单链DNA修饰。研究发现，与裸NK细胞或ADC本身相比，携带ADC的NK细胞具有更高的治疗效果。建立检测TOP1活性的方法拓扑异构酶抑制剂的细胞毒作用与拓扑异构酶的表达水平和活性呈正相关。因此，即使TOP1-ADC成功靶向癌细胞，但在TOP1表达水平低或活性降低的患者，TOP1-ADC可能没有足够的治疗效果。目前尚不清楚拓扑异构酶水平与药物反应之间的关系是否为简单的线性关系。该局限性可以通过在治疗前监测拓扑异构酶的表达水平和活性来解决。这将需要确定一个反映拓扑异构酶活性和DNA损伤反应的biomarker。小编小结Top1抑制剂已经显示出相当大的潜力作为抗肿瘤的治疗药物；然而，它们的不良药代动力学和靶外毒性阻碍了它们的临床应用。这两种障碍都可以通过肿瘤特异性抗体靶向递送Top1抑制剂来缓解，因此开发了 TOP1-ADC药物。TOP1-ADC 的代表药物Enhertu（T-DXd，DS-8201）近年来可谓在ADC领域大放异彩，从一开始的默默无闻，一路过关斩将，凭借一己之力成功的改写了当前HER2表达乳腺癌的药物治疗格局。然而我们知道DS-8201肯定不是终点。TOP1-ADC类药物也不可避免的会出现耐药或无效的问题，目前由TOP1-ADC和其他药物的组合已发现具有很大的协同抗肿瘤的潜力，特别是在对初级治疗产生耐药性的肿瘤。因此其治疗效果仍有很大的提高空间，会成为未来的下一个开发热点。参考文献1.The Potential of Topoisomerase Inhibitor-Based Antibody–Drug Conjugates2.Cysteine-Based Coupling: Challenges and Solutions.3.Recent developments in topoisomerase targeted cancer chemotherapy.4.Potent and broad antitumor effects of DX-8951f, a water-soluble camptothecin derivative, against various human tumors xenografted in nude mice.5.Topoisomerase I (TOP1) dynamics: Conformational transition from open to closed states.