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引言 衰老不仅是一个不可避免的生理过程，更与多种年龄相关疾病如心血管疾病、神经退行性疾病和代谢紊乱密切相关。如何延缓衰老、提升健康寿命（healthspan）一直是科学界的核心议题。近年来的研究表明，热量限制（Caloric Restriction, CR）作为一种非药物干预手段，不仅能有效延缓衰老，还能够改善多种物种的健康状况。然而，CR的分子机制却一直未被完全揭示，尤其是在细胞代谢和能量调控的层面，其核心调控因子如何响应这一干预仍存在许多未解之谜。 AMPK（AMP-活化蛋白激酶）作为能量代谢的关键调控者，一直被认为是CR带来抗衰老效益的重要介质。在热量限制条件下，AMPK的激活能够调节细胞能量平衡，提升线粒体功能并抑制炎症反应。然而，令人好奇的是，一种称为石胆酸（Lithocholic Acid, LCA）的胆汁酸代谢产物被发现能够模拟CR的抗衰老效应。这一发现不仅为代谢调控与衰老的研究打开了新的视野，更让研究者们开始探究LCA与AMPK之间的分子联系。 12月18日Nature的研究报道“Lithocholic acid binds TULP3 to activate sirtuins and AMPK to slow down ageing”，聚焦于LCA通过溶酶体信号通路（lysosomal signaling pathway）激活AMPK的机制。通过一系列生化、分子和动物实验，研究人员发现，LCA能够增强去乙酰化酶Sirtuins的活性，从而去乙酰化并抑制溶酶体质子泵v-ATPase的关键亚基V1E1。这一过程通过调控溶酶体葡萄糖感应通路，最终实现AMPK的激活，并带来与CR相似的抗衰老效益。这项研究不仅揭示了LCA在代谢和衰老调控中的重要作用，还为开发靶向AMPK的抗衰老策略提供了全新的分子靶点和理论依据。 衰老的“刹车”：热量限制与AMPK的角色 衰老是生命进程中的自然现象，但却伴随着多种代谢性疾病和生理功能的衰退。如何延缓这一过程并提升生命质量，成为科学界的重要研究方向。在众多抗衰老策略中，热量限制（Caloric Restriction, CR）因其广泛的跨物种适用性和显著的抗衰老效应，备受瞩目。从线虫到果蝇，再到哺乳动物的研究表明，长期减少热量摄入能够有效延缓衰老，并改善机体的健康状况。CR的奥秘究竟何在？答案的核心，指向了细胞代谢的“能量调控器”——AMPK（AMP-活化蛋白激酶）。 AMPK是细胞内的“能量卫士”，在能量不足（如低葡萄糖水平）时被激活，帮助细胞恢复能量平衡。它通过抑制能量消耗途径（如脂肪生成）并增强能量生成途径（如脂肪酸氧化和线粒体功能），在细胞代谢调控中扮演关键角色。在衰老过程中，AMPK的活性逐渐下降，导致细胞代谢紊乱、氧化应激和炎症的增加，而CR通过增强AMPK的活性，能够逆转这些衰老相关的变化。 研究发现，CR通过多种机制激活AMPK。其中，溶酶体这一细胞器在这一过程中发挥了独特作用。溶酶体作为能量传感的“中枢站”，在葡萄糖水平下降时启动AMPK信号通路，从而调控细胞的代谢状态。AMPK的激活不仅促进线粒体数量和质量的提升，还能够减少炎症和氧化损伤，这是CR抗衰老效益的核心。 此外，AMPK的作用不仅局限于代谢调控，它还通过与下游因子的协同作用参与调节细胞自噬、基因表达和蛋白质稳态，这些机制共同为延缓衰老提供支持。可以说，AMPK如同为细胞装上了一套智能“刹车系统”，在热量减少的情况下精准调控细胞代谢，帮助机体延缓衰老。 从胆汁酸到长寿：石胆酸的惊人发现 当我们谈论胆汁酸时，许多人会将其与脂肪代谢联系在一起。然而，研究人员最近发现，一种名为石胆酸（Lithocholic Acid, LCA）的胆汁酸代谢产物，不仅仅是消化系统的副产品，它还是一种“分子钥匙”，能够解锁抗衰老的新机制。LCA作为一种热量限制（CR）的模拟因子，可以在不改变饮食摄入的情况下诱导类似CR的抗衰老效应，这一发现为衰老和长寿研究带来了新的曙光。 研究显示，LCA在热量限制的条件下会在哺乳动物体内积累，其水平的升高与CR的抗衰老效应密切相关。那么，LCA是如何发挥作用的呢？研究人员发现，LCA可以通过溶酶体信号通路（lysosomal signaling pathway）直接激活AMPK（AMP-活化蛋白激酶），从而模拟CR带来的代谢和抗衰老效益。这种机制的独特之处在于，LCA并非通过改变细胞内AMP/ATP或ADP/ATP的比值，而是通过溶酶体的葡萄糖感应系统来触发AMPK的活化。 更令人惊叹的是，LCA的这种效应已经在多种模式生物中得到验证。在线虫、果蝇和老鼠的实验中，LCA能够延长它们的寿命，同时改善健康寿命（healthspan）。比如，在肌肉特异性表达LCA效应通路的老鼠中，其肌肉功能得到了显著改善，线粒体质量提高，能量代谢得到优化。此外，研究还发现，LCA不仅仅是CR效应的简单模拟，其抗衰老益处甚至能在某些情况下超越CR。 通过这些发现，LCA被认为是一种强大的抗衰老分子，可以直接作用于细胞的代谢调控网络。 石胆酸（LCA）通过v-ATPase的去乙酰化激活AMPK（Credit: Nature） V1E1亚基去乙酰化与AMPK激活的关系（a） 研究通过使用表达HA标记的V1E1野生型或突变型（如3KR突变，模拟去乙酰化状态）的MEF细胞，评估了AMPK的激活水平。免疫印迹实验表明，去乙酰化状态的V1E1（3KR突变）显著增强了AMPK的激活，而其他突变体（如乙酰化状态的突变）无法产生类似效果。这表明V1E1去乙酰化是LCA诱导AMPK激活的关键。 v-ATPase功能的抑制（b） 通过Lysosensor荧光染料检测溶酶体酸化水平，研究发现，与野生型V1E1相比，3KR突变体显著抑制了v-ATPase的活性。这表明去乙酰化的V1E1可以抑制v-ATPase功能，从而触发下游信号。 溶酶体定位与信号转导（c） 免疫荧光实验显示，V1E1去乙酰化能够促进AXIN蛋白在溶酶体的共定位。这种定位变化是溶酶体信号通路激活的重要步骤，与AMPK的激活直接相关。 V1E1乙酰化状态对AMPK激活的调控（d） 比较了模拟恒定乙酰化状态的V1E1突变体（3KQ）和去乙酰化状态突变体（3KR）在LCA处理下对AMPK激活的影响。结果显示，3KR突变显著激活AMPK，而3KQ突变几乎完全阻断了AMPK的激活，这进一步证实了V1E1去乙酰化在LCA信号中的核心作用。 热量限制和LCA对V1E1去乙酰化的影响（e–g, i-k） 在LCA处理（1 μM）和热量限制（CR）条件下，V1E1亚基（尤其是K99位点）的去乙酰化水平在MEF细胞、肌肉和肝脏中显著增加。特别是，用CR处理4个月或用LCA处理1个月的小鼠，其肌肉和肝脏中V1E1(K99)ac水平显著降低，与AMPK的激活呈负相关。 LCA诱导去乙酰化与AMPK激活的时间动态（h） 在LCA处理的时间曲线实验中，V1E1(K99)的去乙酰化水平随着处理时间的延长逐渐增加，而AMPK的激活水平与之呈反向关系，AMPK在处理4小时后达到激活峰值。这表明V1E1去乙酰化与AMPK激活之间存在直接的动态关联。 溶酶体的秘密：细胞内的能量传感器 在细胞的代谢调控网络中，溶酶体不仅仅是“废物处理站”，它还是能量代谢的关键传感器。近年来的研究揭示，溶酶体作为感知细胞内能量状态的核心调控器，能够通过一系列复杂的信号传导路径调控能量平衡。在抗衰老的研究中，溶酶体因其独特的功能而备受关注，尤其是在石胆酸（LCA）介导的抗衰老效应中。 溶酶体的关键功能之一是通过其质子泵复合物v-ATPase监测细胞内葡萄糖水平。当葡萄糖供应不足时，溶酶体通过一条特定的信号通路激活AMPK（AMP-活化蛋白激酶），从而触发细胞对能量不足的应激反应。而LCA则以一种独特的方式直接作用于这一信号通路。研究显示，LCA能够通过去乙酰化溶酶体质子泵的关键亚基V1E1，抑制v-ATPase的活性，从而激活AMPK。这一过程与热量限制（CR）带来的AMPK活化机制非常相似，但LCA无需通过减少能量摄入即可实现这种效应。 实验数据表明，当LCA作用于溶酶体后，质子泵的活性显著降低，溶酶体内的酸性环境被打破。这一变化直接触发了AXIN与溶酶体标志蛋白LAMP2的共定位，并通过LKB1（一种AMPK上游激酶）实现AMPK的快速活化。通过突变体实验，研究者进一步确认了V1E1的去乙酰化对于这一过程至关重要。值得注意的是，LCA对AMPK的激活不依赖传统的AMP/ATP比值的变化，而是通过溶酶体的葡萄糖感应途径这一新颖机制实现。 这些发现为溶酶体的功能提供了新的视角，不仅揭示了其作为能量感应器的重要性，还将LCA推向了抗衰老研究的前沿。 去乙酰化开关：LCA如何控制AMPK的启动按钮 在细胞的能量调控中，去乙酰化修饰就像一个“分子开关”，精准地控制着信号通路的开关与闭合。而在石胆酸（LCA）诱导的AMPK活化过程中，这一“开关”发挥了关键作用。研究发现，LCA通过促进溶酶体质子泵v-ATPase的关键亚基V1E1的去乙酰化，实现了AMPK的高效激活。这一过程的核心，正是去乙酰化修饰如何精准调控溶酶体信号通路。 v-ATPase是一种位于溶酶体膜上的质子泵，其功能依赖于亚基的乙酰化状态。在未受LCA作用时，V1E1亚基的K52、K99和K191这三个关键赖氨酸位点处于乙酰化状态，这使得v-ATPase保持正常的质子运输功能。然而，LCA通过激活去乙酰化酶Sirtuins家族（尤其是SIRT1），去除了V1E1亚基上的乙酰化修饰。突变体实验进一步证明，这种去乙酰化状态（通过突变模拟为去乙酰化的3KR）会显著抑制v-ATPase的活性，导致溶酶体内的pH上升，触发下游信号通路。 V1E1的去乙酰化不仅抑制了v-ATPase的质子泵功能，还直接影响了溶酶体对能量状态的感知。这种状态变化引发了AXIN与溶酶体标志物LAMP2的共定位，同时通过LKB1激酶将信号传递至AMPK，从而实现AMPK的快速活化。时间曲线实验表明，LCA处理仅1小时后，V1E1的K99去乙酰化开始显现，而AMPK的激活水平也随之上升，最终在4小时左右达到峰值。这种精准的分子调控，揭示了LCA通过V1E1去乙酰化触发溶酶体反应的核心机制。 这些发现将去乙酰化修饰的作用推向了前所未有的高度。V1E1的乙酰化状态不只是结构上的“装饰”，更是调控溶酶体功能和AMPK信号通路的“开关按钮”。 重塑能量：LCA与Sirtuins的“双剑合璧” 在细胞代谢的复杂调控网络中，Sirtuins（沉默信息调节因子）家族以其独特的去乙酰化功能，被誉为“代谢调控的指挥官”。这些去乙酰化酶能够感知细胞能量状态，通过去除蛋白质上的乙酰化修饰来调节代谢、基因表达和细胞功能。而石胆酸（LCA）正是激活这些酶的“催化剂”，通过“双剑合璧”，共同推动抗衰老的分子进程。 研究发现，LCA通过结合TULP3蛋白，能够全osterically激活Sirtuins家族的酶活性。LCA处理后，Sirtuins不仅介导溶酶体质子泵v-ATPase关键亚基V1E1的去乙酰化，还对其他细胞器和代谢通路的关键蛋白产生去乙酰化效应。例如，SIRT1在细胞核外的去乙酰化活动显著增强，直接促进了AMPK信号通路的激活。这种分子级别的调控机制，不仅提升了线粒体的质量和功能，还抑制了炎症反应和氧化应激，为抗衰老效益奠定了基础。 更重要的是，去乙酰化这一过程在抗衰老中的作用已经通过实验得到验证。在小鼠模型中，缺乏Sirtuins的细胞完全无法响应LCA的刺激，表现为AMPK无法激活以及抗衰老效应的缺失。而重建含有特定Sirtuins的细胞则可以部分恢复LCA的效应，尤其是SIRT1和SIRT3在这一过程中展现了最显著的功能。此外，实验显示，LCA增强了Sirtuins对多种底物（如组蛋白H3）的去乙酰化能力，这种广泛的效应进一步扩大了其对代谢调控的影响。 去乙酰化的分子事件是LCA模拟热量限制效应的核心桥梁。通过抑制v-ATPase、激活AMPK和重塑细胞代谢，LCA与Sirtuins共同协同，实现了代谢通路的精确调控。这种“双剑合璧”不仅帮助机体维持能量平衡，还显著改善了健康寿命。 从细胞到生命：LCA的抗衰老效益验证 真正的突破需要在实验室的培养皿之外验证。在石胆酸（LCA）的研究中，这一分子惊人的抗衰老潜力已在多种动物模型中得到了验证。无论是微小的线虫、翩翩起舞的果蝇，还是更复杂的哺乳动物，LCA都展现出了其延长寿命和改善健康状况的强大能力。 在线虫实验中，研究人员发现，LCA处理能够显著延长其寿命，同时增强其抗氧化和抗应激能力。例如，与对照组相比，LCA处理后的线虫在面对氧化应激和饥饿时表现出更高的生存率。通过基因敲除实验进一步表明，这种抗衰老效应依赖于线虫中TULP3同源物（如tub-1）的存在，表明LCA通过类似哺乳动物的分子机制发挥作用。 果蝇实验也同样令人振奋。在LCA处理的果蝇中，其寿命显著延长，同时健康寿命（healthspan）也得到了提升，包括更强的飞行能力和更长的运动时间。进一步的分子分析显示，LCA通过激活果蝇中TULP3的同源物ktub，成功触发了AMPK信号通路，并改善了线粒体功能和能量代谢。 最重要的是，小鼠模型中的研究直接验证了LCA在哺乳动物中的抗衰老效益。实验显示，LCA处理能够显著改善老年小鼠的肌肉功能，包括提高肌肉力量和运动耐力。同时，这些小鼠的线粒体数量和功能得到了显著提升，肌肉内NAD+水平也显著升高。肌肉特异性敲除TULP3或AMPK的小鼠则完全丧失了这种益处，进一步确认了LCA通过TULP3-AMPK通路发挥作用。此外，V1E1亚基的去乙酰化突变体（3KR）小鼠显示出与LCA处理相似的抗衰老效应，表明LCA的分子作用靶点得到了精确验证。 LCA为健康衰老带来的启示 在人类追求延长健康寿命的旅程中，热量限制（Caloric Restriction, CR）一直被视为抗衰老的“金标准”。CR通过激活AMPK信号通路、提升线粒体功能和减少氧化应激，显著延缓衰老并改善健康。然而，其实际应用却存在挑战，例如长期热量限制对大多数人难以坚持，同时可能导致营养不足等副作用。石胆酸（LCA）的发现为这一难题提供了全新的解决方案。 LCA作为一种CR的分子模拟物，能够在不改变饮食摄入的情况下激活AMPK，并产生类似CR的抗衰老效应。与CR相比，LCA的优势在于其作用更加精确，能够靶向溶酶体信号通路，同时避免CR带来的副作用。此外，LCA的机制更加清晰：通过去乙酰化溶酶体质子泵亚基V1E1，抑制v-ATPase的活性，从而触发AMPK的激活，最终改善细胞代谢功能。这种靶点明确的分子机制，为开发抗衰老药物提供了坚实基础。 基于LCA的研究，未来抗衰老药物开发可以围绕AMPK与溶酶体的双靶点策略展开。一方面，AMPK作为代谢调控的核心因子，其激活能够系统性改善机体健康；另一方面，溶酶体作为细胞内的能量传感器，通过精确调控其功能，可以实现对细胞代谢的深度干预。这种“双剑合璧”的策略，将抗衰老效益推向更高水平。 LCA的发现还为未来研究开启了新的方向。是否可以设计合成类似LCA的化合物，实现更强效、更特异的AMPK激活？或者通过基因和代谢调控技术，进一步放大LCA的效应？这些问题的解答，可能将推动抗衰老领域进入精准医学时代。LCA的启示在于，它让我们看到了一种通过分子干预实现健康衰老的可能性。 破解衰老的更多谜题 尽管石胆酸（LCA）的研究为抗衰老领域带来了令人振奋的突破，但科学总是在解答一个问题的同时引出更多未解之谜。LCA的发现揭示了溶酶体信号通路与AMPK在抗衰老中的关键作用，但当前研究依然存在一些局限性，亟待进一步探索。 首先，LCA在不同物种中的效应是否具有完全一致的分子机制？在线虫、果蝇和哺乳动物中，LCA均能延长寿命，但这些模型的生理和代谢差异可能影响其具体的作用路径。例如，LCA在哺乳动物中主要通过TULP3蛋白发挥作用，而在低等生物中这一机制的保守性尚未完全明确。进一步的研究需要深入解析LCA在跨物种间的通用性和差异性，以完善其分子网络的全貌。 其次，LCA的抗衰老作用是否存在潜在副作用？尽管LCA能够精准激活AMPK并改善代谢功能，但其长期使用可能对胆汁酸代谢或其他相关通路产生影响。此外，当前研究主要集中在动物模型中，尚未在人体内验证其安全性和有效性。因此，如何将LCA从实验室推广到临床应用，需要更多的研究来评估其药理学特性和潜在风险。 最后，LCA的分子机制虽然清晰，但是否还有其他未知的靶点？研究表明，LCA不仅作用于AMPK，还可能通过Sirtuins、NAD+和线粒体功能等多条途径协同作用。这提示我们，LCA的作用可能远不止目前发现的这些分子层面。未来的研究可以利用多组学技术（如蛋白质组学、代谢组学），进一步挖掘LCA潜在的分子靶点与网络。 未来，抗衰老研究需要更广泛的协作和创新。研究人员可以探索LCA的化学修饰或结构优化，以开发更高效、更安全的抗衰老分子。同时，通过将LCA与其他抗衰老策略（如基因编辑、细胞治疗）相结合，有可能开创更加精准和个性化的健康干预手段。破解衰老的谜题虽困难重重，但每一个突破都会让我们离实现健康老龄化的目标更近一步。LCA的研究让我们看到了未来的希望，而这仅仅是一个起点。 参考文献 Qu, Q., Chen, Y., Wang, Y. et al. Lithocholic acid binds TULP3 to activate sirtuins and AMPK to slow down ageing. Nature (2024). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-024-08348-2 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ End 往期精选 围观 Nature | 单细胞分析技术的革命性进展 热文 Nature | 环状RNA（circRNA）为何成为基因调控的新宠？ 热文 Cell | AI取代科研人员还有多远？ 热文 新英格兰 | 司美格鲁肽（semaglutide）又有新发现：助力关节炎治疗 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述

世界人口正在日益老龄化，全球生育率的下降和预期寿命的显著增加，使与年龄相关的退行性疾病已成为社会关注的前沿。脑老化是指从亚细胞到组织器官水平的一系列形态、结构的退行性变化，包括大脑体积减少、皮质变薄、白质退化等形态学特征和神经元细胞萎缩、树突变性、脱髓鞘等病理生理特征，最终伴随记忆丧失等认知缺陷和精神行为异常，成为推动神经退行性疾病的重要因素，也是社会老龄化负担的主要原因，因此，对脑老化的深入研究十分迫切。 动物模型是探索疾病的重要手段，其中脑老化相关的人工加速衰老模型因耗时短、易重复等优点在研究中更为常用。快速老化SAMP８ 系小鼠表现为记忆减退、淀粉样β前体蛋白 （ APP）代谢异常、神经元退化等，其饲养周期短，但价格昂贵，繁殖力弱来源较少；单侧／双侧海马区注射β淀粉样蛋白 （Ａβ）片段模型表现为学习困难、Ａβ 斑块周围星形胶质细胞增生、神经炎症等，造模周期短且成功率高，但诱发因素单一，对脑组织具有穿透性损伤；APP／PS１ 双转基因模型表现为认知障碍、早期淀粉样斑块和突触损失等，但基因表达不稳定，造价高，未能完全观察到 Tau 蛋白过度磷酸化。Ｄ-半乳糖诱导模型是国内外应用较广泛的模型之一，能观察到认知记忆缺陷的行为学表现和胆碱能神经元减少、Ａβ 免疫反应物聚集等病理特征，肿瘤坏死因子-α（TNF⁃α）和白细胞介素-１β（IL⁃1β）等炎症因子、自由基和8-羟基脱氧鸟苷（８⁃hydroxyguanosine） 等衰老标志物水平的增高，是行之有效的脑老化模型。D-半乳糖诱导脑衰模型具有广泛性和多样性，且构建简便易行，价格低廉，性价比高，具有极大研究开发的潜能。过量D-半乳糖能降低脑组织的氧化酶活性，形成更 多 损 害 神 经 细 胞 的 活 性 氧 （ROS），其氧化应激效应已成为公认的主要机制，此外线粒体功能障碍、自噬、神经炎症和凋亡等也被证实与D-半乳糖的作用相关。D-半乳糖诱发脑老化的机制是构建和研究模型的基础，目前已有大量关于其造模机制的研究，但结果繁杂，各机制之间的关系不甚明确，散乱且不成体系的机制理论也给模型使用者带来混淆和困扰。本文梳理了以往对D-半乳糖致脑老化模型的研究，对D-半乳糖在体内的正常和异常代谢及其脑老化模型的构建机制进行总结，并讨论机制间的连接关系，以期为该模型今后的发展运用和脑老化相关疾病的研究奠定基础。 1.D-半乳糖的代谢和损害 Ｄ-半乳糖是一种还原的小分子醛己糖，和 Ｄ-葡萄糖互为同分异构体，存在于许多食物中，主要来源是哺乳动物乳汁中的乳糖。半乳糖推荐的正常最大日摄入量为50ｇ，其中大部分在摄入后约8ｈ内从体内代谢排出，血液中 Ｄ-半乳糖的正常浓度低于 10ｍｇ/dL。摄入的D-半乳糖被钠依赖性葡萄糖共转运蛋白1型（SGLT⁃１）运输到细胞中，再通过葡萄糖转运蛋白2型-（GLUT-2）进入血液，被半乳糖激酶和1-磷酸半乳糖尿苷转移酶代谢成葡萄糖，并进入糖酵解途径或作为糖原储存在肝、肌肉和脂肪组织中，也 可 通 过 葡 萄 糖 转 运 蛋 白1型（ GLUT⁃1） 穿 过 血 脑 屏 障 摄 取 到 大脑中。D-1半乳糖过量时，会被醛糖还原酶催化成不易被细胞分解的半乳糖醇，影响正常渗透压，引起如细胞肿胀、代谢紊乱，消耗并破坏机体抗氧化防御系统。另外，大量堆积的半乳糖也可被半乳糖氧化酶 （GOA） 氧化成乙醛糖和过氧化氢（H2O2 ），生成多种活性氧自由基，导致细胞的线粒体功能障碍、氧化应激、炎症和凋亡。鉴于半乳糖的代谢特点，可通过注射大量D-半乳糖造成动物糖代谢异常，从而建立具有特殊研究目的的动物模型。 2.D-半乳糖诱导脑老化模型的机制 2.1 氧化应激损伤 D-半乳糖浓度升高时，GOA为将其氧化成H2O2 ，使 超 氧 化 物 歧 化 酶 （SOD）减少；增加的 H2O2与还原形式的 Fe 反应形成OH-，H2O2和OH－与其他ROS共同导致细胞膜脂质过氧化，损害氧化还原稳态。胺与D-半乳糖反应形成不稳定的席夫碱产物，几天内生成更稳定的Amadori  产物，并在数月或数年内不可逆地 转 化 为 晚 期 糖 基 化 终 末 产 物 （ AGEs）。AGEs与 其 受 体结 合， 增 加 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 磷 酸（NADPH） 氧 化 酶 和ＲＯＳ，导致神经元损伤和认知功能障碍。同时，累积的半乳糖醇形成渗透应激，使线粒体的电子传递链（ ETC） 活 性 降 低， ROS增加。还有研究发现，苯二氮卓受体可能是控制线粒体呼吸以防 ROS损伤的一部分机制，D-半乳糖可以通过降低苯二氮卓受体影响大脑皮层线粒体抗 氧 化 能 力。激 活 核 因 子E2 相 关 因 子 ２（Nrf2）作为维持氧化稳态的主要调节因子，介导了Ⅱ期酶HO⁃1的表达，该酶提高了抗氧化和受保护细胞免受氧化损伤的能力，D－半乳糖可通过下调 Ｎrf2和ho⁃1 的表达水平来抑制其抗氧化功能。实验研究中常用氧化应激相关酶的活性作为测定指标，如SOD、GSH-Px、CAT、丙二醛（MDA）、谷胱甘 肽 （GSH）、氧 化型谷胱甘肽（GSSG） 和过氧化脂质 （ LPO） 以及谷胱甘肽巯基转移酶等。 2.2 线粒体功能障碍 Ｄ-半乳糖能诱发线粒体结构损伤，使海马神经元线粒体肿胀、破碎及嵴断裂和缩小，线粒体长度和面积减少。Ｄ-半乳糖产生的ROS导致线粒体Cａ+超载，线粒体膜电位下降，膜中基质的电子密度也大面积降低，部分膜溶解。Ｄ-半乳糖可降低线粒体ATP表达，使细胞能量代谢不足。Ｄ-半乳糖能降低 三 羧 酸 循 环 酶 水 平， 脑 线 粒 体DNA（mtDNA）突变积累也可被Ｄ-半乳糖诱发，可能是Ｄ-半乳糖通过减少DNA修复酶以及通过NOC依赖性途径进行的；Ｄ－半乳糖产生的ROS也可诱导mtDNA的突变，从而抑制mtDNA的转录和翻译。新的线粒体产生依赖于线粒体的生物发生，其中PGC⁃1α⁃NRF１⁃TFAM信号通路是调节线粒体生物发生的关键，而 D-半乳糖能降低海马组织中的过氧化物酶体增殖受体 γ 共激活因子 α（PGC⁃1α），进而阻碍线粒体的新生和稳态。Ｄ-半乳糖也可以影响线粒体动力学的两种代表性蛋白，提高促分裂的动力蛋白相关蛋白１ （DRP１）和促融合的线粒体融合蛋白２（MFN2） 在海马组织中的表达水平，使线粒体分裂融合增加。Ｄ－半乳糖诱导的线粒体生物发生和动力学异常，导致线粒体损伤和功能障碍。 2.3 细胞自噬抑制 D－半乳糖在海马组织中能诱导自噬抑制，使自噬体的形成减少，自噬标志物水平异常，其中自噬起始物微管相关蛋白１A／1B－轻链3（ LC3）及其衍生物LC3Ⅱ/Ⅰ、自噬相关蛋白 ATG３、ATG５、ATG７、BECN１含量降低，自噬降解底物ｐ62增加。沉默信息调节因子１（SIRT１）能调控自噬降解，哺乳动物雷帕霉素靶标（ｍTOR）则能抑制自噬信号通路，Ｄ-半乳糖可以诱导 SIRT１蛋白表达降低和SIRT１表达水平升高；D-半乳糖还能使在自噬调节中充当自噬主要抑制因子的ｐ53水平升高，从而抑制自噬功能。当自噬发生时，LC3a被酯化成LC3b，p62可以与LC3b结合并被泛素化的蛋白质降解。Ｄ－半乳糖诱导后LC3b/a和P62的表达随着溶酶体功能蛋白的降低而提高，表明大量错误折叠蛋白质和衰老线粒体启动自噬过的同时，由于溶酶体功能损害，p62不能及时被消化，次生溶酶体不能被分解而积累。D-半乳糖除了改变自噬指标， 还能降低溶酶体 功能蛋白转录因 EB（TFEB）和溶酶体相关膜蛋白２（ LAMB2）的表达， 通过影响溶 酶体功能进而阻滞自噬通量。 2.4 脑细胞衰老和凋亡     ｐ53、ｐ21 和P16ink4α蛋白是影响细胞周期的关键因素，激活p53 基因，可促进下游p21基因的表达，降低细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的活性，阻断细 胞 周 期；p16ink4α 负 调 节 细 胞 周 期 蛋 白（ CDK4） 的 活 性， 阻 断DNA复制，导致细胞周期停滞。D-半乳糖的持续积累可以提高p53、p21和 p16ink4α水平，降低CDK４，进而诱导细胞衰老。Ｄ-半乳糖可诱导海马神经元的凋亡，并能导致细胞凋亡标志性蛋白的表达异常，如抗凋亡蛋白 Bcl-2表达水平下降及促凋亡蛋白Bax 和半胱天冬酶 -３ （ caspase⁃３） 的水平升高。Ｄ-半乳糖可通过内外两种途径致细胞凋亡：外在死亡受体途径通过 c⁃Jun 氨基末端激酶（JNK）直接激活效应半胱天冬酶，并与线粒体的内在凋亡途径汇合；内在激活ｐ⁃JNK并增强细胞色素 c （Cytc） 的水平，刺激caspase⁃3、caspase⁃9和裂解的聚ADP 核糖聚合酶（poly（ADP⁃ribose） polymerase,PARP⁃１）的活化，诱导细胞凋亡。miR-34anRNA在调节细胞衰老中至关重要，并在衰老大脑中表达激活，D-半乳糖也可以升高  miR-34a 水平，通过其介导的衰老负调节因子SIRT1 的下调诱导脑衰，也可以通过miR-34a的 重 要 靶 标 Bcl-2 的降低诱导细胞凋亡。 2.5 炎症信号激活 Ｄ-半乳糖可以通过Ras 和氧化还原敏感信号通路激活转录因子 NF⁃KB；Toll样受体4 （TLR4） 可促进NF⁃KB 释放，TLR４/ NF⁃κＢ通路被激活时，会促进炎症因子的大量释放，而核蛋白相关受体 １（Nurr1）通过置换核因子活化 NF⁃κＢ 从而抑制炎性因子的产生，D-半乳糖能降低脑部区 Nurr1 水平，激活TLR４/ＮＦ⁃κＢ信号通路导致炎症产生。髓系分化原发性应答基因88（MyD88）是 Toll 样和白细胞介素受体募集的衔接蛋白，以MyD88依赖性途径的形式能被所有Toll 样受体（ TLR） 激活，从而去活化NF⁃κＢ；组蛋白去乙酰化酶３（HDAC3） 是长期记忆形成的关键负调节因子，HDAC-3能通过脱乙酰影响 NF⁃κＢp65途径的激活。Ｄ－半乳糖能联合 ＡｌＣｌ３ ，显著提高 ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６、 ＨＤＡＣ３、 ＮＦ⁃κＢ 的 表 达 及 其 诱 导 的 神 经炎症。 2.6 神经物质代谢异常与年龄相关的神经退行性疾病的学习和记忆缺陷 与胆碱能下降有关，Ｄ-半乳糖能使乙酰胆碱酯酶（AChE） 活性显着增加，乙酰胆碱 （ACh） 水 平 降 低；单 胺 氧 化 酶（MAO）可降解单胺类神经递质，减弱记忆能力，Ｄ-半乳糖可使被认为是脑老化标志的 MAO⁃B 水平升高。Ｄ-半乳糖能使去甲肾上腺素（NE）的代谢产物 ３-甲氨基-４-羟基苯乙 二醇（ ＭＨＰＧ）和５-羟色胺（５⁃HT） 的代谢产物５-羟基吲哚乙酸（５-HIAA）的水平明显下降，提示D-半乳糖可能影响单胺能系统功能。Ｄ-半乳糖可以使黑质内生成多巴胺（DA） 的限速酶酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞数量下降，减少多巴胺能神经元。脑 源 性 神 经 营 养 因 子 （ BDNF）是认知功能以及神经元生长和存活的重要因素，在 D－半乳糖处理的小鼠中被发现减少。突触后密度蛋白 ９５ 调控突触连接，在突触结构和信号传递以及突触可塑性中发挥重要作用，Ｄ-半乳糖能明显降低大鼠海马中突触后密度蛋白95的ｍRNA 和蛋白表达。Ｄ-半乳糖干预可造成海马CA1 区树突棘密度降低，突触数量减少，突触相关蛋白表达下降，Tau 蛋白过度磷酸化水平升高，Ａβ蛋白沉积。 2.7 机制间的联系张熙等发现  Ｄ-半乳糖大鼠的组织器官中存在过量ROS，最早提出自由基致衰老学说，认为D-半乳糖活性氧应激效应态是拟衰老和脑老化的启动因子，这一学说机制得到普遍公认。D-半乳糖诱导亚细胞水平的氧化应激时，脑线粒体是最容易被损伤的部位，大量ROS 导致蛋白质错误折叠，线粒体膜电位降低、呼吸链损伤、mtDNA突变积累，这些变化诱导更多的ROS 产生，从而形成ROS和线粒体损伤的恶性循环。ROS诱导的线粒体功能障碍被认为是加速大脑衰老的主要机制。自噬能及时清理损伤的线粒体以维持其动态平衡，Ｄ－半乳糖本身可作为自噬的抑制因子，也可通过降低溶酶体功能来削弱自噬，从而阻断线粒体稳态的恢复，进一步恶化线粒体障碍。Ｄ－半乳糖诱发的氧化应激和炎症之间存在许多信号分子和通路的连接，任一种机制的传播都可能导致另一种机制的恶化或激活，它们的自我强化循环会 使 脑 细 胞 内 外 环 境 失 衡， 进 一 步 加 速 衰老。氧化应激也可以激活细胞外死亡受体凋亡途径，或者让脂质过氧化产物进入线粒体介导的细胞凋亡途径，致线粒体损伤，释放 Ｃｙｔ ｃ 入胞质，形成凋亡体。Ｄ－半乳糖可以破坏脑组织细胞的结构，也可通过诱发的其他认知障碍机制，如影响神经递质和神经因子以及特异性病理产物的水平，从而产生协同破坏作用，共同推动 Ｄ－半乳糖致脑老化的结果。 3. Ｄ－半乳糖诱导脑老化模型的运用和局限性 3.1 模型的应用与优势 Ｄ－半乳糖模型最早在国外应用于白内障研究，1985年我国学者徐黻本 首次在延缓衰老药物疗效实验中使用 Ｄ－半乳糖模型作为衰老模型。D－半乳糖可以诱导出记忆巩固与再现障碍、细胞退行病变、基因表达与调控功能异常、寿命缩短等全身衰老表现，而大脑因其高耗氧耗能导致的损伤敏感性，成为衰老的“重灾区”。Ｄ－半乳糖模型能在表观行为、脑组织病理和生化分子方面成功模拟出脑老化的状态，其致衰老的启动机制氧化应激易发生在能量代谢最活跃的脑部，累积的 ＲＯＳ 损伤线粒体，进一步可抑制自噬清除，使脑细胞亚生理活动首当其冲受到 Ｄ－半乳糖的影响，持续的氧化应激加重神经炎症，诱发凋亡衰老，破坏脑部形态功能。Ｄ－半乳糖对各种衰老机制都能产生作用，各机制间也并非独立运行，而是相互联系、协同加速衰老的进程，这种机制联合体现出神经退行性疾病多因素致病的特点，且在神经退行性疾病尤其是阿尔茨海默病的模型构建中，得到特别青睐。由于脑老化疾病的复杂性和多样性，近年来衍生出以D-半乳糖诱导的脑老化模型为基础，配合具有目标疾病神经毒性的药物共同制备的复合式造模法，如D-半乳糖联合Ａβ 类寡聚体、Ｄ-半乳糖联合 A1C13及D-半乳糖联合 NaNO2制备的 AD 模型。另外，除了体内的动物实验外，D－半乳糖还能用于体外细胞的加速衰老模型。重要的是，利用该模型探索的治疗方法或干预措施可以转化为临床应用。研究人员在D－半乳糖模型中观察到低水平激光治疗的效果后，发现该疗法可能会恢复ATP以延缓衰老人类的认知能力下降；在D-半乳糖模型中起抗衰老作用的花青素，也已被证实可以改善老年人的认知行为和大脑功能。此模型的大量研究和实践已充分说明其可行性，以及作为加速脑衰模型的优势和广阔前景。 3.2 模型的局限性 一些研究提出质疑，表示对1月龄的 Wistar大鼠腹膜内注射300ｍｇ/ kg的D－半乳糖 8 周没有发现影响焦虑水平、空间学习、记忆和神经发生。有的研究指出Ｄ-半乳糖诱导的衰老与啮齿动物中天然发生的衰老并不完全一致，建议 Ｄ-半乳糖更适合诱导多囊卵巢综合征（PCOS）而不是衰老；D－半乳糖模型鼠虽然某些指标接近自然衰老，但免疫、行为等方面存在较大差异，用于氧化损伤研究尚可，不能完全反映真实衰老情况。这与Ｄ-半乳糖模型的研究自发于各个领域的独立团队有关，各实验室在实验设置上存在差异，关于动物的品系、年龄以及注射剂量、方式和时间间隔尚未达成共识，造模过程缺乏标准化，研究结果质量也参差不齐，有些缺少降低偏移风险的报告。但D－半乳糖致衰老的公认机制是通过氧化应激的扳机产生机体损伤，而加速衰老是指衰老表型的表现早于实际年龄，并且是由累积的适应不良和以氧化应激和慢性炎症为特征的病理引起的，因此D-半乳糖用于模拟衰老早期反应是被认可且理想的。已有的大量结果证明，D-半乳糖是能够通过氧化损伤进一步导致后续老化病程的，各实验室造模得到的老化结果不一，并不能完全否认D-半乳糖致衰老的最终效果，至于这种继发或原发（尚未了解的D-半乳糖效应）于D-半乳糖诱导形成的全方位多因素衰老模型，要如何准确稳定的制备出来，则需要进一步的探索和完善。 ４.总结 综上，Ｄ-半乳糖的过量摄入可用作诱发脑老化的加速衰老模型，氧化应激作为D-半乳糖启动衰老的机制，可进一步通过ROS 加重线粒体障碍和抑制自噬，造成代谢紊乱，并继续协同脑细胞凋亡和炎症、神经功能障碍等模拟脑衰进展。Ｄ-半乳糖诱导早期脑老化的研究已得到广泛研究认可，其对后续衰老进程的影响则仍需深入探索。 来源：中国比较医学杂志 往期动物模型相关推文 ▶  PM2.5 对代谢相关脂肪性肝病模型小鼠 肝淋巴生成的影响 ▶  广州医科大学团队：甘露特钠或可阻断急性胰腺炎重症化 ▶  长爪沙鼠脑缺血和听觉障碍模型研究进展 ▶  吸烟害苦了周边人！王频/邹晓平/杭渤/毛建华团队发现三手烟暴露促进小鼠和人类胃肿瘤的发展 ▶  首次用猪模型进行的远程遥距磁控内窥镜手术完成 高创汇 高圣生物·模式动物·药效学评价项目 ▶ 转基因模式动物|条件性敲除鼠|纯合子筛选 ▶ 肿瘤原位模型|心梗模型|MCAO脑梗模型|脊髓/神经损伤模型|衰老模型等药效学建模 ▶ 类器官|药代动力学|体外药理学|分子病理学|动物影像学|行为学|毒理学研究

▎药明康德内容团队编辑 Danon病是一种严重的多系统疾病，通常由溶酶体蛋白酶-2（LAMP2）突变引起，导致LAMP2蛋白减少或完全缺失。男性患者以肥厚型心肌病、骨骼肌病和智力障碍为主要特征，女性患者常发病晚、临床表现轻（主要累及心肌）。Danon病极其罕见，从1981年至今，全球仅约500例相关案例报道，2012年北京协和医院才首次诊断并报道了中国第一例Danon病。目前，Danon病可用的治疗方案是心脏移植，但这可能会引起诸多并发症，而且并不能实现治愈。当前还没有治疗Danon病的特定疗法。 RP-A501是一款基于腺相关病毒（AAV）的在研基因疗法。此前，美国FDA已授予RP-A501再生医学先进疗法认定（RMAT），用以治疗Danon病。 2024年美国心脏协会（AHA）年会最新科学进展（Late Breaking Science，LBS）专场公布了RP-A501治疗Danon病的1期临床试验结果，表明单次输注RP-A501后，男性患者多个可量化心脏指标均有所改善，治疗安全可控。该研究结果同步发表于《新英格兰医学杂志》（NEJM）。 截图来源：NEJM 研究纳入了7例Danon病患者，均为男性，基线时均存在纽约心功能分级Ⅱ级（表现为一般体力活动引起的乏力、呼吸困难、心悸或心绞痛）、左心室射血分数至少为40%（1例患者除外）、均存在左心室肥大，相关评价指标均异常（中位左心室质量为438 g、中位左心室质量指数为98 g/m2.7）、中位心肌肌钙蛋白Ⅰ水平为0.86 ng/ml。研究人员将患者分为3个队列接受RP-A501治疗，且不同患者接受不同免疫调节方案治疗，其中： 队列1：3例成年和青少年（15~17岁）患者，单次静脉输注低剂量的RP-A501（6.7×1013基因拷贝/千克）； 队列2：2例成年和青少年（15~17岁）患者，单次静脉输注高剂量的RP-A501（1.1×1014基因拷贝/千克）； 队列3：2例儿童患者（8~14岁），单次静脉输注剂量的RP-A501（6.7×1013基因拷贝/千克）。 研究结果显示，治疗12个月时，6例可评价患者均可观察到LAMP2蛋白有所表达，随访24~36个月时，6例可评价患者中有5例可观察到LAMP2蛋白有所表达。 6例可评价患者中，评价心脏肥大的几项指标均有所改善： 随访24~54个月时，左心室质量指数较基线降低23%，6例可评价患者中有5例在12个月时，左心室质量指数较基线降低至少10%，且这种降幅持续至24个月。 室间隔厚度较基线变薄，缩小了8%、左室后壁厚度也缩小了24%。 此外，24~54个月随访时，观察到6例可评价患者的心肌肌钙蛋白Ⅰ水平较基线降低84%，其中4例患者至少降低80%。纽约心功能分级由基线的Ⅱ级改善为Ⅰ级（一般的体力活动不引起乏力、呼吸困难或心悸）。 安全性方面，随访4.5年间，所有患者均存活，病情稳定。常见不良反应为呕吐、头痛、肌病和丙氨酸氨基转移酶水平升高，多为1~2级，整体安全可控。 总之，本次研究结果显示，输注RP-A501与LAMP2蛋白表达相关，且在男性患者中随访24~54个月时观察到临床症状和指标改善的证据。据文章表示，基于本次研究令人满意的结果，目前正在开展一项全球2期相关研究，以评估RP-A501以6.7×1013基因拷贝/千克的剂量，用于治疗年龄8岁及以上Danon病男性患者的疗效及安全性。 点击文末“阅读原文/Read more”，即可访问NEJM官网阅读完整论文。 参考资料 [1] B Greenberg, M Taylor, E Adler, et al. Phase 1 Study of AAV9.LAMP2B Gene Therapy in Danon Disease. November18, 2024. NEJM. DOI: 10.1056/NEJMoa2412392 [2] 北京协和医院国内首次确诊Danon病 专家提示：男童表现心肌肥厚时须提高警惕.2012.01.05. https://ims.pumch.cn/detail/7782.html 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「医学新视点」微信公众号留言联系。 如有其他合作需求，请联系wuxi_media@wuxiapptec.com