IL17RB x IKZF1 x CRBN x IKZF3

蛋白质与小分子相互作用的调节是近年药物发现中发展最快的领域之一。在这篇综述中，讨论了过去十年（2014-2023）的进展，重点是分子胶（MG）——通过稳定天然蛋白相互作用或诱导蛋白新形态相互作用来诱导接近的单价小分子。分子胶进一步可分为三大类：降解型分子胶、非降解性 分子胶 或 蛋白互作稳定剂，以及诱导自缔合(induce self-association)的分子胶。这里首先介绍降解型分子胶的分子机制。 1. 背景介绍 蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络在生物过程中发挥着核心作用，包括细胞信号传导、稳态、细胞增殖和分化。它们在疾病中经常失调，因此已成为化学生物学和药物发现的重要焦点。 在过去十年中，PPI 调节领域迅速发展并扩展到新的、令人着迷的方向。稳定（而不是抑制）PPI 有可能靶向本质上无序的蛋白质（IDP）。然而，在与蛋白质伴侣结合后，无序结构域可能在 PPI 界面上形成有序且可配位的结构。此外，靶向蛋白质对可以调节与许多蛋白相互作用的支架蛋白的单一复合物。 最近出现了许多术语来描述这些新兴概念，包括“化学诱导接近”、“分子胶”、“分子胶降解剂”和“PPI 稳定剂”。尽管这些模式存在根本差异，但这些术语经常可以互换使用。在这里，我们将“分子胶”（MG）视为在 PPI 界面上协同结合的单价小分子。通常，分子胶 对至少一种蛋白质伴侣具有低或无法测量的亲和力；结合后，它们增强或加强界面处的相互作用。分子胶 可以与天然或非天然/新形态的PPI 结合。术语“分子胶降解剂”（MGD）是指 分子胶 的亚类，其中结合配偶体是 E3 泛素连接酶（E3 连接酶）。E3 连接酶将泛素转移到底物蛋白上，通常通过蛋白酶体靶向该蛋白进行降解。降解型分子胶 诱导天然或非天然目的蛋白 (POI) 被 E3 泛素化，并导致蛋白质的蛋白酶体降解。 “PPI 稳定剂”是 分子胶 的另一种亚型，通常是指在没有分子胶的情况下具有内在亲和力的两种蛋白质伙伴，表明天然 PPI 是靶标。在这里，将 PPI 稳定剂与单一蛋白质的变构稳定剂区分开来。分子胶的另一种亚型包括诱导自缔合的化合物，其结果是靶标降解或不降解。在这种情况下，分子胶的结合通常会以意想不到的方式产生高聚蛋白质组装。形成的（三元）复合物与蛋白质靶标的天然状态显著不同。 文献中没有使用特定术语来描述这些分子胶，但偶尔会出现术语“靶标聚合”。在我们看来，“靶标聚集”与能量稳定的蛋白质组装体的形成有关，其中错误折叠或错误组装的蛋白质聚集，通常与疾病表型相关，而不是与化合物诱导的状态相关。最后，术语“诱导接近”更广泛，尽管在某些情况下适用于分子胶，但它还包括不一定属于胶合型作用机制的变构效应。 2. 天然类降解型分子胶  2001 年，发现植物激素生长素促进转录抑制因子AUX/IAA的降解。2007 年，解析了基于生长素的结构的作用机制。晶体结构表明，植物生长素通过与 AUX/IAA 结合位点下方 TIR1 的 β 螺旋桨结构域结合，增强了 AUX/IAA 和 TIR1 之间形成的弱相互作用，TIR1 是 E3 连接酶复合物 SCFTIR1 的一部分。2010 年，研究表明植物激素茉莉酸甲酯通过类似的机制发挥作用，并通过招募E3连接酶SCFCOI1 来降解转录阻遏物JAZ。这些早期的例子表明小分子能够诱导接近 E3 泛素连接酶并降解结合配偶体。激发了对天然降解胶的鉴定的进一步研究。例如，2020 年，报道了链霉菌衍生的手霉素聚酮化合物（手霉素 A 和明日香霉素）可作为共价降解型分子胶，靶向假定的 E3 连接酶UBR7 的 Cys374，并促进与新底物肿瘤抑制因子TP53 的相互作用。  3. 人工合成降解型分子胶 1.  降解型分子胶CRL4CRBN 2010 年，首次描述了人工合成的降解型分子胶 的作用机制。使用沙利度胺包被的珠子对 HeLa 细胞提取物进行亲和纯化，然后在体内模型中进行实验，他们鉴定了cereblon (CRBN)，它是 CUL4-RBX1-DDB1-CRBN (CRL4 CRBN ) E3 泛素连接酶作为药物沙利度胺的分子靶点。沙利度胺于 1957 年在西德被用作孕妇的止吐剂和镇静剂，但由于其致畸副作用于 1962 年从市场上撤出。目前，沙利度胺及其类似物（泊马度胺、来那度胺，也称为免疫调节药物(IMiDs)或CRBN E3连接酶调节药物(CELMoDs）用于治疗多发性骨髓瘤和其他血液恶性肿瘤。2014年，Chamberlain等人的关键结构研究。阐明了来那度胺、沙利度胺和泊马度胺与 CRBN-DDB1（DNA 损伤结合蛋白-1，DDB1-CUL4-Rbx1泛素连接酶 [CRL4] 的接头蛋白成分）的三元复合物的结构。晶体学数据表明，IMiD 结合在 CRBN 表面的浅疏水口袋中，包含三个色氨酸残基（Trp380、Trp386、Trp400）。这个浅袋容纳了戊二酰亚胺环，它与 His378 和 Trp380 (CRBN) 形成氢键。异吲哚酮环暴露在 CRBN-来那度胺复合物的表面，表明该部分参与了用于底物招募的新形态界面的形成。与CRBN 结合后，IMiD 抑制内源性 CRL4 CRBN 底物的泛素化，同时重新编程E3连接酶以靶向新蛋白质进行降解。IMiD 促进与 C2H2 型锌指转录因子 Ikaros (IKZF1) 和 Aiolos (IKZF3)的新形态相互作用，导致它们被 E3 连接酶 CRL4  CRBN 泛素化以及随后的蛋白酶体降解。  后续研究表明，IMiD 具有不同的降解特征，并且可以招募不同的新底物，包括酪蛋白激酶 1A1 (CK1α) 和翻译终止因子 GSPT1。晶体学研究支持这样的假设：新相互作用形成的特异性确实是由 IMiD/CRBN 二元结构中化合物的溶剂暴露面积决定的。来那度胺/DDB1-CRBN/CK1α的晶体结构表明这种结合是协同的，因为CK1α与CRBN的结合严格依赖于来那度胺的存在。CRBN 和来那度胺为位于激酶 N 叶的 CK1α β-发夹环提供了结合界面。除了前面描述的与 CRBN 的相互作用外，CK1α 还通过残基 Ile37、Thr38和 Gly40 与化合物的溶剂暴露部分相互作用。 就CC-885而言，一种具有改善的抗肿瘤活性的新型 CRBN 调节剂 GSPT1 被招募到 CRL4 CRBN 并被降解。晶体学显示 CC-885 保持了与 CRBN 的关键相互作用，并与 Glu377 (CRBN)、Val570 和 Gly575 (GSPT1) 形成了额外的相互作用，以及 CRBN 和 GSPT1 之间的直接相互作用，从而参与GSPT1 的招募。 介导GSPT1 与 CRBN 结合的关键特征是含有关键甘氨酸残基(Gly575) 的表面转角。还报道了一种可改善 Ikaros 和 Aiolos 降解的 CRBN 调节剂CC-220。 戊二酰亚胺环与 CRBN 具有类似的结合模式，而溶剂暴露区域中的其他环则与 CRBN 形成更多相互作用（Glu377、Pro352、Phe102、Phe150）这些额外的相互作用与观察到的 CRBN 亲和力增加相关。 总的来说，对 IMiD 招募看似不同的新底物的观察得出了降解决定子假说。尽管 Ikaros、Aiolos、CK1α 和 GSPT1 在结构和功能上不相关，并且缺乏明显的序列同源性，但同源序列的存在相互作用的结构特征（降解决定子）由关键位置含有甘氨酸残基的特定环定义，足以招募它们。关键的甘氨酸突变为丙氨酸导致功能丧失。进一步的研究表明，IMiD 被定义为降解几个 C2H2 锌指转录因子、 和人类 C2H2 锌指片段。 沙利度胺及其代谢物 5-羟基沙利度胺的致畸作用与其诱导胚胎转录因子 SALL4 的降解有关。 此后不久，SALL4-pomalidomide-CRBN-DDB1的晶体结构得到解析，为设计降低致畸风险的IMiD提供了合理的基础。  新型 CRBN 调制剂的合理优化催生了新一代 IMiD/CELMoD。2020 年报道了两种靶向转录因子 ZBTB16 的 CELMoD（CC-3060 和CC-647）。 有趣的是，这两种化合物识别ZBTB16 不同锌指结构域（1 和 3）内不同的结构降解决定子。 随后发现了 CC-92480，CC-92480 是一种专为高效快速降解动力学而设计的 CELMoD，目前正在进行多发性髓瘤的临床试验。还报道了具有更高效力和选择性的改进的 GSPT1 降解剂，例如 ZXH-1-161  和 CC-90009 。CC-90009是第一个选择性靶向 GSPT1 的临床候选药物。在结构上，CC-90009 与 CC-220 的结合模式相似，包括与 CRBN 和 GSPT1 的相互作用。一个显著的结构差异是缺乏与 Glu377 (CRBN) 的相互作用；相反，与 His353 形成了新的键。总之，这些晶体学研究对于定义 IMiD 与 CRBN 及其新底物的结合模式，以及基于降解决定子假说建立合理的药物开发至关重要。 2022 年，Watson 等进行了一项开创性研究， 表明IMiD/CELMoD化合物调节CRBN的构象。使用冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 将 DDB1-CRBN 的 apo 复合物与有或没有新底物的 CELMoD-DDB1-CRBN 的结构进行比较。CELMoD 与 CRBN 的沙利度胺结合域的结合足以诱导 CRBN 从开放构象到晶体结构中可见的闭合构象的变构重排。使用 CELMoD 在晶体结构中观察到的闭合构象使得 CELMoD 的结构引导优化能够产生更有效和更具新底物特异性的化合物。值得注意的是，在冷冻电镜研究中，Ikaros 仅与闭合 CRBN 构象相关。三种化合物（pomalidomide、iberdomide [CC-220] 和 mezigdomide [CC-92480]）对观察到的 CRBN 构象有明显影响，这与化合物的效力相关。泊马度胺仅足以诱导约 20% 的颗粒形成 CRBN 的闭合构象。Iberdomide 的亲和力提高了约 20 倍，Ikaros 降解能力提高了约 24 倍，将近 50% 的颗粒转变为 CRBNclosed 构象异构体。对于美齐格多胺(mezigdomide)，它能诱导新底物快速降解，并且对对来那度胺和/或泊马度胺的主要治疗不再有反应的复发或难治性患者有效，其100% 的颗粒处于闭合构象。因此，该研究阐明了变构的神秘作用以及 CRBN 降解型分子胶 构象控制的重要性，从而可以进一步合理设计降解型分子胶，提高新底物选择性和功效。 2. 降解型分子胶（ CRL4DCAF15 ） 在 IMiD/CELMoD 之后，发现将新底物招募到 E3 连接酶的第二种分子胶是剪接抑制剂磺酰胺（SPLAMS：indisulam、tasisulam、E7820 [NSC 719239] 和氯喹喔啉磺酰胺 [CQS 或NSC 339004]）。 2017年，两个研究小组报告说，SPLAMS促进了RBM39（RNA结合基序蛋白39，也称为CAPERα）向E3泛素连接酶CUL4-RBX1-DDB1-DCAF15（CRL4DCAF15 ）的募集，导致RBM39多聚泛素化和蛋白酶体降解。生化和结构研究，包括通过晶体学解析的三元复合物和两种冷冻电镜结构，并阐明了分子胶作用机制。这些研究表明磺胺类药物对单个蛋白质的结合亲和力较低，并强调了磺胺类药物与三元复合物的结构互补性。例如，DCAF15-DDB1-DDA1 复合物的 indisulam Kd 值 >50 μM，而 RBM39 存在时其Kd值下降至 187 nM，增强 >100 倍（由 ITC 测定）。在所有三项结构研究中，芳基磺酰胺协同结合，促进 DCAF15 与 RBM39 (RBM39 RRM2 ) 的RNA 识别基序 (RRM) 的结合，并通过功能化浅层、非- DCAF15 表面的保守空腔。  RBM39 与 DCAF15-磺酰胺界面的结合和募集是通过 RBM39 的单个 α 螺旋介导的，该螺旋通过主链羰基氧和侧链与 DCAF15-磺酰胺相互作用。RBM39 RRM2 -DCAF15 PPI (1,150 Å2 ) 的埋藏表面积能够补偿化合物单独与 DCAF15 的弱结合亲和力。所有报道的 RBM39 降解剂共有的芳基磺酰胺部分通过氧原子与 DCAF15 的 Ala234 和Phe235 主链形成氢键。通过磺酰胺的氮原子与 RBM39 的 Thr262 和 Asp264 形成水介导的氢键。此外，DCAF15-RBM39 侧链之间广泛的非极性疏水网络形成了高亲和力的三元复合物。值得注意的是，在冷冻电镜结构中，DCAF15 与 RBM39 的第二个RRM 结构域接合，其具有扩展的非保守表面积，这在 CRL（Cullin-Ring E3 连接酶）底物受体中并不常见。除了 RBM39 之外，在检测到的约 11,000 个蛋白质中，只有所有相互作用残基具有 100% 序列同一性的 RBM23 被降解。 2020 年，报道了一种可扩展的化学分析方法，作为使用 E3 连接酶不可知方法发现降解型分子胶的合理策略。该策略利用了CRL的 neddylation 被激活的要求，通过比较低水平neddylated(UBE2MmutKBM7) 与 高水平的neddylation  (KBM7) 的细胞对化合物的敏感性- 介导的细胞死亡。在野生型和 UBE2M mut KBM7细胞中筛选约 2,000 个细胞抑制/细胞毒性小分子，鉴定出化学骨架，这些化学骨架似乎在功能上依赖于不间断的 neddylation 水平。其中，一种新型磺酰胺 dCeMM1 被鉴定为能够重编程 CRL4 DCAF15 连接酶并选择性降解RBM39，而不影响 RBM23。 令人兴奋的是，靶向 CRL4 DCAF15 的 降解型分子胶 在化学结构、E3 连接酶靶标、新底物结构和 PPI 界面大小方面与 IMiD 不同。两种完全不同类别的 降解型分子胶 的存在表明，如果人们知道如何寻找它们，那么分子胶可能无处不在。 3.  细胞周期蛋白 K 的降解型分子胶 另一种发现新的降解型分子胶的成功方法侧重于已知抑制剂，以识别可疑缺失的降解蛋白。2020 年，三项独立且几乎同时进行的研究报道了结构多样的小分子，这些小分子诱导了细胞周期蛋白的降解。研究人员假设细胞毒性化合物可以根据所需但未鉴定的泛素连接酶成分的表达来证明细胞系选择性。他们进行了系统的数据库挖掘，将 4,518 种临床和临床前小分子的细胞系敏感性与 578 种人类癌细胞系中 E3 连接酶成分各自的 mRNA 水平关联起来。他们观察到细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 抑制剂 CR8 的细胞毒性与 CUL4 接头蛋白 DDB1 的mRNA 水平之间的相关性。进一步的机制研究证明，CR8 通过诱导 CDK12/cyclin K 和 DDB1 之间复合物的形成而发挥 降解型分子胶 的作用。值得注意的是，在 ITC 实验中，DDB1+CDK12 形成了一个弱蛋白质复合物，具有一个大的、结构互补的界面(2,100 Å2 )，基础亲和力约为 50 μM。CR8 将相互作用增强了 500 至1,000 倍 (Kd = 100–500 nM)。在结构上，CR8 占据 CDK12 的 ATP 结合位点，桥接 CDK12-DDB1 界面并与 DDB1 的 β 螺旋桨结构域之一形成离散接触。  CR8 的关键结构特征是疏水性苯基吡啶环系统，该系统暴露在激酶表面的溶剂中，并通过与 Arg928 (DDB1) 相互作用诱导与连接酶接头 DDB1 形成复合物。细胞周期蛋白 K 结合在 CDK12 的反面，不与DDB1 直接相互作用。值得注意的是，CDK12 不是组成型E3 连接酶组分。结构引导突变分析和 TR-FRET 分析表明，在 CR8 存在的情况下，CDK12 承担了胶诱导底物受体的角色，并将细胞周期蛋白 K 置于通常由 CRL4 底物占据的位置；因此，与典型 DCAF 底物受体的结合是相互排斥的。 Mayor-Ruiz 等人采用了不同的方法。在连接酶活性广泛敲除的hyponeddylated细胞模型中建立了一种比较化学筛选测定法。如前所述，该策略通过降解 RBM39 的磺酰胺 dCeMM1 的鉴定得到验证。此外，三种小分子 (dCeMM2/3/4) 被确定依赖于功能性 CRL 来发挥毒性。细胞处理和定量表达蛋白质组学表明，dCeMM2/3/4 严重破坏了细胞周期蛋白 K 的稳定性，并且更轻微地破坏了相关激酶 CDK12 和 CDK13 的稳定性。通过正交测定的进一步验证，包括定量蛋白质组学、功能基因组学、药物亲和色谱法和细胞邻近测定法，揭示了化合物诱导的 CDK12-细胞周期蛋白 K 和DDB1-CUL4B 的关联。 与此同时，Lv 等报道了一种NRF2 抑制剂的高通量表型筛选方法，该方法令人惊讶地鉴定出 HQ461，即相同 CDK12/细胞周期蛋白 K/DDB1 复合物的降解型分子胶。基于超突变的功能获得筛选、CRISPR-cas9 筛选、生化测定和交联证实了分子胶作用机制。 2021 年，报道了一个由 80,000 个小分子组成的文库的高通量筛选，该文库对来自患者的转移性结直肠癌类球体的异质细胞集的活性筛选。后续转录组学和化学蛋白质组学验证了化合物 NCT02 是一种分子胶，可诱导细胞周期蛋白 K 泛素化及其伴侣 CDK12 的蛋白酶体降解。与 CR8 的显著差异是 NCT02 缺乏可检测的 CDK12 激酶抑制活性。 2022 年，Jorda等报道了一系列基于3,5,7-取代吡唑[4,3-d]嘧啶的CDK抑制剂。其中，化合物24 诱导细胞周期蛋白K的降解。分子对接研究表明与CR8有类似的结合模式。必须指出的是，除了CR8的晶体结构外，原始研究中没有报道其他细胞周期蛋白K降解剂的晶体结构。 这些研究的一个显著观察结果是，具有相同分子胶作用机制的降解细胞周期蛋白 K 的化合物具有结构多样性。 2023 年，Kozicka 等彻底研究了细胞周期蛋白 K 降解剂的结构-活性关系 (SAR)。对 90 多种结构不同的化合物进行了评估；首先，在体外使用 TR-FRET 测定法测量小分子存在下 CDK12-细胞周期蛋白 K 和DDB1 之间的复合物形成，然后进行细胞测定。其中 40 种化合物对 CDK12-DDB1 复合物表现出低纳摩尔亲和力（体外<100 nM），并且通过晶体学解析了 28 种三元复合物的结构。DDB1 中的 Arg928 作为粘合部分的热点残基的作用得到了证实。这些分子胶优先通过 π-阳离子与Arg928相互作用，在某些情况下通过氢键和疏水相互作用。总体而言，不同大小的芳烃和杂芳烃甚至较弱的脂肪族基团能够与 Arg928 结合并实现 CDK12/DDB1 相互作用。π-阳离子与 DDB1 相互作用的适当电子和空间效应对于形成高亲和力复合物至关重要。值得注意的是，与铰链激酶残基（CDK12 中的 Met816、Glu814、Tyr815）相互作用的嘌呤部分无法独立增强粘合活性，而仅在 Arg928（DDB1 中）被适当靶向的情况下才具有协同作用。甚至更小的类似物（如化合物 919278所示）缺乏典型的基于嘌呤的激酶抑制剂部分，也能够与激酶铰链残基和 Arg928 形成足够的相互作用，从而充当降解型分子胶。这些观察结果表明，细胞周期蛋白 K 降解剂的最小药效基团是铰链相互作用的受体-供体基序（这对于激酶抑制剂来说很常见），以及一个额外的粘合部分，包括从氢键供体延伸的芳香系统。 4.  β-catenin的分子胶降解剂 2019 年，描述了分子胶的鉴定和合理设计，该 分子胶恢复了致癌转录因子 β-catenin 与其同源 E3 连接酶 SCF β-TrCP 之间的天然 PPI。WNT 通路在癌症中经常失调，多种机制导致磷酸降解子残基 Ser33 和 Ser37 处的β-catenin 磷酸化减少。磷酸化的丧失会损害其有效结合 SCF β-TrCP 的能力并阻止其降解。利用 β-catenin 磷酸化残基和重组 β-TrCP/Skp1 复合物（以下简称β-TrCP）开发了荧光偏振 (FP) 结合测定。单磷酸化肽（磷酸化 Ser33/Ser37）的结合亲和力比未磷酸化或磷酸化 Ser37 肽更适合 HTS 测定的开发。通过筛选 350,000 种化合物库，鉴定出四种结构相似的化合物，其中包括 NRX-1532。该化合物通过 TR-FRET 和SPR 测定进一步验证。β-catenin/β-TrCP/NRX-1933（一种结构相似但更易溶解的四唑类似物）三元复合物的晶体结构已被解析。该化合物结合在 PPI 界面上并与双方形成相互作用。三氟甲基吡啶酮基团填充了一个额外的小疏水袋，该疏水袋由于缺乏 Ser37 磷酸化而显露出来，并充当磷酸盐模拟物。 TR-FRET 测定进一步支持了协同结合模式。 晶体结构表明 β-连环蛋白肽的 N 末端结合不紧密，可能会揭示更大且更容易成药的结合袋。这一假设已经用 NRX-2633 等包含苯氧基取代基的化合物进行了测试，这些化合物能够诱导 Leu31重排，从而产生更大的口袋。NRX-2633 在结合测定中显示出改进的效力和增强的协同性（13 倍）。苯氧基取代基对二芳基硫醚进行结构引导优化，得到了类似物 NRX-252114和 NRX-252262，两种效力均显著提高（NRX-252114的 EC 50 值为6.5 nM，NRX-252262 的 EC 50 值为 3.8 nM ；与筛选命中相比，提高了 >10,000 倍）和协作性（>1,500 倍）。这两种化合物在细胞测定中进行了进一步评估，能够增强 S37A 突变型 β-连环蛋白与 β-TrCP 的结合，增加突变型 β-连环蛋白的 K48 连接泛素化，并恢复其蛋白酶体降解。 该研究强调了协同性的重要性，因为分子胶与三元复合物结合，但不单独与 β-TrCP 结合。如此处所示，用 分子胶 恢复天然 PPI 的一个重要优势是，底物上存在天然存在的界面和可接近的赖氨酸残基，可用于泛素化和降解。此外，分子胶 对 β-连环蛋白的突变形式具有选择性。因此，正常组织中的野生型功能不应受到该策略的影响。这项工作代表了分子胶靶向天然底物-E3 连接酶相互作用的第一个合理例子。该策略可应用于因 PPI 界面突变而减弱的其他天然 PPI。β-连环蛋白的例子还凸显了弱质子泵抑制剂生化筛选的潜在陷阱；也就是说，如果结合太弱而无法检测，则可能难以开发检测方法，并且生物学相关性可能会受到损害。 参考： https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(24)00130-2 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

来源：药渡撰文：夕阳涂鸦    编辑：丸子多发性骨髓瘤（MM）是第二大最常见的血液系统恶性肿瘤，在临床病征上容易复发。而免疫调节药物（IMiDs）的引入可以说是多发性骨髓瘤治疗中可显著改善患者预后的一个重要里程碑。目前，IMiDs是新诊断和复发/难治性骨髓瘤治疗的基础。研究表明，IMiDs主要通过结合CRL4 E3泛素连接酶 (CRL4CRBN) 复合物的底物受体蛋白Cereblon (CRBN) 发挥其抗骨髓瘤活性。通过结合CRBN，IMiDs改变了其底物的特性，导致骨髓瘤细胞存活所必需的蛋白质的泛素化和蛋白酶体降解。随着IMiDs的成功，这引发了许多学者使用CRL4CRBN复合物的活性对治疗骨髓瘤的可能性作进一步探索。在本文中，探讨了骨髓瘤治疗领域中的新角色，即CRBN E3连接酶调节剂（CELMODs）的研究现状，这是新一代具有更广泛生物活性的IMIDs。此外，我们还讨论了一种新型靶向蛋白水解策略，即靶向蛋白水解嵌合体（PROTACs），利用CRL4-CRBN降解可能与骨髓瘤和其他恶性肿瘤的治疗有关的不可成药的蛋白质。1背景介绍泛素-蛋白酶体途径在蛋白质降解过程中起着至关重要的作用。这一过程是由参与泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的一系列酶反应介导的，这些酶反应在整个泛素化途径中会被ATP循环和激活，其中E3的作用是确定蛋白酶体中泛素化和随后降解的底物特异性。人类基因组编码600多个E3泛素连接酶中，cullin-ring泛素连接酶（CRLs）是最大的E3连接酶家族，参与许多细胞稳态过程，如信号转导、细胞周期调控、DNA损伤反应、转录调控和胚胎发育等。CRL4 E3泛素连接酶是由锌指结构域蛋白(ROC1，也称为RBX1)、Cullin4(Cul4)支架蛋白和DDB1-Cul4相关蛋白组成的复合物，决定了CRL4 E3活性的底物特异性。cereblon（cereblon,CRBN）是CRL4 E3底物受体之一，对免疫调节药物等小分子的作用至关重要。通过IMiDs靶向CRBN可改变其对非生理蛋白的底物特异性，这些蛋白随后可被相应的蛋白酶体识别和降解。（图1A）而这种作用机制在多发性骨髓瘤(MM)的治疗中显示出特别的相关性，所以 IMiDs的引入改变了MM患者的传统治疗药物，且显著改善了他们的预后。虽然作用于CRBN的E3连接酶相关功能似乎是IMiDs 抗骨髓瘤活性的主要机制，但最近的报道表明，IMiDs也通过调节CRBN的其他特性（如伴侣功能）发挥作用。因此，为了强调更广泛的生物活性，下一代的免疫调节剂被称为“celmod”（Cereblon E3连接酶调节剂）。近年来，CRL4CRBN复合物和其他E3连接酶被广泛探索为通过异双功能小分子降解典型的“不可成药”蛋白的靶点，称为蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）。本文主要介绍了在多发性骨髓瘤未来的治疗方法中，以CRBN依赖的方式调节CRL4CRBN E3连接酶活性的方法。 图1.CRL4CRBN E3连接酶复合物泛素化研究进展2免疫调节药物（IMiDs）1、 IMiDs的作用机制在2006年引入的沙利度胺是第一类的免疫调节剂，是MM治疗的里程碑之一。连同其新一代的衍生物里，如来那度胺和泊马度胺，以及蛋白酶体抑制剂和单克隆抗体，这些药物被用于治疗MM患者。沙利度胺及其类似物在阐明其作用机制之前，主要被认为是通过诱导IL-2(interleukin)和干扰素-γ等细胞因子的产生来调节T细胞、NK和NK-T细胞的功能。后来发现，沙利度胺及其类似物除了具有抗血管生成、破坏骨髓瘤细胞-骨髓基质相互作用和降低破骨细胞生成等作用外，故被称为免疫调节药物。随后研究表明，CRBN的表达是IMiDs抗骨髓瘤活性所必需的，因为研究发现CRBN基因的敲除导致了骨髓瘤细胞对来那度胺和泊马度胺产生了耐药性。2014年，研究人员首次阐明了免疫调节剂的关键作用机制。两项研究表明，来那度胺与CRBN的相互作用改变了其底物特异性，从而诱导转录因子IZKF1/ 3的蛋白酶体依赖性降解。IKZF1和IKZF3被定义为CRBN的“新底物”，因为它们只有在存在IMIDs的情况下才成为CrBN的靶标。IKZF1/3的降解调控IRF4和MYC等其他基因的表达，对MM细胞的增殖和存活至关重要。而IKZF1/3-IRF4-MYC转录轴的破坏在MM细胞存活中起到了关键性作用 ，与原发性积液淋巴瘤细胞系的研究相反，其中IMiDs独立于IKZF1和IKZF3触发IRF4的表达下调。最近的研究报道了多种潜在的IMIDs新底物，这些新底物需要在生理条件下验证并转化为IMIDs的临床应用。在IMiDs的作用下， CRL4CRBN E3连接酶的可以与新底物发生相互作用。在IMiDs活性下降解的新底物库的差异可能反映了在MM治疗期间观察到的各种不良事件。沙利度胺最常见的副作用是慢性轴突神经病变，而其他以骨髓抑制为特征的药物是最常见的毒性。来那度胺和波马利度胺的骨髓抑制作用是指IKZF1的降解和随后下调转录因子PU.1和GATA1，前后两者分别导致中性粒细胞减少和血小板减少。由于与沙那度胺和波马利度胺相比，沙利度胺对IKZF的降解作用要低得多，它可能不会像它的新衍生物那样引起这种毒性。此外，IMiDs还可以调节CRL4CRBN E3连接酶的活性，以降解与特定新底物具有不同亲和力的各种蛋白。底物特异性的独特模式可能会转化为这些药物的临床疗效和毒性特征的多样性。2.2.IMiDs的临床疗效尽管自来那度胺引入以来，沙利度胺在MM治疗中的作用一直在稳步下降，但在许多来那度胺供应不足的国家，沙利度胺、地塞米松和硼替佐米(VTD)的联合仍是初诊MM患者的关键方法，这些患者有资格接受大剂量化疗，随后进行自体干细胞移植（Auto-HSCT）。最近，Auto-HSCT前的VTD(沙利度胺联合长春新碱V以及吡喃阿霉素T和地塞米松D治疗方案)诱导已被证明在近95%的患者中发挥了有效反应（至少部分反应部分缓解)，证实了以前报道的结果。如最近的第3期Cassiopeia试验所示，通过添加Daratumumab可以进一步提高VTD在反应深度、可测量残留疾病(MRD)阴性率和无进展生存率(PFS)方面的临床益处，Daratumumab是一种针对CD38的一流单克隆抗体，即通常在MM细胞表面表达的抗原。复发/难治性MM的治疗是临床实践中的一大挑战。对于以前没有接触过来那度胺的患者，单独使用来那度胺（特别是在虚弱患者中），或与卡非佐米（Aspire试验）Ixazomib（电气石试验），Daratumumab（Pollox试验）或Elotuzumab（Eloquent-2试验）联合使用是高度相关的治疗选择。反过来，对于来那度胺难治患者，除了无IMID方案（如DKD[CANDOR试验]，DVD[Castor试验]和KD[Endeavor试验]外，以泊那度胺为基础的方案也具有重要的临床价值。根据以前的治疗、表现状况和共病情况，复发/难治性MM患者可以单独或与抗CD38抗体（即达拉图单抗（Apollo试验）或伊沙妥昔单抗[ICARIA-MM试验]、伊洛妥珠单抗（Eloquent-3试验）、蛋白酶体抑制剂（即硼替佐米[OptimisMM试验][65]、卡非佐米[66]和伊沙佐米以及细胞毒性药物（如环磷酰胺）联合使用，但这最终还是要取决于复发/难治性MM患者。免疫调节剂随机临床试验的结果总结在（表1）中。 表1. IMIDS随机临床试验结果总结3CRBN E3连接酶调节剂（CELMODs）1、Celmods的作用机制尽管 关于免疫调节药物（IMiDs）之间的作用机制仍未完全阐明，但已有研究发现，关于CELMODs结构的第二个扩展区域（对应于沙利度胺中的邻苯二甲酰亚胺环）在每个 CELMoD 之间变化，并决定与 CRBN 和新的 CRL4CRBN E3 底物的相互作用，如图 2A、B所示。 图2.IMIDs/CELMoDs在化学结构和IKZF1降解能力方面的差异区分CELMoDs与IMiDs的关键功能之一是CELMoDs增强了对CRBN的亲和力。尽管如此，与来那度胺或波马利多胺相比，CELMoDs的CRBN亲和力大约高10-20倍。与经典IMiDs相比，观察到CELMODs在IKZF1和IKZF3降解中更强的效力（图2C）。 图3.IMIDs和CELMODs的在IKZF中降解效力的比较3.2CELMODS的临床疗效（1）CC-92480（美齐格米特）最近报道了临床1/2阶段CC-92480-MM-002研究的初步结果。共19例复发/难治性MM患者在前一治疗中位数为3（范围，2-4)线后接受了CC-92480（美齐多米）、硼替佐米和地塞米松的联合治疗。（2）伊伯多胺(CC-220)根据1/2期CC-220-MM-001研究(NCT02773030)的初步结果显示，三联用伊伯多胺(CC-220)在重度预处理的MM患者中显示出良好的安全性和临床活性。Iberdomiddaratumumab-地塞米松(IBERDD)队列分别包括63%和58%的DaratumumaMability和四重难治（定义为对≥1个亚胺、1个PI、1个抗CD38单克隆抗体和1个类固醇的难治）患者。同样，在伊伯多胺-硼替佐米-地塞米松（IBERVD）队列中，难治性患者的比例很高（PI型难治性，76%；4型难治性，48%)。然而，IBERDD组和IBERVD组的客观反应率分别为35%和50%。重要的是，对Ibervd的反应与Daratumumab和Bortezomiberefrictory无关。值得强调的是，很大一部分患者从以伊伯多胺为基础的治疗中获得了临床益处，因为获得了最小的反应或稳定的疾病。临床获益率和疾病控制率分别为47%和88%（IBERDD队列）和65%和85%（IBERVD队列）。细胞减少是联合治疗最常见的并发症。IBERDD联合治疗复发/难治性MM计划在第3期Excaliber-RRMM试验(NCT04975997)中与DRD进行比较。此外，IBERVD作为不符合HDT-Auto-HSCT条件的MM患者的一线治疗方法，将在2期Borealis试验(NCT05272826)中进行评估。在1/2期CC-220-MM-001研究(NCT02773030)中，对伊伯多胺联合地塞米松进行了评估。107例入组患者几乎全部为三重难治（IMID、PI和抗CD38单克隆抗体难治），25%有髓外疾病，30%有高危细胞遗传学。依伯多胺和地塞米松治疗导致26%的患者有反应。中位PFS和OS分别为3个月和11个月。有趣的是，以前接受过抗BCMA治疗的患者有类似的反应率（ORR为25%）人们对联合疗法的毒性没有出现新的担忧。伊伯多米-地塞米松联合其他抗骨髓瘤药物如卡非佐米(NCT05199311,NCT02773030)、伊沙佐米(NCT04998786)、环磷酰胺(NCT04392037)和idecabtagene Vicleucel（Karmma-7试验，NCT04855136)的有效性和安全性目前正在几项早期研究中进行调查。4靶向蛋白水解嵌合体（PROTACs）选择性蛋白质降解技术是一种极具临床潜力的的治疗策略，这种治疗方法不单单适用于MM患者。PROTAC策略是通过募集E3泛素连接酶，使其对目标靶向的蛋白质（POIs）泛素化和降解。近年来，随着对泛素化作用机制的广泛研究推动了PROTAC降解剂的发展。PROTAC分子由三个部位组成：（1）一种与目标蛋白特异性结合的小分子化合物。（2）一种与E3泛素连接酶特异性结合的化合物。（3）一种连接靶蛋白配体和E3泛素连接酶配体的连接链。PROTAC技术不需要与目标蛋白的较高结合力，因此在克服经典小分子蛋白抑制剂的潜在局限性（非共价抑制剂的瞬时靶向，蛋白质过表达或点突变引起的耐药性）方面具有很大的优势。这种新的策略可以有效针对“不可成药”靶点，如关键的致癌蛋白。 图3. PROTAC介导的靶向蛋白质降解的机制目前，大多数PROTACs使用CRL4CRBN和VHL两种E3泛素连接酶作为招募连接酶。因此，IMIDs通常被认为是PROTAC“分子胶”部分的先驱，因为它们促进了CRBN与许多治疗相关的新底物的相互作用的发现。2015年开发了第一个基于CRBN的靶向降解BRD4的PROTAC，以沙利度胺为CRBN E3泛素连接酶配体和溴结构域作为靶向蛋白。结果表明，DBET1在MM和AML细胞系中诱导高选择性的CRBN依赖性BET蛋白降解。基于CRL4CRBN-聚马立度胺相互作用的下一代PROTACs也针对BET蛋白(ARV825)，该PROTAC显示出对MM细胞较强的抑制活性，并且在小鼠移植瘤模型中也表现出较好的抑制效果。此外，研究人员还开发了针对其他 MM 有前景的癌蛋白（如 CDK4 和 CDK6 和 MCL-1）的有效 PROTAC。值得注意的是，使用 IMiD 或 CELMoD 治疗期间不可避免出现 MM 细胞的获得性耐药，这可能会造成CRBN 表达改变和编码 CRBN 的基因突变来影响基于CRL4CRBN E3 泛素连接酶的 PROTAC 的疗效。幸运的是，人类基因组编码了 600 多种 E3 泛素连接酶。到目前为止，只有少数几种被用于 PROTAC 的生成：VHL、MDM2、IAP（凋亡蛋白抑制剂）和 CRBN。2022年8月，ARV-110(Adrent，NCT0388861)和ARV-471(Veritac，NCT04072952)的临床试验正在进行第二阶段试验。在血液学领域，具有IMiD样活性 (NX-2127) 的首个口服BTK降解剂的人类1期试验目前正在招募复发/难治性B细胞恶性肿瘤患者 (nct04830137)。同样的，另一种基于IMID的BTK降解剂(NX-5948)已进入1期试验，用于复发/难治性B细胞恶性肿瘤的患者，包括原发性中枢神经系统淋巴瘤(NCT05131022)。最近，同样基于IMID的STAT3降解剂(KT-333)被批准用于治疗成人难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和实体瘤，正处于临床I期试验。5小结IMIDS的引入彻底改变了多发性骨髓瘤的治疗前景，并与抗癌疗法联用显著改善了MM治疗结果。沙利度胺从致畸的“黑暗药物”到第一类IMID的发现，以及对其作用机制的广泛研究，为我们精确和重新理解蛋白质泛素化过程提供了一个全新的视角。尽管IMIDs是MM治疗中最重要的药物之一，但针对IMIDs的适应症也正在扩大到其他恶性肿瘤领域，如血液系统恶性肿瘤。例如，来那度胺对复发的套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤均有疗效。期待更多的IMIDs获批上市，为患者带来福音。参考文献[1] Cullin-RING E3 Ubiquitin Ligases: Bridges to Destruction. Macromol. Protein Complexes 2017, 83, 323–347[2] The Myeloma Drug Lenalidomide Promotes the Cereblon-Dependent Destruction of Ikaros Proteins. Science 2014, 343, 305–309.[3] Cereblon loss and up-regulation of c-Myc are associated with lenalidomide resistance in multiple myeloma patients. Haematologica 2018, 103, e368–e371.[4] Rapid Progress in the Use of Immunomodulatory Drugs and Cereblon E3 LigaseModulators in the Treatment of Multiple Myeloma. Cancers 2021, 13, 4666.[5] CRL4 E3 Ligase Complex as a Therapeutic Target in Multiple Myeloma.[J] .Cancers (Basel), 2022, 14: undefined.声明：本公众号发布的各类文章重在分享资讯、传播知识和普及科学。文章不构成任何投资建议，也非治疗方案建议。👇关注药渡数据媒体矩阵点击"阅读原文",随时掌握行业动态

声明：因水平有限，错误不可避免，或有些信息非最及时，欢迎留言指出。本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及）;本文不构成任何投资建议。   引言2022年7月25日，药审中心承办了百时美施贵宝（BMS）的一类化药，Mezigdomide（CC-92480）胶囊的临床申请。它是一种新型的分子胶，通过与cereblon（CRBN，Cullin环E3泛素连接酶（CRL）的底物受体）结合，通过UPP（泛素-蛋白酶体途径）介导Ikaros和Aiolos的泛素化降解，用于治疗晚期骨髓瘤。（图源：CDE官网）   CRBNCRBN是经典免疫调节类抗肿瘤药来那度胺（Revlimid）的靶点，其在2007年上市，但是在2012年发表的研究上才发现其作用靶点为CRBN。其抑制CRBN的自泛素化并且阻止CRBN与DDB1、CUL4A和ROC1一起形成CRBN-CRL4（一种E3泛素连接酶），而这也是其致畸作用的主要来源。Revlimid最初由新基公司研发，2019年，新基被百时美施贵宝以740亿美元的价格收购，同时，Revlimid被BMS收入囊中。Revlimid一直处于全球畅销药行列，2020年其销售额为121.5亿美元，成为全球销售额最高的一款多发性骨髓瘤药物。   Aiolos和IkarosAiolos和Ikaros是编码造血特异性锌指转录因子，在调节B和T细胞发育中发挥着关键作用。Ikaros家族蛋白的失活会导致T、B、NK和树突状细胞的完全缺失，而Ikaros活性的降低会导致细胞增殖和淋巴瘤，异常的Ikaros蛋白表达直接参与人类血液肿瘤发生。Aiolos可与T和B淋巴细胞中的Ikaros蛋白形成同源或异源二聚体，协同调节淋巴细胞的分化和功能。并且Aiolos还与Ras相互作用，IL-2刺激诱导Aiolos的酪氨酸磷酸化，这是从Ras中解离及其核易位所必需的，Aiolos易位到细胞核可诱导Bcl-2的表达。   MezigdomideMezigdomide目前处于临床2期阶段，其临床前数据良好，体外试验显示其增强了MM（多发性骨髓瘤 ）细胞系的抗增殖和杀肿瘤活性，包括对来那度胺（LEN）和泊马度胺（POM）耐药的细胞。BMS初步探索了其与其他抗癌药联合的效果，发现其与DEX（地塞米松）、蛋白酶体抑制剂（PI）和抗CD38单克隆抗体（mAb）具有有效的协同作用。在患有RRMM（难治性多发性骨髓瘤）的患者中，CC-92480与DEX联合使用显示出可控的安全性，并具有良好的初步疗效（ORR为48%）。   小结BMS的Mezigdomide并不是第一个CRBN分子胶药物，国内诺诚健华的ICP-490已经于今年4月申报上市。但BMS在CRBN靶点的分子胶布局颇多，除了Mezigdomide还与百济神州合作了avadomide，与艾伯维合作了CC-90009，还有在研的CC-99282。BMS的CRBN分子胶药物多来源于新基公司的早期研发，其在CRBN上研究颇多。虽然BMS的来那度胺面临专利到期的冲击，但CRBN是一个验证过的靶点，也许是借分子胶药物延续来那度胺的神话。参考来源：[1] CDE官网[2] CC-92480 Is a Novel Cereblon E3 Ligase Modulator with Enhanced Tumoricidal and Immunomodulatory Activity Against Sensitive and Resistant Multiple Myeloma Cells[3] Aiolos and Ikaros: Regulators of lymphocyte development, homeostasis and lymphoproliferationPR 稿对接：邮箱 acgt@pharnex.com靶点社 靶点江湖 · 新药际会PR | 品牌推广 | 会议会展 | 行业咨询靶点社ACGT「靶点社，汇聚50,000+创新药英雄」