bFGF

*仅供医学专业人士阅读参考除了典型的Aβ病理和tau病理外，近年来，越来越多的研究发现，阿尔茨海默病（AD）患者的脑组织中还会出现病理性血管生成（异常血管生成）的现象，其特征为血管生成因子水平升高以及小血管密度增加。但截至目前，AD患者中病理性血管的生成是否与Aβ病理和tau病理有关，以及其在AD相关脑血管病变中的作用还不清楚。近期，中国科学技术大学申勇、高峰课题组发表了一项重要研究成果。他们分析了AD患者死后大脑样本以及中国老龄与神经退行性疾病倡议（CANDI）的队列数据后发现，AD患者脑组织中会出现血脑屏障受损，以及血管内皮标志物CD31水平升高的现象，且这一现象主要与tau病理严重程度密切相关，与Aβ病理的关系较弱。同样，研究人员在AD患者的脑脊液中发现，多种血管生成因子（比如sVEGFR2、VEGF-C、VEGF-D、PLGF、血管生成素2、Serpin E1）水平仅与p-tau181水平呈正相关，而与脑脊液中的Aβ42/40水平无关。此外，研究还发现，脑脊液中部分血管生成因子如sVEGFR1、sTIE2、血管生成素2、PLGF、IL8等水平的升高，以及uPA水平的降低，与脑血管病变和神经退行性病变加剧显著相关。该研究提示，tau病理可能通过影响血管生成因子的表达，来促进病理性血管生成，从而导致脑血管损伤、神经退行性病变和认知衰退。研究发表在Alzheimer's & Dementia上[1]。论文首页截图在本研究中，研究人员先是从中国科技大学脑库和神经退行性疾病研究中心以及埃默里阿尔茨海默病中心纳入了30例AD患者死后大脑样本，并从人脑前额皮质中提取脑血管进行分析，然后评估血脑屏障的完整性。结果发现，AD患者脑组织中会出现血脑屏障受损，以及血管内皮标志物CD31水平升高的现象。鉴于CD31水平与血管密度和血管生成有关，因此研究人员进一步探究了以上现象与AD病理之间的关系。随后的研究结果表明，在单变量分析中，CD31水平与大脑Aβ42和p-tau181水平呈正相关，而在多变量分析中，CD31水平则只与p-tau181水平显著相关，与Aβ42和Aβ40水平无关。这也意味着，AD患者中病理性血管生成主要与tau病理有关。CD31水平与AD病理之间的关系正如文章开头所说，病理性血管生成主要表现为血管生成因子水平升高以及小血管密度增加，接下来，研究人员想探究AD患者脑脊液中血管生成因子水平的变化与AD生物标志物，以及脑血管病变和神经退行性病变之间的关系。通过分析来自CANDI队列的200名参与者数据后（参与者根据临床痴呆评分CDR分组，其中44名参与者CDR=0，60名参与者CDR评分为0.5，96名参与者CDR评分≥1），研究人员发现，发现随着CDR评分的增加，参与者的血管生成因子水平呈现显著变化。随着CDR评分的增加，参与者的血管生成因子水平变化情况在所有参与者中，脑脊液中的血管生成因子sVEGFR1、sTIE2和bFGF水平升高与脑脊液中Aβ42/40水平降低、总tau或p-tau181水平升高相关，而脑脊液中的血管生长因子sVEGFR2、VEGF-C、VEGF-D、PLGF、血管生成素2和Serpin E1水平则仅与脑脊液中的p-tau181水平显著相关，而与Aβ42/40水平无显著关联。脑脊液中的血管生成因子与AD生物标志物之间的关系随后通过中介效应分析，研究人员发现，血管生成因子和Aβ病理之间的关系，也是依赖于tau病理的。也就是说，p-tau181水平升高可能通过影响血管生长因子的水平，进一步影响Aβ病理，这也进一步证明了tau病理在调控血管生成方面的关键作用。最后，在脑血管损伤和神经退行性病变方面，研究人员发现，部分血管生成因子如sVEGFR2、sTIE2、PLGF、Serpin E1和IL8的升高与脑血管损伤加剧有关，而sTIE2和血管生成素2水平升高，以及uPA水平下降则与脑萎缩加速和认知障碍（简易精神量表评估）显著相关。部分血管生成因子与脑血管损伤标志物之间的关系总之，tau病理可能在AD的病理性血管生成中起到了关键作用，而部分血管生成因子升高与脑血管损伤、神经退行性病变和认知衰退密切相关，表明病理性血管生成可能是AD进展中的一个重要因素。不过研究人员表示，本研究并没有探讨病理性血管生成的具体机制。至于tau蛋白是如何通过调节血管生成因子的表达，从而导致脑血管损伤和神经退行性病变，仍需要更进一步的研究。参考文献：[1]Gao F, Zhan Y, Wang Q, Zhang M, Dai L, Shen Y. Pathological angiogenesis was associated with cerebrovascular lesion and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. Published online January 8, 2025. doi:10.1002/alz.14521本文作者｜张金旭

本文研究中，研究人员所开发出的新型神经类器官模型表现出了与此前研究中使用鱼藤酮类似的敏感性水平，从而就进一步验证了这种新型3D类器官模型的实用性和潜能。 最近，科学家们在毒性测试领域中有一种利用体外研究来取代体内研究的趋势，因此，替代传统动物或平面细胞培养模型，或许迫切需要条件能得到严格控制的体外系统，包括细胞间的相互作用以及对低剂量化学物质的敏感性等，而由人类诱导多潜能干细胞（iPSCs）生成的神经类器官（neural organoids）或许就是模拟人类大脑发育的一种非常有前途的体外平台。 近日，一篇发表在国际杂志International Journal of Molecular Sciences上题为“Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Organoids as a Novel In Vitro Platform for Developmental Neurotoxicity Assessment”的研究报告中，来自横滨药科大学等机构的科学家们通过研究利用人类诱导多潜能干细胞开发出神经类器官从而使其作为一种新型的体外平台来进行发育性的神经毒性评估。 这项研究中，研究人员所开发的人类iPSC衍生的神经类器官模型或能更好地模拟人类大脑在早期发育阶段的结构和功能特性，这些类器官能作为一种更为准确的反应灵敏的模型来评估毒性和药物的有效性及安全性，以及环境中化学物质（尤其是农药）的神经毒性效应。通过提供一种与人类相关的三维平台，这些神经类器官就能作为一种有价值的工具来理解多种物质对机体神经发育的影响，最终或许有望促进更为安全的化学品法规的制定并改善公众的健康结局。 免疫染色图像描述bFGF在不同阶段对类器官分化的影响效应 此前针对神经毒性和神经发育毒性的研究主要是分析机体大脑的前脑和中央大脑，尤其是海马体（hippocampus），因为这些大脑区域主要会受到多种农药和有害化学物质的影响；因此，为了开发出更相关的安全评估模型，研究人员进行了前脑型大脑类器官的分化，这就为一般的神经类器官提供了更为合适的替代方案，在第50天进行荧光免疫染色后结果显示细胞骨架标志物发生了强烈表达，这就表明微管和微丝发育较好，其对于结构成熟至关重要。鱼藤酮（rotenone）是一种能抑制线粒体复合物I的植物衍生农药，尽管其半衰期较短且生物利用度非常有限，但短暂接触鱼藤酮或许也会影响人类机体的健康。 因此，相比之下，本文中研究人员所开发的3D神经模型或能拥有更接近真实神经组织的结构和功能，从而就使其对化学和环境压力变得高度敏感，与传统模型相比，这种灵敏性允许更早且更精准地检测化学物质对神经发育的毒性影响。综上，本文研究中，研究人员所开发出的新型神经类器官模型表现出了与此前研究中使用鱼藤酮类似的敏感性水平，从而就进一步验证了这种新型3D类器官模型的实用性和潜能。（生物谷Bioon.com） 参考文献： Tsunehiko Hongen, Kenta Sakai, Tomohiro Ito, et al. Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Organoids as a Novel In Vitro Platform for Developmental Neurotoxicity Assessment, Int J Mol Sci. 2024 Nov 21;25(23):12523. doi:10.3390/ijms252312523.

在大规模生产诱导多能干细胞（iPSC）的过程中，确保其质量和多能性以满足临床需求面临着诸多挑战。iPSC的多能状态极为敏感，且对培养基质有较强的依赖性。为了实现可放大的干细胞生物工艺，必须采用能够实时监测细胞分化、生长状态及活性的标记物。此外，开发适合的细胞培养模式，以支持高质量的悬浮干细胞生长，是实现工业化规模生产的关键。本文将综述在iPSC的诱导、扩增和生产过程中，如何通过优化培养基、悬浮培养模式和监测技术来维持其质量和多能性。 干细胞生产的最新进展以及挑战 干细胞疗法，包括组织移植和药物发现等应用，已被广泛用于治疗多种临床适应症，特别是在肿瘤、心脏病、免疫疾病和神经疾病等领域。因此，干细胞研究的核心目标之一是在保持细胞分化精确控制的同时，优化细胞生长策略。传统上，胚胎干细胞（ESC）因其固有的多能性而被视为细胞治疗的理想选择，这种多能性使得细胞能够分化为任何特定的细胞类型。ESC的发现为再生医学以及多种病理疾病的治疗提供了巨大的潜力。无论干细胞的来源如何，ESC在增殖过程中必须进行自我更新以维持其多能性，同时抑制向特定细胞类型的分化。 在2007年，Yamanaka及其团队实现了干细胞研究领域的一项重大突破，成功地将人类体细胞转化为具有与人类胚胎干细胞（hESC）相似的基因表达谱和多能性的细胞。这些细胞被命名为人类诱导多能干细胞（hiPSC）。iPSC的产生避免了从胚胎中提取干细胞所带来的伦理问题，使其成为研究和临床应用的一个更为有利的平台。由于其固有的自我更新能力、多能性以及相对较低的免疫原性，iPSC成为一种极具前景的、来源于患者的无限细胞资源，可用于人类遗传疾病的建模和毒理学研究，从而降低了药物开发和临床试验的总体成本和相关风险。凭借其多方面的能力，iPSC技术仍然是个性化细胞治疗和再生医学领域的一个有前途的科学工具。 目前，临床细胞治疗和人类组织再生需要大量（10^8至10^10）符合现行良好生产规范（cGMP）的临床级干细胞。然而，由于多能干细胞对支持基质的依赖以及其多能状态的敏感性，将细胞培养放大到所需规模仍面临重大挑战。在收获过程中，iPSC的最终质量取决于其代谢状态；具体而言，维持多能状态和自我更新对于生产临床级iPSC至关重要。因此，监测细胞分化状态、生长状态和活性的内在标记方法对于大规模生产具有重要意义。此外，现有平台正在不断优化，以满足cGMP标准，从而有效地将生物工艺放大到临床生产环境。本文将重点介绍iPSC细胞培养方法的最新进展，包括培养基、悬浮模式和监测技术，这些方法在一定程度上保持了iPSC的质量和多能性，以满足临床生产的需求。此外，我们还将探讨未来可能提高iPSC生物工艺效率和产量的技术。 从异质细胞群中分离iPSC 许多信号能够激活干细胞分化，因此，细胞培养条件的微小变化或对细胞的应激可能导致细胞群体的异质性分化。这构成了一个严重的安全问题，因为分化细胞的污染可能在细胞移植受体中引发潜在的肿瘤或畸胎瘤形成。然而，干细胞分化也可能自发发生，例如在细胞外基质中长期培养时观察到的间充质干细胞（MSC）的情况。为了调节这种类型的反应并保存用于未来应用的多能干细胞（PSC），已经应用了分离多能细胞和分化细胞的细胞分选方法。荧光活化细胞分选（FACS）和微孔粘附是流行的高通量方法，用于基于定义的多能性特征分离细胞，通过细胞培养条件增强多能性标记阳性干细胞的选择性。对于iPSC，当添加四种抑制剂的小分子混合物（SMC4培养基）时，分选后观察到SSEA4/TRA-1-81阳性iPSC克隆比在传统重编程培养基中分选的细胞衍生克隆增加了55倍。尽管FACS是高度自动化和标准化的，但分选单个细胞以产生稳定的多能细胞克隆仍然是一项劳动密集型且耗时的工作。因此，能够产生多能细胞群体作为池培养的方法是首选的，因为池可以保持多能标记物的长期稳定表达。为此，使用细胞表面标记抗体的磁激活细胞分选（MACS）方法已被用于生成iPSCs池。在这种情况下，用TRA-1-60和SSEA4抗体进行一轮异质性细胞池分选后，TRA-1-60和SSEA4阳性细胞的数量分别增加了28%和11%。另外几轮的MACS进一步富集了表达多能性标记的细胞群体。一般来说，MACS是比FACS更好的方法，因为它可以轻松快速地同时在多个样品上进行，同时仅对细胞施加较小的剪切应力。 尽管细胞分选技术在基于形态学和表面标志物表征干细胞群体方面表现出有效性，但其在分离动物或临床研究级别的多能干细胞方面的广泛应用仍受到限制。这主要是由于GMP级抗体的高昂成本以及临床级FACS设备和专业技能的有限可用性。因此，在未来的细胞治疗临床试验中，迫切需要开发可放大的平台，以生成可靠、均一且安全的临床级多能干细胞群体。 最佳iPSC培养基及培养基的开发 在iPSC扩增过程中，确保其质量的关键步骤之一是使用经过良好表征的材料，其中细胞培养基和基质发挥着至关重要的作用。细胞培养基通过提供营养、矿物质和pH值的良好平衡，对维持健康且增殖的细胞至关重要。细胞培养基质则作为细胞粘附和增殖的支撑结构，通常被饲养层细胞或生长支持因子包裹，以进一步促进细胞的粘附和生长。使用完全表征的细胞培养系统对于控制良好的生物工艺过程至关重要，尤其是对于生产临床级别的生物样品。在过去十年中，iPSC培养基配方和基质已经得到了显著的发展，这主要得益于对维持iPSC细胞系多能性和整体工艺可放大性的信号通路的深入考虑。 在为iPSC设计培养基时，一种有效的策略是识别多能性依赖的信号转导途径中涉及的内源性生长因子。调控干细胞多能性基因表达的途径多种多样，包括转化生长因子（TGF）-β超家族激活级联、受体酪氨酸激酶信号通路（如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的下游信号）、以及涉及胰岛素样生长因子（IGF）的途径等。值得注意的是，维持小鼠胚胎干细胞（mESC）多能性的蛋白质和生长因子（如骨形态发生蛋白（BMP）和白血病抑制因子（LIF））与人类胚胎干细胞（hESC）不同。多能干细胞在维持多能性和自我更新方面可能需要不同的生长因子。例如，bFGF已被确定为维持体外hESC自我更新的关键添加物，在无饲养层培养物中其浓度通常在40 ng/ml到100 ng/ml之间。此外，Wnt/β-catenin信号通路与hPSC的自我更新相关，尽管单独添加Wnt3a不足以在没有饲养层细胞的情况下维持未分化的hESC。由于这些代谢研究主要在hESC上进行，而非iPSC，因此需要对iPSC进行更深入的表征，以便设计培养基，并考虑每种新细胞系在临床应用中开发的独特要求。 通过提供特定的干性支持因子以及创造富含细胞外基质（ECM）的环境，基于饲养层细胞的基质可以防止干细胞自发分化，并改善ESC和/或iPSC的附着。最常用的饲养层细胞是增殖失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），因为它们能够产生多种对维持多能性至关重要的蛋白质，如TGF-β1、激活素A、BMP-4和多营养因子（肝素结合生长因子）等。然而，由于饲养层细胞的增殖能力有限，经过多次传代后，其支持iPSC多能性的效率会降低，且在分离iPSC过程中存在较高的污染风险，这在大规模生产iPSC时会引发相关技术挑战。此外，动物源性饲养基质可能增加病原体和未知病毒向宿主细胞转移的风险，从而导致免疫系统的排斥反应。因此，iPSC的培养方法主要转向使用ECM蛋白、条件培养基或合成生物材料，以实现无动物成分和无细胞（称为“无饲养”）的培养系统。 在过去十年中，随着培养基技术的进步，iPSC细胞培养基质逐步达到了cGMP标准。最近的研究表明，长期使用动物源性血清和含异源分子的培养基可能会影响细胞形态、扩增潜力、基因表达和细胞因子谱。这促使了无异源成分培养基（XFM）配方的开发，随后是无动物源性成分（ACF）培养基，以支持iPSC的扩增。在已开发的ACF培养基中，Essential 8™（Thermo Fisher Scientific）培养基是iPSC培养中使用最广泛的基础培养基之一，因为它包含了8种对干细胞增殖至关重要的成分：DMEM/F12、L-抗坏血酸、磷酸镁、硒钠、FGF-2、胰岛素、NaHCO3以及转铁蛋白、TGF-β1或Nodal。 无饲养iPSC扩增技术的发展为未来的自动化生产提供了可能性。事实上，利用CompacT SelecT™细胞培养系统，在无饲养条件下，大规模自动化生产未分化的iPSC是可行的。在这种情况下，使用含有Activin A和FGF-2的化学限定培养基（CDM）进行自动传代的聚体hiPSC能够保持其特征形态和多能性标记物的表达。生物材料也被探索作为无饲养iPSC培养系统的增强基质。例如，一项研究发现，具有最佳弹性（25 kPa）的水凝胶基质能够使细胞保持多能性。进一步的研究表明，接枝到水凝胶（储存模量为25 kPa）上的双链体外连接素衍生的寡肽支持hESC和iPSC的长期生长，可持续超过10代。细胞外基质（ECM），如纤维连接蛋白、层粘连蛋白和玻璃体连接蛋白，或来自ECM的寡肽，具有特定的细胞结合结构域，使其成为支持iPSC在无饲养基质系统中生长的重要成分。3D生物打印和细胞/组织打印技术也为未来的工艺放大和自动化提供了新的可能性。最近的研究表明，当iPSC在涂有纤维连接蛋白的无饲养壳聚糖或聚氨酯膜上驯化和扩增时，细胞打印技术的有效性得到了验证。在这项研究中，嵌入热敏聚氨酯（PU）水凝胶基质的iPSC显示出更高的活性。然而，需要进一步优化基于聚合物的无饲养基质，因为PU水凝胶培养的多能性标记（如OCT4和NANOG）与对照MEF饲养层培养存在差异。 细胞培养动力学不仅决定了iPSC的最终行为，还影响了整个生物工艺的成本。尽管在具有监测和反馈控制pH值和溶解氧（DO）能力的一次性多层培养器皿中，已经证明了在2D静态培养中大规模生长hPSC的可行性，但在2D或3D静态基质上大规模生产hPSC仍是一种成本高、劳动密集且空间需求大的方法。已知静态培养条件会导致培养基成分、代谢废物、旁分泌因子和气体的不利梯度。目前的共识是，动态悬浮培养是实现临床应用所需的多能干细胞密度的最佳方法，目前正积极开发高效且可放大的悬浮多能干细胞扩增的新策略。例如，可以利用成功的基质研究来设计最佳的悬浮培养模式。 iPSC悬浮方式的关键考虑因素 (聚集体、微载体和微胶囊) 无基质的iPSC悬浮培养系统克服了静态基质在放大生产方面的局限性，同时支持iPSC的生长和多能性维持。由于iPSC的贴壁特性，在悬浮体系中接种和扩增时，会自发形成3D聚集体（或球体）。这些iPSC聚集体与胚状体（EB）相似，因此可以作为扩增后直接进行谱系分化的有效途径。iPSC聚集体的生长和多能性主要受微环境、聚集体大小分布和细胞培养罐大小的影响。已有研究对培养条件进行了优化，使得hiPSC在转瓶中于E8™无饲养条件下，以未分化的悬浮细胞聚集体形式扩增超过10代。此后，搅拌悬浮培养已扩展至3000 ml的一次性生物反应器（1000 ml工作体积），以生产大量的hiPSC聚集体（多达2x10^9个细胞），同时保持多能性标记物的表达，包括TRA-1-81、SSEA-4、OCT4和SOX2。 然而，动态悬浮培养中iPSC聚集体的扩增存在一些限制。与静态悬浮培养相比，其扩增效率较低，且聚集体大小分布不均匀。若不加以控制，细胞团块（>800 μm）的形成可能导致细胞活性下降、自发分化增加、营养和氧气扩散梯度加剧，以及整体扩增过程变慢。通过优化搅拌桨类型和搅拌速度，可以有效控制iPSC培养中的聚集体尺寸。垂直轮生物反应器（VWBR）是一种新型的生物反应器系统，能够在扩增iPSC的同时降低聚集体的大小。该系统通过垂直叶轮搅拌实现容器内的高效均质化。使用该系统，在保持多能性的同时，成功产生了平均直径为350 μm的聚集体（最高密度可达2.3x10^6 cells/ml）。 培养基添加剂对聚集体的形成有显著影响。例如，在hiPSC聚集体的扩增过程中，短期应用维甲酸（RA）可以进一步维持其多能性。类维生素A通过提高多能依赖性转录因子（如Nanog和Oct4）的表达以及激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路来支持iPSC的自我更新。此外，在化学限定培养基中添加Rho相关卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制剂Y27632可以促进多种悬浮罐类型中从单细胞接种开始的iPSC聚集体的形成。ROCK抑制剂通过减少解离诱导的细胞凋亡和提高克隆效率来支持干细胞聚集体的存活。然而，最近的研究表明，长期暴露于ROCK抑制剂会改变iPSC的代谢特性。因此，培养基添加剂、接种策略和生物反应器设置是优化生物工艺产量的关键参数。通过进一步优化，可以实现足够用于临床应用的iPSC聚集体的大规模生产。在这种模式下，需要改进营养物质的运输机制和聚集体的大小分布，以在高密度条件下保持细胞聚集体的多能性和活力。 微载体 在生物反应器系统中加强干细胞培养扩增的工作已经在微载体的应用方面取得了显著进展。微载体的优势在于它们提供了一个表面积以支持多能干细胞（PSC）的生长和附着，同时保留了动态悬浮培养系统的特点。微载体可用于细胞种子制备，如果是可生物降解的，还可以在治疗过程中用于将细胞运送到受损组织。各种生物可降解材料通常用于制造针对细胞系扩增的微载体，包括葡聚糖、胶原蛋白、明胶、聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚L-乳酸（PLLA）、聚苯乙烯（PS）和羟基磷灰石（HA）。与较大的静态基质类似，微载体通过其表面电荷的适当调控，以及当被细胞外基质（ECM）蛋白（如玻璃体连接蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白）包裹时，为PSC的生长提供了进一步增强的支持。搅拌微载体培养系统已被证明可以促进贴壁依赖性干细胞的扩增和规模放大，同时为监测和控制干细胞健康和分化提供了必要的工具。通过增强氧气供应和代谢物的质量传输以及降低微环境毒性，PSC的产量得以提高。 然而，在使用微载体扩增hiPSC时，存在一些需要考虑的问题。微载体的限制主要取决于其直径（100-400 μm）、密度（通常为1 g/ml）和化学成分，这些因素会影响细胞的附着，从而影响扩增能力。由于微球的表面积有限，hiPSC的峰值密度似乎受到微球与细胞比例的限制。附着在微载体微球上的细胞需要经过酶解和过滤处理，这可能会损害细胞的活力和多能性，具体取决于所采用的方法。为了解决这一问题，生物可降解微载体正在开发中。与传统的聚苯乙烯（PS）微载体相比，无异源可溶性微载体的开发取得了显著进展，使得转瓶中的细胞回收率大幅提高。 搅拌式生物反应器会对微载体微球施加流体动力剪切应力，这可能会影响hiPSC的整体健康和多能性。通过优化生物反应器的工艺参数（如搅拌速率），可以减轻剪切应力对iPSC的不利影响。例如，Gupta及其同事的研究表明，在转瓶中，iPSC在微载体上的长期附着、多能性和扩增依赖于维持25 RPM的最佳搅拌速度。这种参数优化方法需要应用于更大规模的iPSC扩增（如生物反应器）。 微载体微球的制造成本是另一个需要考虑的问题，因为根据所使用的材料和添加剂，该工艺可能会变得异常昂贵。因此，微载体材料应具有成本效益，如果可能的话，应可回收，并且在每次生产运行后可消毒。目前，基于微载体的iPSC培养方法正在开发中，旨在通过控制良好的生物工艺系统实现人类iPSC在细胞治疗和组织工程中的持续扩增和回收。 利用微载体制备人诱导多能干细胞 (hiPSC) 的生物工艺研究进展，典型工艺包括静态培养、放大工艺、下游工艺和制剂，微载体通常在放大过程中引入，在下游工艺过程中去除。 微胶囊化 微胶囊与将细胞附着在微球表面的微载体不同，微胶囊化涉及将细胞捕获在球形胶囊内，细胞生长所需的营养物质、氧气和其它生长因子可以通过球形胶囊扩散。球形胶囊由半透性材料或膜组成，在悬浮培养系统中可以保护细胞免受聚团和剪切力的影响。用于生成微胶囊的生物材料包括海藻酸盐、琼脂糖、尼龙、胶体、聚苯乙烯、丙烯酸酯、聚赖氨酸-海藻酸盐水凝胶、醋酸纤维素-乙基纤维素和聚酯膜。通常通过乳化或挤压方法捕获细胞，形成保护管，使细胞增殖。总的来说，聚合物微胶囊与凝胶微胶囊相比具有一定的优势，包括生物相容性和GMP相容性。每单位体积的胶囊材料可以容纳更多的细胞，并且由于在胶囊内空间存在液体细胞悬浮液，聚合物胶囊中的颗粒间扩散限制不那么严重。 在微胶囊系统中培养的干细胞既可以维持多能性，也可以被诱导分化，这取决于其胶囊的组成和微环境中存在的生长因子。微胶囊化技术在大规模生产中所面临的缺点与微载体类似，即制造成本和有限的表面积。此外，一些干细胞类型，如hMSC，在没有添加肽或蛋白质（如纤连蛋白）的情况下被包裹时 (例如，在海藻酸盐中) 增殖困难，前者可改善细胞附着。相比之下，如果细胞附着增强，在收获过程中回收被包裹的细胞可能会带来更困难的挑战。 iPSC监测技术、计算机建模和质量设计 hiPSC敏感的多能性受到细胞微环境、代谢和信号通路变化的影响，因此对需调节干细胞分化的细胞治疗和组织工程方法的发展构成了重大挑战。细胞聚集体悬浮培养和微载体系统的最新进展为有朝一日实现大规模生产用于各种临床应用的hiPSC提供了希望。然而，未来大规模生物反应器 (>5L) 的利用需要开发新的生物反应器监测技术，以便在控制干细胞分化的同时优化iPSC生产过程。 目前有几种离线分析方法可用于生物反应器监测，其中许多方法确定重要的过程变量，如细胞计数、细胞活力和培养基中特定成分的浓度。通常使用染料排除法 (即台盼蓝排除显微镜) 和流式细胞术来测量细胞浓度和活力，而一些流式细胞术也可以量化PSC群体。最近为提高iPSC表征工作的通量所做的努力表明，将荧光细胞条形码 (FCB) 结合到流式细胞术中可以识别多能性和细胞异质性。尽管条形码方法对连续平台不实用，但它们是有用的离线质量控制 (QC) 测试方式。质谱 (MS) 和高效液相色谱 (HPLC) 已被联合用于代谢组学和蛋白质组学研究，确定指示或影响多能性的代谢标记物和途径。这些发现揭示了在代谢物水平上预测和监测iPSC分化的计算机建模的必要性。有趣的是，糖酵解和蛋氨酸代谢被发现调节造血干细胞的分化，因此，模拟这些途径中涉及的关键代谢物的行为可能是一个合适的起点。与此同时，高效液相色谱和质谱系统也得到了改进，以促进在线和近线测量，例如采样自动化，但这些技术仍然受到维护成本和处理样品所需时间的限制。Western blots、qPCR或RT-PCR和免疫组织化学 (ELISA) 是常用的检测方法，通过检测相对于天然ESC的ESC标记基因的表达水平，来确定hiPSC在特定时间点的代谢功能和分化状态。总的来说，在整个制造过程中，有几种有效的离线分析方法可以确定iPSC的多能性和质量。然而，非自动化离线分析测试的样品收集和准备，以及仪器和试剂盒的成本和维护，限制了过程的可放大性，增加了生产成本，牺牲了样品，并存在培养污染的风险。此外，样品采集和数据输出之间的时间延迟大大限制了它们作为过程控制技术的实用性。 为了提高工艺可放大性，生物制药行业最近开始采用质量源于设计 (QbD) 战略，其中工艺和产品管理基于科学知识和风险评估。通过这种方式，可以利用传感器或其它实时检测变化的分析技术开发更灵活的生产工艺，允许通过数据驱动的过程控制进行快速响应，从而在潜在的运行故障发生之前减轻故障。QbD框架通过将可测量的细胞群体的分子和细胞特征与最终产品质量联系起来来运作。就iPSC而言，有效的QbD策略需要实时测量影响干细胞多能性和自我更新的关键参数。 在线传感器在生物反应器过程实时监测方面很有应用前景，包括目前最先进的DO和pH探针。先前的研究表明，缺氧和生物反应器流体动力学可以共同诱导hiPSC向心肌细胞分化，因此，DO水平是生产过程中维持iPSC质量的关键工艺参数。光谱方法，如拉曼和近红外，也可以作为有用的在线探针来监测代谢物 (葡萄糖、乳酸等)，因此，在开发化学计量模型和机器学习算法时，可以提供有用的信息，实时预测和调节iPSC多能性。除了标准的工艺特征外，可重复和稳定形成的hiPSC聚集体对工艺可放大性至关重要。在这方面，某些光学技术显示出作为实时监测细胞健康和分化状态的工具的潜力。例如，双光子激发 (TPE) 荧光显微镜光学测量NAD(P)H和FAD的自身荧光已被证明是监测三维组织构建中细胞分化的有效技术。结合荧光寿命成像显微镜( FLIM)， TPE可以通过NAD(P)H和FAD的光学氧化还原比和荧光寿命来确定MSC的分化状态。通过对NAD+/(NADH + NAD+)的LC-MS/MS测量证实，在分化的MSC培养物中观察到光学氧化还原比值的下降，这是为生物反应器设计的TPE-FLIM探针的潜在能力的一个例子。利用TPE-FLIM作为iPSC监测工具，必须开发一种稳健而灵活的TPEM探针，可以接近生物反应器内的细胞并收集在线数据；然而，目前还没有这样的产品存在。最近，一种原位显微成像装置被开发出来，用于实时可视化和监测连续搅拌罐生物反应器中hiPSC聚集。虽然聚集体大小的控制对维持多能性很重要，但分化进展的直接指示只能通过安装荧光显微镜模块来实现。毫无疑问，仍然需要新的创新工具，结合显微镜成像和荧光检测来评估hiPSC在动态培养中的多能状态。 质量控制措施和考虑因素 为了充分发挥iPSC衍生疗法的潜力，iPSC需要在临床级GMP标准下生产。这是一个复杂的过程，其中iPSC细胞系、传代和关键质量属性 (CQA) 可比性的表征和论证是必不可少的，并且有充分的记录。CQA被定义为生物、化学或物理性质，这些性质应保持在适当的限度内，以维持或控制最终产品的质量。随着自动化、封闭细胞培养系统和经过验证的测试方案的发展，iPSC生产线工业化的目标比以往任何时候都更接近。国际干细胞库倡议 (ISCBI) 最近为临床级hiPSC注册提供了推荐指南，包括：（i）多能性测试; （ii）体外和体内分化测试；（iii）核型分析显示遗传稳定性；（iv）细胞身份鉴定；（v）通过干细胞阵列分析基因表达特性；（vi）微生物试验。 目前用于iPSC扩增的GMP级培养系统需要多次更换培养基和传代，这导致了显著的可放大性、可重复性和成本挑战。由于这些原因，目前个性化iPSC生产的财务成本对大多数患者来说是负担不起的，因此，iPSC库的构建将是有益的。全球iPSC治疗联盟 (GAiT) 的成立旨在支持针对临床应用的iPSC库的创建和全球协调。Alvarez-Palomo及其同事总结了创建临床级iPSC库的关键考虑因素和标准操作程序。 iPSC领域的一个主要QC问题是遗传组稳定性。由于可获得的长期临床数据有限，需要制定严格的遗传稳定性检测指南。先前涉及iPSC的临床试验因在细胞重编程过程中观察到单核苷酸变异(snv)和拷贝数变异(cnv)而暂停。因此，全基因组测序(WGS)，包括snp和比较基因组杂交(CGH)阵列，被推荐作为iPSC产品进入临床前的QC测试。用于生成hiPSC的基因转染平台也对基因组整合带来了巨大的安全问题。由多肽生成的非转基因PSC效率较低，mRNA/miRNA转染需要多个步骤，这就产生了批次间的可变性。毋庸置疑，在整个细胞治疗生物工艺中，遗传标记验证对于开发安全有效的治疗方法至关重要。 结束语和未来展望 在过去的十年中，hiPSC生物工艺技术有了显著的进步，但在临床应用和新产品推出方面的进展仍然缓慢。主要挑战来自基础生物科学和当前大规模生产平台的局限性。现有的hiPSC工艺开发和生产方法是劳动密集型的，这在很大程度上限制了工艺的可放大性，并导致不可预测的批次间可变性。业界一致认为，生产iPSC的最佳方法是悬浮培养，从而提高细胞的生长能力。当选择悬浮方式进行放大时，应考虑将多能性iPSC的生长特征与其随后的分化细胞类型结合起来的工艺，因为一些研究已经发现了多种有益的基质来生长特定类型的高质量iPSC。与重复批次工艺相比，完全自动化的灌流操作与培养环境的反馈控制将允许营养物质的持续置换，并获得显著更高的细胞产量。由于诱导多能干细胞的应激敏感性，目前的灌流系统仅成功用于小鼠诱导多能干细胞。然而，使用现有的ACF培养基和微载体悬浮微球成功扩展hiPSC，表明该行业未来有能力实现可放大的高质量PSC密度。此外，存在进一步推进iPSC工艺发展领域的额外机会。 随着新技术和新模式的出现，需要工艺友好的表征方法和监测工具来控制iPSC在生产过程中的质量。由于基因组和代谢组稳定性对hiPSC的重要性，基因组维度的模型可用于确定影响多能性的关键工艺参数，并指导生产过程中生长表型的优化。此外，结合图像和荧光显微镜的更灵敏的细胞质量检测工具将进一步增强实时监测干细胞分化的PAT。随着这些分析工具的发展，进一步的培养基优化和QbD策略的扩大，临床级iPSC的大规模生产的目标将在未来十年实现。 参考资料：A.Polanco, B.Kuang, S.Yoon, Bioprocess Technologies that Preserve the Quality of iPSCs. Trends in Biotechnology, 2020. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。