SH2D3C

▲ 详细日程见文末 ▲摘要：猪流行性腹泻(PED)是由流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性肠道疾病，新生仔猪死亡率高达100%。2010年出现了高致病性基因群2 (G2) PEDV，其给全球猪肉产业造成了巨大的经济损失。2013年首次在美国报道并在全国暴发疫情，2013 - 2014年PED给许多猪肉生产商带来了巨大的灾难。怀孕母猪/后备母猪接种减毒活疫苗(LAV)是诱导乳原免疫的最有效策略，并通过初乳和乳汁为哺乳仔猪提供抗PED的被动保护。然而，经过大约十年的努力，仍然没有安全有效的疫苗。最大的困扰之一是LAV在野外的潜在毒力恢复。本文依据PEDV - LAV的发展现状及主要困难进行综述。我们还讨论了转录调控序列在PEDV转录中的功能，有助于重组以及防止LAV逆转的可能策略。关键词：猪流行性腹泻病毒；减毒活疫苗；重组；安全问题1概述猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种主要的猪肠道病原体，可引起新生仔猪严重的肠道感染，导致急性腹泻、呕吐、脱水和死亡。1971年在英国首次发现猪流行性腹泻(PED)的疾病，然后传播到欧洲多个猪肉生产国，当时其背后的病原体仍未被发现。1978年，比利时的研究人员首次确定PEDV为该病的病原体。它在欧洲农场引起了广泛的感染，导致20世纪70年代和80年代乳猪的损失严重。然后，它在20世纪90年代在欧洲变得罕见，在成年猪中零星爆发或在乳猪中出现轻微症状。1982年在亚洲报告了首例PED病例，疫情一直持续到20世纪90年代。然后，它成为地方性流行病，直到2010年，高毒性PEDV毒株在中国出现。2013年PEDV传入美国，并迅速在全国蔓延。在2013-2014年疫情期间，在养猪健康监测项目跟踪的猪场中，超过50%的猪场发生了新的疫情，估计造成9亿-18亿美元的经济损失。PEDV是尼多病毒目冠状病毒科甲型冠状病毒属的一员。它是最大的RNA病毒之一，核苷酸长大约28000个，正义单链RNA基因组，5＇帽和3＇聚腺苷化尾部。因为RNA基因组很大，包括PEDV在内的冠状病毒已适应了具有校对酶，可以平衡复制保真度和遗传多样性之间的冲突。PEDV通过积累突变和重组事件经历了一条进化路径，从而提高了病毒的适应性。两个大的ORF, ORF1a和ORF1b，编码在PEDV基因组的5＇2 / 3处，其次是四个结构蛋白和一个辅助蛋白的ORF:刺突(S)，ORF3，包膜(E)，膜(M)和核衣壳(N)蛋白。在病毒复制过程中，ORF1a和ORF1b被翻译成两种多蛋白前体，这些前体在翻译后被病毒蛋白酶进一步加工成16种非结构蛋白(nsp1-nsp16)。在PEDV编码的所有蛋白中，S糖蛋白在病毒粒子表面形成三聚体突起，负责附着于宿主受体，并通过膜融合介导病毒进入细胞，启动感染过程。此外，S基因在PEDV株中是一个高变区域。因此，它可以作为确定PEDV遗传多样性的系统发育标记。根据S蛋白的遗传多样性，PEDV可分为两个基因组:基因组1 (G1)和基因组2 (G2)，基因组2又可分为G1a、G1b和G2a、G2b、G2c亚群。PEDV G1a包括在比利时发现的原型毒株CV777，所有毒株都与CV777具有较高的遗传同源性。新出现的高毒力毒株被归类为G2。由于冠状病毒在复制过程中会合成一组共用相同5＇端的亚基因组RNA (sgRNAs)，因此在包括PEDV在内的冠状病毒中，不同毒株之间的同源重组率相对较高。因此，G1a和G2毒株之间潜在的重组事件导致了S-INDEL毒株、G1b和新近定义的G2c毒株的出现，这表明PEDV的进化复杂而快速。尽管群体免疫和生物安全仍然是预防PEDV最有效的方法，但新变种的不断出现，包括来自重组事件的毒株，其已经导致疫苗失败，并阻碍了PEDV的预防和控制。本文综述了PEDV病毒转录的分子基础，以及安全有效的PEDV减毒活疫苗的合理设计。2PEDV复制和转录中的功能元件PEDV感染的第一步是通过S蛋白识别并结合宿主受体。研究人员已经确定了几种冠状病毒的宿主受体用法。中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)识别二肽基肽酶4 (DPP4)受体结合。严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和SARS-CoV-2结合血管紧张素转换酶2 (ACE2)引发感染。而一些冠状病毒，包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)及其变体、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、人冠状病毒(HCoV)-229E和猫冠状病毒II型，利用氨基肽酶N (APN)作为受体。APN是一种150kDa的跨膜蛋白水解酶，可从肽中切割中性或碱性NH2末端残基。它是一种在上皮细胞、巨噬细胞和粒细胞中普遍表达的蛋白。APN参与了广泛的生物过程，包括细胞增殖、运动、粘附和内吞作用。以往的研究表明APN是PEDV感染的共受体。PEDV的S蛋白能有效结合人和猪的APN。然后，一种外源表达人或猪APN (pAPN)的非受纳犬肾细胞系MDCK可以支持PEDV感染和连续病毒传代。相反，用抗pAPN抗体预处理易感细胞和允许细胞可阻断PEDV的生产性感染。与此同时，PEDV在表达pAPN的转基因小鼠模型中复制。然而，由于APN缺陷细胞系Vero和pAPN敲除猪支持PEDV复制，因此PEDV一定存在未知受体。在进入宿主细胞后，PEDV基因组被释放到细胞质中，并进入细胞器进行病毒复制。PEDV有一个正链RNA基因组，作为初始病毒蛋白翻译的mRNA。ORF1a和ORF1b编码pp1a和pp1ab两种多蛋白，它们是多蛋白前体，并分别被在nsp3和nsp5中存在的木瓜蛋白酶(PLpro)和3c样蛋白酶(3CLpro)两种病毒蛋白酶自加工成16种非结构蛋白(nsps)(图1)。图1.PEDV基因组结构和它的结构蛋白（S,E,M,和N），非结构（nsp1-16）和辅助（ORF3）蛋白。位于5＇UTR或每个ORF上游的绿色和红色条代表领导TRS和TRS主体区域。缩略词：pp1a和pp1ab的数字表示非结构蛋白1-16。PLpro：木瓜蛋白酶样的蛋白酶；3CLpro：糜蛋白酶样蛋白酶；RdRp:RNA依赖的RNA聚合酶；ExoN:核糖核酸外切酶;N7-MTase:N7-甲基转移酶;EndoU:内切核糖核酸酶;2＇-O-MTase:2＇-O甲基转移酶；S:刺突蛋白；E：包膜蛋白；M：膜蛋白；N：核蛋白。在病毒复制过程中，nsp1在翻译后迅速从多蛋白中产生和释放。它以宿主翻译机制和干扰素(IFN)应答系统为靶点，诱导宿主mRNA降解并拮抗IFN应答。复制-转录复合体(RTC)负责病毒RNA合成，由多种病毒非结构蛋白组成。在参与RTC的蛋白质中，nsp3-nsp6负责调节胞内膜和组装双膜囊泡(DMV)，而DMV是病毒RNA合成的地方。此外，剩余的nsps含有RNA合成中涉及的核心酶功能。例如，nsp7和nsp8的异源二聚体启动新生RNA合成并产生用于复制的短RNA引物，与nsp12形成冠状病毒复制复合体的最小核心。Nsp12是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，用于复合体内的RNA合成。在新生RNA的延长过程中，RNA结合蛋白nsp9和解旋酶nsp13也参与其中。此外，双功能蛋白nsp14具有3＇-5＇外切酶(ExoN)和N7 -甲基转移酶(MTase)活性。外切酶结构域通过在RNA延伸期间去除错误结合的核苷酸来负责校对活动，以保持高复制保真度。而且，N7-MTase结构域与2＇-O-MTase nsp16一起介导病毒RNA的加帽过程，nsp10作为辅助因子参与其中。此外，nsp15是一种在冠状病毒中保守的尿嘧啶特异性核糖核酸内切酶(EndoU)，它处理病毒的dsRNA以逃避宿主防御系统的检测，从而导致免疫逃避。RTC初始翻译和组装后的病毒RNA合成包括病毒基因组复制和转录。在病毒基因组复制中，RTC可以识别PEDV正链RNA基因组并持续复制，产生互补的负链基因组。然后，负链基因组拷贝作为模板，更多新生的正链基因组RNA被合成并最终整合到子代病毒粒子中。与连续的基因组复制不同，PEDV利用非连续的转录策略。在负链RNA合成过程中，有一组5＇和3＇共末端亚基因组RNA (sgRNAs)通过中断机制产生，负链sgRNAs随后作为模板产生正链亚基因组信使RNA (sgmRNA)。所有sgmRNAs共享相同的5＇区，称为先导序列，位于冠状病毒基因组的开头，而在sgmRNAs的合成过程中，需要一组顺式作用元件，称为转录调控序列(TRS)。TRS是位于每个体ORF上游的同源性较高的短序列(称为“主体TRS”)和5＇前导序列下游（称为“前导TRS”）(图1）。在负链RNA合成过程中，当RTC在3＇1/3的病毒基因组中遇到N、M、E、ORF3和S基因的主体TRSs时，新生链的延伸被中断。在这种情况下，主体TRS作为RTC的“减速”或“停止”信号，RTC要么通读转录下一个ORF，要么将模板切换到先导TRS，产生sgRNA，携带5＇先导序列的反向互补序列（图2）。图2.PEDV的中断复制模型。当RTC遇到TRS区域时，要么“通读”，要么“模板切换”，生成中断的sgRNA。修改自Baker, s.c.，2008。主体TRS的模板切换事件涉及新生负链的RNA反向互补TRS(负义体TRS或新生抗体TRS)与基因组RNA的5 ' UTR(正链先导TRS)之间的相互作用。在TRS区域内，存在一个由6 ~ 8个核苷酸组成的保守核心序列(CS)并在其第5＇和3＇端两侧有可变序列。基于系统分析，Yang等发现前导TRS-CS在一个属内保守，但在属间不同，但β冠状病毒属的厄贝孔冠状病毒的TRS-L CS与α冠状病毒相似，而与β冠状病毒属不同。例如，α冠状病毒包括TGEV, SADS-CoV和PEDV共享TRS-CS(5＇-CUAAAC-3＇)。对于TRS-CS体，即使是同一属的病毒也表现出多样性。TGEV具有9个高度保守的TRS-CSs体，序列为5＇-CUAAAC-3＇，包括每个ORF的5＇端各1个 (1a, S, 3a, 3b, E, M, N和7)，以及S基因的内部CS。对于PEDV，CV777株的TRS-CS体的E,M和N基因经实验分别确定为5＇-CUAGAC-3＇，5＇-AUAAAC-3＇和5＇-CUAAAC-3＇。推断S和ORF3的TRS-CSs分别是5＇-GUAAAC-3＇和5＇-CCUUAC-3＇。PEDV的主体TRS-CS与先导TRS-CS最多可相差3个核苷酸。先前的研究报道了CS在指导碱基配对和新生负链与基因组5＇末端的先导TRS位点之间的二链体形成方面的关键作用。控制不同ORF表达的TRS-CSs体与PEDV中的先导TRS-CS表现出多种相似性，这可能是控制不同sgmRNAs丰度以及病毒蛋白的另一种策略。除了序列相似性，RNA二级结构也被认为是RNA合成所需的顺式作用元件。5＇UTR在病毒基因组复制中的结构功能首次在基于缺陷干扰RNA (DI RNA)的BCoV系统中得到验证。在BCoV 5＇UTR中预测了四个茎环(SLs)， SL I, II, III和IV，突变分析表明这些结构对病毒复制至关重要。随后，从甲型冠状病毒(HCoV-NL63、HCoV-229E和TGEV)、乙型冠状病毒(HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MHV)和γ冠状病毒IBV中鉴定出3个保守的SLs (SL1、SL2和SL4)。MHV作为一个模型，证明了这些保守结构对病毒复制至关重要。SL1与部分展开的构象处于平衡状态。SL1因碱基配对减少而导致的结构不稳定被证明是致命的或导致病毒复制减少，而重新建立SL1碱基配对的补偿性突变使病毒复制恢复到与野生型病毒相似的水平。在保守的SLs中，SL2在所有属间的一致性最高。它有一个U-turn基序，这可能是RNA-RNA相互作用的原因。突变分析报告，突变破坏SL2茎的稳定性，显著削弱MHV的复制，导致感染滴度峰值降低，与野生型MHV相比，斑块更小。此外，具有不稳定SL2的突变体合成的RNA量显著低于野生型病毒。相反，恢复碱基配对的补偿性突变可以将这些不稳定突变体的病毒复制恢复到与野生型病毒相当的水平。另外，携带颠覆性突变的突变体破坏了茎，无法存活。这表明SL2通过调节RNA合成对病毒复制至关重要。SL4是一个位于先导TRS下游的长发夹结构。有人提出，SL4的基底部分处于一种柔性状态，这可能是导致sgRNA合成过程中模板切换的瞬时远程RNA-RNA相互作用的原因。根据Mfold [http://www.unafold.org/mfold/applications/ rna-folding-form.php(于2022年5月26日访问)]的分析，在PEDV CV777毒株的5＇UTR范围内预测了SL1、SL2、SL4和SL5四个二级结构(图3)。除了保守的SLs外，在核苷酸(nt)残基123和305之间还发现了一个SL5。它是一个包含三个发夹环的大型结构，延伸到ORF1a。迄今为止，在5＇UTR中，这些与先导TRS相邻的二级结构的功能仍然不清楚，需要进一步的实验来证实它们在PEDV RNA复制中的作用。图3.PEDV CV777典型毒株5 ' UTR的二级结构。4个保守茎环（SLs）用Mfold http://www.unafold.org/ mfold/ applications/rnafolding-form.php（2022.05.26），计算了每个SL的吉布斯自由能，并以kcal/mol表示。3PEDV疫苗研制现状产生的感染将基于基因组内各种病毒蛋白和功能元件的协同作用而启动，感染触发宿主对病毒感染的全身和局部粘膜免疫反应。早期的一项研究表明，先前接触引起的免疫反应可以防止断奶仔猪再次感染。此外，PED暴露的后备母猪可以通过肠道-乳腺-分泌IgA轴被动地转移母体免疫，并在攻击后为仔猪提供高达100%的PED保护。这提示病毒复制诱导的宿主免疫，特别是乳原免疫是预防PED的有效途径。Won等和Lv等评论了PEDV疫苗，包括LAV疫苗、灭活疫苗、病媒疫苗和亚单位PEDV疫苗。2010年之前，G1a型PEDV疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，其有效地控制了PEDV在亚洲国家的爆发。Ma等人于1994年制备了一种基于细胞适应CV777毒株的灭活疫苗，母猪接种后，3日龄猪的保护率为85.19%，仔猪的被动免疫保护率为85.0%。随后，该团队又于1995年成功研制出TGEV和PEDV二价灭活疫苗，并在中国实现商业化。除了灭活疫苗，Tong等人报道了一种体外连续传代CV777生产的LAV。对3 - 6日龄仔猪的保护率为95.52%，被动免疫保护率为96.2%。1999年成功开发了PEDV和TGEV的二价LAV，对PEDV的主动和被动保护率分别高达97.7和98%。这两种二价疫苗在2010年PEDV高毒变株突发事件之前，在中国广泛使用，有效控制了PEDV和TGEV的传播。日本和韩国也开发了疫苗。一种日本毒株PEDV 83P-5在Vero细胞中连续传代后被减毒，并作为LAV在市售。重要的是，母猪接种83P-5被动保护了80%的仔猪免受G2 PEDV攻击的死亡。两株韩国毒力毒株SM98-1和DR-13也进行了体外传代和减毒。SM98-1毒株已被用作肌肉注射LAV或灭活疫苗，DR-13毒株可作为口服LAV。Song等人的研究表明，晚期妊娠母猪口服DR-13后，87%的哺乳仔猪能抵抗同源病毒的攻击。从2010年底开始，由于出现了G2分支的高毒力PEDV变体，中国经历了严重的PED疫情，对养猪业造成了毁灭性的破坏，并传播到其他亚洲和北美国家以及欧洲(乌克兰)。2015年，两种多价疫苗在中国正式获批上市。一种是由TEGV、PEDV (CV777株)和猪轮状病毒减毒研制的三价疫苗，另一种是含有TGEV和PEDV的二价减毒疫苗(ZJ08株，G1b)，但由于G1和G2株之间的交叉保护较差，其有效性值得怀疑。一项比较研究评估了G1b和基于G2b的疫苗对2周龄断奶仔猪G2b毒株攻击的效果。这表明，基于G1b毒株的灭活疫苗对G2b的攻击提供了足够的保护，证明了粪便中PEDV RNA在高峰脱落期间减少了3-4个logs，病毒脱落持续时间更短，但G1b毒株衍生的疫苗失败了。在韩国和泰国也观察到类似的现象，在这两个国家，市售的G1毒株衍生的疫苗未能对目前流行的G2毒株提供完全的保护。迄今为止，高毒力PEDV是中国主要的猪病毒病原体之一(占世界生猪存栏量> 50%)。因此，迫切需要针对G2株的有效疫苗来预防和控制仔猪的这种致命病毒感染。大多数许可的PEDV疫苗是灭活疫苗或由已被杀死或完全减毒的整个病原体组成的LAV。这种全病原体疫苗可以引起强烈的保护性免疫反应。Collin等人研制了一种G2b型灭活疫苗，基于分离的美国变异NPL-PEDV 2013 P10.1株。根据基于细胞的病毒中和试验，该疫苗通过肌肉注射引起了相当水平的针对PEDV的体液免疫。然而，灭活疫苗不能复制，只能诱导较小范围的免疫反应。此外，由灭活疫苗诱导的免疫不像LAV那样持久，导致需要多次剂量才能增强。此外，由LAV触发的强被动乳原免疫是保护新生哺乳仔猪免受包括PEDV在内的肠道疾病侵害的最有希望和最有效的方法。在非自然寄主组织培养中进行连续传代导致病毒致弱是培养LAV的常规方法。迄今为止，已经报道了几种细胞减毒的G2毒株，包括美国分离株PC22A，亚洲株YN, Pingtung-52和KNU-141112。Hou等人对四种减毒毒株的突变模式和分子机制进行了全面的评论。一般来说，细胞适应毒株在仔猪中是减毒的，并且通过激发高水平的中和抗体而具有高度的免疫原性。然而，对于这些报道的G2 PEDV为基础的LAV候选物的保护功效存在一些担忧。首先，由于最脆弱的种群是乳猪，在它们遇到病毒之前没有足够的时间诱导主动免疫，因此PEDV疫苗接种的理想策略是在母猪/后备母猪中诱导保护性乳原免疫反应。由于在母猪/后备母猪中进行PEDV攻击研究是昂贵且劳动密集型的，科学家们利用基于细胞的病毒中和试验来测试疫苗接种诱导的保护性免疫反应，这可能作为保护的指标。此外，新生儿猪模型用于测试病毒致弱，保育猪(或断奶猪)用于评估病毒的免疫原性和筛选有希望的候选病毒。例如，在细胞培养适应的PC22A株的研究中，100代(P100)和P120在断奶仔猪中完全减毒，但在新生仔猪中部分减毒。然而，与P120病毒相比，PC22A的P100在毒力毒株攻击后诱导了更高的血清PEDV IgA、IgG和病毒中和(VN)抗体滴度和更多的PEDV IgA抗体分泌细胞。这些结果表明PEDV的致弱是一把双刃剑。在仔猪中完全减毒的LAV候选物不能在母猪中诱导足够的乳原免疫。年龄较大的猪比仔猪更能抵抗PEDV感染和疾病。因此，仔猪中PEDV的完全衰减通常会导致减毒病毒的低效复制和老龄猪中病毒免疫原性的降低，从而导致保护性免疫的低效。其次，G1组和G2组之间的交叉保护程度较低，G2a组和G2b组之间的交叉保护效率也是疫苗开发中需要关注的问题。Liu等证实CH/HBXT/2018 (G2a)和CH/HNPJ/2017 (G2b)灭活疫苗对异源株的VN抗体滴度均显著低于同源株。因此，在进一步的疫苗研究中，异种毒株的攻击对阐明交叉保护具有重要意义。4PEDV减毒活疫苗毒力逆转的风险与预防除了保护效率之外，阻碍PEDV LAVs应用的最大问题之一是安全问题。减毒毒株携带突变，通过系列传代或分子工程引入，使其没有致病性。然而，一些疫苗毒株通过(1)病毒基因组内突变的积累和(2)重组在初级疫苗受体传代过程中表现出毒力的逆转。在本节中，我们将回顾抵制PEDV - LAV发展的逆转事件的策略。有两种方法可以产生有希望的减毒候选疫苗:(1)经典方法是通过在非自然宿主或环境中连续传代病毒，使其适应新条件并减少在自然宿主中的复制，或者(2)通过对多种基因进行遗传修饰的反向遗传学方法，这些基因对于降低病毒的致病性是必不可少的。然而，由于宿主的免疫功能低下或弱病毒的遗传不稳定，衰减突变的逆转和基因组中其他地方的补偿性突变都可能导致毒力的逆转。nsp16的2＇-O-MTase在冠状病毒中高度保守，在复制和转录过程中介导病毒基因组RNA和sgmRNAs的加帽过程。在老龄小鼠模型中，一种SARS-CoV nsp16突变体(dNSP16)在异源攻击后显示出作为候选疫苗的有效性。然而，在缺乏功能性B细胞和T细胞(RAG - / -)的小鼠模型中，接种dNSP16突变体后，62.5%(5/8)的免疫受损小鼠表现出体重减轻和死亡，而这在老年小鼠模型中是不存在的，表明毒力的逆转。同时，虽然引入的靶向nsp16的突变在逆转录物中被保留，但在nsp3、nsp12和nsp15中发现了6个突变，这些突变可能具有代偿性突变的作用。先前的一项研究表明，PEDV nsp14-ExoN突变体E191A显著减弱，但具有高度的遗传不稳定性，并且在体外和体内均观察到反向突变。重组MHV和SARS-CoV携带断裂的nsp14外显子结构域也有类似的报道。在体外连续传代(250次)后，尽管在外显子(-)活性位点未发现反向突变，但具有工程外显子的MHV突变体(MHV-ExoN(-)- p250)积累的突变比野生型MHV多8倍，并且显示出更高的复制保真度，这表明在病毒复制过程中出现了外显子功能的代偿突变。为了减轻这种突变驱动的逆转，可以将针对不同基因的多个突变结合到病毒基因组中，并通过不同的机制减弱病毒。例如，我们形成了重组PEDV icPC22A-KDKE4A-SYA，携带失活的nsp16 2＇ -O-MTase和S蛋白的内吞信号。如上所述，nsp16 2＇-O-MTase功能障碍在小鼠中减弱了SARS-CoV、MHV和MERS-CoV。S蛋白胞质尾部的保守基序YxxΦ调节被感染细胞表面S蛋白的水平，并作为毒力因子发挥作用。重组突变体icPC22A-KDKE4A-SYA在猪体内传代三次后保留了引入的突变，表明其体内遗传稳定性。在SARS-CoV LAV发展过程中也采用了类似的方法，通过将失活的nsp14-ExoN和nsp16-2＇-O MTase结合产生dNSP16/ExoN。与dNSP16突变体不同，dNSP16/外显子不会引起重大疾病，并且在接种后30天免疫功能低下小鼠模型中被清除，而不会恢复到毒力形成。总的来说，多种突变的组合通过各种途径减弱病毒，为对抗突变驱动的冠状病毒LAV的逆转提供了答案。此外，重组是许多RNA病毒的重要进化因素，特别是冠状病毒，在密切相关毒株的混合感染中，其重组率高达20%。重组驱动的逆转，即当一种疫苗毒株与产生新变体的野毒毒株重组时，对LAV的应用构成了障碍。几种动物病毒的LAV包括犬细小病毒、传染性法氏囊病病毒、牛疱疹病毒1，以及冠状病毒、IBV和PEDV的成员，他们都发生了由重组驱动的逆转引起的疫苗失败。在中国几个养猪业大省发现了PEDV重组变异体。一种在田间表现出高致病性的变异源于低致病性疫苗与强毒田间菌株之间的重组事件。病毒基因组重组的一般机制有三种:(i) DNA基因组中的断裂和修复，(ii) RNA基因组中的聚合酶模板切换，以及(iii)分段RNA基因组中的片段重组。作为一种非分段RNA病毒，冠状病毒可以在两个不同分子之间进行分子间重组，也可以通过模板切换在同一分子内进行分子内重组。分子内重组是指复制酶在先导区和主体TRS区之间切换，产生一组sgmRNAs，而分子间重组是指复制酶从不同亲本毒株的供体模板跳到受体模板，在RNA合成过程中共享同源序列，偶尔会产生重组病毒子代。对冠状病毒TRS位点和重组事件的系统分析表明，近10%的主体TRS区域参与断点热点，重组热点经常与主体TRS相关。因此，TRS线路成为阻止冠状病毒复制过程中分子间重组的主要靶点。通过将3-nt引入与野生型TRS序列有三个核苷酸差异的重组TRS中，设计了一种抗重组SARS- CoV。重装TRS线路与野生型线路不相容，它是导致携带混合野生型和重装的TRS的拯救嵌合病毒失败的原因。随后，同一组的研究人员进一步优化了调控回路，设计了一个7-nt重组的TRS，该TRS具有增强的遗传稳定性，基因组可作为SARS - CoV减毒疫苗开发的有效抗重组平台。对于PEDV来说，重装TRS线路有两个困难:(1)与在大多数冠状病毒中观察到的TRS-CSs的高度一致性不同，PEDV的TRS-CSs表现出令人难以置信的多样性，其中，TRS-CS主体与先导TRS-CS可以有三个核苷酸的差异(见第2节);(2)在PEDV基因组中，所有的体TRS-CSs都与上游ORF重叠。因此，将突变引入TRS区域可能会改变上游ORF的氨基酸序列，导致不利突变。需要新的方法而不是直接重新编码TRS-CSs来防止TRS相关的重组驱动的逆转。第一种可能的方法是通过引入沉默突变来重新设计与上游ORF重叠的TRS-CSs，以保留原始氨基酸序列。除了沉默突变外，保守氨基酸替代策略也可用于设计TRS-CSs，该策略将蛋白质中的一个氨基酸替换为具有相似生化特性的另一个氨基酸。除了序列相似性方面，TRS区域的RNA二级结构被认为是顺式作用元件，也调节RNA转录。正如我们在第2节中所讨论的，PEDV基因组5＇UTR的二级结构在病毒复制中起着重要作用。然而，对于二级结构的准确预测信息有限，尤其是对主体TRS的预测。研究人员根据SARS-CoV-2报道了冠状病毒基因组在其生命周期中的二级结构动态。例如，与感染细胞中的病毒RNA相比，病毒粒子内的RNA基因组经历了主要的构象改变，并表现出过渡的密封。虽然预测了PEDV CV777毒株5＇UTR的二级结构(图3)，通过靶向主体TRS区域内的关键结构元件来重新编码PEDV TRS系统的更多方法将受益于PEDV基因组结构在病毒复制过程中的动态说明。这些区域的结构变化也可能调节RTC的模板开关事件，导致转录回路的改变。使用这些方法，重新编码的主体TRS-CSs将与野生型不兼容，但保留上游ORF的保守置换。最后，我们可以通过人为引入间隙，将PEDV的TRS区域与上游ORF区分离，从而破坏原有的TRS位点，重组PEDV的基因组。因此，引入的间隙有望作为调节PEDV转录的功能元件，我们可以像之前在SARS-CoV中描述的那样重新连接转录回路。目前，我们正在设计一个改造的TRS，几乎没有改变原来5＇的二级结构UTR。一个重塑的PEDV突变体RMT已经被拯救，在体外和体内有效地复制。RMT在新生仔猪中显示出部分减毒表型和诱导的部分保护作用(未发表的数据)。它也显示出与野生型S-INDEL PEDV菌株的重组减少。因此，它可以作为未来开发抗重组PEDV LAV的平台。5结论新出现的高毒力PEDV在哺乳仔猪中引起了大规模暴发，死亡率很高，给猪肉工业造成了重大损失，但很少有疫苗能有效预防这种疾病。由于新生仔猪的脆弱性，最有效的疫苗接种策略是在妊娠母猪体内诱导强乳原免疫，通过初乳和乳汁将保护性中和抗体被动传递给哺乳仔猪。同时，保护母猪肠道的主动粘膜免疫在这一过程中起着至关重要的作用。先前对另一种猪肠道冠状病毒TGEV的研究表明，只有用活病毒免疫，而不是灭活疫苗或亚单位疫苗免疫，才能触发足够的乳原免疫。因此，在母猪体内使用易于触发乳原免疫的LAV是预防和控制PED的一种很有前途的方法。未来需要同源和异源挑战来证明疫苗对野外流行毒株的交叉保护作用。此外，弱毒株的毒力回复的安全性问题仍未得到解决，这阻碍了LAV的应用。利用反向遗传学和新开发的方法，结合几种不降低病毒免疫原性的致弱突变(例如，nsp1突变)和重新连接的TRSs，可以帮助提高候选疫苗的遗传稳定性，从而可能对突变和重组驱动的逆转更具抵抗力。参考资料：Niu X, Wang Q. Prevention and Control of Porcine Epidemic Diarrhea: The Development of Recombination-Resistant Live Attenuated Vaccines. Viruses. 2022 Jun 16;14(6):1317. doi: 10.3390/v14061317. PMID: 35746788; PMCID: PMC9227446.为了推动兽用生物制品行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展、乘风济海将于2024年4月17日-18日在南京共同举办“兽用生物制品研发和产业化大会”，系中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）中的一个分领域专业会议。诚邀全国相关领域研究者共享学术盛会。名称：兽用生物制品研发和产业化大会时间：2024年4月17日-18日（周三-周四）地点：南京国际展览中心主办单位：生物制品圈、抗体圈、四叶草会展，乘风济海媒体支持：药时空、细胞基因研究圈报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请（严格审核通过）。注：大会日程以会议现场为准。中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）是一场将“政、产、学、研、用、管、投”各方精英围绕全产业链新资源展开的合作大会，将于2024年4月16日-18日在南京国际展览中心举办。大会将主打“全产业链新资源对接”，围绕投资、立项、临床前研发、临床研究、生产、供应链国产化、销售、MAH合作、国际品种合作、公司股权合作与并购全产业链，为中国医药同仁带来全新的资源与商机。大会下设的同期会议包括：宠物药品、食品、保健品新资源大会兽用生物制品研发和产业化大会透皮技术研发生产与注册开年分享会吸入制剂研发、生产与注册新机遇新进展分享会中国改良新药与缓控释制剂全产业链合作大会多肽产业创新与发展大会新药典新型辅料与包材产品与技术交流会新药典新型实验室仪器与耗材实操演示交流会陆续更新中......识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2024年1月4日，西湖大学解明岐团队、浙江大学邵佳伟团队和之江实验室王慧团队在Cell Research杂志上联合发表了题为Engineered poly(A)-surrogates for translational regulation and therapeutic biocomputation in mammalian cells的最新研究成果，报导了一套新型基因表达控制系统，全面实现各种基因疗法的智能化精准调控。通过对人体细胞中蛋白质翻译起始的“mRNA首尾环化过程”进行工程化改造，该系统不仅能够接收不同的外源信号来远程、高效调控多种治疗蛋白药物的表达和生产，从而实现安全、可控的药物递送，还突破了胞质内肿瘤标记物的识别瓶颈，在探测到肿瘤组织中特异性标记物后，可自主识别并彻底清除癌细胞。该调控策略对未来基因治疗在临床中的安全性、可控型和精准化应用具有重要意义。精准控制基因表达对于实现高效、安全的基因和细胞治疗至关重要。目前，合成生物学基因开关大多基于转录调控系统，不仅信号感知和决策速率慢，而且在应对位于细胞质内的疾病标记物时，表现的束手无策。虽然一直以来翻译调控系统有潜力解决这些弊端，但目前已报导的系统因调控效率低，仅在细胞层次上表现出一定的潜力，很难真正应用到体内的疾病治疗。本工作巧妙地打造了新型的基因环路，将mRNA自身的多聚腺苷酸尾(poly-A)区域替换成人工合成的“特异性结合域”，利用“首尾环化”机制实现目标基因的精准、高效和特异性调控，最终突破了现有翻译系统效率低的瓶颈，成功将转录后调控策略引入基因疗法的赛道。经典真核生物翻译起始过程由多种翻译起始因子(initiation factor)eIFs和多聚腺苷酸结合蛋白(PABP) 协同完成。其中eIF4E在翻译起始前，结合到成熟mRNA的5’帽端（5’UTR），并招募中心支架蛋白eIF4G，而PABP蛋白则通过同时结合eIF4G和mRNA 3’ 非翻译区（3’UTR）的 poly-A，使mRNA的5’UTR和3’UTR 相结合来形成环状的“首尾相连”结构，最终招募43S前翻译起始复合物而促进蛋白质的生物合成。由此可见mRNA的首尾环化在翻译起始过程中发挥重要作用。哺乳动物细胞中的翻译起始利用此环化机理，研究人员开发了“可控环化“的翻译调控系统。该系统的基础框架为定制化mRNA和人工翻译起始因子(synthetic translation initiation factor, STIF)。打造定制化mRNA的关键步骤是将原mRNA的poly-A切除，同时在3’UTR区域引入特异性结合STIF因子的核酸适配体序列，从而形成“人工定制化尾巴（poly-A surrogate）”。STIF由RNA结合蛋白MCP/L7Ae和可结合5’UTR的轮状病毒来源的NSP3蛋白相融合，一端结合到”尾部“的核酸适配体区，另一端直接招募eIF4G及相关的翻译起始复合物，最终促进定制化mRNA“成环”来起始目标基因的翻译（图1）。该设计彻底解决了长期存在的翻译表达调控效率低的难题，有效提高基因调控系统在体外和体内工作效率，使其有望应用于未来可控型基因治疗的临床应用中。图1. 由工程化poly(A)替代物介导的翻译调控。在此翻译控制系统的基础上，研究人员进一步构建了拆分型翻译起始因子，将不同的二聚或三聚蛋白对分别与RNA结合蛋白和NSP3融合，赋予了翻译调控系统响应光照（红光、蓝光），小分子(Grazoprevir，Danoprevir，脱落酸，赤霉酸，雷帕霉素)，或者细胞内特定蛋白质靶标和信号的能力（图2）。图2. 使用多部分STIF设计框架定制响应性基因表达。其中响应Grazoprevir的翻译调控基因开关在调控基因治疗方面表现突出。该基因开关可以适配现有各种基因治疗载体，包括DNA、体外转录RNA以及AAV表达系统。以糖尿病的基因治疗为例，通过搭载该基因开关，口服Grazoprevir便可以调控上述不同治疗载体在体内进行糖尿病治疗，实现疾病治疗的智能化。而Grazoprevir作为FDA批准的小分子药物将进一步有助此基因开关在临床上的应用开发（图3）。图3. Grazoprevir开关在哺乳动物细胞和基因治疗应用中的翻译调控。翻译调控系统的重要优势在于能够识别转录系统无法企及的细胞质内的生物元件(图4)。研究人员进一步挖掘此优势，通过将NSP3和RNA结合蛋白分别与蛋白标记物的特异性纳米抗体相连，得到了功能强大的蛋白质传感器。该感受器具有独特的空间感知优势，可以感知定位于不同细胞质的蛋白靶标。而基于转录起始的蛋白感受器只能感应存在于细胞核中的信号（图4）。图4. 识别细胞内靶蛋白的基因编码传感器该蛋白质传感器成功弥补了现有基因线路无法感知只存在于细胞质里的肿瘤异常蛋白的技术空白（如一系列癌症特异性的融合蛋白）。将相关基因环路原位导入小鼠皮下荷瘤模型中后，其能自主探测到肿瘤胞质内的特异性标记物，通过形成关键性的“首尾相连”结构，启动凋亡基因Bax的表达，来最终实现异常组织的自我清除（图5）。图5. 靶标特异性蛋白质传感器的工程设计研究人员进一步将该系统与其它类型的基因传感器相结合，通过多输入的“生物计算”系统来精准化识别更加复杂病理环境。最终可为多种复杂疾病定制出诊断、治疗、预防一体化的智能化基因疗法（图6）。图6. 治疗性生物计算系统的设计总而言之，该研究通过工程化改造“翻译成环”过程，开发了新的基因调控机制，丰富了合成生物学方面的细胞工程策略（工具箱）。在应用方面，该策略极大的提升了翻译调控系统应用于基因治疗的潜力，克服了当前基因治疗策略不可控的安全隐患，同时也可将治疗目标扩展到需要实时监控和动态干预的疾病中，而不仅仅是局限于需要长期无间断干预的疾病治疗。另外，本研究开发的蛋白传感器首次成功赋予mRNA基因治疗手段响应蛋白信号的功能。该功能将推动癌症、微生物感染等多种复杂疾病的精准、智能化疗法的临床开发。参考资料[1]Shao J, Li S, Qiu X, Jiang J, Zhang L, Wang P, Si Y, Wu Y, He M, Xiong Q, Zhao L, Li Y, Fan Y, Viviani M, Fu Y, Wu C, Gao T, Zhu L, Fussenegger M, Wang H, Xie M. Engineered poly(A)-surrogates for translational regulation and therapeutic biocomputation in mammalian cells. Cell Res. 2024 Jan;34(1):31-46. doi: 10.1038/s41422-023-00896-y.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

目前新冠病毒(SARS-CoV-2)疫情仍处于流行阶段，最近在法国出现的Omicron亚变体BA.2.86的子代变异株—JN.1迅速向全球蔓延。因此，对BA.2.86亚变体病毒学特征的揭示和有效抗病毒药物的研发，对于该病毒及其子代的防控具有重要意义。近期，复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室、上海市重大传染病和生物安全研究院双聘PI陆路/姜世勃/夏帅团队通过对BA.2.86膜融合动力学的分析，揭示了该病毒的膜融合特征。同时，该团队将其在前期开发出来的通用冠状病毒融合抑制剂多肽EK1（现在II/III临床试验中）通过原核表达技术进行制备，所产生的多肽—reEK1具有广谱、高效的抗病毒活性，还具有可大规模生产且成本较低的潜在优势，对当前新冠病毒或未来可能爆发的其他冠状病毒引发的大流行传染病防控提供了药物研发新思路。该研究成果在今年1月9日发表在国际知名期刊Cell Discovery（中科院I区期刊, IF=33.5）。SARS-CoV-2依赖包膜表面刺突（S）蛋白介导感染，S蛋白介导的病毒与细胞膜发生的膜融合过程是SARS-CoV-2入侵靶细胞的重要途经。其与病毒的感染能力和致病性密切联系。变异株S蛋白中出现的不同突变将影响SARS-CoV-2的膜融合特征，也使得变异株可能具有药物抵抗及免疫逃逸的能力。最近出现的新冠病毒变异株BA.2.86仅在S蛋白上就累积了共33个不同突变，且与目前主流Omicron变异株差异较大，并在一些非结构蛋白（如NSP2、NSP3）上也出现新突变位点（图2）。研究者通过建立带有GFP荧光的膜融合系统，评估了变异株BA.2.86的融合动力学特征，并发现其S2亚单位中S939F突变位点对膜融合能力具有较大贡献。结果显示，在人来源肺部细胞Calu-3为代表的多种靶细胞中，BA.2.86的融合效率比其前代变异株BA.2明显升高。因此，具有独特突变模式的BA.2.86已经开启新冠病毒全新的进化方向，未来其可能进化出具有更强膜融合能力和传播能力及免疫逃逸能力的子代变异株，但目前针对该类变异株的融合抑制剂尚未有相关报道姜世勃/陆路团队在既往研究中发现，包含SARS-CoV-2在内的冠状病毒HR1结构域极其保守，阐明了靶向冠状病毒HR1是研发广谱抗冠状病毒多肽类抑制剂的关键机制（Lancet 2004; Nat commun 2014; Cell Res 2020），并依此成功开发了一系列广谱抗病毒多肽，如EK1、EK1C4等( Scie Adv 2019; STTT 2021; Cell Res 2022)。而在本研究中，该团队利用原核表达系统，研发出了广谱抗冠状病毒多肽reEK1及其重组原核表达工艺，为大规模抗冠状病毒药物储备提供了新方案。EK1是一种广谱、高效的多肽类冠状病毒融合抑制剂，目前正在II/III期临床试验中。由于多肽药物的化学合成成本较高，限制了其在大规模疫情防控时代的应用，而本研究提供了一种经原核表达系统大量生产多肽药物的新方案。原核表达的reEK1多肽与化学合成EK1多肽序列完全一致，纯度高（多肽纯度>99%），并且兼具产量大、成本低的潜在优势。结果表明，reEK1可以高效抑制BA.2.86的S蛋白介导的细胞-细胞融合过程（IC50 = 331 nM），并在假病毒感染系统上也显示出良好的抑制活性（IC50 = 298 nM）（图3）。同样，在其它新冠病毒变异株S蛋白介导的细胞-细胞融合模型上，其IC50 均在在243 ~ 420 nM范围内，因而进一步表明其具有很好的广谱性，可以应对目前和未来新冠变异株或其它新发与再现的冠状病毒感染。为了进一步探索reEK1在体内的抗病毒效果，研究者对hACE2转基因小鼠模型进行鼻腔雾化给药，试验结果表明reEK1可有效地预防SARS-CoV-2（BA.2）活病毒对小鼠的感染，显著降低小鼠肺部的病毒载量，从而改善肺部病理损伤，展现出良好的抗病毒临床应用前景（图4）。原核表达多肽工艺能够促进高产量、低成本的多肽药物的生产，或许能够替代传统化学合成工艺，为未来大规模的冠状病毒疫情防控提供抗病毒药物的储备。复旦大学博士研究生王李珏为第一作者，复旦大学陆路研究员、姜世勃教授、夏帅青年研究员以及中科院生物物理研究所朱赟研究员为该论文的共同通讯作者。原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41421-023-00631-2识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。