Hunan University

核糖核酸酶靶向嵌合体（RoboTAC）降解癌症基因的RNA。（图/MPI MOPH） 核糖核酸（RNA）在细胞的多样性和基因表达中发挥关键作用，RNA可能提供比蛋白质更多的药物靶标。然而，由于RNA分子小、稳定性相对较差，过去一直被视为“难成药”靶点。目前靶向RNA的策略主要包括RNA干扰（RNAi）和反义寡核苷酸（ASO），这些方法能够高特异性地结合目标RNA，但它们的大分子尺寸使得细胞内递送成为难题。 相比之下，小分子药物更容易穿透细胞膜与RNA结合。如果能够像靶向蛋白降解剂那样，将核酸酶募集至RNA附近，实现RNA的靶向降解，将为药物开发提供新的策略。    01     基于核酸的TPD新策略  2018年5月，美国Scripps研究所的Matthew D. Disney研究团队开发了一种RNA降解策略——核糖核酸酶靶向嵌合体（RIBOTACs），RIBOTACs是一类异双功能小分子，它们通过特异性地结合目标RNA结构，并将内源性的核糖核酸酶（如RNase L）招募至这些RNA上，实现对RNA的降解（图1）。这种技术为靶向RNA提供了一种新的方法，尤其适用于那些传统小分子药物难以靶向的RNA结构。近年来，随着RIBOTACs技术的发展，RIBOTACs在多个疾病领域都展示出了不俗的治疗潜力，为治疗传统小分子药物难以靶向的RNA相关疾病提供了新的可能。 图1 RIBOTACs与PROTACs作用机制示意图   02      RIBOTACs在抗肿瘤方面的应用 2021年8月，Matthew D. Disney研究团队将酪氨酸激酶RTK抑制剂dovitinib与特定的RNA结构（pre-miR-21）结合设计出了靶向降解RNA的小分子RIBOTAC（图2）。RIBOTAC通过招募细胞内的核糖核酸酶RNase L来特异性降解pre-miR-21。相关研究表明，靶向降解pre-miR-21（microRNA-21的前体）的RIBOTAC在细胞和小鼠模型中显示出对pre-miR-21的高选择性和降解效率，能够显著降低miR-21的水平，并减轻三阴性乳腺癌和Alport综合征（遗传性肾炎）小鼠模型的疾病进展。这项研究为三阴性乳腺癌和Alport综合征等疾病的治疗提供了新的策略和方法，同时表明RIBOTACs技术在抗肿瘤领域具有极大的发展潜力。 图2基于dovitinib的RNA和蛋白质的RIBOTAC的合理设计 2024年5月，厦门大学朱志教授和杨朝勇教授课题组开发了一种Aptamer-RIBOTAC（ARIBOTAC）策略（图3），通过结合核酸适体AS1411和核糖核酸酶靶向嵌合体，特异性地识别并进入肿瘤细胞，激活内源性RNase L来选择性切割特定的miRNAs，从而实现癌症的精准治疗。这种嵌合体表现出卓越的能力，能特异性地识别并进入癌细胞，引发内源性 RNase L 的局部激活，并选择性地裂解与 ASO 互补的 miRNA。通过降解致癌 miR-210-3p 和 miR-155-5p，ARIBOTAC 策略在体外和体内的有效性和普遍性得到了验证。这些发现强调了 ARIBOTAC 策略通过精确靶向与癌症相关的 miRNAs 作为癌症治疗途径的潜力。 图3 4A-ASO-AS嵌合体降解miRNA的机制 同年6月，湖南大学蒋健晖教授和楚霞教授课题组介绍了一种新型的诱导性核糖核酸酶靶向嵌合体（iRIBOTAC）策略（图4），该策略通过响应生物正交或细胞特异性触发因素，实现对G-四链体(G4) RNA的按需降解，用于精准癌症治疗。 图4 iRIBOTAC的设计   03     RIBOTACs在神经退行性疾病方面的应用 肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性疾病（FTD）是进行性神经退行性疾病。最常见的遗传原因是染色体9开放阅读框72（C9orf72）内含子1中的GGGGCC六核苷酸重复扩增（HRE; G4C2 exp）。这种扩增的RNA转录本r（G4C2）exp具有毒性，并在c9ALS/FTD的发病机制中起作用。2021年10月，RIBOTACs技术在神经退行性疾病治疗方面的研究进展显著，特别是在ALS和FTD的治疗研究中。Matthew D. Disney教授及其团队设计了一种能够降解ALS和FTD中的致病RNA的RIBOTAC分子，并在患者来源的脊髓神经元和ALS小鼠模型中观察到成功诱导致病性mRNA降解并减少相关病理。 目前，RIBOTACs技术在帕金森病（PD）治疗方面的研究主要集中在降低与该病相关的ɑ-突触核蛋白（ɑ-synuclein）水平上。ɑ-突触核蛋白是一种无序蛋白，通常难以成为药物作用的靶点，因为它缺乏小分子可以结合的口袋。然而，2024年1月，该团队在帕金森病邻域取得的研究显示，通过RiboTAC技术，可以结合并选择性降解其相应的mRNA，从而降低ɑ-突触核蛋白水平。该研究将筛选到的靶向编码ɑ-synuclein的SNCA mRNA并抑制其蛋白翻译的小分子（Synucleozid-2.0）转化为一种RIBOTAC—Syn-RIBOTAC（图5），Syn-RIBOTAC能够选择性降解SNCA mRNA，显著降低了其表达的ɑ-突触核蛋白水平，并恢复了约50%受ɑ-突触核蛋白异常积累而表达失调的基因。这标志着RIBOTACs技术在神经退行性疾病领域的又一突破。 图5 Syn-RiboTAC选择性地降解SNCA mRNA机制示意图   04     RIBOTACs在抗病毒方面的应用 SARS-CoV-2作为一种RNA病毒，其复制过程对病毒的增殖至关重要。降解病毒RNA可以有效地抑制病毒复制，减少病毒的产生和传播。2024年4月，武汉大学的周翔教授和田沺教授研究团队针对SARS-CoV-2的紧急治疗需求，开发了一种基于核糖核酸酶靶向嵌合体（RIBOTAC）降解病毒RNA的策略。研究人员通过在核苷的糖环或碱基部分修饰RNase L配体，并将修饰后的核苷被掺入病毒的RNA后，利用招募RNase L降解病毒RNA，以抑制病毒的复制（图6）。研究表明，基于核糖核酸酶靶向嵌合体（RIBOTAC）降解病毒RNA的策略能够在细胞层面对SARS-CoV-2具有显著的抑制效果。在体内实验在仓鼠模型中能够抑制SARS-CoV-2的复制和活性。该项研究为抗病毒药物开发提供了有价值的新策略，进一步拓展了RIBOTACs技术的应用。 图6利用RIBOTAC推进针对SARS-CoV-2的核苷剪裁策略   05     结语    尽管RIBOTACs技术展现出巨大的治疗潜力，但它在开发过程中也面临一些挑战。其中包括开发高亲和力和选择性的RNA小分子配体的难度较大，以及由于分子量较大导致的细胞吸收和生物利用度问题。尽管如此，科学家们对其前景持乐观态度，认为随着生物和计算方法的发展，更多高亲和力、高选择性的RNA和RNase L小分子配体的发现，将进一步推动RIBOTAC的应用及其临床转化。 Ref.[1] Costales MG, Matsumoto Y, Velagapudi SP, Disney MD. Small Molecule Targeted Recruitment of a Nuclease to RNA. J Am Chem Soc. 2018;140(22):6741-6744. doi:10.1021/jacs.8b01233.[2] Dey SK, Jaffrey SR. RIBOTACs: Small Molecules Target RNA for Degradation. Cell Chem Biol. 2019;26(8):1047-1049. doi:10.1016/j.chembiol.2019.07.015.[3] Zhang P, Liu X, Abegg D, et al. Reprogramming of Protein-Targeted Small-Molecule Medicines to RNA by Ribonuclease Recruitment. J Am Chem Soc. 2021;143(33):13044-13055. doi:10.1021/jacs.1c02248.[4] Fang Y, Wu Q, Wang F, et al. Aptamer-RIBOTAC Strategy Enabling Tumor-Specific Targeted Degradation of MicroRNA for Precise Cancer Therapy. Small Methods. Published online May 25, 2024. doi:10.1002/smtd.202400349.[5] Min Y, Xiong W, Shen W, et al. Developing nucleoside tailoring strategies against SARS-CoV-2 via ribonuclease targeting chimera. Sci Adv. 2024;10(15):eadl4393. doi:10.1126/sciadv.adl4393. 共建Biomedical创新生态圈！ 如何加入BiG会员？

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry 导读：N-甲基腺苷(m6A)是肠癌中常见的RNA修饰。尽管其含量丰富，但m6A甲基化对肠癌中lncrna CARMN的生物学意义仍不明确，尤其是对于突变型p53的获得性功能增强。 7月22日，湖南大学张英杰研究团队在期刊《Clinical And Translational Medicine》上发表了题为“lncRNA CARMN m6A demethylation by ALKBH5 inhibits mutant p53-driven tumour progression through miR-5683/FGF2”的研究论文，本研究中，研究人员阐明了CARMN在携带突变p53的结直肠癌患者中表达水平降低，这归因于其丰富的m6A甲基化，这在体外和体内促进了癌症的增殖、侵袭和转移。进一步的研究表明，ALKBH5作为CARMN的直接去甲基化酶，靶向477个甲基化位点，从而保留了CARMN的表达。然而，突变p53与ALKBH5启动子的相互作用阻碍了其转录，增加了CARMN上的m6A甲基化水平。随后，YTHDF2/YTHDF3识别并降解m6A修饰的CARMN。同时，过表达CARMN在体外和体内显著抑制了结直肠癌的进展。另外，研究人员鉴定出miR-5683是lncRNA CARMN的直接下游靶标，通过协同下调FGF2表达发挥抗肿瘤作用。本研究揭示了CARMN在携带突变p53的结直肠癌中的调节者和功能机制，可能为基于去甲基化的癌症诊断和治疗策略提供见解。 研究表明对CARMN的m6A甲基化是导致突变p53获得性功能增强并引发结直肠癌恶性进展的关键因素，这一发现为癌症治疗提供了一种有前景的方法。 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1002/ctm2.1777 研究背景 01 目前的研究表明，人类基因组中约90%被转录成RNA，但其中只有不到2%含有编码蛋白质的基因。尽管被称为“垃圾DNA”，但人类和小鼠基因组中仍有超过80%被转录成各种RNA物种，如lncRNAs（长非编码RNAs）、miRNAs（微RNAs）、siRNAs（小干扰RNAs）和piRNAs（piwi介导的RNAs）。lncRNAs的特点是长度超过200个核苷酸，没有明显的编码蛋白质的能力，在不同的生理和病理条件下，在转录、翻译和翻译后水平上发挥着关键作用。显然，尽管缺乏广泛的开放阅读框，但lncRNAs作为RNA分子发挥着关键的生理功能。lncRNAs的活性由癌症中RNA结合蛋白和miRNA介导的途径之间的复杂相互作用决定。此外，人类基因组中lncRNAs的发现和特性研究正在迅速扩大，凸显了非编码RNA生物学动态变化的景观。 CARMN(心脏中胚层增强子相关非编码RNA)是平滑肌细胞中高度丰富和进化保守的特异性长链非编码RNA。最近的研究发现，CARMN是MIR143/145簇的宿主lncRNA，在心肌细胞和平滑肌细胞分化以及表型调控中发挥重要作用。值得注意的是，在体外实验中，CARMN的早期缺失是驱动VSMCs(血管平滑肌细胞)向致动脉粥样硬化表型转化的关键事件，同时也加速了体内动脉粥样硬化的进展。沉默CARMN为动脉粥样硬化提供了一个有前景的治疗途径，它提供了传统降脂或抗炎策略之外的新靶点，因为它可以有效抑制动脉粥样硬化斑块中的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖。然而，关于lncrna参与调控突变型p53诱导的结直肠癌的研究仍然很少。 研究进展 02 研究人员分别在12、24、36、48和60 h用细胞计数试剂盒(cck -8)检测细胞活力，检测ALKBH5在细胞中的功能。与最近的一篇报道一致，在SW480细胞中，敲低ALKBH5显著增加了细胞的增殖和迁移率，而过表达ALKBH5则观察到相反的结果。采用流式细胞术检测过表达和敲低ALKBH5对SW480细胞凋亡的影响。此外，敲除ALKBH5诱导细胞周期停滞在S期。细胞划痕和迁移实验显示，培养24、48 h后，敲低ALKBH5的SW480细胞划痕距离和迁移率降低。综上所述，这些发现表明突变型p53直接结合到ALKBH5区域的启动子上，抑制其转录，下调ALKBH5蛋白水平，加速结直肠癌的进展。 为了进一步确定miR-5683与突变型p53的功能，研究人员检测了细胞凋亡和自噬的各种标志物。过表达miR-5683可显著降低Bcl-xl和Bcl-2的表达水平。而抑制miR-5683可增加Bcl-xl和Bcl-2的表达，并阻断对c-caspase 3的诱导作用。尤其是，miR-5683模拟物确实随着LC3II/I的诱导而改变。在SW480细胞中转染RFP-GFP- lc3质粒并给予miR-5683模拟物处理后，观察到GFP降解，RFP/GFP升高，表明自噬被激活。而且，miR-5683过表达抑制突变型p53R273H的产生，而抑制miR-5683则明显促进突变型p53R273H的产生。这些结果表明，miR-5683和CARMN一样，对突变型p53的表达有负反馈作用。这些表明miR-5683抑制p53突变型结直肠癌细胞的进展，并促进细胞凋亡和自噬。 为验证CARMN在体内对结直肠癌生长的影响，研究人员在SW480细胞中敲入载体和CARMN绿色荧光蛋白(GFP)，然后分别接种于裸鼠右侧腋下构建移植瘤模型，SW480/ CARMN过表达组的肿瘤体积明显小于SW480/vector组。研究人员用qRT-PCR分析小鼠组织中p53、CARMN、ALKBH5、FTO和FGF2的表达水平。与对照组相比，过表达CARMN的小鼠异种移植组FGF2、突变型p53和FTO的表达降低。结果表明，在突变型p53存在的情况下，CARMN抑制结直肠癌的体内生长。研究人员还评估了p53、m6A、ALKBH5、FGF2和Ki67在小鼠皮下移植瘤中的水平及其相关性。与对照组相比，过表达CARMN的肿瘤中ALKBH5的表达水平较高，而p53、m6A、FGF2和Ki67的表达水平较低。综上所述，研究结果表明突变型p53在转录水平下调ALKBH5的表达，从而导致CARMN的m6A甲基化水平升高，随后被YTHDF2/3降解。另一方面，CARMN与miR-5683直接相互作用，并通过降解FGF2 mRNA抑制Akt/mTOR通路，诱导凋亡/自噬，对结直肠癌的生长具有协同抑制作用。此外，CARMN和miR-5683对突变型p53的表达具有负反馈作用，而FGF2对突变型p53的表达具有正反馈作用。 CARMN介导体内抗肿瘤作用 研究小结 03 综上，本研究表明CARMN 缺失与具有突变 p53 的结直肠癌的不良临床病理特征和预后相关。CARMN 过表达可降低结直肠癌细胞的增殖、迁移能力，而 CARMN 敲低则促进突变 p53 的结直肠癌进展。ALKBH5通过m6A-YTHDF2/ ythdf3依赖的方式影响CARMN的去甲基化及其水平的增加。 参考资料： https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1002/ctm2.1777 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情

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