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摘要嵌合抗原受体-T（Chimeric antigen receptor-T，CAR-T）细胞疗法是一种革命性的过继性细胞疗法，它可以改造T细胞并将其重新定向到特定的肿瘤细胞。自CAR-T细胞疗法于2017 年首次获准用于B细胞衍生恶性肿瘤以来，它在血液肿瘤领域取得了前所未有的进展，近年来，它极大地重塑了癌症治疗的格局。目前，累积的证据表明，CAR-T细胞疗法可以成为实体瘤的可行治疗策略。然而，由于肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用和肿瘤抗原的异质性，CAR-T细胞疗法在实体瘤中的应用需要绕过更多具有挑战性的障碍。乳腺癌具有侵袭性强、恶性程度高、预后差的特征。本综述强调了CAR-T细胞疗法在乳腺癌中的基本靶点，总结了与CAR-T细胞疗法相关的挑战，并提出了应对这些挑战的策略，为乳腺癌治疗提供了一种新方法。引言根据2020年最新的全球癌症统计数据，乳腺癌已超过肺癌，成为最常诊断出的癌症。约有230万新确诊病例和68万死亡病例。乳腺癌因其恶性程度高、预后极差，严重威胁着妇女的健康。根据雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）和人类乳腺癌受体（human epidermal receptor 2, HER2）的表达水平，乳腺癌可分为以下亚型:基底样乳腺癌、管腔A型乳腺癌、管腔B型乳腺癌、三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）和HER-2扩增亚型。手术、化疗和放疗仍是乳腺癌的主流治疗手段。治疗后乳腺正常组织受损、复发、转移等致命并发症严重制约了乳腺癌的治疗效果。曲妥珠单抗等靶向疗法的不断临床应用使HER2阳性乳腺癌患者预后得到改善，不良反应更少。然而，由于靶向疗法的分子特异性，其总体治疗效果仍然有限，因此迫切需要替代疗法。TME由肿瘤细胞、免疫细胞、间充质细胞、分泌的趋化因子和免疫细胞组成、 免疫细胞、间充质细胞以及分泌的趋化因子和细胞因子组成，共同调节肿瘤细胞的生理过程。近几十年来，TME在肿瘤发生过程中的调控机制已被阐明，肿瘤浸润免疫细胞在TME中发挥着重要作用。基于免疫检查点如程序性死亡-1/程序性死亡配体-1（programmed death-1/programmed death ligand-1，PD-1/PDL1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4）的免疫疗法已广泛应用于多种肿瘤。抑制免疫检查点可以阻断免疫细胞中的免疫抑制信号，激活免疫细胞识别并消灭肿瘤细胞。肿瘤细胞。免疫疗法在肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌中取得了令人满意的临床治疗效果，振兴了癌症治疗领域。CAR-T细胞是人工制备的T细胞，其表面表达一种合成的肿瘤细胞特异性受体。CAR-T细胞的制备过程如图1所示。T 细胞最初从外周血单核细胞中分离外周血单核细胞中分离出来，并用慢病毒转染以表达CAR。经修饰的CAR-T细胞随后在体外扩增，并回输到患者体内。CAR-T细胞可以识别特定的肿瘤抗原抗原，激活免疫反应，最终消除肿瘤细胞。CAR-T细胞疗法在治疗血液肿瘤方面取得了治疗血液肿瘤取得了令人瞩目的成就。自2017年以来美国食品和药物管理局已批准六种CAR-T细胞用于血液肿瘤治疗。（图2）CAR-T细胞疗法对血液恶性肿瘤的显著效果，促进了它在包括乳腺癌在内的实体瘤中的应用。在这篇综述中，我们介绍了新型CAR-T细胞工程策略，总结了乳腺癌中的潜在靶点和临床试验，并讨论了CAR-T细胞疗法面临的挑战和CAR-T细胞疗法的工程策略。图1 工程化CAR-T细胞制造流程图。首先，从患者身上抽取血液样本。其次，从人血液样本中分离并收集T细胞。然后，将慢病毒转染到患者的T细胞基因组中，促进T细胞表达人工修饰的car。最后，设计的CAR-T细胞在体外大量扩增并注射到肿瘤患者体内。 CAR的构建 CAR 根据其结构和功能分为四个主要部分结构和功能，包括：抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和一个细胞内信号域。具体结构如图3所示。在CAR的开发过程中优化四个结构域可以显著增加在肿瘤治疗中的安全性和有效性。抗原结合域位于CAR-T细胞的细胞外膜上，主要作用是识别肿瘤抗原和将识别到的抗原信号转导到细胞中。抗原结合区是一个单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv），由可变的重链和链接了Gly4Ser肽的轻链抗体组成，是CAR中最常见的连接子。scFv序列通常是源自小鼠或人类的单克隆抗体的一部分。目前，更小的天然的克隆抗体（纳米抗体）也被设计用于scFV序列。该结构域能识别细胞肿瘤特异性抗原并激活T细胞，它与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子无关。它为克服肿瘤细胞中MHC分子下调导致的免疫逃逸提供了一种方法。抗原结合区的识别能力和亲和力直接影响CAR-T细胞的抗肿瘤效果。铰链区负责连接细胞外抗原结合域和细胞膜的跨膜区域。它为抗原结合域提供了灵活性，以应对与肿瘤细胞结合时的空间障碍。使得CAR-T细胞就能更容易地识别肿瘤细胞并与之相互作用。跨膜结构域连接CAR-T细胞的胞内和胞外结构域，将CAR的基本结构固定在细胞膜上。Ⅰ型蛋白是跨膜区的主要成分，如CD3ξ、CD4、CD28或者CD8α。Savoldo等人发现相比于含有CD3ξ的跨膜结构域，含有CD28的跨膜结构域结构更加稳定。细胞内信号结构域是 CAR 的细胞内定位成分，通常由激活结构域和共刺激结构域组成。激活结构域和共刺激结构域。肿瘤抗原的识别信号传递给CAR-T细胞，激活胞内信号结构域，促使T细胞消灭肿瘤细胞。CAR的大多数激活结构域来源于基于酪氨酸活化模体的CD3ξ免疫受体。然而，仅靠CD3ξ传递的激活信号还不足以诱导T细胞产生持久的免疫反应。因此，在CAR的结构中引入了OX40、CD27、CD28、4-1BB或ICOS等共刺激结构。研究发现，激活共刺激结构域可通过产生IL-2等细胞因子，显著提高CAR-T细胞的抗肿瘤效果和持久性。图2 FDA批准CAR-T细胞用于肿瘤治疗的过程 CAR-T 细胞疗法的发展 随着生物技术的进步，CAR-T细胞已经发展了几代。发展过程如图3所示。图3 CAR-T细胞的基本结构图和从第一代到最新一代CAR-T细胞的发展流程图。CAR-T细胞的基本结构由细胞外肿瘤抗原结合域、铰链域、跨膜域和细胞内信号域组成。第一代CAR-T细胞仅包含CD3z胞内信号域。第二代或第三代CAR-T细胞在上一代CAR-T细胞的基础上增加了一个或多个共刺激分子。下一代CAR-T细胞应用了多种新的工程策略，包括双特异性car、开关、纳米抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9和细胞因子途径第一代CAR-T细胞仅通过CD3z结构域的胞内区域传递激活信号。由于缺乏共刺激信号导致CAR-T细胞死亡较快，它们在临床试验中的疗效有限。在上一代CAR-T 细胞构建的基础上，第二代CAR-T细胞加入了共刺激信号结构域4-1BB或CD28。两种信号共同激活大大提高了CAR-T细胞的肿瘤杀伤效力和持久性。多项临床试验证实，靶向CD19的第二代CAR-T细胞在 B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic Leukemia，B-ALL）治疗中取得了显著的临床疗效。此外，为了进一步提高CAR-T细胞的活化能力，第三代CAR-T细胞设计了额外的共刺激信号分子的。这一代CAR-T细胞通常使用 CD27、CD28、ICOS、4-1BB 和 OX40 等成本刺激信号分子，其抗肿瘤疗效优于前代产品。第三代CAR-T细胞已成为构建CAR 结构的主要广泛应用技术。NKG2D带有CD27或4-1BB共刺激信号分子的CAR-T细胞可以在没有 IL-2的情况下促进CAR-T细胞的扩增和自我富集，从而有效提高识别和消除乳腺癌的能力。靶向表皮生长因子受体CAR-T细胞含有CD28、4-1BB和CD3ξ共刺激信号分子对肿瘤有很强的抑制作用。此外，人们还开始采用一些新的策略来寻找治疗效果更好、不良反应最小的 CAR-T 细胞疗法。研究发现，CD28 可促进细胞因子分泌，4-1BB可增加T细胞增殖，CD27可提高T细胞存活率。第四代靶向FRα CAR-T细胞含有共刺激域CD28、4-1BB和CD27，由于这三个共刺激域的综合优势，对乳腺癌具有更优越的疗效。开关结构包括与肿瘤抗原特异性结合的Fab分子和与CAR-T细胞特异性结合的肽表位。CAR-T细胞只与开关的肽表位结合，而不与内源性组织或肿瘤细胞上的抗原结合。因此，识别和激活过程严重依赖于开关的存在。与传统的CAR-T治疗相比，这种开关策略可以通过控制 CAR-T 细胞的活性和细胞因子的释放来减少不良反应的发生。在单链CAR结构中设计两个配体结合域是一种更有效识别肿瘤细胞的策略。CAR可识别两种不同的肿瘤抗原， 其中任何一种都足以激活T细胞。这种激活模式明显提高了识别肿瘤细胞的效率。在Yang等人的研究中，一种二价串联CAR（TanCAR）旨在同时靶向CD70和B7-H3，从而增强了抗肿瘤功能，改善了乳腺癌抗原异质性和变异性问题。信号传输结构域是目前CAR中的新结构域，可能是除共刺激结构域之外激活 CAR-T 细胞功能的另一个重要信号。Kagoya等人设计了新一代CAR-T细胞，与传统CAR- T细胞相比，它增加了一个新的信号分子域。该信号结构域由IL-2受体β链和STAT3结合酪氨酸-X-X-谷氨酰胺（tyrosine-X-X-glutamine，YXXQ）模体构建而成。与传统的CAR-T细胞相比，这些新型CAR-T 细胞能通过激活JAK激酶和STAT3/STAT5转录因子信号通路，提高增殖、抗肿瘤能力和持久性。 CAR-T细胞在乳腺癌中的治疗靶点 在实体瘤中，CAR-T 细胞的构建更为复杂，靶向肿瘤特异性抗原的识别是 CAR-T 细胞疗法面临的重要挑战。多年来，一些肿瘤表面抗原已被确定为乳腺癌 CAR-T 细胞疗法的治疗靶点。在接下来的章节中， 我们将总结CAR-T 细胞治疗乳腺癌靶点的一些最新进展。此外，表1列出了总结的靶点信息。瘤细胞特异性受体。CAR-T 细胞的制备过程如表1所示。 表1 CAR-T疗法治疗乳腺癌的靶点汇总HER2人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是研究最广泛的乳腺癌分子之一，20%-25% 的乳腺癌患者HER表达升高。HER2的过度表达与乳腺癌转移和复发率较高有关。自1998年FDA批准曲妥珠单抗以来，使用单克隆抗体的特异性彻底改变了HER2阳性乳腺癌的主流治疗理念。虽然HER2 靶向疗法已广泛应用于乳腺癌患者，并取得了良好的治疗效果，但耐药性仍限制了其对患者的治疗效果。构建的HER2靶向CAR-T细胞能主动识别肿瘤，并在肉瘤临床试验中取得了更好的疗效和安全性。Gábor等人设计了带有曲妥珠单抗衍生scFv和CD28的共刺激结构域 HER2靶向CAR-T细胞。结果显示，在这些曲妥珠单抗耐药的乳腺癌患者中，只有 7% 的CAR-T细胞在57天内实现了肿瘤完全缓解。细胞由 T 细胞组成。结果证实，少量的 CAR-T 细胞就能对抗肿瘤 HER2 抗体耐药的异种移植物产生强大的抗肿瘤作用。在另一项针对曲妥珠单抗耐药乳腺癌的研究中，以HER2为靶点的CAR-T细胞可渗入肿瘤球的核心区域，显示出肿瘤细胞的细胞毒活性，而抗HER2抗体则无效。此外，CAR-T细胞还能穿透肿瘤基质，根除曲妥珠单抗耐药乳腺癌异种移植物中的肿瘤。这项研究表明，CAR-T细胞可以通过掩蔽肿瘤表位和阻断乳腺癌肿瘤基质，有效克服抗体治疗失败的问题。同时，Saul等人通过正位异种移植模型发现，将HER2靶向CAR-T细胞送入脑部可对脑转移的乳腺癌产生较强的抗肿瘤作用，解决了肿瘤脑转移中药物难以突破血脑屏障的难题。HER3/4作为HER2的异二聚体和信号转导伙伴，HER3/HER4与乳腺癌的致癌信号转导和耐药性有关。Heregulin（HRG）是一种分泌于细胞内的可溶性生长因子，含有表皮生长因子亚域，与HER3/4受体有很高的亲和力。它能通过与特定受体结合，诱导HER酪氨酸激酶受体家族异源二聚化。HRG的这一细胞外结构域被设计用于构建HER3/4靶向的CAR-T细胞。体外实验和移植肿瘤模型发现，这些细胞能特异性识别HER3表达过高的乳腺癌细胞，并对其产生强烈的肿瘤杀伤作用。EGFR表皮生长因子受体（EGFR）是表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族的重要成员之一，在大约一半的TNBC中被发现过表达，在乳腺癌进展和恶性转化中具有重要的调控能力。EGFR激活与表皮生长因子受体结合后，其酪氨酸激酶结构域会发生自身磷酸化，并激活下游的PI3K/AKT 信号通路。EGFR特异性CAR-T 细胞已在肺癌中显示出抗癌潜力，并在胰腺癌Ⅰ期临床试验中显示出更好的安全性和抗肿瘤效果。Xia等人发现，EGFR靶向CAR-T细胞在体外对TNBC具有特异性和较强的肿瘤杀伤能力，这种能力在异种移植小鼠模型中得到了进一步证实。机制研究证实，EGFR靶向CAR-T细胞可激活TNBC细胞中的颗粒酶-穿孔素-PARP和Fas-FADD-caspase信号通路，这可能是提高抗肿瘤效果的重要机制。在另一项研究中，Liu等人设计了两种不同类型的EGFR靶向CAR-T细胞，它们的scFv区域具有不同的DNA序列。这些CAR-T细胞能识别EGFR高表达的TNBC细胞，并能够在体外试验和异种移植小鼠模型中触发TNBC细胞死亡。MSLN间皮素（MSLN）是间充质细胞表面的一种糖蛋白。研 究发现，它的表达在包括乳腺癌在内的各种癌症中上调，这使得MSLN靶向CAR-T细胞成为乳腺癌治疗的一种潜在意。Zhang等人设计了第三代MSLN靶向CAR-T细胞，该细胞含有CD28和4-1BB共刺激结构域。在体外和体内乳腺癌异种移植模型中，MSLN 靶向CAR-T细胞特异性地破坏了MSLN阳性的乳腺癌细胞系，并显著抑制了乳腺癌肿瘤的生长。同时还发现，在CAR- T细胞存在的情况下，T细胞和细胞因子分泌水平显著增加。ICAM1细胞间粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM1）是一种细胞表面跨膜糖蛋白受体，属于免疫球蛋白超家族。研究发现，ICAM1 的功能与肿瘤细胞粘附、细胞生长信号通路以及免疫细胞向炎症部位的转运有关。与正常乳腺组织相比，ICAM 在TNBC中的表达水平更高。ICAM1特异性scFv Mg2被选为细胞外抗原结合域。体外肿瘤细胞和TNBC小鼠模型实验显示，ICAM1靶向 CAR-T 细胞具有很强的特异性破坏TNBC细胞的能力，能显著降低TNBC肿瘤的生长，提高小鼠模型的存活率。AXLAXL是一种酪氨酸激酶受体（RTK），最初是在慢性骨髓性白血病患者身上发现的。AXL 在乳腺癌细胞膜中过表达，其过表达与患者生存率降低有关。以往的研究表明，它可能与肿瘤的生理过程有关，包括增殖、凋亡、迁移、炎症和血管生成。此外，它还能激活细胞内的各种下游信号通路，如 NF-kB、MAPK、mTOR、AKT 和PI3K。Wei等人构建了AXL靶向CAR-T细胞，并在体外检测了其对AXL阳性肿瘤的抗原特异性细胞毒性和细胞因子释放能力。实验结果表明， AXL靶向CAR-T细胞在TNBC异种移植模型中具有显著的抗肿瘤能 力和更强的持久性。MUC1MUC1 是一种跨膜粘蛋白，被大量糖基化，通常在大多数腺体上上皮细胞和器官上表达。在90% 以上的乳腺癌患者中发现了的过度表达和异常糖基化。异常糖基化的MUC1（tMUC1）可以是通过合成单克隆抗体特异性识别TAB004用于乳腺癌，但不用于正常结构。Zhou等人利用 TAB004 结构作为抗原结合域设计了MUC28z嵌合抗原受体。这些类型的CAR-T细胞在识别tMUC1后能增强细胞因子和趋化因子（如Granzyme B和IFN-γ）的表达和分泌。tMUC1靶向CAR-T细胞显示出显著的细胞毒性和抗肿瘤作用，并能减少 TNBC 肿瘤在体外和异种移植模型中的增殖和生长。GD2神经节苷脂（GD2）是一种酸性糖磷脂，有两个硅铝酸残基，被确定为乳腺癌干细胞样细胞的标志物。在TNBC 中，GD2 的表达水平上调。Seitz 等人设计了一种新型 GD2靶向CAR-T 细胞，用于识别和破坏 GD2 阳性的肿瘤细胞。该CAR中scFv的构建基于地纽昔单抗beta(dinutuximab beta)，一种单克隆抗体 CH14.18）。这项研究发现，GD2-靶向CAR-T细胞的激活可介导肿瘤细胞死亡，并阻止乳腺癌的恶化和转移。FRα叶酸受体α（FRα）是一种膜结合蛋白，对叶酸具有高亲和力，具有将叶酸转运到细胞内的功能。FRa在乳腺癌细胞表面过度表达，而在正常组织中则没有，因此FRα有望成为乳腺癌的靶向抗原。Luangwattananun等人通过慢病毒系统生成了FRα靶向CAR-T细胞。当这些特异性CAR-T细胞与表达FRα的TNBC细胞共培养时，具有显著的抗肿瘤能力。此外，其细胞毒性作用在FRα表达增加的细胞中更为明显，而在 FRa 阴性的正常乳腺细胞中则没有观察到。同时，CAR-T细胞对FRα阴性的MCF10A正常乳腺细胞不产生这种特异性细胞毒性。PD-L1程序性死亡受体 1（Programmed death receptor 1 ，PD-1、CD279）和程序性死亡配体1（PD-L1）可以激活免疫细胞抑制信号，其表达通常在持续T细胞活化的肿瘤患者中。靶向PD-L1是一个有前途的靶点，在多种肿瘤的临床试验中取得了良好的效果。目前已开发出一种嵌合PD-1（chPD1）受体，可识别乳腺癌中表达的PD- L1。Parriott等人设计了ChPD1-T细胞，通过分泌IL2、IL-17、IL-21、IFN g、TNF和GM-CSF 等炎症因子以及减少炎症抑制细胞因子IL-10来识别和破坏肿瘤细胞。ChPD1-T细胞明显减轻了肿瘤负荷，延长了肿瘤小鼠的无瘤生存期。Bajor等人发现，PD-L1靶向的CAR-T细胞在PD-L1表达较 高的TNBC细胞中表现出强烈的脱颗粒反应和细胞因子产 生。低PD-L1表达的肿瘤细胞与CAR-T细胞共培养可通过 诱导肿瘤细胞上的PD-L1表达而导致肿瘤细胞清除延迟。进一步的研究证实，HER-2靶向CAR-T细胞可提高乳腺癌细胞上PD-L1的表达水平，协同增强PD-L1靶向CAR- T细胞的肿瘤杀伤功能。PTK7蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）是受体酪氨酸激酶（RTKs）家族的重要成员，其胞内结构域可催化非活性酪氨酸激酶。PTK7的表达在乳腺癌中有所增加。我们构建了三种不同类型的PTK7特异性CAR（PTK7- CAR1/2/3），它们都含有人工修饰的PTK7特异性scFv结构域、CD8α分子跨膜结构域、CD3z 细胞内结构域序列和4-1BB 细胞内共刺激结构域。这些CAR-T细胞都能增加细胞因子的产生，并对高表达PTK7的乳腺癌产生细胞毒性，而不会对正常组织造成明显损伤。Trop2滋养层细胞表面抗原2（Trop2）是一种细胞表面糖蛋白，在TNBC中过表达，在肿瘤生长、增殖、迁移和转移 中具有重要功能。Chen等人开发了一种新型 Trop2靶向CAR-T细胞。通过体外实验，这些构建的CAR-T细胞对表达Trop2的乳腺癌细胞具有很强的肿瘤杀伤能力。在Trop2靶向CAR-T细胞中添加CD27可通过提高IL-7Ra的表达和降低PD-1的表达，提高其在肿瘤细胞和肿瘤小鼠模型中的抗肿瘤效果。SLC3A2Ansari等人发现，肿瘤相关抗原 SLC3A2（一种细胞表面蛋白）的较高表达量对肿瘤的生长起着重要作用。预示着乳腺癌的预后较差。SLC3A2靶向CAR-T细胞通过同时刺激体外 INF-g和IL-2的产生，显示出对乳腺癌肿瘤细胞的细胞毒性。在体内异种移植模型中，SLC3A2-靶向CAR-T细胞显著提高了总生存率，并减少了皮下异种移植肿瘤的生长和肿瘤负荷，且无体重减轻和细胞因子释放综合征（CRS）。B7-H3B7-H3是一种免疫检查点分子，也被称为 CD276，属于免疫检查点抑制剂 B7 超家族。Chen等人发现，B7-H3在乳腺癌中过表达，B7- H3的上调与乳腺癌的不良预后和临床结果相关，这意味着B7-H3可能是CAR-T疗法 的前瞻性靶点。Lei等人发现，以 B7-H3 为靶点的CAR-T 细胞可以特异性地损伤表达 B7-H3 的实体瘤细胞， 包括乳腺癌。同时，低剂量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA通过增强B7-H3的表达，减少具有免疫抑制功能的CTLA-4和TET2的分泌，显著提高了体外B7-H3靶向CAR-T 细胞的抗肿瘤效果。CD70CD70是坏死因子受体超家族的重要成员，在细胞表面表达，并在多种肿瘤中广泛过表达。Yang等人设计了一种同时靶向CD70和B7-H3分子的二价串联CAR（Tan CAR）。改良后的 CAR-T 细胞能与 CD70 特异性结合，对 CD70 阳性的乳腺癌细胞具有更高的持久性和抗肿瘤能力。与单链特异性CAR-T细胞相比，当Tan CAR-T细胞作 用于同时表达两种靶抗原的乳腺癌细胞时，能提高诱导肿瘤细胞损伤和乳腺癌细胞释放细胞因子的能力。VEGRF2/3血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor ，VEGF）和血管内皮生长因子受体（VEGFR）在血管生成和淋巴管生成中具有重要的生理功能，而血管生成和淋巴管生成与肿瘤细胞的生长、侵袭、迁移和转移等分子和生物学功能密切相关。阻断或干扰血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体（VEGFR）之间的相互作用已成为一种可能的治疗方法。VEGFR-2和VEGFR-3是血管内皮生长因子受体（VEGFR）家族的重要成员，人们设计了以VEGFR-2或VEGFR-3为靶点的CAR-T细胞，以验证它们在乳腺癌治疗中的潜力。Xing等人发现，这些CAR-T细胞通过上调INF-γ、TNF和IL-2细胞因子的产生能力，对VEGFR-2/3阳性的 乳腺癌细胞表现出很强的细胞毒性。此外，靶向VEGFR-2/3的CAR-T细胞还能显著抑制裸鼠模型中异种移植肿瘤的增殖、侵袭和转移能力，并破坏内皮细胞的管状结构。TEM8肿瘤内皮标志物8（TEM8）是一种具有高度保守整合素的糖蛋白，参与内皮细胞的侵袭和转移，最初被视为肿瘤内皮标志物。TEM8在乳腺癌细胞中表达升高，TEM8的高表达与乳腺癌的高生长、高转移和高复发率有关。TEM8靶向CAR-T细胞可分泌免疫刺激细胞因子，并在TEM8 特异性识别后通过破坏TEM8 过表达的TNBC细胞和肿瘤血管内皮细胞来阻断肿瘤血管生成。这些细胞还能诱导TNBC衍生的异种移植瘤消退，并通过靶向干细胞样乳腺癌细胞对抗乳腺小球的形成。NKG2DLsNKG2D（Natural Killer Group 2，member D）是一种在NK细胞和T细胞中高度表达的受体。NKG2D配体（NKG2DLs）经常在包括乳腺癌细胞在内的多种肿瘤细胞中上调。免疫细胞中的 NKG2D与肿瘤细胞上的NKG2DLs 相互结合，在激活免疫细胞的肿瘤杀伤效应方面发挥了重要作用。在体外，以NKG2DLs为靶点的CAR-T细胞能有效识别并清除过表达NKG2DLs的TNBC。此外，带有4-1BB或CD27分子的成本调控域可特异性增强CAR-T细胞的持久性。αvβ6整合素整合素αvβ6是异二聚体细胞表面受体家族的成员，介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质之间的相互作用。avb6整合素在乳腺癌中上调，其过表达与癌症患者的预后有关。整合素αvβ6可激活TGFβ信号通路并促进细胞增殖和迁移、上皮-间质转化以及基质金属蛋白酶活性。通过将融合的CD28 + CD3结构域与源自口蹄疫病毒的A20肽相结合，构建了高度选择性的avb6靶向CAR-T细胞。IL-4 反应性融合基因（4αβ）在CAR-T细胞中共表达，以增加这些细胞的增殖和扩增能力和持久性体内细胞。Whilding 等人发现，αvβ6靶向CAR-T细胞在体内和体外对乳腺癌细胞具有很强的细胞毒性，而对正常 组织的损伤较小。CD32A131R抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是免疫细胞杀死肿瘤细胞的常用方法。肿瘤细胞的识别和溶解过程受抗体的 Fc 片段与免疫效应细胞的FcγR结构域结合亲和力的影响。CD32 是FcγR家族的成员，由三种不同的变体 A、B和C组成，它们对Fc片段具有亲和力。CD32A131R 是根据第131位的精氨酸定义的。Caratelli等人设计了一种低亲和力嵌合受体CD32A131R，通过与西妥昔单抗交联诱导消除表皮生长因子受体过表达的乳腺癌。这些 CAR-T 细胞能有效识别特定的西妥昔单抗结合的肿瘤细胞，并通过西妥昔单抗和CAR-T细胞的结合促进INFγ和TNF的表达和分泌。 CAR-T联合疗法 尽管CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗方面取得了重大进展，但仅靠CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效仍然有限。因此，仍然需要有效的方法来促进CAR-T细胞疗法。多项研究表明，CAR-T细胞的持久性和杀伤肿瘤能力受多种分子或基因表达的影响。我们总结了几种将CAR-T细胞与其他分子相结合以提高疗效的前瞻性方法。HER2靶向CAR-T的联合疗法Il-21是TME中的一种细胞因子，可促进T细胞增殖并驱动T细胞记忆效应，具有防止肿瘤转移或复发的功能。Du等人发现，IL-21能增强分化不良CAR-T细胞的聚集和扩增能力，并通过增加细胞因子，有效提高HER2 靶向CAR-T细胞对HER2-表达细胞的细胞毒性。他们的研究表明，在将HER2靶向CAR-T细胞与曲妥珠单抗耐药的 HCC1954和BT474细胞结合后，IL-21的加入能显著增加对曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞的强细胞毒性，并促进 IFN-γ和IL-2的合成和分泌此外，Li等人还发现，抗PD1抗体可以增强HER2靶 CAR-T细胞的治疗效果。在另一项同源小鼠模型研究中，加入抗PD1抗体后，更多HER2靶向CAR-T细胞驻留在肿瘤基质中，显著提高了识别肿瘤和维持 T 细胞持久性的能力。结果表明，抗PD1抗体可以提高CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力，并减轻肿瘤负荷。IKZF家族蛋白含有一个锌指结构域，可以识别特定的DNA序列，与其他蛋白结合，并通过重塑染色质和与RNA Pol II转录起始复合物结合来激活或抑制靶基因。在以HER2为靶点的CAR-T 细胞中敲除转录因子IKZF3，可以在不影响CAR细胞活性和功能的情况下， 通过增加 T 细胞的活化和增殖，显著提高杀伤癌细胞的能力。EGFR靶向CAR-T细胞的联合疗法聚胞苷酸（poly I:C）是一种合成的双链RNA（dsRNA）类似物。它能被dsRNA激活的toll样受体3（TLR3）和蛋白激酶（PKR）识别并结合。它可介导免疫功能，并对多种癌症具有广泛的抗肿瘤作用。EGFRVIII 靶向CAR-T细胞与Poly I: C的联合应用显著提高了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，促进了IFN g和IL-2的产生和分泌。它还改善了CAR-T细胞对皮下乳腺癌移植小鼠肿瘤生长和增殖的抑制作用。同时，这种成分还能大幅减少脾脏和外周血中髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）的数量，从而降低MDSC在肿瘤免疫过程中的免疫抑制作用。奥拉帕利（Olaparib）是一种口服多聚ADP核糖聚合酶抑制剂，对突变的BRCA阳性转移性乳腺癌有临床疗效。Sun等人发现，奥拉帕利通过抑制MDSC的迁移和聚集以及促进T细胞在TME中的存活和持续，可以显著提高 EGFRVIII 靶向CAR-T细胞的抗肿瘤效果。从机制上讲，奥拉帕利能阻止癌症相关成纤维细胞释放的SDF1α的表达，从而减少MDSC的迁移，从而增强 CAR-T 细胞对肿瘤的免疫效果。CDK7是转录因子TFIIH的关键组成部分，TFIIH被引入PolII附近的转录起始位点，以促进转录的启动。Xia等人发现，表皮生长因子受体靶向CAR-T细胞抗性乳腺癌细胞特别容易受到CDK7抑制剂THZ1的影响。在TNBC肿瘤模型中，THZ1与表皮生长因子受体靶向CAR- T细胞结合使用，与单独使用CAR-T细胞相比，能更好地抑制免疫抵抗，防止肿瘤增殖和转移。ROR1靶向CAR-T细胞的联合疗法受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1）是 ROR 家族中的I型跨膜受体，具有细胞外配体结合结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域。Nicholas 等人总结说，ROR1参与抑制细胞凋亡、增强表皮生长因子受体信号通路和诱导肿瘤上皮-间质转化（EMT）。然而，ROR1 靶向CAR-T细胞对乳腺癌的疗效有限。Srivastava等人发现，奥沙利铂能激活肿瘤巨噬细胞并释放T细胞募集趋化因子，从而改善ROR1靶向CAR-T细胞的浸润。此外，奥沙利铂与抗-PD-L1联用可协同改善ROR1靶向CAR-T细胞损伤肿瘤的功能。转化生长因子（TGF）β是一种TGF-β是TME中公认的免疫抑制细胞因子，与ROR1靶向CAR-T细胞的抗肿瘤作用相关。细胞因子的产生和 ROR1 靶向 CAR-T 细胞的增殖功能在TGF-β的存在下明显受损。Tanja等人发现，通过抑制剂SD-208阻断TGF-β受体信号转导可以促进ROR1靶向CAR-T细胞的肿瘤杀伤功能。其他CAR-T细胞的联合疗法白细胞介素-7 受体（IL7R）存在于淋巴祖细胞表面， 对淋巴细胞的正常发育至关重要。研究发现，上调IL7或 IL-7受体可延长免疫细胞的存活时间并增强抗肿瘤效果。Zhao等人发现，激活IL-7受体可通过提高CAR-T 细胞在体外和体内的生长、增殖、活化和细胞毒性能力，增强传统 AX靶向CAR-T细胞的抗肿瘤功能并延长其存活时间。P38通路是一种应激活化蛋白激酶通路，也经常受到破坏，并与人类癌症的存活和迁移有关。通过CRISPR-Cas9筛选和T细胞功能测试发现，干扰P38通路可以增强T细胞的扩增能力，限制其氧化和分化压力。研究发现，P38抑制剂（P38i）能使 CAR-T 细胞更有效地进行T细胞介导的肿瘤特异性溶解，这表明P38i在提高CAR-T细胞抗肿瘤功能方面具有广阔的临床应用前景。CAR-T细胞在TME中的持久能力是阻碍其对实体瘤产生治疗效果的一个重要因素。研究发现，CD8+ T 17（Tc17）细胞和T辅助17（Th17）细胞在TME中更具持久性。一项研究发现，当STING激动剂DMXAA或cGAMP的刺激物与抗PD-1抗体结合时，Th/Tc17细胞产生的CAR-T细胞可以提高CAR-T细胞在TME中的持续能力和 肿瘤抑制作用。单细胞RNA测序表明，DMXAA能促进CAR-T细胞的转运，并通过产生趋化因子调节其在TME中的免疫效应。rAd.sT是一种靶向TGF-β信号的溶瘤腺病毒。Li等人报道，MSLN靶向CAR-T细胞与rAd.sT联合应用于乳腺癌治疗，可增加TME中细胞因子IL-6和IL-12的产生，从而产生更强的肿瘤抑制效果。 乳腺癌临床试验 在几年的乳腺癌研究中，CAR-T细胞的一些前瞻性靶点的人体试验已在世界各地得到证实，验证了该疗法的临床治疗效果和安全性。具体临床试验总结见表2。2017年 一项以c- Met 为靶点的CAR-T细胞I期临床试验（NCT01837602）在转移性乳腺癌患者中开展。在2例患者的血液和4例患者的肿瘤组织中检测到CAR的mRNA，细胞注射耐受性良好，无大于1级的相关不良反应。肿瘤被杀死后，免疫组化分析表明 CAR-T细胞在肿瘤内引起了炎症反应，导致肿瘤大面积坏死。然而，另一项以c-Met CAR-T为靶点的Ⅰ期临床试验（NCT03060356）因资金停止而终止。到目前为止，针对HER 2的CAR-T细胞疗法临床试验在乳腺癌患者中开展得最为广泛。目前共有五项1/2期临床试验。其中两项已撤销（NCT02547961）（NCT02713984），三项正在招募（NCT04650451）（NCT03740256）（NCT04430595）。此外，MUC1靶向CAR-T细胞的Ⅰ期临床研究也在广泛开展。(NCT02587689) (NCT04020575) (NCT04025216)。第1/2阶段针对 CEA的CAR-T细胞治疗CET阳性乳腺癌的临床试验也在进行中（NCT02349724）（NCT04348643）。此外，还有其他一些临床试验靶点，包括 EpCAM（NCT02915445）、NKG2DL （NCT04107142）、ROR1（NCT02706392）、CD70（NCT02830724）、C7R/GD2（NCT03635632）、CD133（NCT02541370）和CD44v6。(NCT04427449)。未来，针对乳腺癌患者的更多 CAR-T细胞临床治疗试验，以获得最佳治疗效果。表2 CAR-T细胞治疗乳腺癌的临床试验汇总 CAR-T细胞疗法面临的挑战 尽管针对实体瘤的 CAR-T 疗法已在实验室和临床中得到广泛研究，并取得了良好进展、其临床疗效仍不令人满意。如图4  所示，严重的不良反应、肿瘤细胞异质性、TME的免疫抑制以CAR-T 细胞的持久性是CAR-T细胞疗法面临的障碍。因此，在未来的研究中应开发出更好的工程策略，以提高CAR-T细胞疗法的临床疗效并减少不良反应。下面，我们将总结CAR-T细胞疗法存在的问题和可能的解决方案。图4 影响CAR-T细胞功能的挑战概要。特异性设计的CAR结构以及INF-g、tnf - α、IL-2、CCL2等促进免疫功能的细胞因子的产生和释放，有效增强了CAR- t细胞的抗肿瘤能力。TME中TAMs、MDSCs、Treg等免疫抑制性细胞的募集，TGFb、VEGF、IL-4、IL-10等免疫抑制性细胞因子的释放，以及PD-1信号的激活均可抑制肿瘤免疫。细胞外基质的异常形成和血管系统的失调也是影响CAR-T细胞的重要因素。具体目标由于CAR-T细胞识别和损伤肿瘤细胞的特定机制和特征，因此识别肿瘤细胞上表达的特定肿瘤靶标非常重要。在肿瘤细胞表面有较高的表达水平。与正常组织相比，肿瘤组织中的特异性靶标分子更多。在上一节中，我们总结了一些潜在的乳腺癌特异性靶标分子。然而，由于肿瘤细胞的异质性，大多数靶点只对特定类型的乳腺癌有效。同时，目标抗原的逃逸（即肿瘤抗原的完全或部分丢失）也是另一个巨大的问题。虽然CAR-T细胞对肿瘤细胞的初始反应率很高，但据报道，相当一部分反复注射CAR-T细胞的患者的反应率显著下降。联合识别多个靶点是克服抗原逃逸的另一种方法。二价串联CAR (Tan CAR）靶向CD70和B7-H3的研究表明，CAR-T细胞能够增强肿瘤识别能力。与此同时，一项结合了HER2、GD2和CD44v6靶点的Ⅰ期临床试验（NCT04430595）正在进行中，它能有效减少抗原逃逸，提高肿瘤细胞的识别率。治疗相关毒性神经毒性和细胞因子释放综合征（Neurotoxicity and cytokine release syndrome，CRS）是CAR-T细胞疗法最常见的两种严重和不可预测的反应。目前的研究表明，这些不良反应与CAR-T细胞分泌的大量细胞因子有关。神经毒性通常表现为癫痫发作、谵妄、记忆力减退和急性脑水肿，而CRS通常表现为发热、低血压和呼吸功能不全。在一例转移性结肠癌患者中，患者在注射HER2-靶向CAR-T细胞后15分钟内出现呼吸困难，5天后死亡。胸片和血清样本显示肺部有明显的免疫浸润。据推测，大量CAR-T细胞在输注后立即迁移到肺部，并通过识别肺上皮细胞上的低水平HER2引发细胞因子释放。免疫细胞因子（包括 IL-6、TNF-a、IL-10、GM-CSF和IFN-γ）的表达显著增加。CAR-T治疗引起的细胞因子风暴可能导致呼吸窘迫和死亡。尽管这是一份关于HER2靶向CAR-T细胞治疗结肠癌引起严重不良反应的病例报告、有效避免对正常肺组织的损伤仍是一个需要讨论和解决的问题。靶向CAR-T被广泛应用于乳腺癌治疗。因此，我们认为在乳腺癌治疗中也会出现严重的细胞因子风暴。在对CAR-T外泌体的研究中，发现纯化的CAR-T细胞外泌体表达穿孔素、颗粒酶B和细胞膜分子，包括CARs、CD3、CD8和TCRs。应用CAR-T外泌体治疗乳腺癌可有效控制毒性并提高安全性。此外，Sterner等人和Giavridis等人发现，IL-1、IL-6和GM-CSF参与了CRS的调节过程，而敲除细胞因子编码基因或特定的细胞因子抑制剂可显著减少CRS的发生。此外，自杀基因通过小分子介导的活化过程导致细胞死亡的Caspase9蛋白被引入CAR-T细胞，作为避免CAR-T细胞不可预测的治疗 反应的一种新的可能机制。将修饰的Caspase9蛋白融合到人 FK506 结合蛋白（FKBP）中，可有效、特异性地消除表达自杀基因的CAR-T细胞，而不影响正常 CAR-T 细胞的生长和增殖，从而减少对正常组织的损伤。糖皮质激素是一种强效抗炎药物，它能有效缓解患者的脑部炎症和血管源性CAR-T细胞疗法引起的水肿症状。Kloss等人发现，CAR-T细胞识别肿瘤细胞上的不同抗原可有效提高肿瘤识别的特异性，减少对正常细胞的损伤。基于这一 观点，Srivastava 等人设计了逻辑门控ROR1靶向CAR-T细胞。合成的Notch（ynNotch）受体可识别肿瘤上的EpCAM或B7-H3。ROR1 CAR的表达是由synNotch受体激活诱导的。在乳腺癌研究中，这种策略对ROR1+乳腺癌有抗肿瘤作用，而对正常组织无毒性反应。CAR-T细胞的增殖和持久性CAR-T细胞的增殖和持续能力往往与抗肿瘤效果直接相关。CAR-T细胞中某些基因的功能会影响其持久性。如上所述，在CAR的结构中加入共刺激结构域是显著提高CAR-T细胞增殖和持久性的传统方法。Agnes等人发现，集落刺激因子-1（CSF-1）通过与癌细胞中由c-fms基因编码的CSF-受体结合，与免疫细胞增殖有关。c-fms基因通过基因修饰在T细胞中表达。CSF-1的加入刺激了通过分泌IF和IL-2，CAR信号的增殖效应不会影响这些基因修饰细胞的细胞毒性。在另一项研究中，Bouche等人报告说，CD28亚域突变的CAR-T细胞具有更好的存活率和功能。通过对CD28亚域的无效突变，与T细胞耗竭相关的各种基因，如Nfatc1、Nr42a和Pdcd1的表达明显减少。此外，有几种转录因子被认为是T细胞衰竭的诱导因子。Khan等人发现，TOX可通过驱动衰竭T细胞的表观遗传重塑，将具有抗肿瘤功能的效应T细胞转化为无功能的衰竭。TCF-1是另一种可通过介导Eomes和c-Myb的表达来调控衰竭T细胞转化的转录因子。转录因子NR4A的激活与PD-1 TIM3等免疫抑制分子的表达有关。敲除NR4A后，CAR-T细胞显示出更强的肿瘤杀伤活性和更好的持久性。此外，包括干细胞记忆T（TSCM）细胞、幼稚T细胞和中枢记忆T（TCM）细胞在内的分化不良T细胞亚群具有很强的增殖能力。在构建CAR-T细胞时，利用这些细胞设计CAR-T细胞是延长CAR-T细胞在患者体内的增殖和持久性并增强其抗肿瘤活性的有效方法。肿瘤微环境的免疫抑制作用免疫逃避是抗肿瘤免疫疗法面临的一大挑战，它直接决定了肿瘤免疫的有效性。TME中细胞因子和趋化因子的变化是影响免疫逃避的重要因素。抗肿瘤免疫激活过程会释放大量细胞因子。TME中趋化因子的表达模式发生了变化，优先招募和抑制炎症细胞类型，避免招募抗肿瘤免疫细胞。这一生理过程导致了大量免疫抑制细胞的存在。免疫抑制细胞包括MDSCs、TAMs和Treg细胞。包括MDSCs、TAMs和Treg细胞在内的免疫抑制细胞被细胞因子在TME中招募，这是免疫抑制效应的关键原因。此外，Binnewies等人认为趋化因子和TME中的细胞因子，包括IL-4、IL-10、TGFβ和血管内皮生长因子，可直接抑制T细胞效应，改善免疫抑制细胞的聚集。同时，聚集的抑制细胞还会分泌大量免疫抑制细胞因子，通过正反馈过程进一步增强免疫抑制效应。这是一种通过促进免疫增强基因的表达和细胞因子的分泌来增强CAR-T细胞免疫反应的常用方法。Adachi等人发现在小鼠模型中，CAR-T细胞中IL-7和CCL19基因的上调可改善 T细胞或树突状细胞对实体瘤组织的侵袭，促进肿瘤消退。此外，CAR-T 细胞中IL-18和IL-12基因的过度表达可激活内源性免疫细胞，增强抗肿瘤反应。研究表明，INF-g、TNFa和IL-2等细胞因子可增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能。TME中T细胞免疫抑制信号的激活是CAR-T细胞疗法一个重要障碍。PD-1/PD-L1是乳腺癌中特征最明显、研究最多的信号之一。以往的研究表明，抑制PD-1信号可对包括乳腺癌在内的各种肿瘤患者产生显著的临床疗效。PD-1信号的激活会诱导CAR-T细胞的耗竭和失活。抗PD1抗体明显改善了靶向 HER2 CAR-T细胞的抗肿瘤作用。有形障碍癌症相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤组织间质中的基质细胞。它们可以促进肿瘤周围异常细胞外基质（ECM）的沉积，形成致密的纤维化环境，并限制CAR-T细胞向肿瘤组织的运输。CAF诱导的肿瘤免疫抑制效应是促进CAR-T 细胞疗效的一个障碍。TGF-β的激活过程可增强CA分泌ECM 蛋白，从而形成物理网络并限制T细胞的移动。虽然之前的研究证实，与传统抗体药物相比，HER2靶向CAR-T细胞穿透ECM的能力更强，但 TME中ECM的存在仍会阻碍CAR-T细胞识别和杀死肿瘤的能力。NOX4是TGF-β信号转导的下游分子。抑制NOX4不仅能阻TGF-β信号传导，还能阻止CAF分化，从而减少EMC蛋白分泌，促进免疫细胞浸润肿瘤组织。Caruana等人报告说，体外操T细胞后，肝素酶（HPSE）表达不足，这可能是降解和穿透 ECM能力下降的原因。HPSE能降解ECM的主要成分硫酸肝素蛋白多糖。表达HPSE GD2-靶向CAR-T细胞被设计用于增强降解ECM的能力，促进T细胞对肿瘤（包括乳腺癌细胞）的侵袭和抗肿瘤活性。血管系统失调肿瘤的血管系统往往会发生重塑，出现严重的血管异常和功能障碍。免疫细胞从血管到实体瘤的穿透性受损，导致CAR-T细胞的抗肿瘤效果减弱。肿瘤组织中的血管系统失调和内皮能量不足会降低细胞间粘附分子1（ICAM1）和粘附分子 VCAM1 的表达水平，从而限制T细胞在肿瘤组织中的浸润。同时，肿瘤血管系统正常化可增强组织血液灌注，从而改善CAR-T细胞的浸润和存活能力，促进CAR-T细胞的抗肿瘤能力。贝伐单抗是一种针对血管内皮生长因子的人源化单克隆抗体，不仅能抑制新生血管的萌发，还能使血管系统恢复正常。同时，贝伐单抗还能抑制细胞粘附分子的下调过程，提高CAR-T细胞对肿瘤的侵袭能力。Xing等人设计了靶向VEGFR2/3的CAR-T细胞，并在乳腺癌治疗中取得了显著效果，为抗肿瘤形成和抗血管生成提供了新思路。将CAR-T细胞直接注射到肿瘤部位，使其远离血管运输系统，是另一种有效的治疗策略。与静脉注射相比，腹腔注射 CAR-T 细胞治疗间质间皮瘤可获得更好的反应和耐受性，这为 CAR- T 细胞的局部注射治疗提供了新的前景。 未来展望 CAR-T 细胞在血液肿瘤中的成功应用，使其成为实体瘤治疗中一种前景广阔的方法。此外，美国食品和药物管理局批准 CAR-T 细胞用于临床应用，也大大促进了 CAR- T 细胞疗法在实体瘤治疗中的探索。目前已制造出多种以乳腺癌相关抗原为靶点的 CAR-T 细胞，以发挥更好的乳腺癌治疗效果。虽然CAR-T细胞疗法在体外和体内都表现出了显著的抗肿瘤功能，但治疗相关的严重毒性、T细胞持久性较差以及TME中的免疫抑制等问题仍然阻碍着它在乳腺癌和其他实体瘤中的临床应用。此外，值得注意的是，包括单克隆抗体和ADC在内的分子靶向疗法在乳腺癌方面也取得了很好的疗效s。此外，与 CAR-T 细胞疗法相比，这类药物的制备和临床应用更为方便。然而，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗等单克隆抗体对 HER2 表达的乳腺癌细胞的杀伤作用仍取决于免疫细胞的活性，表位掩蔽和立体阻碍导致的耐药性仍是需要妥善解决的一大难题。此外，ADC依靠抗体识别肿瘤细胞并携带细胞毒性药物杀死肿瘤细胞。肿瘤细胞的特异性识别、抗体与药物的脱钩以及耐药性仍然阻碍着ADC药物在乳腺癌中的广泛应用。CAR-T细胞能直接识别和破坏肿瘤细胞，从而有效避免了抗体疗法所面临的困难。因此，在未来CAR T细胞治疗仍是治疗乳腺癌不可或缺的有效方法。END

ADC领域发展百花争鸣，早在 20 世纪初，Paul Ehrlich 就首先提出了“魔法子弹”的概念，截至2022 年11月全球共有 15 款 ADC 药物获批用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤，此外，目前还有100多个ADC候选者处于临床试验的不同阶段，预计到2026年，ADC的全球销售额将超过164亿美元。然而，高成本以及由于分子尺寸过大、渗透性低、耐药性限制ADC在实体肿瘤领域的发展。PDC和ADC具有相似的概念，但具有不同的结构和性质。ADC第一，二代药物发展持续了近十年左右，到了三代四代时全面爆发。有了ADC经验的积累，PDC不 用 重 头 开 始 。因此国内医药企业布局PDC药物可以另辟蹊径，提高ADC的递送效率和并改善其副作用，再加上组合式创新，这一领域的繁荣在几年内或许可以预见，我们期待在PDC领域出现DS-8201的重磅产品，造福更多患者。多肽偶联的物质包括蛋白、抗体、核酸（DNA或siRNA）、多肽、小分子和核素等，可谓具有无限想象空间。目前国内PDC布局者包括同宜医药、智肽生物、泰尔康、主流生物、汉鼎医药、博瑞生物等。ADC开发中的挑战ADC关键成分包括选定的靶蛋白、抗体、payload和linker。大多数ADC都有类似的作用模式：当与膜靶结合时，ADC被内化并运输到溶酶体，在溶酶体中共价键被裂解以释放payload。释放的payload随后与其细胞内靶相互作用以发挥细胞毒性。同时，它可能扩散并杀死邻近细胞，从而诱导所谓的“旁观者效应”。ADC最初被设想为增加其在肿瘤部位的特异性保留和细胞毒性活性，同时不伤害健康组织。理想的ADC应在循环中保持稳定，并准确靶向癌细胞。每一个因素都会影响ADC的最终疗效和安全性，考虑不充分将会给临床带来诸多的不确定性。尽管DS-8201激起各国研究者对ADC的热情，但扩大其治疗指数仍然存在挑战。靶向相关毒性ADC的成功开发依赖于抗体结合的适当靶抗原。理想情况下，为了降低靶外毒性，靶抗原应在肿瘤中高度表达，在正常组织中表达较低甚至不表达，或至少限于给定的组织类型。不幸的是，到目前为止我们针对的靶点均是肿瘤相关抗原（TAA）而不是完全特异性抗原（肿瘤特异性抗原，TSA）。除非表达抗原的正常细胞对药物作用不敏感，否则ADC被正常细胞摄取将产生毒性并降低可用的ADC剂量。Linker不稳定性相关毒性选择合适的linker同样是开发ADC的挑战。Linker通常被设计为在血流中稳定，随后在靶细胞内或靶细胞附近释放payload。linker的作用是有效递送payload的基础，但也是决定ADC产品毒性的重要因素。药物在循环中过早释放可导致全身毒性和较低的治疗指数。中性粒细胞减少症是许多通过蛋白酶可裂解缬氨酸-瓜氨酸接头（VC）与MMAE结合的ADC的一种常见毒性，如Brentuximab vedotin、ASG-5ME、Glembatumab vedoting、Industumab vedotin、Polatuzumab vedoctin和PSMA靶向ADC。结果表明，基于VC-MMAE的ADC诱导的中性粒细胞减少症是由于释放的payload对骨髓中分化的嗜中性粒细胞的直接细胞毒性作用。周围神经病变是与微管抑制剂payload相关的另一种重要的靶点非依赖性临床毒性，导致治疗中断和/或剂量减少。微管抑制剂破坏了关键必需蛋白从神经元细胞体主动转运到远端突触的间期微管功能，并最终导致周围神经病变。药物释放机制是接头选择的重要考虑因素。可裂解和不可裂解连接体均已用于已批准的第二代ADC和第三代ADC，目前正在临床试验中研究。总的来说，理想的linker应在在血液及输送过程稳定并在到达目标细胞时的有效裂解。旁观者效应相关毒性在被靶抗原阳性细胞吸收后，ADC释放的payload也可能对邻近的靶抗原阴性细胞产生细胞毒性，称为旁观者效应。高疏水性payload可以被动扩散至细胞外，也可以由于膜完整性丧失而释放，即被动扩散、转运蛋白介导的摄取或其他非特异性内吞机制导致相关毒性。ADC中的旁观者效应通常与肿瘤杀伤（疗效）的增加有关，尤其是对于具有异源抗原表达的肿瘤。例如，可裂解ADC DS-8201a（Enhertu）释放DXd，从而杀死靶向癌细胞周围的肿瘤细胞，但不会杀死更远处的细胞（Dxd半衰期短）。这有利于治疗HER2异质性肿瘤。可裂解连接体的旁观者效应取决于释放的payload的膜可穿透性和电荷性质。此外，实现旁观者效应可能导致靶外毒性。具有旁观者效应的高疏水性payload渗透到正常组织中，与不可切割、不可渗透的payload相比，导致毒性增加。Fc等受体介导的毒性ADC的靶向非依赖性摄取和毒性也由不同的受体介导，这些受体识别ADC中IgG骨架中的Fc区域。IgG恒定结构域在结构中高度保守，通过Fc受体与免疫系统的其他成分相互作用以启动免疫效应。尽管实现ADC功效通常不需要Fc，但Fc受体与ADC的抗体（IgG）成分的识别和结合可以介导靶向非正常细胞的非依赖性内化。其他Fc结合受体，包括Fcγ受体（FcγRs）、新生儿Fc受体（FcRn）和C型凝集素受体（CLRs）可能潜在介导IgG/ADC内化/运输和对正常细胞的毒性。耐药性一种耐药机制涉及下调细胞表面抗原，从而阻碍ADC发挥其细胞毒性作用。另一种常见的耐药机制是通过ATP-binding cassette transporters排出payload。作为这些泵的潜在底物，ADC中使用的细胞毒性弹头可能会被排出靶细胞，从而降低药物疗效。与payload作用靶点突变、内化、运输和再循环缺陷、导致药物释放受损的溶酶体降解以及细胞死亡途径的改变都可能是ADC耐药性的潜在机制。总之，对ADC的耐药性是限制这些药物临床成功的关键因素之一。PDC的进展和优势PDC与ADC具有相似的概念，但具有不同的结构和性能。 一般来说，PDC对实体瘤的高渗透性和低生产成本使其成为极具吸引力的竞争者。 一些放射性PDC已被批准用于诊断成像，如111In-DTPA-奥曲肽和68Ga-DOTATE。迄今为止，三种治疗性PDC，Lutathera、Pepaxto和Pluvico（FDA撤市场，EMA上市）已获得FDA批准。PDC所用的相关linker、肽和靶点如表2处于临床II,III期的PDC药物如表3分子量低与抗体相比，用作靶向肿瘤细胞载体的肽通常少于40个氨基酸，这提供了一些无与伦比的益处。小分子量使肽的免疫原性低于抗体。此外，生产成本更低，药物负荷更容易控制，这有助于生产均匀的偶联。同时，肽很容易被修饰以提高其生理稳定性和药代动力学特性，并缩小PDC和ADC之间的差距。PDC中使用的肽分为两类：细胞穿透肽（CPP）和肿瘤归巢肽（THP）。具有CPP的PDC通过非特异性机制进入细胞，而具有THP的PDCs通过特异性结合肿瘤细胞表面表达的靶或受体，选择性地介导细胞毒性payload进入肿瘤细胞。更广泛的payload选择性与ADC相比，由于肽的良好渗透性和低分子量，PDC中使用的payload的IC50可以更高。PDC中使用的细胞毒性药物可根据其一般作用机制进行分类，包括干扰DNA复制和转录的药物（如CPT和DOX）、抑制DNA生物合成的药物（例如GEM和MTX）以及作用于微管的抗有丝分裂药物（如PTX）。CPT是一种小分子化学药物，其衍生物已被证明具有强大的抗肿瘤和抗血管生成活性，但由于溶解度差和严重的毒性副作用，其临床应用受到限制。PTX是一种靶向微管蛋白的小分子细胞毒素，可以抑制细胞分裂。然而，它是高度疏水性的，具有P-糖蛋白介导的外排，导致耐药性。这些药物都可以和多肽偶联改善药物本身存在的缺陷。此外，与ADC相比，PDC具有更高和更可控的药物装载能力。向载体装载更多payload可以有效提高靶组织中的药物浓度。借鉴ADC成功经验，PDC可以走得更远随着持续的兴趣和商业投资，目前正在积极研究更多的ADC候选药物，作为各种肿瘤类型的单一疗法或联合疗法。我们应该清醒地认识到，ADC的发展仍然面临着重大挑战，如不良毒性和耐药性。  鉴借鉴ADC成功经验，PDC可以走得更远。新靶点的探索为了减少靶外毒性，ADC和PDC的理想靶点应在仅在肿瘤细胞表达或高表达，在正常组织中很少或低表达。由于两种共轭形式之间存在高度的靶点重叠，PDC不可避免地会遇到与ADC相似的对健康组织的“靶向、非肿瘤”毒性，这突出了探索新的肿瘤特异性抗原的重要性。除了膜靶点，细胞基质靶向治疗逐渐引起研究者的关注。不同类型肿瘤中的细胞基质共享一些相同的标记物，因此靶向基质细胞的药物缀合物可能适用于多种肿瘤类型。已经基于靶向基质细胞抗原构建了几种ADC，如fibronectin（纤维连接蛋白）、tenascin-C和TEM8。这些细胞外靶点对PDC来说由于快渗透，可偶联高效低毒药物降低副作用方面更具优势。已经鉴定了几种靶向肿瘤细胞外基质的肽。fibronectin是细胞外基质的重要糖蛋白成分，在许多恶性肿瘤中过表达。纤维连接蛋白-纤维蛋白复合物（fibronectin-fibrin）是诊断癌症的重要生物标志物。已经证明，线性五肽CREKA以良好的溶解度、生物相容性和靶向特异性与纤维连接蛋白-纤维蛋白复合物结合。组织蛋白酶是一个在细胞表面表达，然后释放到细胞外基质的内肽酶家族。它们在各种肿瘤中过表达，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌。聚肽GFLG可被组织蛋白酶B特异性水解，以触发药物载体的药物释放，用于的肿瘤治疗。总体而言，我们完全相信，新抗原鉴定的进展将极大地促进高效低毒药物缀合物的开发和临床转化。目标分子的优化对于ADC，较小的结合单元，如肽片段、单链可变片段、单结构域抗体片段或双抗体，已被用于克服大尺寸而导致的低渗透性。然而，可能会导致循环快速清除。目前已经开发了几种技术来延长半衰期。如环肽（单环、双环、三环、四环肽）、非天然氨基酸修饰、拟肽等，这些策略都可以极大提高多肽的稳定性、渗透性。目前的肿瘤靶向肽来源：植物、动物、微生物，以及来自噬菌体展示技术和其他筛选技术的化学合成或肽库。payload和Linker的优化使用DOX作为payload的第一代ADC低临床活性。由于循环中的生物分布、摄取和结合损失，估计只有1-2%的payload达到细胞内目标。因此，即使在较低的累积浓度下，payload的效力必须很高（理想情况下在亚毫摩尔范围内）以根除靶细胞。最近，ADC设计中出现了高效的PBD二聚体，使得在单次静脉注射ADC后，可以在多个临床前体内模型中实现肿瘤完全消除。但考虑到真正的TAA几乎没有，ADC的临床结果可能不仅取决于靶抗原在正常细胞上的表达水平，还取决于其在关键器官上的相对功能重要性，尤其是在使用高效弹头时，如PBD二聚体。对PBD二聚体效力的担忧可能需要使用低效药物替代，特别是当关键正常细胞（如肺组织中的HER2）上有显著水平的抗原表达时。不同于ADC必须使用高活payload，PDC可以使用一般化疗药，这极大方便了临床医生的用药习惯，降低了潜在的医生用药的安全担忧风险。最近，其他类型的payload正在出现，如有毒蛋白、细胞因子、PROTACs和寡核苷酸，这也可以用于下一代治疗性PDCs。药物缀合物设计的另一个关键方面涉及Linker，应研究Linker, 以免干扰肽与其受体的结合亲和力和药物的功效。不合适的接头可能阻碍药物在循环中从PDC释放，从而降低其整体治疗效力。PDC中使用的连接物包括酶裂解（酯、酰胺和氨基甲酸酯）、酸裂解（腙和碳酸盐）、可还原二硫键和不可裂解linker。新措施应对耐药性耐药与药物外排增强、异常生物代谢增强、DNA修复能力增强、信号通路补偿、靶点改变、细胞死亡抑制等相关。耐药性在很大程度上导致了癌症治疗中的化疗失败。ADC已经做出了许多努力来克服耐药。由于对ADC耐药的最常见机制之一是药物外排泵的表达增加，基于此两种策略1）使用非外排泵底物的payload。2）linker接头修饰以增加亲水性，这是基于MDR1更有效外排疏水性化合物。例如磺基SPDB和mal-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺的极性linker。另外已开发双靶点或双表位ADC以克服耐药性。上述克服ADC耐药值得PDC借鉴。已经进行了一些有益的尝试来提高PDC的功效。例如，LTP-1，一种THP-CPP-PTX偶联物，通过将PTX与由THP和CPP组成的多功能肽连接，显著增强了细胞毒性，并可能克服PTX抗性。除了增强药物的外排，由于下游通路或连接信号通路的异常激活而引起的旁路补偿也在介导抗药性中起着重要作用。结论和未来展望随着对癌细胞生物学的日益了解，临床疗效已从传统化疗药物的单药治疗提高到药物组合、靶向治疗和联合治疗。尽管ADC实现了癌症治疗的巨大进步，但ADC的发展仍存在一些限制或挑战。PDC分子量小，易于合成为单一均匀实体，具有大规模生产的良好特征，并具有可优化其药代动力学特征。PDC仍处于早期阶段，但潜力巨大。参考文献:consideration in the future constructionof peptide-drug conjugates for cancer therapy.Experimental Hematology & Oncology (2022) 11:93识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

Jason Armond / Los Angeles Times via Getty Images The FDA had a fairly quiet week, approving drugs, providing clearance, greenlighting clinical trials, and other regulatory activities for Alnylam, Eli Lilly, Cytokinetics, Prometheus, Owlet, and more. Here’s a look at the agency’s reported activities. Oct. 6 Alnylam Pharmaceuticals’ Oxlumo (lumasiran) received an approval for an expanded indication to include advanced primary hyperoxaluria type 1 (PH1) patients with severe renal impairment, including patients on hemodialysis. The FDA scheduled a Cardiovascular and Renal Drugs Advisory Committee meeting for Dec. 13 to discuss Cytokinetics’ NDA for omecamtiv mecarbil tablets to reduce the risk of cardiovascular death and heart failure events in patients with symptomatic chronic heart failure with reduced ejection fraction. Eli Lilly received Fast Track designation for its tirzepatide to treat adults with obesity or overweight with weight-related comorbidities. Boston Cell Standards received 510(k) clearance for its IHControls panel (HER2/ER/PR) for evaluating breast cancers. Owlet submitted a 510(k) premarket notification for a new prescription monitoring device for infants. The device uses pulse oximetry and is intended to be prescribed by doctors for in-home monitoring of babies. Annovis Bio received the go-ahead for a Phase II/III trial of buntanetap in moderate Alzheimer’s. Entera Bio concluded its Type C meeting and agreement with the FDA that a single Phase III placebo-controlled trial could support an NDA of EB613 under the 505(b)(2) regulatory pathway. The FDA also agreed that Total Hip Bone Mineral Density (BMD) could be the primary endpoint of the registrational trial in post-menopausal osteoporosis patients. Kiromic BioPharma received validating written feedback from the FDA regarding its Type B Pre-IND meeting request over its Deltacel development strategy. Deltacel/KB-GDT is being developed for non-small cell lung cancer. Oct. 5 Transcenta Holding’s TST004 received IND clearance to run a clinical trial for the treatment of IgA nephropathy. Oct. 4 Multi Radiance Medical received FDA clearance for its MRM FibroLux laser therapy to treat pain associated with fibromyalgia. Oct. 3 PDS Biotechnology reported a successful End-of-Phase II meeting with the FDA for PDS0101 in combination with Merck’s Keytruda for treatment of unresectable, recurrent/metastatic human papilloma virus (HPV) 16-positive head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). PDS will move into a registrational trial ahead of the originally planned schedule. Prometheus Biosciences received the greenlight to initiate a Phase I single ascending dose/multiple ascending dose (SAD/MAD) trial for PRA052 in healthy volunteers. The drug is being developed to treat ulcerative colitis. Kira Pharmaceuticals received clearance to launch a Phase II trial of KP104 in systemic lupus erythematosus associated thrombotic microangiopathy. Kite announced the FDA approved its retroviral vector (RVV) manufacturing facility in Oceanside, Calif. Eagle Pharmaceuticals’ ENA-001 was granted Orphan Drug Designation for treatment of Apnea of Prematurity. Poxel received Orphan Drug Designation for PXL770 for patients with autosomal-dominant polycystic kidney disease. Seneca Therapeutics received clearance to initiate a Phase I/II trial using Seneca Valley Virus (SVV-001) in combination with a checkpoint inhibitor in patients that are TEM8 positive and SVV-001 permissive with neuroendocrine tumors of neuroendocrine carcinomas. Sept. 30 Taiho Oncology and Taiho Pharmaceutical Co.’s Lytgobi was approved by the FDA for treatment of adults with previously treated, unresectable, locally advanced or metastatic intrahepatic cholangiocarcinoma harboring FGFR2 gene fusions or other rearrangements.