GALA

SGLT2 inhibitors, medications approved for diabetes, could be used in Fabry disease to reduce albuminuria, which occurs when damaged kidneys let a large protein called albumin pass into the urine, according to a real-world study in adults with Fabry disease.Because patients were followed for a short period of up to about 1.5 years, larger and longer studies are needed to confirm the effectiveness of SGLT2 inhibitors over time and to explore their effects on kidney health in Fabry disease.“Given the nature of the study design and small case numbers, further long-term controlled studies are required to evaluate the long-term efficacy of this medication class,” researchers wrote.The study, “Sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors reduce albuminuria in patients with Fabry disease: a real-world case series,” was published in the International Medicine Journal.Fabry disease is caused by genetic mutations leading to a deficiency of the enzyme alpha-galactosidase A. Without this enzyme, fatty molecules called glycosphingolipids build up to toxic levels in cells, causing damage to organs and resulting in symptoms.When glycosphingolipids damage the kidneys, patients may develop proteinuria, where too much protein leaks into the urine. SGLT2 inhibitors, which are used to treat diabetes by helping the kidneys to remove sugar from the body through urine, may also reduce proteinuria.To explore this, researchers analyzed changes in the amount of albumin present in the urine of 11 adults with genetically confirmed Fabry disease, ages 48 to 59, who had been taking SGLT2 inhibitors for at least one month. All had evidence of albuminuria.Eight patients (72%) also had signs of cardiomyopathy, or damage to the heart’s muscle, and two (18%) had diabetes. Eight (72%) had genetic mutations linked to classic Fabry disease, and three (27%) had non-classic genetic mutations.Nearly two-thirds of patients (64%) were on enzyme replacement therapy, two (18%) were on chaperone therapy, one (9%) was on substrate reduction therapy, and one (9%) was not being treated with any Fabry disease-specific medications.SGLT2 inhibitors — dapagliflozin, marketed as Farxiga or generics, or empagliflozin, available under the brand name Jardiance among others — were prescribed to reduce albuminuria, and used for an average of nine months. Ten patients reported no missed doses.At the study’s start, median urine albumin-creatinine ratio (uACR), a measure of how well the kidneys are working, was 76 milligrams per millimole (mg/mmol). After treatment with SGLT2 inhibitors, uACR nearly halved, to a median 39 mg/mmol.A reduction in albuminuria was observed in seven patients, with those experiencing severe proteinuria demonstrating the most benefit from SGLT2 inhibitors.Side effects from SGLT2 inhibitors were mainly “transient.” Four patients had frequent urination, one felt lightheaded, and two developed urinary tract infections requiring antibiotics. One infection led to sepsis, which arises when the body’s immune response damages its own organs, causing the treatment to be stopped.While these findings can’t be widely applied due to limitations in sample size, they suggest another possible treatment for kidney damage related to Fabry disease, where treatment choices are limited. “Larger-scale research is recommended to assess the efficacy and safety of [SGLT2 inhibitors],” the researchers wrote.

摘要:近年来，基因治疗在众多治疗领域针对各种特定细胞群取得了突破性进展。然而，大多数最近的临床研究仍然使用传统的病毒载体系统，这些系统在商业规模上成本效益地制造具有挑战性。非病毒载体已成为基因传递研究中的一个快速发展主题，例如聚合物、脂质、无机颗粒以及不同类型的组合。尽管非病毒载体在细胞毒性、免疫原性和突变原性方面较低，吸引了越来越多的研究者探索这一有前景的传递系统，但它们并未携带理想的特性，并且面临包括基因转移效率、特异性、基因表达持续时间和安全性在内的关键挑战。本综述涵盖了非病毒载体研究和配方方面的最新进展、挑战和未来展望。 1.引言 2020年标志着基因治疗领域的又一个里程碑。首个含有白细胞富集步骤的细胞基因疗法Tecartus在7月获得了FDA的批准。从1990年第一次成功的基因治疗临床试验的势头，到1999年宾夕法尼亚大学发生的悲剧性死亡事件导致基因治疗技术研究的冷却，基因治疗在2017年再次崛起，一年内获得了三项FDA的批准。目前，美国市场上共有十种基因治疗产品，而且在clinicaltrials.gov上有超过100项临床试验正在招募患者。过去30年中基因治疗的起伏为我们提供了许多经验教训，并为最近对基因传递系统能力重新燃起的兴奋情绪奠定了坚实的基础，这些系统能够应对一些最具破坏性的疾病。虽然一些最近的临床研究应用了非病毒载体，但大多数最近的临床研究仍然使用传统的病毒载体系统，这些系统在商业规模上成本效益地制造具有挑战性。众所周知，载体是将遗传物质运送到目标位置的载体。它在产品的效力和安全性中起着至关重要的作用。使用病毒载体在历史上一直存在争议。尽管病毒载体并未已知对患者造成伤害，但引发免疫反应和转基因插入风险的小可能性等，导致该领域的许多人继续寻求非病毒传递系统。 近年来，经常研究的非病毒载体是聚合物、脂质、无机颗粒或不同类型的组合（图1）。与病毒载体相比，非病毒载体在细胞毒性、免疫原性和突变原性方面较低，吸引了越来越多的研究者探索这一有前景的传递系统，并推动基因治疗领域向前发展。然而，非病毒载体并未携带理想的特性，并且面临关键挑战，如基因转移效率、特异性、基因表达持续时间和安全性。非病毒载体已成为基因传递研究中的一个快速发展主题。本综述涵盖了非病毒载体研究和配方方面的最新进展。也讨论了挑战和未来展望。 图1. 载体材料 2.材料 2.1.聚合物 基因治疗包括将遗传物质传递到细胞中，转染和调节基因表达。阳离子聚合物一直是非病毒基因治疗载体的重要类型，由于其多样的化学结构和潜在的高载荷能力，多年来一直受到研究者的欢迎。它们可以中和带负电的遗传物质以形成复合物（polyplex）并将有效载荷运送到目标细胞。 非生物可降解聚合物 聚乙烯亚胺（PEI）是第一种阳离子聚合物，于1995年合成了线性和分支形式用于基因治疗。它在聚合物链的骨架上独特地排列了胺基，允许在生理pH范围内仅部分质子化。然而，在内质体的更酸性区域中，额外的胺基会质子化。带电的PEI的存在产生了渗透效应（“质子海绵效应”），以诱导内质体爆发，这被认为可以提高转染效率。PEI的高缓冲能力也有利于基因载荷的内质体逃逸。如今，PEI仍然是衡量非病毒载体转染效率的黄金标准。 尽管被认为具有高转染效率的非病毒载体，PEI仍可能因特异性和转染不足而受到影响。此外，它是一种不可生物降解的聚合物，会在细胞周围积累并引发细胞毒性。在过去的几年中，科学家们在理解这些限制背后的机制方面取得了显著进展。Clark等人使用由中性脂质和负电荷脂质混合物1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）和双（单酰基甘油）磷酸盐（BMP）衍生的单层和囊泡模型系统，研究了PEI在细胞内传递过程中从晚期内质体囊泡逃逸的能力，包括在渗透应激下与内质体脂质的相互作用。结果证实了PEI对DPPC/BMP膜的吸附，这是有助于polyplexes内质体逃逸的重要因素。该模型为研究非病毒载体对膜稳定性和渗透性后续影响提供了新的工具。除了PEI，胺基终止的PAMAM是另一种阳离子树状分子。实际上，PAMAM是在生物应用中最常用的树状载体之一，也是第一个用于基因传递的。这些常见树状分子的一个主要缺点是它们的毒性，主要与表面胺基的化学性质有关。此外，聚甲基丙烯酸酯和聚甲基丙烯酰胺是两种重要的合成乙烯基阳离子聚合物，具有模仿PEI的pH敏感性、质子海绵理论和缓冲性质的能力。在过去的20年中，它们一直在不断修改，试图提高基因传递效率并降低毒性。尽管聚甲基丙烯酸酯的细胞毒性低于PEI，但由于与膜的相互作用能力低，它们目前在基因治疗中的应用受到限制。 聚(乙烯亚胺)(PVI)是一种水溶性聚合物，合成为聚(1-乙烯亚胺)和聚(4-乙烯亚胺)。其亚胺基团在酸性pH值下质子化，改变PVI链的构象。PVI还具有生物相容性、无毒性和通过激活质子海绵机制逃离内质体的能力，这使其成为一种新兴的非病毒载体。最近，不同链长的烷基化聚(1-乙烯亚胺)已被研究用于DNA复合物和转染。其中，丁基化PVI被发现在HepG2肝癌细胞中最有效。此外，还发现叶酸-偶联的含胺聚(1-乙烯亚胺)也能有效地复合DNA并转染癌细胞。 生物可降解聚合物 鉴于基因治疗通常需要重复给药且更倾向于低细胞毒性，生物可降解的聚合物载体，无论是合成的还是天然的，都比非生物可降解的具有明显优势。合成聚合物具有出色的化学结构多样性和批次一致性，但可能缺乏与细胞的充分相互作用。相比之下，天然聚合物具有高生物相容性，但由于来源差异导致批次间变化问题。因此，为了确保产品质量，需要对天然聚合物的关键属性实施控制策略。辅料公司有时使用混合以满足辅料规格。此外，使用适当的测试和规格来确保一致的质量和可靠的性能。例如，凝胶渗透/尺寸排除色谱法（GPC/SEC）可能被应用于测量聚合物的特性。制药公司、辅料供应商、美国药典大会（USP）、监管机构和国际药用辅料委员会（IPEC）需要共同努力，控制、减少或最小化辅料变异性对天然辅料的潜在负面影响，包括聚合物。 壳聚糖（CS）是一种线性多糖，是最丰富的天然碳水化合物聚合物之一。它具有高度的生物可降解性、生物相容性和无毒性。其明显的pKa值为6.5，在酸性条件下溶解，其中大部分氨基质子化以与遗传物质形成复合物。研究发现，聚合度高的壳聚糖（>50）可以显著打开细胞间的紧密连接。壳聚糖载体的表面也可以通过配体修饰或装饰以增强细胞进入和特异性。这些特性使壳聚糖成为基因治疗的有吸引力的非病毒载体。近年来，壳聚糖包覆的纳米颗粒作为脑癌基因治疗的载体正在积极研究中，通过受体介导的内吞作用，人类血脑屏障脑血管内皮细胞（hCMECs）证明了增强的粒子摄取。 聚(β-氨基酯)(PBAEs)是一类在过去20年中取得重大进展的非病毒载体。这个类别最初在2000年开发成线性PBAEs，但在2016年这个类别的发展转向了分支PBAEs。这些两亲聚合物在挑战性条件下显示出强大的转染能力以及有效的内质体逃逸特性。然而，它们的应用受到限制，因为它们形成了自组装的核酸纳米颗粒。因此，它们不足以包裹各种表面电荷的蛋白质。在2019年，Green等人合成了一种新的超支化PBAE，其中包含阳离子和阴离子电荷。结构变化提供了聚合物末端亲水性的差异化，影响了蛋白质复合物能力，以及纳米颗粒的国际化和内质体逃逸。同年，Liu等人合成了一种高度分支的PBAE，其中在HPAE主链中包含生物可降解的二硫键单元，在末端含有胍基团。这些聚合物将微小DNA传递给多能脂肪来源的干细胞和小胶质细胞，实现了高转染效率。 传统上，聚乳酸(PLA)是一种合成的生物可降解聚合物，广泛用于药物传递。其羧酸在体内水解成乳酸，并迅速转化为从体内排出的葡萄糖，无不良影响。在2013年，Jones等人合成了一种含有叔胺的阳离子聚乳酸，使其适用于基因治疗。如今，PLA在持续的结构修改中引起了靶向传递的持续兴趣。 基于聚合物的传递系统的全部潜力尚未实现。在2020年，氨基糖苷类，一类自然发生和半合成的抗生素，被研究作为新的阳离子聚合物载体，以促进基因进入细胞。 2.2.脂质 脂质已被用于传递基因很长时间了。大多数脂质由正电荷的头基组成，它们通过静电相互作用与核酸的阴离子磷酸基团结合，形成脂复合物。由于自组装的脂质尾部结构，脂复合物通常以脂质体、固体脂质纳米颗粒或脂质乳液的形式出现。与其他载体材料相比，脂质是可生物降解的，毒性较小，并且可以结合亲水性和疏水性物质。第一个FDA批准的小干扰核糖核酸（siRNA）治疗（Onpattro）使用了基于脂质的载体。另一种有希望的基于脂质的siRNA治疗（inclisiran）用于高脂血症治疗，于2020年12月在欧盟获得批准。3期临床试验表明，通过每6个月皮下给药一次，inclisiran降低了低密度脂蛋白胆固醇水平的50%。 传统脂质 传统脂质分子上每个分子都有一个头基团，可能是永久性或临时性带电的。常见的头基团有铵盐、咪唑盐、吡啶盐、赖氨酸或精氨酸等。同时，疏水尾部可以是两个饱和或不饱和的碳氢链或类固醇。碳氢链脂质传递核酸的能力已经被广泛研究，尤其是那些以铵盐为头基团的脂质。常见的例子包括单价脂质，如N-(1-(2,3-二油氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵（DOTMA）、2,3-双[(Z)-十八碳-9-烯酰氧基]丙基-三甲氮铵（DOTAP）、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲氮铵（DMRIE）、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷胆碱（DPPC）和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷胆碱（DOPC），或多价脂质如2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-[2-[二(十七烷基)氨基]-2-氧乙基]戊酰胺（DOGS）。尽管这些脂质由于其正电荷而仍然是基因载体的主导，但它们相对有毒，并且在体内表现出次优的行为，例如，半衰期短。因此，表面修饰的可电离脂质，如1,2-二油氧基-3-（二甲氨基）丙烷（DODAP）或1,2-二亚油酰氧基-3-二甲氨基丙烷（DLin-DMA）被开发出来，以克服这些缺点并实现更好的效果。这些材料在生理pH值下是中性的，允许系统性传递，但可以带正电荷以促进与DNA形成脂质复合物并促进内质网逃逸。值得注意的是，七三十四碳-6,9,28,31-四烯-19-基 4-（二甲氨基）丁酸酯（DLin-MC3-DMA）是siRNA传递的“黄金标准”，因为它相对于其比较物具有优越的基因沉默活性，并成功应用于Onpattro，即首个FDA批准的siRNA治疗。除了这些碳氢链脂质外，胆固醇及其衍生物是另一类可用于基因传递的脂质。其中一种衍生物，DC-Chol，现在商业上可用，并已在临床试验中用于癌症基因治疗。 双子表面活性剂 双子表面活性剂最近作为一组对基因传递有用的脂质出现。它们是两个表面活性剂单体，头基团通过间隔基团通过共价键连接。双子表面活性剂通常比相应的表面活性剂单体具有更低的CMC值，导致更低的表面张力、更高的溶解能力等。因此，传递系统中所需的这种载体量减少，相应的毒性也减少。最近的研究集中在阐明双子表面活性剂的结构与生物活性的关系。例如，Jin等人比较了三种结构相似的双子表面活性剂，16-3-16、16(Py)-S-2-S-16(Py)和16-7N(G.K.)-16，它们都具有相同数量的尾部碳原子。发现具有甘氨酰-赖氨酸二肽的头基团的16-7N(G.K.)-16比未取代的16-3-16或含有吡啶盐的16(Py)-S-2-S-16(Py)表现出更高的转染效率。 脂质体 脂质体是通过将胺与疏水丙烯酸、丙烯酰胺或环氧化合物共轭合成的脂质类材料。脂质体因其无溶剂和无催化剂的合成过程而变得有吸引力。这种快速简单的合成允许筛选具有多样结构的大量脂质体库。早在2008年，Aknic等人合成了1200多个脂质体，并在小鼠、大鼠和非人灵长类动物中证明了有效的基因传递和表达。最近，Molla等人通过应用硫内酯化学的一锅法合成方法准备了13个脂质体。这些材料被配制成脂质体以传递siRNA，并在HeLa-GFP细胞上进行了测试。其中五种配方显示出比商业试剂更高的敲低效率，强调了脂质体结构对转染能力的重要性以及脂质体配方属性如粒径。这些发现可能为未来脂质体在基因传递中的进一步探索奠定了基础。 辅助脂质 基于脂质的基因传递系统经常使用“辅助脂质”来增强转染效率，稳定粒子或改善细胞内运输。与阳离子和可电离脂质相比，辅助脂质是中性材料。1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷乙醇胺（DOPE）是最常用的辅助脂质之一，因为它的圆锥形分子形状，有利于膜融合和/或双层破坏。此外，胆固醇也被用作辅助脂质，因为它可以增强细胞膜流动性并稳定脂质体配方中的双层脂质，从而提高效果和稳定性。Sasayama等人利用胆固醇开发了一种基于1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-（聚乙二醇-2000）的纳米粒子配方LNPK15。这种配方在小鼠和猴子中的半衰期分别延长至15.2小时和27.0小时，并且也显示出强大的敲低效率。 2.3.肽类 肽类是由2-50个氨基酸残基通过肽键连接的短链。它们是生物相容的和可生物降解的，并且可以合理设计，作为自组装纳米级结构的构建模块。遗传物质通过共轭或静电作用与肽类相互作用，形成肽核复合物，促进传递。肽核酸（PNA）共轭物由肽类部分和核酸部分通过共价键连接。它们是稳定的未充电分子，能够抵抗核酸酶降解，对酸性和碱性pH以及高温不太敏感。最近，Altrichter和Seitz准备了一个基于肽核酸的反义模块，包含一个Smac模拟化合物（SMC）。通过结合细胞穿透肽，SMC-PNA几乎完全下调了细胞FLICE样蛋白。多肽是用于基因传递的主要肽类之一，包括聚（L-赖氨酸）（PLL）、聚（L-精氨酸）（PLR）和聚（L-谷氨酸）（PGA）。最广泛使用的PLL具有其侧链的高电荷密度，允许有效的DNA凝聚。PLL/pDNA复合物通过内吞作用的易摄取已被报道，大小约为100纳米。然而，其低转染效率和次优的内质网逃逸限制了其应用。PLL已被各种功能基团修饰，如PEI或棕榈酸，以提高效果。它也与其他肽类结合以克服内质网逃逸不良。Zhang等人准备了PLL/DNA复合物与谷氨酸修饰的肽（AR-23），促进内质网逃逸并增强溶解活性。 多肽可以进一步设计成树状大分子，它们使用氨基酸作为核心、分支、树状大分子表面或这三个单元的任何组合的构建模块。肽类树状大分子可能提供了与遗传物质复合所需的正电荷基团，通过细胞膜的可能性，以及逃离内质体所需的缓冲能力。例如，PLL树状大分子可能利用其灵活的分支树状大分子结构和核心中的氨基酸赖氨酸。最近的研究已经将氨基酸的选择从赖氨酸扩展到精氨酸或其他替代品，为PLL树状大分子作为基因传递载体带来了额外的好处。这些努力改变了树状大分子的灵活性和电荷分布，提供了与核酸的额外相互作用并增加了细胞摄取。树状大分子系统也可以结合脂质或聚合物以获得更大的效果。已经证明，通过向脂质/树状大分子杂交体中添加多元醇或聚合物辅料，如聚乙烯醇18（PVA 18），可以增强转染效果。 除了多肽，还开发了许多功能性肽类。这些肽类在其结构中具有某些序列，从而带来各种好处，如增强的细胞穿透或靶向。例如，细胞穿透肽（CPP）是小肽，可以轻松穿过细胞膜并促进遗传物质的运输。作为一种常用的CPP，转录激活因子（TAT）蛋白最近在实体瘤上使用多细胞肿瘤球体作为细胞模型进行了评估。结果表明，较高的TAT浓度显著增加了肽的摄取。除了TAT，penetratin、GALA、transportan及其衍生物如PepFect和NickFect也因其细胞穿透能力而受到关注。一些其他肽类可以通过识别细胞表面的受体来靶向特定细胞，从而提高效率并减少毒性。已经发现或合成了各种靶向肽，如RGD肽和转铁蛋白（Tf）。额外的Tf受体结合肽，如T7肽，正在引起兴趣以提高靶向能力，如Gu等人应用T7修饰的多肽纳米粒子，CRDPEG-T7，传递pDNA pPMEPA1用于骨转移性前列腺癌治疗。他们发现T7的结合抑制了肿瘤生长并延长了荷瘤小鼠的生存时间。 2.4.无机材料 无机材料比有机材料更稳定，也被用作基因载体。实际上，第一个报道的非病毒基因传递是基于磷酸钙的，可以追溯到20世纪60年代。如今，更常见的无机载体包括基于硅的系统，如介孔硅纳米粒子、金纳米粒子、磁性纳米粒子、碳纳米管、石墨烯、上转换纳米粒子和量子点。金纳米粒子相对无毒，并且可以与聚合物和脂质载体一起准备。刘等人为帕金森病治疗构建了金纳米粒子复合材料，其中pDNA被吸附到带正电的金纳米粒子表面并封装到脂质体中，然后附加靶向NGF和DHA。注意到该系统通过改善运动和非运动功能障碍，对小鼠显示出显著的神经保护效果。碳纳米管是另一种有吸引力的载体，由单个或多个石墨烯片组成，大小可以从几百纳米到几十微米不等。碳纳米管促进基因穿透通过细胞膜独立于哺乳动物细胞的内吞作用过程。在分子动力学模拟的帮助下，梁等人发现碳纳米管通过降低这一过程的自由能，协助核苷酸穿透脂质膜。在2020年，合成了与Caspase3 siRNA链接的单壁碳纳米管，以治疗心血管疾病。这种基因载体显著提高了转染效率，导致更大的Caspase3基因沉默。 3.用于转染增强和细胞毒性降低的混合载体系统 非病毒载体在基因传递的最前沿，具有高效的基因转染和低细胞毒性，一直是一个双刃剑。最近一些尝试在降低细胞毒性的同时增强转染效率，包括无机-有机混合载体、改性PEI载体、无机-脂质载体和肽-脂质载体。 3.1.无机-有机混合载体 无机-有机混合载体已被确定为非病毒载体新类别中的一个日益增长的趋势，用于各种细胞类型的平台或靶向基因传递。其中一次尝试是将甘露糖基团结合到载体中。在2020年，Ma等人受到在临床中用作渗透剂的多羟基化合物甘露醇的启发。他们构建了具有控制的细胞摄取和随后的细胞内运输的仿生非病毒载体，用于基因传递，并首次引入了基于甘露醇的磷酸钙甘露醇-阿伦德龙酸盐（CaP-MA）有机-无机非病毒载体。带有甘露糖基团的新载体可能模拟了通过洞穴蛋白介导的细胞更新，并以非破坏性途径传递遗传有效载荷，随后避免了在溶酶体中基因降解。因此，这些载体在转染、生物相容性和毒性方面优于未改性的CaP纳米粒子。 另一种降低细胞毒性的尝试是使用无胺载体来对抗与胺相关的毒性。Choi等人开发了一种非传统的非病毒载体，使用介孔硅纳米粒子（MSNs）作为生物相容剂，以顺序的、累积的和定向的方式装载siRNA。它是通过钙离子介导的siRNA的磷酸盐和MSN的未带正电的裸表面之间的互连（钙粘接）建立的。结果表明，基于非带正电的MSN的钙粘接策略作为一种通用的非病毒载体平台用于RNAi传递的潜力，这可能为进一步研究其在基因传递中的应用打开了大门。 3.2.改良的PEI载体 PEI载体面临的最大挑战是细胞毒性，这是由于不可降解的酰胺键的存在，导致在正常细胞中积累并破坏代谢活动。还已知细胞毒性的程度与聚合物分子量呈正相关。因此，减少毒性的一个有希望的策略在于配体修饰的低分子量PEI，如那些结合叶酸或各种功能肽。Yu等人已经证明，由环糊精接枝的低分子量PEI（CD-PEI800）自组装的纳米粒子（SNPs）对Jurkat细胞呈现低细胞毒性和高转染效率。他们推测，由CD-PEI800生成的阳离子水凝胶有助于SNPs提高基因封装效率。2020年，Steinman等人首次合成了三氨基环丙烯交联的线性PEI（PEI/TAC）纳米粒子载体，以降低PEI的毒性。与未修饰的PEI相比，携带DNA的载体颗粒更小，这积极影响了细胞摄取。TAC的交联增加了聚合物的阳离子电荷，允许与遗传物质结合并促进内质网逃逸，从而增强了整体转染效率。同时，减少引入细胞的聚合物量进一步降低了毒性效应。另一种保持PEI生物相容性和降低毒性的方法是通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒子与精氨酸修饰的PEI聚合物（AnPn）的结合。添加AnPn显著改善了pDNA的核定位和在原代人类星形胶质细胞中成功表达基因。 3.3.无机-脂质或肽-脂质载体 使用脂质复合物的一个挑战是转染效率低。Lebrón等人生成了含钌（Ru）和磷脂复合物的阳离子金属脂质体，以增加聚阳离子并增强转染。他们还发现转染受到Ru脂质的长度和疏水性的影响。这些载体获得的正转染效率表明，它们有可能作为基因治疗中的纳米载体。此外，它们的大小和表面电荷影响了使用不同质量比的脂质对DNA的压缩，进一步防止核酸降解。有趣的是，Ru脂质载体对正常细胞的细胞毒性比癌细胞小，这表明了靶向基因治疗的前景。基于肽的阳离子脂质是另一类有前景的非病毒载体，用于将核酸输送到细胞中。Zhao等人合成了两种含有三鸟氨酸头（LOrn3）和单鸟氨酸头（LOrn1）的肽脂质，并研究了脂质体介导的基因传递的相互作用动力学。这两种脂质复合物都被用作载体，将绿色荧光蛋白（GFP）输送到Hela和Hep-2细胞中。转染效率受到肽脂质的电荷比的显著影响。LOrn1和LOrn3在电荷比为4:1和3:1时，对Hela细胞的转染效率最高，毒性最低。尽管这两种肽脂质载体具有相似的化学结构，但LOrn3含有更多的氨基，这产生了细胞内化和更高的质子缓冲能力。因此，LOrn3导致了增强的内质网逃逸和DNA释放，比LOrn1更有效的转染。该研究为未来推进肽脂质载体的研究提供了理论见解。 4.基因载体特性和配方因素对体外和体内性能的影响 为了在目标细胞中产生治疗效果，基因传递系统需要在血管中足够稳定，以便被运输到细胞作用部位。随后，它们必须附着在细胞膜上，进入细胞，从内质网逃逸到细胞质中，并从载体材料中释放治疗基因（图2）。此外，如果输送的是pDNA，它还必须通过细胞质扩散并进入细胞核。因此，为了设计一个具有足够效力的适当基因传递系统，了解基因载体和传递系统的特性对基因转染效率的影响至关重要（图3）。 图2. 非病毒基因载体的递送机制 图 3. 基因载体特性和配方因素对非病毒基因传递系统的影响 4.1.载体材料 载体材料的化学结构和特性是成功基因传递的主要考虑因素。人们有兴趣建立结构-活性关系（SAR）以了解分子结构的影响，并促进基因载体的设计。已经对聚合物和脂质材料的SAR进行了研究。例如，Buck等人将短链氨基脂质与DOTAP:chol基脂质复合物结合，发现较长的脂质尾（C12）比较短的（C10）提高了迷你圈DNA的转染效率。通过构建一系列使用不同分子量的聚乙二醇（PEG）的α-环糊精串珠的聚轮烷，Ghodke等人展示了含有研究中最大PEG（PEG 1500）的复合材料与较小PEG（PEG 200、400和600）相比，对Turbo GFP siRNA的沉默效率最低。离子化状态是载体材料的关键属性之一。具有5.5-6.5的pKa值的脂质材料有利于体内效力。对于基于聚合物的载体，由于研究正在进行中，尚未建立通用规则。例如，Routkevitch等人最近报告说，使用缓冲范围较窄的聚（β-氨基酯）（PBAE）导致了对pH更敏感的转染水平。 4.2.载体材料与基因的比例 载体材料与基因的比例在转染效率中起着至关重要的作用，因为它可以影响载体-基因复合物的形成能力和物理化学特性。Neves等人在不同的氮磷比（N/P）下表征了编码p53的肽RALA/p53 DNA载体。他们发现，与N/P为2的系统相比，N/P从5到10的系统具有更小的粒径、更正的表面电荷和更高的pDNA封装能力，这反过来导致了更好的细胞内化、更高的p53蛋白表达水平，以及在使用HeLa细胞测试时更大的细胞凋亡程度。Sainz-Ramos等人开发了基于2,3-二(十四烷氧基)丙胺(DTPA)的nioplex配方，具有三种不同的脂质与DNA比例，以传递CFTR基因治疗囊性纤维化。他们指出，脂质与DNA比例为5/1的配方比2/1或10/1的转染效率要高得多。 4.3.纳米粒子大小 纳米粒子大小是影响传递过程中所有步骤的关键因素。通常，大约100纳米的较大尺寸有利于在血液中长时间循环，但相对较小的载体可以更有效地穿透细胞。小于5纳米的颗粒可以通过肾脏过滤清除，而大于200纳米的颗粒则通过脾脏和肝脏过滤清除。颗粒大小还可以影响细胞摄取机制和速率。例如，大于1微米的颗粒通过吞噬作用被摄取，而大约200纳米的颗粒更倾向于通过clathrin或caveolae介导的摄取途径。然而，很难定义最佳转染效率的颗粒大小范围，因为大小效应高度依赖于载体类型和细胞摄取途径。Xia等人比较了市面上可获得的5-50纳米大小范围内的金纳米粒子的细胞摄取、细胞毒性和生物分布。观察到颗粒大小的增加导致HepG2癌细胞的细胞摄取增加，但L02正常细胞的摄取减少。5纳米的金纳米粒子显示出最高的毒性，而50纳米的纳米粒子在血液中保持了最长的循环时间。此外，Haddick等人准备了大小范围为60-160纳米的各种介孔二氧化硅纳米粒子。他们注意到160纳米大小的纳米粒子显示出最快的细胞内化和最佳的敲低效率。推测更大的大小可能导致颗粒与细胞膜之间的接触表面积更大，从而导致更多的内吞作用。 4.4.介质pH值和离子强度 当载体-基因复合物基于它们的静电相互作用形成时，介质pH值和离子强度可以改变复合物的平衡。因此，复合物复杂的物理化学特性及其效力可以受到很大影响。Chivu等人评估了在pH 7.4或12磷酸盐缓冲液中准备的聚己内酰胺胍/pDNA纳米粒子。他们的发现揭示了由于胍基团（pKa ≈ 12）的电荷密度更高，纳米粒子在pH 7.4下具有更高的zeta电位。因此，当装载有荧光标记的寡核苷酸时，与pH 12相比，polyplex在pH 7.4下呈现增强的HepG2、HEK293T、HeLa细胞系的细胞摄取。Chroni等人合成了一种包含嵌段共聚物、亲水性阴离子磁性纳米粒子和短脱氧核糖核酸的磁性复合物。通过动态光散射测量的这种磁性复合物的强度在低NaCl浓度下保持恒定，随后随着离子强度的增加逐渐减少，因为更高的离子强度产生了DNA和载体之间的较弱相互作用，减少了复合物的数量。 4.5.其他影响因素 药物传递系统中使用的辅料预计会影响配方性能。Keil等人设计了一种用于局部肺部疾病治疗的基因治疗纳米嵌入微粒（NEM）粉末。NEM是通过喷雾干燥含有PEI和核酸的polyplex，以及辅料甘露醇或海藻糖来制备的。发现甘露醇产生的干燥颗粒具有更大的空气动力学直径，并且在重组后增加了polyplex的粒径。此外，与海藻糖相比，含有甘露醇的干燥粉末溶解度低，阻碍了其生物特性的评估。Wickline等人最近发现，使用透明质酸意外地提供了更均匀的纳米粒子大小分布，没有聚集到阳离子两性肽和RNA配方上。这些新颖的透明质酸纳米粒子也比其他纳米粒子配方具有更强的效果，如10倍低剂量的siRNA抑制腹主动脉瘤的能力所示。此外，透明质酸纳米粒子还与mRNA结构复合形成稳定的纳米粒子，这些纳米粒子足够小，可以穿透软骨，从而实现在该组织中传递和翻译mRNA。总的来说，证据可能表明，选择配方组成是另一个需要研究的方面，以改善细胞的转染和基因传递系统中的稳定性。 除了配方组成，纳米粒子的制备方法也可以影响其性能。Pezzoli等人应用了两种方法来准备PEI-pDNA polyplexes。一种是DROPPING模式，其中pDNA作为单一滴加到聚合物溶液中，然后让复合溶液静置。另一种是MIXING模式，其中pDNA通过剧烈的上下吹打与聚合物溶液混合。研究表明，DROPPING模式产生了更大的纳米粒子，从而显著提高了转染效率。 5.挑战和前景 近年来，基因治疗在众多治疗领域的特定细胞群中取得了突破。使用非病毒载体传递基因治疗的机制挑战已经被Yin和Anderson等人在2014年很好地回顾。虽然非病毒载体需要实现保护遗传物质免受内切核酸酶降解、提供运输到核和核摄取以及载体解包的特性，但它通常需要定制的系统。此外，传递系统应根据治疗方式的不同机制进行设计。将DNA运输到细胞核是其治疗效果所必需的，因此相对较大的粒径对效果构成了额外的挑战。RNA不需要进入细胞核即可表达，但与DNA相比，它不太稳定。此外，细胞和载体之间的相互作用因不同的方式而异，这极大地影响了转染效率。到目前为止，选择非病毒载体传递系统的一种尺寸适合所有方法尚未可行。正如所有三个最近FDA批准或紧急使用授权的基因传递产品中所展示的，这些产品都采用了脂质纳米粒子作为载体，每个产品都定制了自己的脂质系统（表I），即使Moderna和Pfizer/BioNTech都传递了用于COVID-19预防目的的mRNA疫苗。此外，载体系统可能相当复杂。例如，Pfizer/BioNTech疫苗不得不使用一包4种脂质；一种可电离的阳离子脂质来包裹带负电的mRNA，一种PEG化脂质以帮助控制粒径，二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC），一种磷脂，以及胆固醇，有助于形成脂质纳米粒子的结构。由于载体配方的复杂性，筛选成功的载体需要巨大的努力。据报道，在开发patsiran，一种siRNA药物时，必须筛选300多种可电离脂质。最近，GuidTx开发了一种高通量技术来筛选脂质纳米粒子系统，这可能会潜在地提高选择非病毒载体进行基因传递的精度和效率。 开发一种有效且安全的基因载体需要全面了解遗传物质和载体的物理化学及生物学特性、目标细胞的生理学以及在分子水平上对载体诱导的转染的理解。例如，不同目标细胞类型之间的细胞膜电荷差异创造了许多研究机会，以调查和修改非病毒载体，以实现特定遗传载荷在特定细胞类型中的理想效果。除了效果之外，开发者还应该关注毒性。虽然非病毒基因载体比病毒载体具有更低的免疫毒性，但不能忽视纳米粒子可能触发免疫反应。例如，发现壳聚糖在小鼠树突状细胞、腹腔巨噬细胞和人类外周血单核细胞中诱导IL-1β反应。硅纳米粒子导致促炎细胞因子分泌增加。它们还显示出激活巨噬细胞分泌IL-1β。免疫毒性取决于载体材料和细胞。因此，需要逐个案例进行评估。 毫不奇怪，最近关于新型非病毒载体的研究出版物大多集中在改善载体性能特征上，如大小、表面电荷、转染效率、细胞毒性以及细胞内外的运输。与此同时，很少有出版物从产品开发的角度报告研究，特别是涉及载体在配方制备和产品储存期间的物理和化学稳定性。例如，研究配方缓冲液的离子强度和pH值对非病毒载体稳定性的影响是值得的，因为这些因素可能影响载体的转染效率或改变其潜在的临床应用。此外，冷冻或冷藏通常用于储存基因治疗配方。因此，冻融应力和给药前温度升高的影响可能会损害基因治疗的效果，例如通过触发纳米粒子大小分布的变化、聚集潜力或化学降解。另一方面，基因治疗产品表征的稳定性指示技术尚未建立完善，限制了这一领域研究工具的可用性。非病毒基因传递系统在将药物从实验室带到临床应用方面也呈现出复杂性。根据质量由设计原则，定义适当的关键质量属性和关键过程参数不仅对确保产品质量很重要，而且可以加快产品开发。由于基因载体本身是可变的，且生产过程涉及活细胞，因此控制材料杂质并确保批次间的一致性是一个挑战。在建立规格接受标准时，还需要了解产品属性与其安全性和有效性之间的关系。最后，非病毒载体基因治疗的配方设计仍处于起步阶段。各种方法正在快速发展。Chen等人最近将疏水性前药纳入基于脂质的纳米粒子基因传递系统，这提供了一种方便的方法来避免基因药物配方系统给药的免疫刺激后果。还有更多的研究机会在前方，以调查和理解非病毒载体基因治疗配方的属性及其对临床应用的影响。在ClinicalTrials.gov上注册的110个即将进行的基因治疗试验中，病毒载体仍然是这些试验中的主要基因传递系统；只有Sigilon Therapeutics的一项I/II期试验应用非病毒载体传递基因修改的细胞系。与此同时，近年来有许多关于各种非病毒载体的临床前研究和出版物，这无疑证明了基因传递领域正在快速发展。尽管面临许多挑战，Moderna和Pfizer-BioNTech的紧急使用COVID-19疫苗成功地使用了基于mRNA的脂质纳米粒子，并分别达到了94.5%和95%的预防COVID-19的有效性。重要的是，两者都是在如此短的时间内开发的。这些最近的成功为未来发现更多有效和安全的非病毒载体基因治疗产品带来了兴奋和希望。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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iStock, Sundry Photography The regulator agreed to allow Sangamo Therapeutics to use data to seek accelerated approval for its Fabry gene therapy candidate, eliminating the need for an additional registrational study and potentially shortening the time-to-market by three years. Sangamo Therapeutics on Tuesday announced that it has aligned with the FDA on an accelerated approval pathway for its investigational Fabry disease gene therapy isaralgagene civaparvovec based on promising data from an ongoing Phase I/II study. After a “successful” Type B meeting with the regulator, Sangamo can now use estimated glomerular filtration rate (eGFR) slope data—a surrogate marker for kidney function—from the Phase I/II STAAR trial as the “primary basis” to seek accelerated approval for isaralgagene civaparvovec. The company said data to support the accelerated approval pathway will be available in the first half of 2025, and it expects to Biologics License Application in the second half of next year. The FDA also indicated that Sangamo could use data from an extension study, looking at eGFR slope at 104 weeks, to confirm the clinical benefit of isaralgagene civaparvovec. According to Sangamo, the accelerated approval pathway could speed up the gene therapy’s time-to-market by three years and “avoids the requirement for an additional registrational study to establish clinical efficacy.” Sangamo CEO Sandy Macrae in a statement said that he is “delighted to have a clear regulatory pathway” for isaralgagene civaparvovec, which could allow the company to “bring this treatment to patients significantly sooner than originally anticipated.” Analysts, however, seem to be more measured in their assessment of Tuesday’s news, noting key financial challenges for Sangamo. Truist Securities analyst Nicole Germino pointed out in an investor note that “they need a partner to take the program forward to commercial execution.” In November 2023, Sangamo kicked off a strategic reprioritization initiative to focus its resources on its genomic editing and delivery technologies. As a result, the company deferred investments in its Fabry program, instead opting to search for a development partner for the gene therapy. While bigger pharma players have shown interest in rare diseases, “gene therapy programs such as sickle cell disease have run into challenges on reimbursement, which has curtailed uptake,” Germino wrote to investors. H.C. Wainwright analyst Patrick Trucchio was a bit more optimistic in his assessment, however, indicating in an investor note that Sangamo’s promising data from STAAR could “foster a robust collaboration” which may give the company a potential “source of non-dilutive funding for other wholly-owned programs.” Fabry disease is a rare lysosomal storage disease characterized by the toxic buildup of the lipid globotriaosylceramide, damaging vital organs such as the kidney, heart, stomach and nerves. Patients with Fabry disease typically experience mood disorders, pain, kidney disease, gastrointestinal disturbances and heart failure. The disease is caused by mutations to the GLA gene, which leads to deficiencies in the activity of the alpha-galactosidase A enzyme. Sangamo’s isaralgagene civaparvovec works by delivering a functional copy of the GLA gene and allowing the liver to restore alpha-galactosidase A activity to healthy levels. Germino noted that Sangamo “could use a near-term cash infusion to maximize their new pipeline focused on neurological diseases” as the licensing agreement with Roche announced in August 2024 only gives it a cash runway into the first quarter of 2025. Under the deal, Roche’s Genentech paid $50 million in near-term upfront fees and milestone payments to Sangamo to develop novel genomic medicines for neurodegenerative diseases.