Gamaleya Research Institute Of Epidemiology And Microbiology, Health Ministry Of The Russian Federation

在过去十年中，疫苗发现和开发的新方法改变了该领域。COVID-19 大流行期间的进展使得人们能够使用信使 RNA 和病毒载体等新平台每年生产数十亿剂疫苗。分析工具箱、设备和生物工艺技术的改进使得疫苗开发速度和疫苗生产规模都达到了前所未有的水平。大分子结构功能表征技术与改进的建模以及数据分析相结合，能够以单粒子分辨率定量评估疫苗配方，并指导疫苗药物底物和药物产品的设计。这些进步在精确评估新平台提供的疫苗的关键质量属性方面发挥了重要作用。无标记和免疫分析技术的创新有助于表征抗原位点和开发强大的体外效力分析。这些方法与下一代测序等分子技术一起，将加速所有平台提供的疫苗的表征和放行。用于实时监控和优化工艺步骤的过程分析技术可以实施质量源于设计的原则并更快地放行疫苗产品。未来十年，疫苗研发领域将继续进步，汇集新技术、方法和平台，改善人类健康。 引言 2012 年，《生物技术与生物工程》发表了一篇评论“疫苗工艺技术” ，重点介绍了用于预防人类各种传染病的疫苗生产的各种技术。在过去十年中，该领域取得了长足进步，部分原因是用于开发安全有效的 COVID-19 疫苗的资源大幅增加。这项艰苦工作的结果是，与使用蛋白质抗原作为疫苗等更传统的方法相比，引入并优先考虑了新的疫苗平台，特别是信使 RNA (mRNA) 和复制缺陷型腺病毒。 在过去 10 年中，含 DNA 和 RNA 的疫苗取得了巨大进步，这些疫苗本身并不含有目标抗原，而是携带指示接种者自身细胞产生抗原的指令。病毒载体和 mRNA 脂质纳米颗粒 (LNP) 疫苗属于这一类。自 2012 年以来，已有十种新的病毒载体疫苗和两种 mRNA-LNP 疫苗获得批准（表 1，译者注：原文数据如此）。自 2012 年的总结以来，许多其它重要疫苗也获得批准。Flucelvax® 是首个使用细胞培养技术生产的季节性流感疫苗，于 2012 年引入美国（诺华，现为 Seqiris）。Flucelvax 工艺使用悬浮 MDCK 细胞培养作为病毒繁殖的底物，而不是鸡蛋。该疫苗于 2007 年首次在欧洲获批，名称为 OptaFlu。一年后，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了 Flublok®，这是一种使用杆状病毒表达系统生产的昆虫培养重组流感疫苗（Protein Sciences Corporation，2017 年被赛诺菲收购）。该疫苗于 2016 年从三价改为四价，并于 2020 年获得欧洲药品管理局（EMA）批准。Flublok® 利用重组表达与所选毒株精确匹配的血凝素 (HA) 蛋白，避免了病毒适应鸡蛋或细胞培养而导致抗原漂移的潜在问题。 表1. 病毒载体疫苗。 2017 年，FDA 批准葛兰素史克公司生产的带状疱疹 (HZ，shingles) 疫苗Shingrix，供 50 岁及以上的成年人使用。该疫苗是一种重组糖蛋白抗原，在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中生产并冻干，使用单独的 AS01B 佐剂悬液小瓶进行复溶。疫苗悬液含有 50 μg 重组水痘带状疱疹病毒 (VZV) 糖蛋白 E，其免疫原性增强，由两种佐剂组成：基于脂质体的 AS01B 佐剂系统，含有 50 μg 3-O-脱酰基-4′-单磷酰脂质 A (MPL) 和 50 μg Quillaja saponaria Molina，fraction 21。此外，2017 年，FDA批准了Dynavax 的Heplisav-B 乙肝疫苗，该疫苗含有新型胞嘧啶磷酸鸟苷 (CpG) 1018® 佐剂和重组蛋白亚单位抗原。该产品于 2019 年在欧洲获得批准。CpG 1018® 佐剂是一种修饰骨架寡核苷酸，可模仿细菌和病毒 DNA 来刺激先天免疫系统。2019 年，FDA 批准了 JYNNEOS® (Bavarian Nordic A/S)，一种天花和猴痘疫苗，适用于 18 岁及以上被确定为感染风险高的成年人。JYNNEOS® 是一种由 MVA-BN 毒株（一种减毒、非复制性正痘病毒）生产的活疫苗。MVA-BN 在悬浮于不含任何直接动物来源物质的无血清培养基中的原代 CEF 细胞中生长，然后通过包括核酸酶消化在内的多个切向流过滤 (TFF) 步骤收获、纯化和浓缩。为了增加疫苗供应，FDA 于 2022 年 8 月批准了 JYNNEOS® 的紧急使用授权 (EUA)，用于向 18 岁以下的个人皮下 (sc) 给药(0.5 mL) 和向 18 岁及以上的个人皮内 (id) 给药 (0.1 mL)。 2020 年，世界卫生组织 (WHO) 批准了 nOPV2 的紧急使用清单 (EUL)，作为全球根除脊髓灰质炎的不断发展的战略的一部分。该疫苗使用在源自非洲绿猴肾脏的 Vero 细胞中制备的改良 Sabin 株 (nOPV2 株 S2/cre5/S15domV/rec1/hifi3) 的减毒活脊髓灰质炎病毒 2 型。为了降低疫苗源性脊髓灰质炎的发病率，该疫苗通过对亲本基因组进行5处修改，影响域 V、cre 元件和 RNA 依赖性 RNA 聚合酶，提高了遗传稳定性并降低了重组率。同样在 2020 年，WHO 对首个 Sabin 灭活脊髓灰质炎疫苗 (sIPV，注射剂，LG Chem) 进行了预审批。该疫苗采用基于微载体的 Vero 细胞生产，生产不使用野生型病毒，降低了逆转录突变的风险。此外，细胞生长培养基从含血清培养基改为无动物源性成分 (ACF) 培养基，在病毒灭活前增加了洗滤步骤，并使用重组胰蛋白酶。 2020 年初 COVID-19 疫情爆发后不久，全球 200 多种候选疫苗中的首批进入临床试验。到同年 12 月，监管机构授予了首批 EUA。到 2023 年 3 月，已接种超过 130 亿剂 COVID-19 疫苗。据估计，仅在 2021 年，新疫苗就挽救了 1400 多万人的生命。许多因素促成了疫苗研发的加速，包括对新模式（mRNA 和复制缺陷型腺病毒）的预先投资以及政府对临床研究的大量资助。约 40% 的剂量为之前确定的全病毒灭活类型，其余剂量则平均分为两种类型：mRNA-LNP 和腺病毒载体。从化学、生产和控制 (CMC) 的角度来看，为应对疫情，疫苗生产和分析也取得了重大进展，缩短了从证明有效性到广泛提供疫苗的时间线，支持将生产规模从每年数百万剂扩大到数十亿剂。生产规模和效率的变化需要复杂的分析表征能力。 表2.十大 COVID-19 疫苗。 在本综述中，我们描述过去 10 年中取得的技术进步，这些进步使得开发和生产用于预防各种人类传染病的新型疫苗成为可能。其中一些进步，特别是在 mRNA 和病毒载体递送方面的进步，也适用于新兴的治疗性肿瘤疫苗领域。本综述的范围涵盖整个疫苗生产过程，从细胞培养和无细胞系统到制剂、纯化、稳定性、分析和监管环境的变化。 细胞培养 细胞培养越来越多地用于表达疫苗生产所需的抗原（图 1）。病毒表达可以在贴壁细胞系或悬浮驯化细胞系中实现。 图1. 基于细胞的病毒疫苗生产概要示意图。 贴壁细胞系 历史上，出于对安全问题的担忧，用于疫苗生产的细胞系的选择一直受到限制。随着时间的推移，出现了更多的选择，尤其是使用连续细胞系。基于贴壁细胞系的疫苗的一个例子是基于重组水泡性口炎病毒 (rVSV) 的埃博拉疫苗 rVSVΔG-ZEBOV-GP (V920，商品名 ERVEBO®)，其最初被构建并被描述为抗生物恐怖主义药物。rVSV Indiana 株包括了VSV 囊膜糖蛋白的缺失，被Zaire埃博拉病毒 (ZEBOV) Kikwit 1995 株表面糖蛋白取代，并且它在 Vero 细胞中生产。最近的创新还包括开发各种单位体积表面积非常大的一次性生物反应器 (SUB)；例如，Dohogne 及其同事描述的生物反应器。Drugmand 等人在2020 年描述的固定床反应器结合了强化连续和自动化一次性生物工艺方法。脊髓灰质炎疫苗的案例将上游工艺、下游工艺以及灭活联系在一起。 悬浮培养 多种疫苗细胞培养应用涉及悬浮培养。为了生产蛋白质，已成功使用杆状病毒表达的昆虫细胞培养 (Sf9)；例如，用于大规模生产 FDA 许可的流感疫苗的 HA 蛋白。或者，用于病毒生产的宿主细胞，例如 Vero 细胞或 PER.C6 细胞，可以驯化后悬浮培养。如果可以适应细胞培养，通常可以使用成熟的方法在经典的搅拌罐生物反应器中培养细胞。为生产抗体而开发的许多 CHO 细胞培养技术改进可以应用于疫苗生产。最近，行业已从 10,000–20,000 L 规模的不锈钢生物反应器过渡到约 3000 L 规模的SUB。Watterson 等人描述了一种使用 CHO 细胞表达的 SARS-CoV-2 Sclamp 候选疫苗，该疫苗适用于大规模商业生产，在2–8°C 下稳定。当与 MF59 佐剂配制时，它会引发中和抗体和 T 细胞反应，并在动物模型中提供保护。在 CHO 细胞中表达的 VZV 截短糖蛋白 E 是极为有效的Shingrix 疫苗的基础。用于疫苗的细胞培养技术与用于大规模生产抗体的技术非常相似。 在 COVID-19 大流行期间，牛津大学的研究人员领导了开发有效疫苗的工作，他们使用基于复制缺陷型腺病毒的平台来递送刺突蛋白。2022 年的 ECI 会议上介绍了该平台的规模放大。该平台涉及使用悬浮细胞培养表达复制缺陷型腺病毒以递送冠状病毒刺突蛋白，该平台可放大并由阿斯利康成功转移到多个生产基地，从而能够在约 18 个月内供应超过 10 亿剂COVID-19 疫苗。 微生物生产 传统上，微生物发酵平台被用于生产主要类别的疫苗，它们仍然至关重要。人乳头瘤病毒 (HPV) 的表面 L1 蛋白由酿酒酵母表达，并组装成病毒样颗粒 (VLP)，以产生Gardasil疫苗 。乙肝病毒 (HBV) 表面抗原由酿酒酵母或毕赤酵母表达。基于 DNA 质粒的候选疫苗通常由大肠杆菌细菌发酵制成。肺炎球菌结合疫苗由特定肺炎链球菌菌株表达的荚膜表面多糖 (CSP) 与白喉 CRM197 蛋白结合而成。一些重要的疫苗最初是减毒活病毒 (LAV) 疫苗，最终被带有佐剂系统的单一重组 VZV 糖蛋白所取代。过去十年，在开发能够实现高产量的替代培养物方面取得了进展，例如基于Thermothelomyces heterothallica真菌培养物(称为 C1) 的 Dyadic 平台。基于C1 的系统可以在数周内开发出表达免疫活性抗原的稳定菌株；总体而言，与其它成熟的系统相比，产量更高。基于 C1 的系统可以轻松扩展到工业规模，并且具有成本效益，其使用标准的微生物发酵罐和廉价的培养基。一种使用 C1 表达技术生产刺突蛋白关键受体结合域 (RBD) 成分的 COVID-19 候选疫苗目前正在临床中进行评估。麻省理工学院的研究人员开发了一个基于毕赤酵母的平台，该平台完全自动化，可用于生产包括疫苗抗原在内的多种蛋白质。之所以选择这种酵母，是因为它可以快速生长到高细胞密度，并具有可接受的蛋白质表达。目前正在使用具有端到端功能的高度自动化生物反应器系统，将类似技术应用于轮状病毒的三价候选疫苗的生产。 对于蛋白质抗原，技术挑战通常在于可重复地生产暴露关键表位的疫苗，以便它们被免疫系统识别。对于基于 VLP 的疫苗（例如 HPV 疫苗）尤其如此，复杂的分析能力对于成功至关重要。对于 mRNA 疫苗，大肠杆菌发酵仍然是生产体外转录 (IVT) 为 mRNA 所需质粒 DNA (pDNA) 模板的主要方法，例如辉瑞-BioNTech 的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗 Comirnaty® 和 Moderna 的 Spikevax®。pDNA 的无细胞合成正在取得长足进步，但由于酶和核苷酸/核苷成本高昂，其成本效益仍然不如微生物生产。pDNA 是 IVT 反应的原材料，所需的总量明显少于 DNA 疫苗，因为可以从单个线性化的 pDNA 模板制作许多 mRNA 拷贝。用于 IVT 的 pDNA 序列通常需要大量重复元素（例如 poly(A) 尾），这可以为大肠杆菌细胞菌株的选择提供参考。许多业界主力菌株最初针对高 pDNA 产量而不是 pDNA 保真度进行了优化，但现在已有多种菌株能够正确复制具有重复元素的较大质粒。最近描述了一种在大肠杆菌中生产结合疫苗的新方法，即通过将关键酶插入细菌中。这种方法避免了分别生产蛋白质和多糖，然后进行纯化、化学结合和重复纯化的要求。 自从在不锈钢压力容器中实现500–5000 L 规模的发酵以来，发酵设备进行了多项创新，其自动化、清洁、验证和操作变得越来越复杂。由于建设成本高，在很多地区只有有限数量的大型生产基地。过去十年，微生物和细胞培养的一个重大进步是向一次性生物反应器（SUB）的过渡。人们对一次性生物反应器进行了大量投资，通过省去清洁和灭菌步骤并提高灵活性，可以生产小规模的微生物培养物。许多微生物培养中常见的工艺条件，例如压力、高空气流速、溶剂和严格的温度控制，将用于疫苗生产的 SUB 的上限规模限制在 3000 L 左右。 对于纯化，已经针对整个工作流程建立了一次性选项 - 从深层过滤、用于浓缩和洗滤的切向流，到用于层析的一次性层析柱。疫苗生产商正在努力建立一次性系统的第二来源供应商，以避免供应链问题。行业举措，正在建立灵活的一次性系统，该系统具有标准化、与独立于供应商的组件和连接。最终用户和技术提供商也在共同努力，为一次性组件提供可持续的回收和循环经济战略。 无细胞合成 疫苗的“体外”生产，包括蛋白质、RNA疫苗和 VLP，已成为一种简单而优雅的方法，可加速疫苗工艺开发和生产。无细胞 IVT 始于线性化的 DNA 模板，用于在 T7 RNA 聚合酶的控制下转录复制子 RNA（图2）。IVT 反应在几个小时内完成，生成 3-5 mg/mL 的产品，例如 RNA。对于 RNA 疫苗，可以通过在IVT 反应中补充 m7GppG 帽结构类似物并保持帽分子相对于 RNA 序列第一个核苷酸（GTP）的高摩尔比来对 RNA 复制子的 5′ 端 进行加帽（图 3）。加帽已经通过使用 CleanCap 试剂的共转录加帽商业化。或者，可以在第二个酶促反应中使用加帽酶 (VCC) 和甲基供体作为底物对 mRNA 进行加帽。与加帽类似物的 60%–80% 相比，VCC 加帽效率更高 (100%)，但共转录加帽是一个更快的过程，因为它不需要第二个酶促反应步骤。在 IVT结束时，加入 DNAase I 酶以降解 DNA 模板，然后加入 EDTA 以抑制 DNAase 活性、稳定 RNA 产物并减轻 RNA 沉淀。去除包括酶、残留 NTP、DNA 模板和异常 mRNA（双链 [ds] RNA 和截短的 RNA 片段）在内的杂质至关重要，因为 RNA 纯度已被证明会影响翻译效率并改变疫苗在体内的免疫刺激反应。例如，用反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 去除双链 RNA (dsRNA) 后，蛋白质表达量增加了 10 到 1000 倍。TFF 已被广泛用于 IVT 后的 RNA 纯化，纯度可达90%–99%，收率可达 90%–95%。如纯化部分所述，TFF 还可与层析法配合用于去除 dsRNA。对于 RNA，可通过一次性兼容无 RNAase 系统（如微孔板、试管以及包括波浪式运动或搅拌罐的生物反应器）实现放大，如图2所示 。 图2.用于 RNA 生产的无细胞 IVT 反应。典型的反应从 2–5 mL 开始，用于优化筛选（2–10 mg），然后是10–15 mL IVT 用于动物研究（25–50 mg），之后是5–20 L 用于临床研究（10–50 g），最多 50–200 L 用于商业生产（125–500 g）。 图3.通过体外转录 (IVT) 获得的 mRNA 结构。 简化的 RNA 生产工艺可以快速开发疫苗；例如，SARS-CoV-2 疫苗从 DNA 模板到首次人体试验仅用了 42 天。IVT RNA 候选疫苗的商业化上市时间也可以缩短至 2 年以内。商业设施可以小 2-3 个数量级，建设时间减半，前期资本成本仅为其二十分之一。10 亿剂疫苗可以在一个低成本的 2000 万美元设施中生产。通过使用封闭式工艺，可以在低级别洁净室设施中生产，从而进一步降低设施成本。虽然取消高级别洁净室要求可以节省能源和资本成本，但试剂成本在 IVT 工艺的经济性中占主导地位，占商品生产成本 (COG；表 3 ) 的 96%。良好生产规范(GMP) 材料和试剂供应是一个限制因素，尤其是在确保酶试剂为 ACF （无动物源性）和 GMP 级的情况下增加了复杂性。尽量减少试剂使用的方法非常重要；方法包括 IVT 后加帽和集成连续工艺，其中可以加快反应速度并实现试剂重复使用。自动化 RNA 生产系统也正在开发中，其中 IVT 反应与机器人操作下的纯化步骤集成在一个封闭系统中。同样，微流控系统用于将 RNA 制备整合到 LNP 生产中，用于个性化疫苗方法（图 4）。如今，台式系统可用于简化发现构建工作流程，因为寡聚体可以以 10 µg 的规模组装成全长 DNA 或 mRNA 序列，而无需pDNA 模板。未来，台式核苷酸生产系统可能会成为现实。 表 3. mRNA IVT 生产 10 亿剂的技术经济评估。 缩写：COG，商品成本；IVT，体外转录；mRNA，信使RNA；sa-mRNA，自扩增mRNA。 a 假设：一个生物反应器的反应产出量为 5 g/L RNA IVT，收率为 65%，新设施利用率为 80%，活动持续时间为 12 个月。成本不包括封装。COG 显示的范围涵盖了加帽类型和酶采购供应方法。分析由 Biopharm Services Ltd Biosolve 工艺成本分析工具支持。 图4.脂质纳米颗粒组装工作流程。 虽然单链 RNA 的设计结构已经得到充分证实，但新的 RNA 治疗方式仍在不断扩展。自扩增 mRNA（sa-mRNA）具有高拷贝数和随后的高抗原表达，每剂含量比单链 RNA 低 60 倍。反式扩增 mRNA（taRNA）也已在动物研究中得到证实，其中一个 mRNA 模板编码复制酶，而单独的模板扩增多个目标 mRNA，同时编码不同的蛋白质。共价闭合环状 RNA（circRNA）已在动物模型中显示出连续翻译蛋白质的可行性。circRNA 由 IVT 线性RNA 生成，可通过多种方法环化，例如 T4 RNA 连接酶或内含子剪接。这种稳定的闭环结构可防止被核酸外切酶切割，不需要 5′ 加帽或 3′ poly(A) 尾巴，并且有可能在室温下保持稳定。预计，以机械建模和人工智能 (AI) 工具为指导的计算机分子设计将继续改进分子设计，以优化半衰期、稳定性和效力，还可以改善 CMC 属性，包括减少杂质。最近的研究表明，通过降低 IVT Mg 2+水平来减少 dsRNA、使用热稳定性 T7 RNA 聚合酶在 50°C 下进行更快的反应以及应用高盐转录策略，可以进一步提高产量和纯度。这些扩大工艺设计空间的努力可以通过扩展自动筛选工具来支持，从而实现具有 IVT、纯化和过程分析集成工作流程的实验统计设计。 除 RNA 外，各种疫苗类型的无细胞生产已被证明，包括亚单位、结合物、VLP 和膜增强疫苗。这些示例主要使用大肠杆菌的裂解物系统，尽管使用了多种来源，包括CHO、小麦胚芽和烟草。市售试剂盒提供了快速的方法来创建用于发现和工艺开发的材料，并且已经证明可以规模放大，以支持临床生产。最近的一项研究应用无细胞表达技术成功生产了与当前接种标准相当的下一代 24 价肺炎球菌结合疫苗。无细胞平台表达了增强的载体 CRM 蛋白序列，其中包含多种非天然氨基酸。它们位于主要 T 细胞表位的外部，因此可以进行位点特异性共价结合，并有可能提高血清型覆盖率。由于翻译后修饰、细菌来源系统的免疫原性问题、二硫键折叠复杂性以及规模放大所需的试剂成本等挑战，无细胞疫苗生产的广泛采用仍然受到限制。预计随着基于哺乳动物的裂解物系统和连续工艺系统的应用进展，这些情况将在未来 10 年内得到改善。 纯化 过去十年中，疫苗的纯化已从复杂的工作流程向更标准化、强化的方法转变。图 5总结了示例。重点是继续降低成本和剂量，同时提高产量和收率。如最近的评论所总结的那样，通过离心、深层过滤、细胞裂解和过滤对细胞收获进行了逐步改进。膜设计的改进促进了从离心到深层过滤的转变，或两者的结合。可用的更高 MWCO 膜的开发支持了较大病毒的浓缩、缓冲液置换和杂质降低（宿主细胞蛋白 [HCP]）。单程 TFF 的持续改进实现了强化和连续的工作流程。随着膜设计的进步，病毒产品的除菌过滤不断优化。 图5.疫苗生产流程。将包括传统工艺流程在内的工艺类型与强化/集成的未来方法进行比较。 亲和捕获层析选项的扩展为简化和标准化工作流程提供了关键优势。对于病毒工艺，亲和捕获的可用性在减少单元操作数量方面提供了显着优势，如图 5所示。工程化配基从头设计的进展为病毒疫苗带来了高特异性和可调节的亲和配基，并在温和的洗脱条件下，具有强大的杂质清除能力。商业上可获得的来源，例如源自骆驼单链结构域的来源，已经针对一系列腺相关病毒 (AAV) 血清型（例如 Capture select AAV9）建立了可用亲和策略。配基设计不断改进，例如使用组合化学方法的短碱基（5-15 个氨基酸）配基和分子印迹计算机设计聚合物可快速生成配基颗粒。对于 RNA，脱氧胸苷 (oligo dT) 配基已成为与 3′ poly(A) 尾结合的亲和捕获方法。通过结合 OligodT 和精制 IEX，可以有效去除包括 dsRNA 在内的杂质。亲和层析技术的进步使通过多柱工艺实现效率改进的策略得到更广泛地应用。例如，双柱逆流层析法结合尺寸排阻层析法 (SEC) 可将腺病毒的收率提高6倍，回收率分别达到 86%，DNA 和 HCP 清除率分别达到 90% 和 89%。Fischer 等人采用类似的强化方法纯化甲型流感病毒。季胺 (QA) 阴离子交换整体柱与模拟移动床层析法相结合，病毒收率达到 89%，DNA 清除率超过 98%。 从传统的基于树脂基球的分离到对流形式的膜和整体柱（图6 ）的转变继续得到更广泛的应用。树脂基球的扩散限制（其中较大的病毒颗粒难以进入基球内的配基）通过对流传输膜的较大孔径和更高流速的优势得到克服，包括微孔水凝胶纳米纤维和整体柱形式。这些已成功应用于一系列疫苗产品，典型的回收率为 60%–90% 且杂质结合最小化，包括99% 的 HCP 和残留 DNA（resDNA）去除以及 5-log 内毒素降低。去除的杂质包括病毒、VLP、噬菌体、细胞外囊泡、pDNA和RNA。最近证明了整体柱的工艺效率，IEX 整体柱纯化风疹病毒悬液仅需 1 小时，而使用填料基球层析柱则需要 10 小时以上。 图6. 层析的扩展形式。（左图）树脂基球。功能配基内化在树脂介质的孔内；这种形式以缓慢的扩散传质为主，从而产生缓慢或分辨率较低的工艺，对大分子具有显著的尺寸排阻效应。湍流发生在具有涡流的树脂与剪切应力升高且产量较低的区域之间。（中间图）膜技术，其功能基团固定在膜表面。宽孔径允许高流速并最大限度地减少尺寸排阻效应。（右图）整体柱形式支持具有功能化大孔或大孔和中孔的互连通道。大直径通道提供对流传质并实现支持快速工艺处理的、独立于液流的分辨率和载量。层流为生物制剂和疫苗提供低剪切应力和更高的收率。 对强化工艺和提高上游表达滴度的追求重新引发了人们对沉淀、双水相萃取 (ATPE) 和结晶等非层析方法的兴趣。无层析的工艺有可能将 COG 降低 20% 到 30%，并且更适合连续工艺。使用统计实验设计减少了优化条件的复杂负担，可以通过 pH、温度、电导率和混合物组成最大限度地提高目标稳定性和完整性。典型的聚乙二醇(PEG) 沉淀的例子包括使用 5% PEG 和 0.5 M NaCl 实现 85% 的甲型肝炎病毒回收率和 65% 的 HCP 减少率。然后用核酸酶处理裂解物，以防止核酸/病毒聚集体的共沉淀。mRNA 沉淀已与 TFF 相结合，以捕获通过洗滤去除的沉淀和杂质，然后重新溶解。预计可以使用塞流或盘管流反转反应器实现连续疫苗沉淀。ATPE 的强化和上游滴度的提高涉及混合两种聚合物和亲液盐（磷酸盐柠檬酸盐、硫酸盐）溶液，并且可以克服传统上过度稀释提取系统的大体积限制。最近的许多例子表明，使用 PEG/盐组合物在提取的上相中分离一系列疫苗产品（包括病毒、VLP 和细胞外囊泡）是可行的，从粗裂解物中实现 70%–99% 的回收率。Turpeinen等人表明，使用简单的螺旋混合器以连续模式使用 45% PEG 和 30% 柠檬酸盐混合物可以回收 99% 的 HIV VLP 并去除 73% 的DNA，这种方法可以减少大体积缓冲液的使用和工艺时间。 尽管疫苗结晶作为一种纯化工具还处于起步阶段，但最近的一些进展已经显示出令人信服的机会。例如，已经证明了非复制性轮状病毒疫苗候选物（与破伤风毒素的 P2 表位融合的 VP8 亚基蛋白）的结晶。在悬滴蒸汽扩散系统中评估了筛选晶体条件，然后使用蒸发技术进行了放大。发现随后的抗体结合曲线与结晶前相似。该技术还放大到通过连续段塞流结晶实现可调晶体尺寸控制。这些技术为通过疫苗结晶进行连续生产提供了可能性。看看技术发展能在多大程度上推动目标分子中的杂质清除，或者结晶是否需要与层析法或沉淀以及两相萃取相结合，这将是一件有趣的事情。 预计在未来 10 年内，工艺将进一步强化并集成到更小的占地面积中，从而提供更低成本的工艺，更易于全球部署。改进的技术可以实现一步层析法和连续工艺，其结合单程切向流过滤以及对昂贵试剂的可持续回收，这对 RNA 生产尤为重要。支持非层析工艺（包括结晶）的技术预计将进入临床前开发阶段。所有这些活动都将得到 AI 指导的机械建模和支持自主操作的先进控制策略的支持。 药物产品（DP）工艺 大多数获批的疫苗通过肌肉注射(IM)、皮下注射或皮内注射给药，也有少数获批的口服和鼻腔疫苗。此外，正在开发通过吸入输送到肺部和使用微针贴片输送到皮内的疫苗。无菌注射 DP 生产包括制剂 (配方)、除菌过滤（大多数情况下）、灌装小瓶或预灌装注射器、目视检查、贴标和包装 (即灌装-完成)。一些疫苗在灌装后在最终容器中冷冻干燥 (冻干)。结合疫苗需要将抗原与载体蛋白结合。最后，某些疫苗可能需要经过工艺步骤来加入佐剂。许多注射疫苗，例如含有减毒活病毒或铝凝胶佐剂的疫苗，不适合除菌过滤，因此上游步骤需在无菌条件下进行以确保无菌。 许多为 COVID-19 开发的疫苗都包含 DP 生产方面的创新。其中最关键的是辉瑞-BioNTech 的 Comirnaty® 和 Moderna 的 Spikevax® 中使用了 mRNA-LNP。需要建立一个全球性的灌装-完成站点网络，并构建具备 LNP 制备和 TFF 等新单元操作的能力。LNP 的制备需要将水性 mRNA 溶液和4种脂质的乙醇溶液受控地泵入微混合装置，如图 4所示。刚形成的含 mRNA 的LNP 具有非常有限的物理稳定性，因此 LNP 形成步骤之后立即进行溶剂和缓冲液置换，使用 TFF 去除乙醇并调节 pH 值。 尽管 COVID-19 mRNA-LNP 疫苗表现出显著的有效性，但它的一个主要限制是需要冷冻储存和运输，这增加了成本和复杂性，并阻碍了更广泛的分发。辉瑞-BioNTech 疫苗目前的保质期为 18 个月，但必须保持在 −90°C 至 −60°C，而Moderna 疫苗的保质期为 9 个月，保存温度为−50°C 至 −15°C。最近的一篇评论总结了提高mRNA-LNP 疫苗稳定性的重点领域，包括优化构成纳米颗粒的脂质、缩短 mRNA 链长、增加 GC 含量以及使用冻干等干燥技术等。 mRNA-LNP 疫苗的冻干是可行的，并且可以提高热稳定性。虽然未来的 mRNA-LNP 产品可能会被冻干，但目前的 mRNA-LNP COVID-19 疫苗却不能，因为冻干产能有限，在疫情期间没有足够的产能生产数十亿剂。喷雾冷冻干燥和无菌喷雾干燥等新兴技术在未来可能会成为可行的选择。在某些条件下，单个喷雾冷冻干燥机或喷雾干燥机可以匹配许多冻干机的产出量。 应对 COVID-19 的举措还包括重组病毒载体疫苗的重大进展，例如阿斯利康的 Vaxzevria®（由印度血清研究所生产，商品名 Covishield®）、国药集团的 Covilo®、杨森的 Ad26.COV 2-S、Gamaleya 的 Sputnik V 和康希诺的 Convidecia。在过去 10 年中，有4种病毒载体疫苗获批用于治疗埃博拉病毒，一种用于治疗登革热病毒。病毒载体疫苗采用传统的灌装技术，包括混合冷藏液体、冷冻至 −20°C 和冻干。 许多新型疫苗 DP 制剂和给药方法正在开发中。有些将需要新的 GMP 生产步骤，例如微针和多种类型的纳米颗粒。 重组人白蛋白 在生产或配方中使用任何动物源成分都需要采取广泛的预防措施，以防止被病原体污染。白蛋白和明胶长期以来一直被用作制剂成分来稳定某些疫苗。多年来，白蛋白的来源是人类志愿者捐献的混合血浆。2006 年，默克获得批准，使用在酿酒酵母中表达的 Recombumin® 重组人白蛋白进行 MMR®II 的上游生产。 2019 年，默克使用重组人白蛋白作为 DP 配方辅料的 ERBEVO® Zaire埃博拉病毒疫苗获得 EMA（欧盟委员会，2020 年）和 FDA（美国食品药品监督管理局，2019 年）批准。白蛋白是 InVitria 公司从大米中提取的 Exbumin®。疫苗需要在 −80°C 至 −60°C 下储存和运输，在 2–8°C 下最多可保存 14 天。预计重组白蛋白将在未来用于更多疫苗。 佐剂 佐剂对于含有佐剂的疫苗的有效性至关重要，并且是其开发和生产的专业领域。目前使用的许多佐剂都被视为知识产权 (IP)。例如默克铝佐剂、葛兰素史克佐剂系统、MF59® (Novartis)、Matrix-M (Novavax) 以及位于西雅图的 Access to Advanced Health Institute 拥有的几种佐剂。 目前 FDA 和 EMA 批准的疫苗中最常见的佐剂类型是不溶性铝盐悬液（无定形羟基磷酸铝硫酸盐、氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾）。此类佐剂已使用了近 100 年。它们的基本粒径为几十纳米，形成松散连接的网络，根据测量方法和剪切条件的不同，其尺寸为 1-20 µm。含有铝佐剂的疫苗无需冷冻，因为这会导致佐剂粒径增加；但是，如果有足够的稳定剂（如蔗糖）和/或冷冻速度足够快，这些疫苗可以冻干或喷雾冷冻干燥，以提高稳定性。另一个问题是铝颗粒可能会形成难以悬浮的沉淀物。 商业疫苗中的其它佐剂包括明尼苏达沙门氏菌（Salmonella minnesota）脂多糖 (MPL、MPLA)的化学改性脂质部分、含有 CpG 基序以模拟细菌 DNA 的合成寡核苷酸（例如 CpG 1018®）、角鲨烯和皂苷。这些佐剂以各种组合使用，在某些情况下吸附到氢氧化铝上或作为乳液或纳米颗粒的一部分。所有佐剂的共同主题是粒径，这是一种具有免疫学后果的属性，可能很难通过生产和质量控制进行管理。 稳定 在产品制剂和工艺开发过程中，需要确定降解途径，以评估生产工艺和产品成分变化对稳定性的影响。生物制品最重要的化学降解途径之一是水解，这通常会导致肽键打开。其它化学降解途径包括脱水和氧化。物理变化包括亚基或疫苗主要形态的聚集和变性（或蛋白质的错误折叠）。这些分子变化会导致产品质量变化，从而导致功能丧失、脱靶免疫原性或其它不良影响。分子的单一变化可能会使其完全失效，具体取决于结构受到影响的位置。另一方面，有些变化不会产生任何影响，因为它们不在与产品活性相关的领域。由于疫苗产品中使用的抗原和佐剂的复杂性，很难理解或预测所有可能的变化及其影响；一般来说，尽量减少所有降解非常重要。 疫苗产品中必须控制和监测影响或加速降解的因素。这些因素包括产品 pH 值、氧气水平和水活性（例如固态制剂），这些因素会导致水解和氧化。高温通常会加速所有途径的降解。某些缓冲液、离子强度和微量金属会影响产品的稳定性。最后，暴露于光线、冻融和暴露于剪切或搅拌会导致气-液或固-液界面发生转换，从而导致产品发生变化。 通过添加在制剂研究过程中确定的不同类型的稳定剂，可以确保产品的稳定性。最终的成分取决于产品的类型、降解风险和给药途径。稳定剂包括冷冻保护剂、除氧剂和蛋白质；例如明胶、PEG 和用于控制 pH 值的特定缓冲液。根据目前对降解的潜在机制的理解，可以确定特定稳定剂的具体类型和数量。 一旦确定了产品成分，就需要在整个生产和分发过程中进行环境控制。降低温度（无论是冷藏还是冷冻）都可以保护产品质量。由于可以通过减少水和氧气的存在来限制许多降解途径，因此可以通过冷冻干燥（冻干）或喷雾干燥并将惰性气体引入顶部空间来干燥产品。从历史上看，冻干一直是稳定疫苗产品的主要途径，与其它形式的干燥方法一样，对未来的疫苗产品也很重要。 表 4总结了疫苗产品的不同平台和所用形式类型以及长期储存条件。一些液体产品不能冷冻，否则会影响产品质量；这对于含有铝佐剂的疫苗产品尤其重要。冷冻条件可以保护原本以溶液/液体为基础的产品，但会导致复杂的生产和供应链挑战。干燥产品可以在更高的温度下储存，从而最大限度地降低质量风险，但除非最终剂型是固态，否则需要进行复溶步骤和/或生产稀释剂。 表4. 疫苗产品形式和储存条件。 干燥趋势 干燥疫苗产品包装在各种容器中，这决定了最终干燥产品加工所选择的操作。大多数干燥疫苗产品使用小瓶商业化，这增加了全球产能。灌装机非常快，可灵活适应不同尺寸的小瓶，并在全球范围内安装。此外，小瓶灌装设备可在几种液体产品之间共享，从而提高利用率，并为无菌灌装设施的高资本投资带来经济回报。冻干设备旨在优化玻璃小瓶中单剂量或多剂量单位的生产。然而，对于冻干产品，可能需要定制稀释剂，这会使灌装要求翻倍。对额外组件和二次生产操作的需求增加了成本。在患者给药时，两组材料会引入额外的步骤，并增加临床出错的风险。已经开发了双室产品选项，以方便复溶。虽然这些产品消除了临床中的给药步骤，但需要额外的生产步骤，在一个室中冻干并在第二个室中灌装稀释剂。 疫苗通常通过胃肠外途径给药，因此生产的最后阶段必须在无菌条件下进行。容器必须在线清洗和灭菌，或购买即用型容器（成本增加）。液体和冻干产品都需要灌装和封塞。待冻干的产品仅需部分封塞，然后无菌运输到冷冻柜中，在冷冻柜中进行冷冻、干燥、气体覆盖和完全封塞（图 7）。系统设计为允许从灌装线直接转移到冷冻柜，同时保持无菌条件。对于双室注射器，工艺差异需要专用设备。图 8说明了完成产品生产所需的操作。由于该设备专用于此类产品，因此利用率可能更难管理。双室产品的成本因组件数量、步骤数量以及设备容量减少而增加。 图7. 液体和冻干产品的加工操作。 图8..双室系统的工艺操作。 先进的产品干燥技术 干燥疫苗产品生产技术的进步必须包括上述新型疫苗形式的功能，同时注重提高生产率和改善质量保证。减少干燥操作的持续时间为提高生产率提供了重要的机会。干燥循环时间的主要限制是水分去除率，通常必须降低该值，以保持较低的产品温度，以防止“回熔”（melt-back）或“塌陷”（collapse）。塌陷是一种产品缺陷，产品饼的结构会丢失，会影响稳定性和产品活性。必须控制热量和质量传递，以确保最终产品质量。目前的冻干柜使用在搁板内流动的传热流体来冷冻产品并驱动汽化。对于冷冻和加热，能量必须通过玻璃瓶底部穿过搁板传递并到达产品的整个体积，这可能是低效的。由于壁、搁板之间和搁板上的瓶子位置的热量和质量传递差异，整个柜子不均匀，进一步导致效率低下。 传热方面的改进可以显著缩短循环时间。或者，水分压非常低的干燥环境可以驱动产品中水分的蒸发，而无需直接加热产品。连续生产系统通过提高设备利用率来提高生产率。此原理可应用于所有产品类型的干燥，包括小瓶和双室装置。其中一些技术允许原位干燥，而另一些技术则会生成干燥产品，必须将其以适当的剂量分装到容器中。批量干燥产品的生产为开发不限于典型小瓶的新型形式提供了机会，并且稳定性更高。利用现有原理和小瓶灌装能力的小瓶产品连续冻干方法是最容易实施的。 喷雾干燥可产生球形颗粒的干粉产品，是许多先进干燥工艺的重点。对于批量干燥技术，灌装到单位剂量容器中需要进行粉末灌装，这对于无定形粉末来说可能具有挑战性。除了提高喷雾干燥产品的流动性之外，还降低了产生细颗粒和污染小瓶外部表面的风险。虽然无菌操作的顺序是相反的，但工艺步骤的数量保持不变（图 9）。 图9.传统冻干技术与批量干燥工艺的比较。 任何工艺改进都必须满足无菌要求，以提供适当的产品质量。设备必须经过灭菌并在高度受控的环境中运行，以保持最高水平的无菌保证；目前新的趋势包括尽可能实施封闭系统。所有输入都必须在使用时通过除菌过滤进行灭菌，或以预灭菌材料的形式进行无菌引入。房间分类是根据设备设计和所需的干预措施确定的。 原位干燥工艺替代方案 目前，商业产品最常见的方法是在最终容器（例如小瓶和双室注射器）中进行原位干燥。人们已经研究了传统冻干工艺的所有步骤的改进。冷冻步骤对于形成适当的多孔宏观结构和增强蒸汽去除的传质至关重要。发展的重点是改善成核控制和增加干燥步骤的表面积。通过关注能量输送可以改进初级和二级干燥步骤，在当前的冻干柜中，能量输送受到通过搁板到玻璃小瓶的热量传递、以驱动蒸发的限制。连续处理可以提高生产率和一致性。 泡沫干燥 泡沫干燥不需要冷冻，而是利用干燥过程中的蒸发冷却来维持产品温度。形成的气泡提供了膜状表面和高干燥表面积；工艺开发的重点是控制气泡的大小和膜的厚度，以确保快速高效的干燥过程。泡沫干燥技术已被证明可用于保存疫苗以及生物制药、微生物样本和农产品。 微波真空干燥（MVD） 微波能量可用于替代搁架中的加热流体，应用于传统的冻干柜中，可以继续使用现有设备。微波场中快速循环的水分子会导致分子水平或接近分子水平的加热和水的蒸发，而不会显著加热敏感产品。此外，能量会立即穿透整个系统，而不会产生传统冻干中观察到的局部热量和质量传递效应。微波场的频率控制为在单个产品工艺开发过程中优化系统提供了一种工具。 MVD 技术已被证明可用于疫苗和其它生物制药。Bhambhani 等人使用 EnWave 中试规模系统研究了 MVD，其中产品在小瓶中离线冷冻并转移到 FreezeREV® 干燥机（图 10a）。升华是由于干燥室中产生微波的磁控管提供的能量而发生的。干冰冷凝器用于冷凝水蒸气，并塞住产品小瓶。MVD 的循环时间比冻干短 87%。早期中试规模研究的结果显示，水分含量和活性与传统冻干法相当。 图10. 替代干燥工艺。（a）EnWave FreezeREV 中试规模系统示意图。（b）小瓶产品的连续冻干。WIPO PCT 专利号 WO 2018/204484 A1。（c）层流 PACE 系统。（d）IMA Life Lynfinity 连续喷雾冷冻干燥机。 连续处理 图10b显示了 Pisano 及其同事提出的连续原位干燥工艺。小瓶通过模块移动，每个步骤之间都需要专门设计的转移模块来保持适当的压力、温度和气体成分。该系统的设计旨在利用传统和熟悉的工艺操作快速连续地生产干燥产品。将每个小瓶移动到冻干阶段的操作非常复杂，因此人们将重点放在生产批量干粉上。 批量干燥工艺替代方案 虽然通常需要混合和研磨才能达到小分子或干粉可吸入产品的目标粒径，但这些额外的步骤对于注射剂来说并不常见。赋形剂被加入喷雾干燥机进料中，材料可以直接转移以进行粉末灌装。 如图 9所示，与原位干燥工艺相比，批量干燥工艺颠倒了灌装和干燥的顺序。这需要完全无菌的粉末或颗粒灌装能力（“干灌装”）。粉末灌装已经存在了一段时间，用于灌装无菌抗生素粉末，尽管具有挑战性，但该工艺是通过提高喷雾干燥材料的流动性来实现的。也可以使用各种粉末灌装设备来灌装颗粒。批量干燥的一个优点是，批量无菌粉末或颗粒可以灌装到几乎任何类型的容器中，包括传统的小瓶和双室注射器，以及不适合原位干燥的新型复溶注射系统。使用批量干燥和干粉灌装可以大大降低生产双室注射器的成本。已经开发了几种其它方法来解决干粉灌装的问题和挑战。 喷雾干燥 现在可以使用无菌喷雾干燥技术，并允许连续干燥和粉末生产。一个例子是 Aseptic SD™ 系统。在喷雾干燥中，含有产品的液体溶液流过喷嘴，将产品分散成细小颗粒。喷雾干燥的优点之一是能够通过调节喷嘴来控制粒度。必须提供无菌气体作为产品干燥的传热介质；可以使用惰性气体（例如 N2或 Ar）来限制氧化降解。在传统的喷雾干燥模式下，热气流过系统以驱动蒸发。气体温度可高达 120°C，这可能会导致敏感生物产品的降解。但是，系统中会迅速发生蒸发冷却以降低产品温度，并且受热时间非常短。这些系统已成功应用于生物生产。 另一种系统使用网状雾化器在干氮层流中形成球形液滴（图 10c）。此外，沿膜逆流提供干氮，以去除气体中的水分。该系统在环境温度下运行，以限制敏感产品受到的热应力。该技术的概念验证已在 mRNA-LNP 产品中得到证实，在保持包封效率、粒度和分布以及体外和体内 mRNA 活性方面取得了优异的效果。 喷雾冷冻干燥 喷雾冷冻干燥也称为“批量冷冻干燥”的一种形式，其需要在装有冷气的塔中对液滴进行冷冻，然后在干燥室中真空升华。目前，该领域有两个主要竞争对手，并已成为最近多篇评论的主题。第一种技术基于在塔中进行液滴冷冻，然后在独特的旋转滚筒中对冷冻颗粒进行真空干燥。该技术已成功扩大规模，产品收率高达 97%。第二种技术是连续喷雾冷冻干燥机，如图 10d所示。液滴从喷嘴产生，并在滴过液氮冷却柱时被冷冻，从而形成小直径的球形颗粒。冷冻球通过传送带在不同的压力和温度下移动，以获得低水分产品。最终产品直接装入适当的容器中，容器以无菌方式密封，用作粉末灌装系统的进料。 疫苗表征研究的进展 最近推出的新型疫苗技术平台（即mRNA和病毒载体疫苗）促进了分析技术的快速发展，以支持疫苗开发和质量分析。 生物物理和分析技术 现有生物物理和分析技术的分辨率和灵敏度不断创新性地提高，使得疫苗（包括灭活或减毒病毒、重组蛋白亚单位和 VLP 以及多糖结合物）的纯度和异质性表征更加严格。这些进步提高了疫苗关键质量属性(CQA) 定量评估的可靠性，提高了批次放行的可信度。 此前已综述了质谱 (MS) 在疫苗开发中的应用，并列举了重组蛋白抗原和糖结合物的具体应用实例。毛细管电泳 (CE) 结合飞行时间 (TOF)-MS 已用于表征结核分枝杆菌抗原及其糖结合物。电荷检测质谱 (CDMS) 可同时检测质量/电荷和电荷，已用于量化多种疫苗类别和多价疫苗的纯度和异质性。 mRNA 疫苗技术的巨大成功促使了分辨率和灵敏度的提高，以及毛细管凝胶电泳 (CGE) 和离子对 RP-HPLC (IP-RP-HPLC) 等分析方法的创新应用，以评估疫苗构建体的完整性和异质性。此外，以足够的分辨率分析多价疫苗变得更加可行。采用 IP-RP-HPLC 和 MS 组合来检测和表征 mRNA COVID-19 疫苗的 mRNA-LNP 制剂中脂质片段与 mRNA 核苷的加合物。研究表明，这些加合物的形成会降低疫苗效力，而储存时间和温度与此有关。 dsRNA 是 mRNA 产品中的反应原性杂质，其含量必须尽可能接近于零。虽然有分析和免疫化学检测方法，但提高灵敏度和通量将有助于工艺和产品监控。为此，开发了一种采用微流控技术的 CE 方法，该方法利用ssRNA 和dsRNA 两种不同荧光团的差异荧光强度。 动态和多角度光散射 (DLS 和 MALS) 技术的分辨率和数据分析能力不断提高，可以精确分析蛋白质抗原、病毒和病毒载体以及 LNP 的尺寸异质性和聚集性。mRNA-LNP 的尺寸分类使研究人员能够确定疫苗制剂体内免疫原性的粒径依赖性。一项最近的创新是基于光散射的质谱光度法技术，可以确定单个粒子的大小，从而确定粒子集合中的异质性。该技术已用于研究 SARS-CoV-2 刺突蛋白与 ACE2 受体之间的相互作用。 新的单粒子检测方法可以观察溶液中的配制疫苗产品（如 mRNA-LNP），并提供动态视图（而非静态电子显微镜 (EM) 图像）。溶液中单粒子成像的一项最新创新是凸透镜诱导限制或 CLIC。CLIC 是一种很有前途的技术，用于可视化和定量分析 mRNA-LNP 结构、大小和 mRNA 候选疫苗中 mRNA 负载的异质性。与传统的平均集合测量相比，光散射技术的同步进步使得单粒子尺寸分析成为可能。分辨率的提高以及基于模拟和机器学习 (ML) 的数据分析技术发挥了关键作用。 最近开发的可调电阻脉冲传感器(TRPS) 方法正用于生物纳米颗粒（如 LNP）的单颗粒分析，包括尺寸分布和 zeta 电位。通过测试不同大小的 mRNA-LNP 的体内免疫原性，已经证明了更高精度的尺寸分级的影响。与较大的（100-140 nm）mRNA-LNP 相比，较小的（<80 nm）mRNA-LNP 在小鼠中似乎引起的免疫原性较低，尽管其对人类免疫原性的影响尚不清楚。虽然 SEC-MALS 已成为一种成熟的技术，但场流分馏 (FFF)-MALS 提供了基于尺寸分离的优势，而无需与固体基质相互作用。该技术用于关联基于亚单位融合蛋白的呼吸道合胞病毒 (RSV) 候选疫苗和含有封装 mRNA 的 LNP 的聚集依赖性效力变化。 BioSAXS 是最近推出的技术，是小角度 X 射线散射 (SAXS) 和 SEC-HPLC 的组合。与 DLS 类似，SAXS 是一种溶液散射技术，用于对蛋白质和蛋白质复合物进行低分辨率结构表征和建模。BioSAXS 已用于确定 sa-mRNA 疫苗 (IMP-1) 的回转半径，与 DLS 确定的流体动力学半径高度一致。 冷冻电子显微镜分辨率的显著提高使得人们能够可视化充满 mRNA 的 LNP，并确定每个纳米颗粒携带的 mRNA 构建体的数量。这些测量揭示了 mRNA 载入到 LNP 中的异质性，以及给定群体中存在空的 LNP。此外，在一些 mRNA-LNP 颗粒中，观察到 mRNA 形成与脂质分离的泡状结构。高分辨率冷冻电子显微镜还被用于确定野生型和突变型 S 蛋白三聚体的结构，以支持亚单位 COVID-19 疫苗的开发。 无标记检测技术创新促进了疫苗开发的多个方面，从抗原选择到 DS 和制剂 DP 的功能表征。例如，生物层干涉法 (BLI) 比表面等离子体共振 (SPR) 具有更多优势，尽管这两种技术都可以实时测量大分子和配体之间的结合和解离动力学。BLI 用于评估 SARS-CoV-2 S 蛋白 RBD 三聚体与 ACE2 受体和中和人单克隆抗体的结合动力学和亲和力。 免疫分析 除了继续使用流行的酶联免疫吸附试验(ELISA) 技术外，还开发了一些其它技术，旨在提高检测灵敏度、精度、速度和通量。这些平台的例子包括AlphaLisa、VaxArray 和 Luminex，它们提供了相对容易的多路复用。据报道，对 ELISA 和 Luminex 免疫分析法在检测和定量 SARS-CoV-2 抗体方面进行了全面比较。多路复用的 VaxArray 已用于表征麻疹和风疹疫苗以及流感疫苗。VaxArray 最近已被用于同时快速检测和量化肺炎球菌疫苗中常见的 23 种多糖血清型。在基于抗原抗体的免疫分析法的创新变体中，VaxArray 已被用于识别和表征使用互补寡核苷酸作为捕获试剂的 mRNA 构建体。AlphaLisa 是一种基于化学发光的高通量免疫分析法，已用于检测SARS-CoV-2 核衣壳蛋白。这些免疫分析法可用于细胞培养，例如，用于评估用 mRNA 疫苗转染细胞后的蛋白质表达。由于 mRNA、pDNA 和病毒载体携带的转基因的疫苗功能取决于编码蛋白质抗原的细胞内表达，因此免疫分析也为这些类别的疫苗提供了有价值的定量表征。 上述较新的免疫分析技术越来越多地被用作检测病毒抗原诱导的血清抗体的诊断工具。它们还提供了一个平台，用于比较感染和未感染人群中预防性疫苗引起的免疫反应水平。与高量子产率荧光团结合的抗体有助于在基于细胞的检测（如流式细胞术）中灵敏地检测和可视化这些功能事件，流式细胞术利用激光诱导光散射和荧光检测的组合。荧光显微镜的进步也使得可视化 mRNA 序列翻译成其相应的蛋白质成为可能。 测序和 PCR 技术 过去十年，测序技术的进步在多个方面对疫苗质量检测产生了重大影响。新一代测序 (NGS) 的准确性明显高于Sanger测序，这使得 NGS 成为检测核酸疫苗身份和遗传稳定性的宝贵工具。NGS 被用作一种获批的 COVID-19 mRNA 疫苗的批签发身份检测。 疫苗批次放行的一项监管要求是不得含有外来病毒，但挑战在于这些病毒可能是未知的或新出现的。外来病毒的主要来源是生产中使用的细胞底物，包括哺乳动物、昆虫和细菌细胞系。应证明主细胞库和工作细胞库 (MCB、WCB) 不含此类外来病毒因子 (AVA)。从历史上看，体内（在5种动物中）和基于细胞的体外感染性测试已被使用和接受，以确保疫苗中的病毒安全性。然而，在过去十年中，用 NGS 取代体内测试的势头强劲。其中许多举措是由欧洲和美国的监管机构以及世卫组织与生物制药行业和专家顾问合作推动的。NGS 病毒检测灵敏度和广度的最新进展、生物信息学和参考数据库的改进、COVID-19 大流行凸显的快速放行疫苗批次的需求以及减少使用动物的努力共同推动了这一进展。世卫组织和美国食品药品监督管理局分别发布了用于验证 NGS 的参考标准病毒和稳定细胞系的推荐清单。 在过去十年中，在用 NGS 替代猴神经毒力测试方面取得了重大进展，该测试是减毒口服脊髓灰质炎病毒疫苗生产过程中所需的安全测试，也是针对脊髓灰质炎以外可能表现出神经毒力的病毒的测试。另一种体外方法，即通过 PCR 和限制性酶切 (MAPREC) 进行的突变分析，能够检测和量化主要导致神经毒力的回复突变体的频率。NGS 与 MAPREC 的比较分析产生了相同的结果。然而，NGS 的全基因组测序和低频突变检测能力使其成为确保 LAV 疫苗生产中病毒安全性和一致性的更具吸引力的工具。据报道，NGS 已验证为新型 2 型口服脊髓灰质炎疫苗的批签发安全测试。除了成本和时间优势外，NGS 还可以取代基于动物的传统测试，具有明显的伦理优势。 液滴数字 PCR（ddPCR）的引入是过去十年中 PCR 技术的一项非常重要的进步。ddPCR 是一种高通量定量方法，可用于准确确定 DNA 和 RNA 病毒和疫苗的基因组拷贝数。ddPCR 检测的另一个优点是不需要标准曲线或参考标准进行定量。该技术有望广泛应用于不同类别疫苗的身份和遗传稳定性测试，包括 pDNA、mRNA、病毒载体和 LAV疫苗。ddPCR 已被验证可用于在减毒活裂谷热（一种 RNA 病毒）疫苗的开发中定量 RNA 拷贝数并检测回复突变体。 虽然分析表征技术的进步已导致疫苗抗原的高纯度和结构完整性，但宿主依赖性生物因素往往使得难以预测所需的免疫反应是否会在体内引发。尽管如此，高分辨率结构分析，辅以免疫分析和突变扫描，已被用于识别对产生病毒中和抗体至关重要的抗原位点。当疫苗效力的主要机制是细胞介导免疫 (CMI) 时，这种相关性更具挑战性。然而，最近有报道称使用 MS 辅助识别 HLA 呈递的 T 细胞表位并设计CMI 引发的 mRNA 疫苗。 分析放行检测 分析方法是疫苗的关键基础，需要持续监测和更新，以提供最佳信息来指导这些产品的开发和生产。分析质量源于设计 (QbD) 概述了开发稳健分析方法的途径。分析 QbD 中编纂的概念基于指导文件，包括 ICH Q14，该文件描述了开发和生命周期维护稳健方法的增强方法。将这些指导文件中概述的方法应用于传统方法可以带来显著的收益，但将它们应用于旧技术时存在固有的局限性。 SARS-CoV-2 疫苗的开发和商业化速度对于未来的疫情应对来说是令人鼓舞的，但必须采取更多措施来缩短所有新型预防性疫苗的开发时间。疫苗生产过程难以控制，最终产品难以进行简单的定义和表征。投资新兴分析技术将有助于项目尽早生成关键信息，以避免在临床开发的后期阶段停滞不前，并将带来更好的产品和过程理解。开发和建立使用新技术的先例很重要，这将最大限度地降低风险并允许其广泛采用。在分析 QbD 方案中，在分析目标概况 (ATP) 的开发过程中，应认真考虑引入新技术。下面讨论独立于产品方法和特定于产品方法的分析技术的部分进展。 与产品无关的方法 疫苗制剂的安全性测试包括微生物学测试，例如无菌、生物负载、内毒素、支原体和外来因子测试；其中许多方法由药典当局详细描述。这些方法的优点是已经得到充分建立和理解，但可能非常费力且耗时，此外还引发了对使用动物的伦理担忧。最近的指导意见鼓励考虑替代传统方法。FDA 表示，“如果申请方提供有关测试特异性、敏感性和稳健性的充分信息，则 IND 下可以接受与 USP、FDA 指南或联邦法规(CFR) 中概述不同的分析程序。”同样，附件 1 指出，“生产商应考虑采用合适的替代监测系统（例如快速方法），以加快检测微生物污染问题并降低产品风险。” 新的快速微生物学方法的采用正在获得发展势头，部分原因是对 COVID-19 大流行的响应，以及对细胞和基因治疗产品的需求，其中许多产品的保质期很短。众所周知，传统的、基于生长的无菌评估方法由于样本量和生长条件而存在局限性。BacT/Alert 3D 系统已加入药典 14 天生长无菌测试，作为经过验证的无菌方法；其它测试（一些基于生长，一些则不是）正处于不同的开发阶段。基于 PCR 和 ELISA 的检测方法现在被广泛用于检测支原体，基于 NGS 的方法也正在开发中。 外来因子检测需要能够检测出各种可能污染物的方法。人们正在探索诸如激光力细胞学等新技术，以识别细胞病变效应并改进传统的、基于细胞的检测方法。NGS 技术不仅在检测微生物污染物方面具有重大前景，而且还有望取代目前用于检测 AVA 的体内、体外和 PCR 测试。 特定于产品的方法 除了药典放行检测外，疫苗还需要检测特定于所开发疫苗的 CQA，例如身份、强度、纯度和效力。传统上用于检测这些属性的方法存在局限性，而新兴技术在许多情况下可以缓解这些局限性。 疫苗效力分析方法种类繁多，以满足人们的期望，即它们将提供有关患者所需免疫反应的信息。体内效力分析充满了基于动物的分析所固有的变异性、不可重复性和较长的周转时间。出于这个原因，以及出于对动物福利和成本的考虑，体外分析的开发已成为疫苗表征和批签发的核心。了解疫苗的作用机制 (MOA) 仍然是开发最相关效力分析的关键，但开发科学家可用的工具比以往任何时候都多。在不了解保护性免疫反应的确切性质的情况下，新技术正在提供有关疫苗基本作用方式的更丰富、更精确的信息。在某些情况下，抗原与佐剂相互作用以产生所需的免疫反应仍然无法通过当前的方法和知识进行评估。 几十年来，噬斑分析一直是活病毒疫苗的病毒学主力方法，但近年来的科学技术进步可以用来增强和/或替代病毒定量方法，如传统噬斑和 TCID50 方法。荧光成像技术分辨率和定量准确性的提高促使自动病灶计数取代传统检测方法。细胞单层中斑块或细胞病变效应 (CPE) 的目视识别可以被 PCR、激光力细胞学和细胞电阻抗等替代。在佐剂的存在抑制这些技术的使用的情况下，微生理系统显示出作为将疫苗效力与体内功效关联起来的模型系统的前景。使用这些系统还可以提供一种评估旧疫苗和工艺变化的影响的方法，而无需使用临床前动物模型或临床试验。 蛋白质亚单位和 VLP 疫苗通常依靠抗原性分析来确定体外效力。与标准 ELISA 方法相比，基于 AlphaLisa、荧光能量转移 (FRET)、Luminex 和电化学发光等技术的分析在速度、灵敏度、动态范围、数据密度和多路复用能力方面具有优势。除了基于蛋白质的疫苗外，免疫分析还用于采用较新技术开发的疫苗，例如最终抗原是蛋白质的 mRNA。例子包括人类狂犬病疫苗，已为其开发了基于囊膜糖蛋白的 ELISA 和时间分辨免疫荧光，以及全细胞百日咳疫苗 ELISA，后者已被证明是目前使用的体内 Kendrick 测试的有希望的替代品。流式细胞术（可能使用荧光标记的抗刺突蛋白抗体）被用于对首个获批的 COVID-19 mRNA 疫苗进行效力分析。 在缺乏用于效力测量的特异性免疫分析法的情况下，可以开发与效力相关的结构和功能分析法作为替代方法。世卫组织生物标准化专家委员会于 2021 年分布的一份报告作为 mRNA 疫苗开发的指南，表明了监管部门对这一概念的开放态度。事实上，这种替代分析法已被接受用于表征双价 mRNA COVID-19 疫苗的疫苗效力。 作为纯度和完整性分析旧技术的进步的一个例子，CE 已发展成为 SDS-PAGE 和免疫印迹技术的更好替代方案，大大改善了工艺和产品理解。同样，MS 有望改进传统的、基于 ELISA 的 HCP 检测方法。 SARS-CoV-2 疫苗的开发和放行测试为未来的大流行疫苗铺平了道路，也提供了有望缩短预防疫苗开发时间的方法。 过程监控分析 最近的 COVID-19 疫情凸显了实时或快速放行疫苗批次的必要性，以最大限度地减少可预防的死亡和疾病。此外，如果在 DS 或 DP 的 GMP 生产结束时一批疫苗未能满足放行规范，则代价可能极其高昂。因此，通过入线或近线测试监控每一步工艺对于确保最终产品的高质量和快速放行非常重要。每种正在开发的新疫苗通常都有明确的目标产品质量概况 (QTPP)。已经描述了通过优化生物工艺以达到目标 QTPP 的概念，并支持 mRNA DS 工艺的分析数据。这一基本原则与在所有平台上为所有生物制药开发工艺实施QbD 原则相关。 应监测生产工艺步骤，以保留效力所需的抗原表位。在存在细胞底物的情况下测量效力的能力的提高在许多情况下使这成为可能，从而避免了工艺故障并实现了优化。例如，通过“流式病毒分析法”在线监测有缺陷的病毒颗粒，结合基于激光力细胞学的效力测量，已用于改进 LAV 疫苗生产工艺。结合电容工具和高内涵成像来实时监测细胞密度和峰值感染，这些过程分析技术 (PAT) 工具可以共同为 LAV 疫苗提供效力分析替代品。 最近，有文章回顾了将 PAT 整合到生物过程中的好处。拉曼、核磁共振 (NMR)、近红外和中红外 (IR) 光谱以及 DLS 越来越多地被用作 PAT 工具，因为这些生物物理测量提供了与功能相关的结构信息。NMR 光谱对于在针对肺炎链球菌的疫苗抗原的纯化工艺开发中优化荚膜多糖的质量非常有价值。NMR已被用于在开发针对流感嗜血杆菌和脑膜炎球菌 A 亚群的结合疫苗的过程中监测多糖的三级结构。 多年来，DLS 和其它光散射技术已用于监测亚单位和 VLP 疫苗的聚集和多分散性，并优化纯化和制剂条件，以防止聚集引起的效力丧失。最近，DLS已用于为 mRNA-LNP 疫苗选择相对单分散的最佳大小的LNP 群体。这些信息有助于在 mRNA DP 工艺的开发中控制微流控混合参数，尤其是流速。随着 QbD 驱动的 mRNA DS 和DP 连续生产工艺的进一步开发和优化，PAT 将继续发挥重要作用。 原文：B.Buckland, G.Sanyal, T.Ranheiim, et al., Vaccine process technology—A decade of progress. Biotechnology and Bioendineering, 2024. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

中文摘要 重组病毒载体疫苗是以病毒为载体递送目的抗原的一种疫苗。病毒载体技术路线早期多用于动物疫苗和难以用传统技术路线开发的病原体疫苗。我国针对新型冠状病毒感染疫苗研发布局的5条技术路线中，因重组病毒载体疫苗具备可同时产生较强的体液和细胞免疫、可通过黏膜途径接种以及1剂完成免疫程序等优势而获批上市，并在疫情防控中起到了重要作用。但重组病毒载体疫苗因预存免疫问题，即存在可能降低疫苗保护效力、为增强免疫原性可能导致安全性风险提升等因素，故上市的重组病毒载体疫苗产品较少。随着基因工程技术、分子生物学技术的发展，病毒载体种类日渐增多，并在多种疫苗中得到应用。此文就重组病毒载体疫苗的研发现状进行综述。 正文 重组病毒载体疫苗是将编码有效抗原的特定基因插入病毒载体并表达而获得的疫苗，可诱导体液及细胞免疫，病毒基因组稳定，无需佐剂即可诱导高免疫原性和持久免疫应答等，但存在预存免疫问题，当前研究主要通过人类稀有或灵长类动物腺病毒（adenovirus，Ad）来替代高流行性病毒载体、增加接种剂量等，来一定程度上克服预存免疫、加强免疫原性。病毒载体根据复制能力可分为2种，复制型病毒载体和复制缺陷型病毒载体。病毒载体疫苗平台是快速有效应对新突发传染病的途径之一，目前主要使用的病毒载体有Ad、痘苗病毒（vaccinia virus，VV）、疱疹病毒、水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、流感病毒等。本文就各种用于预防或治疗不同疾病的病毒载体疫苗研究新进展进行综述。 1 病毒载体 1.1 双链DNA病毒 1.1.1　Ad载体　Ad直径70～90 nm，基因组约36 kb，在自然界广泛分布，人类Ad已有52种。Ad基因组包含早期表达的与病毒复制相关的E1—E4基因，第1代Ad载体剔除了E1和E3基因，缺失复制能力；第2代在第1代基础上删除E4基因，突变E2基因，降低了在293细胞中培养时产生复制型Ad的能力，虽提高了安全性，但降低了免疫原性；第3代为去除了所有编码蛋白质序列的空壳病毒，极大增加了载体容量，增加了安全性，也进一步降低了免疫原性，未规避预存免疫，病毒包装过程还需依靠辅助病毒和互补细胞系。重组Ad载体是非常有前景的载体之一，目前研究较多的有人5型Ad（Ad5）、26型Ad（Ad26）以及黑猩猩Ad（chimpanzee Ad，ChAd） 3型（ChAd3）等，用于已上市COVID-19疫苗、埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）疫苗等，以及临床研究阶段的呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）疫苗等。 1.1.2　VV载体　VV是一类体积大、结构复杂的病毒。病毒颗粒约为360 nm×270 nm×250 nm，基因组140～220 kb。VV宿主范围较广，作为载体可容纳大片段外源基因而不影响其生长特性。在开发靶向蛋白较大的疫苗时具有优势。如天花疫苗使用改良型VV安卡拉毒株（modified VV ankara，MVA），与天花病毒存在交叉抗原，能够表达有效抗原并诱导机体产生体液和细胞免疫，且安全性较好。VV载体被用于研究多种传染病预防，如EBOV疫苗、猴痘疫苗、流感疫苗等。 1.1.3　疱疹病毒载体　疱疹病毒的种类很多，共发现有100余种，人疱疹病毒直径120~150 nm，基因组120~150 kb，被开发为病毒载体的有单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）、火鸡疱疹病毒、猪伪狂犬疱疹病毒等。疱疹病毒作为载体，可携带多个或较大基因，容纳外源基因能力强。其中，HSV能够感染多种细胞并快速增殖，利用这一特性改造的HSV基因工程载体可以用于基因和神经系统疾病治疗。2015年，FDA批准了第1个基于HSV-1的溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）药物，该药物通过基因工程技术删除HSV-1基因组中的感染细胞蛋白（infected cells protein，ICP）34.5和ICP47基因，并将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ，GM-CSF）插入ICP34.5位点，用于治疗黑色素瘤。HSV作为OV载体的研究热点，可发挥原位肿瘤疫苗功能，激活抗肿瘤免疫，多应用于肿瘤治疗。HSV-1和HSV-2作为载体均已被开发成OV候选药物，并且已进入临床试验阶段。 1.2 单链RNA病毒 1.2.1　仙台病毒（Sendai virus，SeV）载体 　SeV又称乙型副流感病毒Ⅰ型，直径150~200 nm，基因组长约15 kb，是典型的人畜共患病毒。基于SeV载体的OV药物因潜在的癌症治疗作用而受到关注。SeV载体具有宿主范围广、表达量高、胞质表达、安全性好等优点，作为利用反向遗传学构建的新兴RNA病毒载体，SeV载体目前广泛用于基因治疗药物和新型疫苗研究。日本DNAVEC公司开发的用于治疗下肢缺血的SeV-hFGF2/dF，是国际上首个获批临床研究的SeV载体基因治疗药物。此外，应用SeV载体开发的HIV、HSV疫苗等处于临床前研究阶段。 1.2.2　麻疹病毒（measles virus，MV）载体　MV直径100～250 nm，基因组长约15 kb，可导致儿童急性呼吸道疾病。目前我国麻疹发病有低龄化趋势，且易伴有并发症。作为病毒载体，MV具有可容纳6 kb的外源序列并稳定表达、同时诱导产生显著的细胞和体液免疫应答、仅在胞浆中复制不会整合到宿主基因组等优点。通过将与目标病毒感染、复制或逃逸有关的蛋白基因插入MV反基因组载体中开发的HIV、寨卡病毒和基孔肯雅病毒的候选疫苗均已步入临床试验阶段。 1.2.3　VSV载体　VSV长度150～180 nm，直径50～70 nm，基因组约11 kb，通过昆虫叮咬和家畜传染，人感染后仅出现流感症状，但家畜感染后表现为口、蹄等水疱样病灶，肉、奶产量下降，造成畜牧业经济损失。VSV基因组能容纳多个外源基因；病毒复制多代次后性状保持稳定；不会整合到宿主细胞基因组；增殖滴度高，免疫原性好，不受宿主抗病毒载体免疫影响，可诱导较强的细胞免疫和体液免疫。基于VSV载体开发的EBOV疫苗已获FDA批准上市，保护率达到97.5%。 1.2.4　流感病毒载体　流感病毒通常呈球形颗粒，直径约100 nm，但新分离的毒株大多为丝状颗粒，长度能达到20 μm。人流感病毒分为甲、乙、丙型。通过反向遗传学技术，在流感病毒中插入外源基因构建流感病毒载体疫苗。流感病毒载体在人体内可引起体液、细胞及黏膜免疫，复制周期无DNA，不会整合到宿主细胞，还可通过更换亚型解决预存免疫问题。目前以流感病毒为载体开发的疫苗包括已进入Ⅲ期临床试验的COVID-19疫苗，以及早期研究阶段的HIV疫苗、RSV疫苗等。 1.2.5　新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）载体　NDV颗粒呈多形性，直径120~300 nm，长约15 kb。不同NDV株的毒力不同，多数NDV载体疫苗选择La Sota缓发型弱毒株。构建NDV载体疫苗首先利用反向操作技术获得感染性病毒克隆，随后进行分子遗传操作。重组NDV活病毒载体遗传性状比较稳定，毒株间不易发生重组；病毒复制在胞浆内完成，不产生DNA，不会整合到宿主细胞基因组。NDV弱毒株疫苗可同时诱导全身体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫，有较好的保护作用，已在临床试验中验证了其安全性，NDV已被应用于COVID-19疫苗的临床前开发等。 2 重组病毒载体疫苗 2.1 COVID-19疫苗 COVID-19可引起急性呼吸道传染病，目前已经上市的重组病毒载体COVID-19疫苗主要采用人或黑猩猩Ad载体，流感病毒载体等开发的COVID-19疫苗已进入临床试验阶段。 国内上市的COVID-19载体疫苗，采用人Ad5去除了E1和E3基因并导入新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）刺突蛋白基因，在感染细胞后可表达SARS-CoV-2 刺突蛋白，诱导体液和细胞免疫。但人Ad5在人群中流行率较高，可通过提高病毒滴度或者加大接种剂量来解决预存免疫。临床研究发现接种1剂COVID-19载体疫苗14 d后，重症保护率和总体保护率分别为96.0%、63.7%，安全性良好。英国牛津大学与阿斯利康公司合作开发了以ChAd为载体的疫苗AZD1222，在载体中导入COVID-19全长刺突蛋白，采用加大接种剂量的方式解决预存免疫问题。受试者接种2剂AZD1222，第2剂加强接种后至少14 d，疫苗总体保护率为70.4%。俄罗斯Gamaleya公司开发的Sputnik V COVID-19疫苗是一种基于重组Ad26和Ad5的组合载体疫苗，2个载体均可表达SARS-CoV-2刺突蛋白，分别使用2种重组载体进行初次、加强免疫，第1剂接种后21 d保护率达91.6%。由于人呼吸道中的抗体水平远低于外周血中，SARS-CoV-2在鼻腔感染和复制时就容易出现免疫逃逸，因此Chen等将改造双重减毒甲型流感病毒载体插入SARS-CoV-2受体结合域基因，开发了可经鼻腔喷雾接种的活病毒载体疫苗dNS1-RBD，该疫苗株可在上呼吸道有限复制，NS1基因缺失增强了流感病毒载体的安全性，且可诱导强效的抗病毒应答，在Ⅲ期临床试验中呈现出广谱保护率和安全性。 2.2 EBOV疫苗 EBOV是一种能够引起烈性传染病的病毒，有较强的传染性和最高达90%的病死率。基于重组病毒载体技术路线开发的EBOV疫苗众多，主要采用Ad、VV和VSV载体。 中国人民解放军军事科学研究院与天津康希诺生物股份公司开发的表达EBOV Zaire型（ZEBOV）囊膜糖蛋白（glycoprotein，GP）的Ad5-EBOV疫苗，可产生有效的细胞和体液免疫应答，于2017年在国内获批上市，增加Ad5-EBOV疫苗免疫剂量可在一定程度上克服载体预存免疫影响。Ewer等以灵长类动物ChAd3为载体来降低预存免疫，将Ad的GP基因替换成ZEBOV或EBOV Sudan型的GP基因，开发的复制缺陷型ChAd3- ZEBOV疫苗可诱导细胞免疫。在重组痘病毒载体的EBOV疫苗研发中，为提高有效抗原的表达量，减少预存免疫影响，免疫策略均为序贯免疫，即不同技术路线的疫苗按照一定时间间隔、剂次开展的接种，也称为异源疫苗接种。西安杨森制药有限公司采用2种EBOV疫苗Zabdeno（Ad26.ZEBOV）和Mvabea（MVA-BN-Filo）异源接种，临床研究表明，双剂量方案具有良好安全性，该方案于2020年获欧盟委员会批准上市。提高异源接种间隔时间，抗体有效浓度最高可保持1年。同源疫苗接种是指相同技术路线的疫苗按照一定时间间隔、剂次开展的接种，异源和同源Ad26、MVA载体EBOV疫苗方案都具有良好的耐受性，异源第2剂加强接种免疫后效果更好。美国默沙东公司Ervebo疫苗是在减毒VSV中插入EBOV表面抗原GP，保留了一定的复制能力，通过该病毒的轻度感染即可产生特异性抗体，该品于2019年获FDA批准上市。Grais等发现，Ervebo维持预防效果可达2年之久。以VSV为载体开发的重组VSV-ZEBOV疫苗在Ⅲ期临床试验中显示良好安全性，提高接种剂量可降低预存免疫、增加免疫原性。 2.3 HSV疫苗 HSV可引起人类多种疾病，如口唇部疱疹、腰腹部疱疹以及生殖系统疱疹等。在新生儿、严重营养不良和免疫功能低下者等人群中可引发危及生命的感染。从20世纪30年代开始，虽然尝试了灭活疫苗、蛋白质亚单位疫苗、减毒活疫苗和DNA疫苗等各种技术路线，但目前还没有获批上市的疫苗。 目前虽已发现HSV基因组的ICP34.5等基因表达的蛋白质会导致HSV的免疫逃逸并减弱细胞对HSV的清除，造成HSV基因组在感染细胞内持续存在，形成“潜伏”状态，但HSV影响潜伏的蛋白及其机制尚未被阐明。尽管已有将HSV改造成载体荷载免疫调节基因如GM-CSF的OV用于肿瘤的治疗，但用于健康人群的疾病预防仍具有潜在风险。因此，HSV疫苗的开发主要采用其保护性抗原，构建病毒载体、重组蛋白或者mRNA核酸疫苗等技术路线。 HSV蛋白GP〔如糖蛋白D（glycoprotein D，gD）〕、衣壳结构蛋白和披膜蛋白（如VP16）、非结构蛋白ICP27等能够诱导细胞免疫，可作为疫苗靶标的蛋白。由于HSV疫苗开发可能需要多蛋白协同发挥免疫效应，因此，多个外源基因的病毒载体SeV、Ad等成为目前开发HSV疫苗的选项。 以HSV阴性人群预防和阳性人群治疗为目标，Ren等采用复制缺陷型SeV，通过反向遗传学方法构建了2个重组病毒载体，1个编码HSV-2 gD（HSV-2-gD)，另1个编码HSV-2 ICP27，在动物实验中显示出良好的体液和细胞免疫应答。通过2种携带HSV-2抗原的复制缺陷型病毒载体疫苗加强免疫，可较好地克服预存免疫，产生较强的特异性免疫原性并能够有效地预防HSV-2引起的生殖器复发感染。通过Ad构建编码HSV-2-gD的重组载体疫苗，在动物实验中显示出良好的体液免疫应答，也可一定程度上抑制HSV-2感染复发时的症状。 2.4 RSV疫苗 RSV是导致呼吸系统疾病的主要病原体，可引发各年龄段人群的下呼吸道感染，更是导致婴幼儿病毒性呼吸道感染住院的首要因素。免疫力低下或患有慢性基础病的老年人感染RSV的风险高并极易导致原有基础病加重。目前开发RSV疫苗使用的病毒载体有Ad、流感病毒等。 Salisch等使用人群中低流行性的Ad26和Ad35载体开发的RSV疫苗，动物实验显示能够诱导有效的免疫应答。婴儿免疫系统未发育完全，老年人免疫系统弱，均需要免疫原性更强的疫苗。武汉博沃生物科技有限公司开发的RSV疫苗采用Ad5载体，以融合蛋白作为RSV疫苗的主要靶标，可避免其他技术路线RSV疫苗缺点，如减毒活疫苗的毒力返祖、灭活疫苗可能诱导的抗体依赖的疾病增强效应，该产品已进入中试样品制备阶段。Lee等将RSV 的融合蛋白262—276蛋白表位插入到流感病毒载体构建的疫苗，动物实验显示可诱导产生保护性中和抗体。 2.5 HPV疫苗 HPV感染症状表现为寻常疣、尖锐湿疣等，分低危、高危型。临床已证实高危型HPV感染是引起宫颈癌和癌前病变最重要因素。用于研发HPV重组载体疫苗的病毒载体有Ad、MV等。 以Berna商业疫苗株MV载体开发的预防性HPV疫苗，动物实验显示可诱导特异性抗体。Gupta等基于MV开发的HPV疫苗已进入Ⅱ期临床试验。浙江普康生物技术股份有限公司开发的HPV16重组Ad载体治疗性疫苗已进展至Ⅰ期临床试验。法国Transgene公司开发的TG4001是基于非复制型、高度减毒的重组牛痘病毒MVATG8042载体、含有HPV16抗原（E6、E7基因）的重组病毒载体疫苗，目前已进入Ⅱ期临床试验，其联合程序性死亡配体1抑制剂Avelumab治疗晚期HPV阳性肿瘤患者，试验结果表明二者联合使用安全，且在HPV 16阳性肿瘤患者中产生抗肿瘤活性。中国生物技术股份有限公司研发的疫苗以HSV-1 OV为载体，在构建载体具有溶瘤活性的同时，表达HPV E6、E7等多个蛋白的多个抗原表位，可诱导产生持久的细胞免疫应答。 2.6 流感疫苗 流感病毒是引起呼吸道疾病的主要病原体，临床一般表现为轻症，即急性起病、发热、头痛等，重症病例可出现病毒性肺炎、继发细菌性肺炎甚至休克。目前开发的重组病毒载体流感疫苗主要采用Ad和VV载体。流感病毒根据血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性分为不同的亚型，通过调整HA和NA的组合可解决预存免疫问题。 HA是流感病毒表面重要的糖蛋白，唐昕莹选择人群血清阳性率较低的灵长类动物来源的Ad载体，以HA为靶基因，插入多个流感病毒抗原表位制备的流感疫苗，通过加强免疫降低预存免疫，该品在动物实验中展现出有效的保护效果。口服疫苗可作用于黏膜免疫系统，美国Vaxart公司的口服Ad5载体H1N1疫苗VXA-A1.1在Ⅱ期临床试验中显示出有效保护率和安全性。美国Altimmune公司的Ad5载体鼻腔接种流感疫苗NasoVAX，在免疫原性最强的剂量下，可诱导体液、细胞和黏膜的广泛免疫应答，具有良好的免疫原性及安全性。韩頔等以Ad5为载体，构建了表达SARS-CoV-2 刺突蛋白和H3N2 HA的重组双价非复制型Ad5载体疫苗HAdV5-S1-2A-HA，该品在小鼠体内诱导对SARS-CoV-2和H3N2流感病毒感染的特异性体液与细胞免疫，为预防COVID-19和流感的双价疫苗研发提供了基础。将流感病毒A/Wisconsin/67/2005株的核蛋白和基质蛋白构建到MVA上获得的重组病毒载体疫苗MVA-NP+M1已进入Ⅱ期临床试验，该品可诱导良好的T细胞免疫应答。 3 展望 重组病毒载体疫苗是新型基因工程疫苗研究的热点，虽具有可诱导多种免疫、表达稳定等优点，但已上市产品仍较少，主要是预存免疫问题，包括单一病毒载体疫苗应用于多次免疫接种程序或人群中高流行性病毒（如Ad）产生的预存免疫；为降低预存免疫，采用多样化病毒载体疫苗序贯接种时，诱发非特异性免疫；载体中插入大容量外源基因时，可能存在构建效率低、脱靶、耗时长等问题。未来开发病毒载体疫苗要突破的关键技术包括：联合基因编辑和同源重组等新技术，构建多样化、可容纳大容量外源基因的DNA病毒载体；利用反向遗传学技术等，拯救重组病毒构建多样化RNA病毒载体；形成较为全面的安全、高效表达的病毒载体库；采用免疫组学等新型免疫评价技术，发现并鉴定更有效的免疫原及作用靶点，进一步降低预存免疫问题。建立病毒载体疫苗研发平台，可快速响应新突发传染病，开发应对多领域各类疾病的治疗性疫苗，对保障人民健康、促进生命科学技术发展具有十分重要的意义。 作者 邢思熙1,2  许方婧伟1,2  张云涛1,2 1中国生物技术股份有限公司科研管理部，北京  100024；2新突发传染病新型疫苗研发全国重点实验室，北京  100024 通信作者：张云涛， Email：zhangyuntao@sinopharm.com 引用本文：邢思熙, 许方婧伟, 张云涛. 重组病毒载体疫苗的研究新进展[J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(5): 318-324.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20231205-00021 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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在过去的十年中，疫苗发现和开发的新方法已经改变了这个领域。COVID-19大流行期间的进步使得每年能够生产数十亿剂疫苗，这些疫苗使用了信使RNA和病毒载体等新型平台。分析工具箱、设备和生物工艺技术的进步使得疫苗开发的速度和生产规模都达到了前所未有的水平。大分子结构-功能表征技术，结合改进的建模和数据分析，能够在单粒子分辨率下定量评估疫苗配方，并指导疫苗药物物质和药物产品的设计。这些进步在精确评估新型平台交付的疫苗的关键质量属性方面发挥了重要作用。无标记和免疫分析技术的创新有助于抗原位点的表征和稳健体外效力测定方法的开发。这些方法，连同诸如下一代测序的分子技术，将加速所有平台交付的疫苗的特性鉴定和释放。用于实时监测和优化过程步骤的过程分析技术使实施按设计质量原则和加快疫苗产品的释放成为可能。 在未来十年中，疫苗发现和开发领域将继续进步，汇集新技术、方法和平台，以改善人类健康。 1、引言  2012年，在《生物技术与生物工程》上发表了题为“疫苗工艺技术”的综述，重点关注了用于生产预防多种人类传染病疫苗的各种技术。在过去的十年中，该领域取得了巨大进步，部分原因是由于投入到开发安全有效COVID-19疫苗的资源大幅增加。这一密集努力的一个意外结果是新型疫苗平台的引入和优先考虑，特别是信使RNA（mRNA）和复制缺陷腺病毒，而非更传统的方法，如使用蛋白质抗原作为疫苗。 在过去的10年中，DNA和RNA疫苗取得了巨大进步，这些疫苗本身并不包含感兴趣的抗原，而是携带了宿主自身细胞产生抗原的指令。病毒载体和mRNA脂质纳米颗粒（LNP）疫苗就属于这一类。自2012年以来，已有10种新型病毒载体疫苗和2种mRNA-LNP疫苗获得批准（表1）。 自2012年综述以来，还批准了许多其他重要的疫苗。Fluelvax®，首个使用细胞培养技术生产的流感季节性疫苗，于2012年在美国推出（诺华，现为Seqiris）。Fluelvax工艺使用悬浮MDCK细胞培养作为病毒扩增的基质，而不是鸡蛋。该疫苗最初在2007年以OptaFlu的形式在欧洲获得批准。一年后，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Flublok®，这是一种使用杆状病毒表达系统生产的昆虫细胞重组流感疫苗（Protein Sciences Corporation，2017年被赛诺菲收购）。该疫苗在2016年从三价变为四价，并在2020年获得了欧洲药品管理局（EMA）的批准。Flublok®利用重组表达的血凝素（HA）蛋白，与选定的菌株完全匹配，避免了病毒适应鸡蛋或细胞培养导致抗原漂移的潜在问题。 2017年，FDA批准了GSK的带状疱疹（HZ，shingles）疫苗Shingrix，用于50岁及以上成人。该疫苗是在CHO细胞中生产的重组糖蛋白抗原，并冻干，另外还有一瓶AS01B佐剂液体悬浮液用于重组。疫苗悬浮液含有50微克的重组水痘-带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白E，通过两种佐剂增强了免疫原性：基于脂质体的AS01B佐剂系统含有50微克的3-O-去酰基-4'-单磷酸脂质A（MPL）和50微克的Quillaja saponaria Molina，分数21（Shingrix [产品说明书]，2023）。同样在2017年，Dynavax获得了FDA对其乙型肝炎疫苗Heplisav-B的批准，该疫苗含有新型的胞嘧啶磷鸟苷（CpG）1018®佐剂和重组蛋白亚单位抗原。该产品在2019年在欧洲获得批准。CpG 1018®佐剂是一种修饰的骨架寡核苷酸，模仿细菌和病毒DNA以刺激先天免疫系统。2019年，FDA批准了JYNNEOS®（Bavarian Nordic A/S），这是一种天花和猴痘疫苗，适用于18岁及以上被认为有感染高风险的成年人。JYNNEOS®是一种由MVA-BN株生产的活疫苗，是一种减毒、非复制性正痘病毒。MVA-BN在无血清介质中悬浮生长在初级CEF细胞中，不含有直接动物来源的物质，然后收获、纯化和通过几个切向流过滤（TFF）步骤浓缩，包括苯佐酶消化。为了增加疫苗供应，在2022年8月，FDA针对JYNNEOS®发布了紧急使用授权（EUA），用于18岁以下个体的皮下（s.c.）给药（0.5 mL）和18岁及以上个体的皮内（i.d.）给药（0.1 mL）。 2020年，世界卫生组织（WHO）发布了nOPV2的紧急使用清单（EUL），作为全球脊髓灰质炎根除战略的一部分。该疫苗使用改良的Sabin株（nOPV2株S2/cre5/S15domV/rec1/hifi3）的活减毒脊髓灰质炎病毒2型，在非洲绿猴肾来源的Vero细胞中制备。为了减少疫苗衍生脊髓灰质炎的发生率，该疫苗具有增加的遗传稳定性和降低的重组率，这是通过在父母基因组上进行五处修改实现的，这些修改影响了V域、cre元素和RNA依赖性RNA聚合酶（Polio Global Eradication Initiative, 2021）。同样在2020年，WHO对首个Sabin灭活脊髓灰质炎疫苗（sIPV，注射，LG Chem）进行了预认证（World Health Organization, 2020a）。该疫苗是在微载体上使用Vero细胞生产的，生产过程中不使用野生型病毒，降低了回复突变的风险。此外，细胞生长介质从含血清介质变为无动物成分介质（ACF），在病毒灭活前增加了超滤步骤，并使用了重组胰蛋白酶。最近，在2022年9月13日，美国加入了符合WHO标准的30个国家之列，这些国家有循环疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（cVDPV）。 COVID-19大流行开始后不久的2020年初，全球超过200个疫苗候选产品中的首个进入了临床试验（McGill University Interdisciplinary Initiative in Infection and Immunity [MI4], 2022）。到那一年的12月，监管机构开始授予首个紧急使用授权（EUA）。到2023年3月，已经接种了超过130亿剂COVID-19疫苗。据估计，仅在2021年，就有超过1400万人因新疫苗而获救。许多因素促成了疫苗开发的加速，包括对新方式（mRNA和复制缺陷腺病毒）的预先投资以及政府对临床研究的大规模资助。大约40%的剂量是之前建立的全病毒灭活类型，其余的剂量平均分配在两种类型之间：mRNA-LNPs和腺病毒载体（表2）。 从化学、制造和控制（CMC）的角度来看，疫苗制造和分析也取得了显著进步，以应对大流行，缩短了从证明有效性到广泛提供疫苗剂量的时间线——支持生产规模从每年数百万剂增加到数十亿剂。 在这篇综述中，我们描述了在过去10年中取得的技术进步，这些进步使得开发和生产用于预防多种人类传染病的新型疫苗成为可能。其中一些进步，特别是mRNA和病毒载体递送方面的进展，也适用于治疗性癌症疫苗的新兴领域。本综述的范围涵盖了整个疫苗制造过程，从细胞培养和无细胞系统到配方、纯化、稳定性、分析以及监管环境的变化。 2、细胞培养  细胞培养已被越来越多地用于疫苗制造中表达抗原（图1）。病毒表达可以在粘附细胞系或悬浮适应的细胞系中实现。 2.1 粘附细胞系 历史上，由于对安全性问题的考虑，疫苗制造中使用的细胞系选择受到限制。随着时间的推移，可用的选择越来越多，特别是连续细胞系的使用；这一进展最近已经总结。粘附细胞系疫苗的一个例子是基于重组水泡性口炎病毒（rVSV）的埃博拉疫苗，rVSVΔG-ZEBOV-GP（商品名ERVEBO®）（Blue，2016），最初是作为反生物恐怖主义制剂构建和表征的。rVSV株Indiana含有一个缺失的VSV包膜糖蛋白，被扎伊尔埃博拉病毒（ZEBOV）Kikwit 1995株表面糖蛋白所取代，它是在Vero细胞中生产的（Merck & Co., 2022）。最近的创新还包括开发了各种一次性生物反应器（SUBs），具有非常大的单位体积表面积；例如，Dohogne和同事（2019）描述的生物反应器。Drugmand等人在2020年描述的固定床反应器结合了强化的连续和自动化的一次性使用生物处理方法。为脊髓灰质炎疫苗描述的例子将上游处理、下游处理和灭活联系在一起。 2.2 悬浮培养  几种疫苗细胞培养应用涉及悬浮培养。对于蛋白质的生产，使用杆状病毒表达的昆虫细胞培养（Sf9）已经成功应用；例如，在大规模生产FDA批准的流感疫苗的HA蛋白。或者，用于病毒生产的宿主细胞，如Vero细胞或PER.C6细胞，可以适应悬浮培养。如果细胞培养可以适应，细胞通常可以在使用确立方法的经典搅拌罐生物反应器中培养。许多为CHO细胞培养开发的技术改进已经用于制造抗体，可以应用于疫苗制造。最近，行业从10,000-20,000升规模的不锈钢生物反应器转变为大约3000升规模的SUBs。描述了一种SARS-CoV-2 Sclamp疫苗候选物，使用CHO细胞表达，与大规模商业制造兼容，在2-8°C下稳定。当与MF59佐剂配方时，它可以引发中和抗体和T细胞反应，并在动物挑战模型中提供保护。在CHO细胞中表达的VZV的截短糖蛋白E是效果非常好的Shingrix疫苗的基础。用于疫苗的细胞培养技术可以与用于大规模制造抗体的技术非常相似。 3、微生物生产  微生物发酵平台传统上被用来生产主要类别的疫苗，它们仍然至关重要。人类乳头瘤病毒（HPV）表面的L1蛋白由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达，并组装成病毒样颗粒（VLPs），以创建Gardasil疫苗（Nooraei等人，2021）。乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原由S. cerevisiae或皮奇亚酵母（Pichia pastoris）表达。基于质粒DNA的疫苗候选物通常由大肠杆菌（Escherichia coli）细菌发酵生产（Liu，2019）。肺炎球菌结合疫苗由特定的肺炎链球菌菌株表达的荚膜表面多糖（CSPs）与白喉CRM197蛋白结合而成（Javed & Mandal，2021）。一些重要的疫苗，如带状疱疹（HZ）疫苗，最初是作为减毒活病毒（LAV）疫苗，但最终被单一的重组VZV糖蛋白和佐剂系统所取代。过去十年中，在开发能够高产量生产的替代培养方面取得了进展，例如基于Thermothelomyces heterothallica（称为C1）的真菌培养的Dyadic平台。C1基础系统可以在几周内开发出表达免疫活性抗原的稳定菌株；一般来说，产量比其他成熟的系统高。C1基础系统容易扩展到工业规模，并且具有成本效益，使用标准微生物发酵反应器和廉价的培养基。一种使用C1表达技术开发的COVID-19疫苗候选物，用于制造关键的受体结合域（RBD）成分的刺突蛋白，目前正在临床评估中。麻省理工学院的研究人员开发了一种基于P. pastoris的平台，该平台完全自动化，可以用来生产各种蛋白质，包括疫苗抗原。选择这种酵母是因为它可以快速生长到高细胞密度，并具有可接受的蛋白质表达。使用高度自动化的生物反应器平台，正在进行一种轮状病毒三价疫苗候选物的生产应用，该平台包括端到端的能力。 对于蛋白质抗原，技术挑战通常是以可重复的方式生产，关键表位暴露，以便它们被免疫系统识别。这对于基于VLP的疫苗尤其如此，如HPV疫苗，复杂的分析能力对成功至关重要。对于mRNA疫苗，大肠杆菌发酵仍然是生产用于体外转录（IVT）成mRNA的质粒DNA（pDNA）模板的主要方法，如Pfizer-BioNTech的Comirnaty®和Moderna的Spikevax® COVID-19 mRNA疫苗。无细胞合成pDNA正在取得进展（见无细胞合成部分），但由于酶和核苷酸/核苷的成本高昂，仍未像微生物生产那样具有成本效益。pDNA作为IVT反应的原料，所需的总量明显少于DNA疫苗，因为可以从单个线性化的pDNA模板中制造出许多mRNA拷贝。用于IVT的pDNA测序通常需要大量的重复元素（例如，聚（A）尾部），这通知了大肠杆菌菌株的选择。许多工业主力菌株最初是为了高pDNA产量而优化的，而不是pDNA保真度，但现在有各种各样的菌株能够正确复制具有重复元素的大型质粒。最近描述了一种通过将关键酶插入细菌中来制造结合疫苗的新方法。这种方法绕过了分别制造蛋白质和多糖，然后进行纯化、化学结合和重复纯化的需要。 在制造规模为500-5000升的不锈钢压力容器的时代以来，发酵设备已经取得了许多创新，这些容器越来越复杂，难以自动化、清洁、验证和操作。由于建设成本高昂，发达国家只有有限数量的大型制造场所。过去十年中，微生物和细胞培养的一个重大进步是转向一次性使用（SUBs）。在一次性SUBs上进行了大量投资，允许在较小规模上制造微生物培养，通过消除清洁和消毒来增加灵活性。微生物培养常见的许多工艺条件，如压力、高气流速率、溶剂和坚固的温度控制，限制了疫苗制造中SUBs的上限规模约为3000升。 图1 基于细胞的病毒疫苗制造的总结示意图。 4、无细胞合成  包括蛋白质和RNA疫苗以及VLPs在内的疫苗的体外转录（IVT）已成为加速疫苗工艺开发和制造的优雅而简单的方法。 图2 无细胞体外转录反应用于RNA生产。典型的反应从2-5毫升用于优化筛选（2-10毫克）开始，10-15毫升体外转录用于动物研究（25-50毫克），5-20升用于临床研究（10-50克），以及高达50-200升用于商业生产（125-500克）。IVT，体外转录。 无细胞IVT始于一个线性化的DNA模板，用于在T7 RNA聚合酶酶的控制下转录复制子RNA（图2） 图 3 体外转录（IVT）的mRNA结构。mRNA，信使核糖核酸 IVT反应在几小时内完成，产生如RNA这样的产品，浓度为3-5 mg/mL。对于RNA疫苗，RNA复制子的5'端（图3） 缩写：COG，货物成本；IVT，体外转录；mRNA，信使RNA；sa-mRNA，自扩增mRNA。假设：一个生物反应器的反应产量为5克/升RNA IVT，产量为65%，新设施利用率为80%，活动持续时间为12个月。成本不包括交付封装。COG显示了一个范围，以涵盖不同类型的加帽和酶源供应方法。分析得到Biopharm Services Ltd Biosolve工艺成本分析工具的支持。 可以通过在IVT反应中补充m7GppG帽结构类似物并保持帽分子与RNA序列的第一个核苷酸（GTP）的高摩尔比来加帽。加帽已被商业化为共转录加帽，使用CleanCap试剂。或者，mRNA可以在第二个酶促反应中加帽，使用加帽酶（VCC）和甲基供体作为底物。VCC加帽效率更高（100%），与使用帽类似物的60%-80%相比，但共转录加帽是一个更快的过程，因为它不需要第二个酶促反应步骤。在IVT结束时，添加DNA酶I酶降解DNA模板，然后添加EDTA以灭活DNA酶活性，稳定RNA产品，并减少RNA沉淀。去除包括酶、残留NTPs、DNA模板和异常mRNAs（双链[ds]RNA和截断RNA片段）在内的杂质至关重要，因为RNA纯度已被证明会影响翻译效率并改变疫苗体内免疫刺激反应。例如，通过反向相高效液相色谱（RP-HPLC）去除双链RNA（dsRNA）后，蛋白质表达增加了10-1000倍。切向流过滤（TFF）已用于IVT后RNA的广泛纯化，实现了90%-99%的纯度和90%-95%的产量。TFF还与色谱法相结合，用于去除dsRNA，如纯化部分所讨论的。对于RNA，规模可以通过一次性兼容的无RNAase系统实现，如微孔板、管子和生物反应器，包括摇摆运动或搅拌罐，如图2所示。 简化的RNA制造过程使疫苗开发更快；例如，从DNA模板到首次人体试验在42天内实现SARS-CoV-2疫苗。上市时间也可以减少到不到2年的IVT RNA疫苗候选物。商业设施可以小2-3个数量级，建造时间减半，并且是原始资本成本的二十分之一。在低成本的2000万美元的设施中，可以生产10亿剂。通过使用封闭工艺，可以进一步降低设施成本，这允许在较低级别的洁净室设施中生产。虽然消除更高级别洁净室的要求既节省了能源成本，也节省了资本成本，但试剂成本在IVT过程的制造成本中占主导地位，高达96%（COGs；表3）。GMP的物料和试剂供应是一个限制因素，特别是考虑到确保酶试剂是无动物成分（ACF）和GMP级别的复杂性。减少试剂使用的方法是极其重要的；方法包括IVT后的加帽和集成的连续工艺，其中反应速率可以加速，并且可以实施试剂的再利用。也在开发自动化RNA生产系统，其中IVT反应与纯化步骤在单个封闭系统中通过机器人操作集成。 图 4 脂质纳米颗粒组装工作流程 同样，微流体系统已经将RNA集成到LNP生产中，用于个性化疫苗方法（图4） 今天，可以使用台式系统来简化发现结构工作流程，因为寡核苷酸被组装成全长DNA或mRNA序列的10-µg规模，无需pDNA模板。将来，台式核苷酸制造系统可能是可能的。 虽然单链RNA的设计结构已经很好地建立，但新的RNA治疗方式仍在不断扩展。自复制mRNA（sa-mRNA），具有高拷贝数和随后的高抗原表达，在剂量上比单链RNA低60倍。反义mRNA（taRNA）也在动物研究中建立，其中一个mRNA模板编码了复制酶，而单独的模板扩增了多个目标mRNA，同时编码不同的蛋白质。共价闭合环状RNA（circRNA）在动物模型中已经显示出连续翻译蛋白质的可行性。circRNA是从IVT线性RNA产生的，可以通过多种方法如T4 RNA连接酶或内含子剪接环化。这种稳定的封闭环结构提供了对外核糖核酸酶切割的保护，不需要5'加帽或3'聚（A）尾部，并且有潜力在室温下稳定。预计，通过计算设计指导、机械建模和人工智能（AI）工具，不仅可以改进分子设计，优化半衰期、稳定性和效力，还可以改进CMC属性，包括减少杂质。最近的工作显示，通过降低IVT Mg2+水平，以50°C的热稳定T7 RNA聚合酶进行更快的反应，并应用高盐转录策略，可以进一步提高产量和纯度。这些扩展工艺设计空间的努力可以通过扩展自动化筛选工具来支持，以实现IVT、纯化和过程分析的集成工作流的统计设计实验。 除了RNA，无细胞制造已经证明了各种疫苗类型的生产，包括亚单位、结合疫苗、VLPs和膜增强疫苗。这些示例主要使用大肠杆菌裂解系统，尽管使用了包括CHO、小麦胚芽和烟草在内的一系列来源。商业上可用的试剂盒为发现和工艺开发提供了快速方法，并已证明可以扩大规模以支持临床制造。最近的一项研究应用了无细胞表达技术，成功生产了下一代24价肺炎球菌结合疫苗，与当前的标准护理相当。无细胞平台表达了增强的载体CRM蛋白序列，其中包含多种非天然氨基酸。它们位于主要T细胞表位的外部，可以进行位点特异性共价结合，有潜力改善血清型覆盖。无细胞疫苗生产的更广泛采用仍然受到限制，因为后翻译修饰的挑战、对细菌来源系统的免疫原性担忧、二硫键折叠复杂性以及扩大规模的试剂成本。预计在未来10年内，随着基于哺乳动物的裂解系统和连续系统的应用，这些将得到改进。 5、纯化 在过去的十年中，疫苗的纯化继续从复杂的工作流程过渡到更加标准化和强化的方法。示例总结在图5中。 图5 疫苗生产流程 比较了包括传统流程在内的流程类型与未来强化/集成方法。 这种关注持续推动降低成本和剂量，同时提高吞吐量和产量。在细胞收获、深层过滤、细胞裂解和过滤方面取得了逐步改进，如最近回顾所总结的。膜设计的进步促进了从离心到深层过滤，或两者的结合的过渡。可用的更高MWCO膜的扩展支持了更大病毒的浓度、缓冲液交换和杂质减少（宿主细胞蛋白[HCPs]）。 继续改进单通TFF，实现了强化和连续的工作流程。病毒产品的无菌过滤在膜设计的进步中继续改进。 亲和捕获色谱的选择范围不断扩大，为简化和标准化的工作流程提供了关键优势。对于病毒处理，亲和捕获的可用性在减少单元操作数量方面提供了显著优势，如图5所示。亲和配体设计的进展导致了针对病毒疫苗的高特异性和可调亲和配体，具有在温和洗脱条件下的强大杂质清除能力。商业上可用的来源，如源自骆驼单链域的Capture select AAV9，已经为一系列腺相关病毒（AAV）血清型建立了。配体设计的改进仍在继续，如使用组合化学方法的短基（5-15个氨基酸）配体和分子印迹的硅设计聚合物，用于快速配体粒子生成。对于RNA，脱氧胸苷（oligo dT）配体已成为亲和捕获方法，它与3'聚（A）尾部结合。通过结合OligodT和抛光IEX，可以有效地去除包括dsRNA在内的杂质。亲和色谱的进步使得多柱处理的效率改进得到更广泛的采用。例如，通过使用尺寸排除色谱（SEC）的两柱对流色谱，腺病毒的生产力提高了六倍，实现了86%的恢复率和90%及89%的DNA及HCP清除率。对流感病毒A的纯化应用了类似的强化方法。四元胺（QA）阴离子交换单体与模拟移动床色谱实现了89%的病毒产量，并且>98%的DNA清除。 图6 色谱的扩展格式。（左图）树脂珠。功能配基被内化在树脂介质的孔隙中；这种格式由慢扩散质量传递主导，导致慢速或低分辨率的过程，对于大分子有显著的尺寸排除效应。湍流发生在树脂之间，产生涡流流动和剪切应力升高区域以及较低的产量。（中间图）膜技术，功能团固定在膜表面。大孔径允许高流速并最小化尺寸排除效应。（右图）单体格式支持具有功能化的大孔或大孔和中孔的相互连接通道。大直径通道提供对流质量输送，实现流动无关的分辨率和容量，支持快速处理。层流提供低剪切应力，为生物制剂和疫苗提供更高的产量。 从传统的基于树脂珠的分离到膜和单体的对流格式的转变继续获得更广泛的应用（图6）树脂珠的扩散限制，其中大病毒颗粒难以进入珠内的配体，被对流传输膜的优势所克服，包括微孔水凝胶纳米纤维和单体格式。这些已成功应用于一系列疫苗产品，典型的恢复率为60%-90%，最小限度的杂质结合，包括99%的HCP和残留DNA（resDNA）以及5-log内毒素减少。去除的杂质包括病毒、VLPs、噬菌体、细胞外囊泡、pDNA和RNA。单体处理的效率最近通过IEX单体纯化风疹病毒悬浮液在1小时内完成，而使用树脂珠则需要>10小时。 对强化工艺的追求和提高上游表达滴度重新激发了对非色谱方法的兴趣，如沉淀、水相两相提取（ATPE）和结晶。无色谱工艺有潜力将COGs降低20%-30%，并且更适用于连续加工。使用统计设计实验可以减少优化条件以最大化目标稳定性和完整性的复杂负担，pH、温度、电导率和混合物组成。典型的聚乙二醇（PEG）沉淀包括使用5% PEG和0.5 M NaCl实现的85%的甲型肝炎病毒恢复和65%的HCP减少。然后将裂解液用核酸酶处理，以防止核酸/病毒聚集体的共沉淀。mRNA沉淀已与TFF结合使用，以捕获沉淀物，并通过透析去除杂质，然后重新溶解。预计可以使用塞流或盘旋流反转反应器实现连续疫苗沉淀。 ATPE的强化，随着上游滴度的提高，涉及混合两种聚合物和亲水盐（如磷酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐）的溶液，并可以克服历史上大量稀释提取系统的体积问题。一些最近的例子表明，使用PEG/盐组成来分离包括病毒、VLPs和细胞外囊泡在内的一系列疫苗产品是可行的，这些产品在提取的上层相中，实现了从粗裂解液中70%-99%的恢复率。展示了使用45% PEG和30%柠檬酸混合物在连续模式下，通过简单的螺旋混合器实现了99%的HIV VLP恢复和73%的DNA去除，这种方法应该可以减少大量缓冲液的使用和处理时间。尽管疫苗结晶作为纯化工具仍处于起步阶段，但一些最近的进展已经显示出引人注目的机会。例如，已经展示了一种非复制性轮状病毒疫苗候选物（VP8亚单位蛋白与破伤风毒素P2表位的融合蛋白）的结晶。在悬挂滴蒸发扩散系统中评估了晶体条件，然后使用蒸发技术进行放大。随后的抗体结合谱发现与结晶前相似。技术还扩展到了可调晶体尺寸控制的连续 Slug 流结晶。这些技术为疫苗结晶在连续生产中的应用提供了可能性。有趣的是，技术发展能在多大程度上推动目标分子的杂质清除，或者结晶是否需要与色谱或沉淀或两相提取相结合。 在未来十年中，预计流程将进一步强化和集成，以实现更小的占地面积，从而提供更低成本的流程，便于全球部署。改进的技术可能导致一步色谱法和连续处理，以及单通切向流过滤和昂贵试剂回收的可持续实践，这对于RNA生产尤为重要。预计将支持非色谱工艺的技术，包括结晶，进入临床前开发。所有这些活动都将得到机械建模的支持，用于AI引导的流程开发和先进的控制策略，以支持自治操作。 6、药物产品 （DP）加工 大多数获批的疫苗通过肌肉内（IM）、皮下（s.c.）或皮内（i.d.）注射进行递送，还有一些获批的口服和鼻疫苗。此外，正在进行疫苗开发计划，以通过吸入将疫苗递送到肺部，以及使用微针贴片递送到真皮空间。无菌注射DP制造包括混合（配方）、灭菌过滤（大多数情况下）、填充小瓶或预充填注射器、视觉检查、贴标签和包装（即填充-完成）。一些疫苗在填充后的最终容器中进行冷冻干燥（冻干）。结合疫苗需要将抗原与载体蛋白结合。最后，可能需要一些工艺步骤来结合一些疫苗的佐剂。许多注射疫苗，如含有减毒活病毒或铝凝胶佐剂的疫苗，不适合无菌过滤，因此上游步骤必须无菌进行，以确保无菌性。 针对COVID-19开发的许多疫苗包括DP制造的创新。其中关键之一是Pfizer-BioNTech的Comirnaty®和Moderna的Spikevax®中使用的mRNA-LNP。需要建立全球网络的填充-完成站点，以构建新的LNP形成和TFF单元操作的能力。LNP形成涉及将含mRNA的水溶液和四种脂质的乙醇溶液控制性地泵入微混合装置，如图4所示。新形成的含mRNA的LNPs物理稳定性非常有限，因此LNP形成步骤紧接着使用TFF进行溶剂和缓冲液交换，以去除乙醇并调节pH值。 尽管COVID-19 mRNA-LNP疫苗显示出显著的效力，但主要限制是需要冷冻储存和运输，这增加了成本和复杂性，并阻碍了更广泛的分发。Pfizer-BioNTech疫苗目前有18个月的保质期，但必须在-90°C至-60°C下保存（emc，2023a 2023b），而Moderna疫苗的保质期为9个月，在-50°C至-15°C下（emc，2023a，2023b）。最近的一项综述总结了改进mRNA-LNP疫苗稳定性的重点领域，包括优化构成纳米粒子的脂质、缩短mRNA链长度、增加GC含量以及使用干燥技术如冻干等。冻干mRNA-LNP疫苗是可行的，可以提高热稳定性。虽然未来的mRNA-LNP产品可能会被冻干，但目前的mRNA-LNP COVID-19疫苗不是，因为全球冻干能力有限，而且在大流行时没有足够的能力生产数十亿剂。新兴技术，如喷雾冷冻干燥和无菌喷雾干燥，将来可能是可行的选择。在某些条件下，一个喷雾冷冻干燥机或喷雾干燥机可以与许多冻干机的吞吐量相匹配（见第6.4节）。 对COVID-19的响应还包括诸如阿斯利康的Vaxzevria®（由印度血清研究所作为Covishield®生产）、国药的Covilo®、Janssen的Ad26.COV 2-S、Gamaleya的Sputnik V和康希诺的Convidecia等重组病毒载体疫苗的主要进展。在过去的10年中，有四种病毒载体疫苗获得了埃博拉的批准，一种获得了登革热的批准（表1）。病毒载体疫苗使用传统的填充-完成技术，包括冷藏液体、冷冻至-20°C和冻干的混合。许多新型疫苗DP配方和递送方法正在开发中。其中一些将需要新的GMP制造步骤，如微针和许多类型的纳米颗粒。 6.1 重组人血白蛋白 在制造或配方中使用任何动物来源的成分需要采取广泛的预防措施，以防止与病原体污染。白蛋白和明胶长期以来一直作为配方组分用于稳定某些疫苗。多年来，白蛋白的来源是混合的人类志愿者捐献的血浆。2006年，Merck & Co. Inc.获得了使用在S. cerevisiae中表达的Recombumin®重组人血白蛋白用于MMR®II上游制造的批准。2019年，Merck & Co. Inc.获得了EMA和FDA对使用重组人血白蛋白作为DP配方辅料的ERBVO® Zaire埃博拉病毒疫苗的批准。白蛋白是稻米来源的Exbumin®，由InVitria提供。该疫苗需要在-80°C至-60°C下储存和运输，最多可在2-8°C下存放14天。预计未来将有更多的疫苗使用重组白蛋白。 6.2 佐剂  佐剂对包括它们的疫苗的有效性至关重要，并且它们是开发和制造的专业领域。今天使用的许多佐剂都是知识产权（IP）。例子包括Merck Aluminum Adjuvant（Merck & Co.，Inc）、GSK佐剂系统、MF59®（Novartis）、Matrix-M（Novavax）和几个由西雅图Access to Advanced Health Institute拥有的。 目前在FDA和EMA批准的疫苗中最常见的佐剂类型是不可溶性铝盐悬浮液（非结晶磷酸铝硫酸氢钾、氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾）。这一类已经使用了近100年。它们具有数十纳米的基本粒径，并形成松散连接的网络，根据测量方法和剪切条件，尺寸在1-20微米之间变化。含有铝佐剂的疫苗不会冷冻，因为这会导致佐剂粒径增加；然而，只要有足够的稳定剂，如蔗糖和/或足够快的冷冻，这些疫苗就可以冻干或喷雾冻干以提高稳定性。另一个问题是铝颗粒可能会形成沉积物，这很难重新悬浮。 商业疫苗中的其他佐剂包括化学修饰的鼠伤寒沙门氏菌脂多糖的脂质部分（MPL，MPLA）、含有CpG基序的合成寡核苷酸以模拟细菌DNA（例如，CpG 1018®）、角鲨烯和皂苷。这些以各种组合使用，并且在某些情况下吸附到氢氧化铝上或作为乳液或纳米颗粒的一部分。所有佐剂的一个共同主题是粒径，这是一个具有免疫学后果的属性，通过制造和质量控制可能很难管理。 6.3 稳定化 在产品配方和工艺开发过程中，会确定降解途径，以评估制造过程和产品组成变化对稳定性的影响。生物制品最重要的化学降解途径之一是水解， 通常导致肽键断裂。其他化学降解途径包括脱水和氧化。物理变化包括聚集和变性，或者在蛋白质的情况下是错误折叠，这些分子变化会导致产品质量变化，从而导致功能丧失、非目标免疫原性或其他不良影响。分子的一个单一变化，根据结构受影响的位置，可能会使其完全失效。另一方面，有些变化不会有任何影响，因为它们不涉及与产品活性相关的区域。由于疫苗产品中使用的抗原和佐剂的复杂性，很难理解或预测所有可能的变化及其影响；通常，重要的是最小化所有降解。 控制或加速降解的因素必须得到控制和监控，以确保疫苗产品的稳定性。这些因素包括产品pH值、氧气水平和水分活性（例如，在固态配方中），这些因素会促成水解和氧化。通常，提高温度会加速所有途径的降解。某些缓冲物种、离子强度和微量金属可以影响产品的稳定性。最后，暴露于光照、冻融和暴露于引入空气-液体或固体-液体界面的剪切或搅拌可能会导致产品变化。 通过在配方研究中确定的不同类型稳定剂，可以确保产品稳定性。最终组合取决于产品类型、降解风险和给药途径。稳定剂包括冷冻保护剂、氧气清除剂和蛋白质；例如明胶、聚乙二醇（PEG）和特定缓冲剂以调节pH值。特定稳定剂的类型和数量可以根据对降解机制的当前理解来确定。有关解决这些问题的不同机制和配方策略的详细信息的综述超出了本次综述的范围，但感兴趣的读者可以参考其他专注于配方设计和稳定化方法选择的综述（例如，不同的干燥技术）。 一旦产品组合确定，就必须在整个制造和分销过程中进行环境控制。降低温度，无论是冷藏还是冷冻，都可以保护产品质量。由于许多降解途径可以通过减少水和氧气的存在来限制，产品可以通过冻干（lyophilization）或喷雾干燥，并引入惰性气体进入顶空。传统上，冻干一直是稳定疫苗产品的的主要途径，并且与其他形式的干燥一样，对未来疫苗产品也将很重要（见第6.4节）。 表4Vaccine product formats and storage conditions. 总结了疫苗产品的不同平台以及所使用的格式类型，以及长期储存条件。一些液体产品不能在不影响产品质量的情况下冷冻；这对于含有铝佐剂的疫苗产品尤为重要。冷冻条件可以保护那些否则将是溶液/液体基础的产品，但会导致复杂的制造和供应链挑战。干燥产品可以储存在更高的温度下，从而最小化质量风险，但需要重新配制步骤和/或生产稀释剂，除非最终剂量形式是固态。 6.4 干燥趋势  干燥疫苗产品被包装在各种容器中，这决定了最终干产品加工所选择的操作。大多数商业化的干燥疫苗产品都是在小瓶中，这增加了全球产能。灌装机非常快速，适用于不同大小的小瓶，并且全球安装。此外，小瓶灌装设备可以与几种液体产品共享，增加了使用率，并为高资本投资的无菌灌装设施提供了财务回报。冻干设备已经设计用于优化单剂量或多剂量单位在玻璃小瓶中的生产。然而，对于冻干产品，可能需要定制的稀释剂，这使灌装要求翻倍。需要额外的组件和第二制造操作会增加成本。在患者给药时，两套材料引入了额外的步骤，并增加了临床中错误的风险。已经开发了双室选择，以方便重新配制。尽管这些产品消除了临床中的转移步骤，但需要额外的制造步骤将冻干在一个室中，并将稀释剂填充在第二个室中。 疫苗通常是通过肠外途径给药，因此制造的最后阶段必须在无菌条件下完成。容器必须在线清洗和灭菌，或以更高的成本购买即用型。对于液体和冻干产品，都需要填充和塞紧。要冻干的产品只部分塞紧，然后无菌地运输到冷柜中，进行冷冻、干燥、气体覆盖和完全塞紧（图7）。已经设计了系统，允许在保持无菌条件的同时，直接从灌装线转移到冷柜。对于双室注射器，由于过程的差异，需要特定的设备。图8说明了完成产品制造所需的操作。由于设备专门用于这种类型的产品，使用率可能更难以管理。双室产品的成本低于组件数量、步骤数量和设备的降低容量。 6.4.1 先进的产品干燥技术  针对干燥疫苗产品的制造技术的进步必须包括上面讨论的新型疫苗格式的能力，同时专注于提高生产力和改善质量保证。减少干燥操作的持续时间为提高生产力提供了重要机会。干燥周期时间的主要限制是水分去除速率，通常必须降低以保持低产品温度，以防止“熔化后”或“坍塌”。坍塌是一种产品缺陷，其中产品蛋糕的结构丢失，可能会影响稳定性和产品活性。必须控制热量和质量传递，以确保最终产品质量。当前的冻干柜使用在架子内部流动的传热流体来冷冻产品并驱动蒸发。对于冷冻和加热，能量必须通过架子传递到玻璃小瓶底部，并到达产品的整个体积，这可能是低效的。由于架子、架子之间以及小瓶在架子上的位置引起的热量和质量传递差异，整个柜子中的不均匀性导致了进一步的效率低下。 图 7 液体和冻干产品的工艺操作 图 8 双室系统的过程操作 改进热量传递，如下面讨论的新颖方法，可以显著缩短周期时间。或者，具有非常低水蒸气分压的干燥环境可以不直接加热产品而从产品中蒸发水分。连续生产系统通过提高设备利用率来提高生产力。这一原理可以应用于所有产品类型的干燥，包括小瓶和双室装置。其中一些技术允许原位干燥，而其他技术则产生必须分装到容器中的干燥产品。生产大量干燥产品为开发超出典型小瓶的新型格式提供了机会，具有更好的稳定性。利用现有原理和灌装容量的连续冻干方法对小瓶产品将是最简单的实施方式。 图9 与传统冻干工艺相比的块状干燥工艺 喷雾干燥，结果是产生球形颗粒的干燥粉末，是许多先进干燥过程的焦点。对于干燥散装技术，填充到单位剂量容器需要粉末填充，这对于无定形粉末来说可能具有挑战性。除了改善喷雾干燥产品的流动性外，还减少了产生细小颗粒和外部小瓶表面污染的风险。过程步骤的数量保持不变，尽管无菌操作的顺序是相反的（图9）。任何过程改进都必须满足无菌要求，以提供适当的产品质量。设备必须在点使用时通过无菌过滤进行灭菌，或者作为预先灭菌的材料无菌引入。 房间分类是基于设备设计和所需的干预确定的。 6.4.2 原位干燥工艺替代方案  原位干燥在最终容器中，如小瓶和双室注射器，目前是商业产品中最常见的。已经对传统冻干的所有步骤进行了改进研究。冷冻步骤对于允许适当的多孔宏观结构和增强的质量传递以去除水分至关重要。开发工作集中在控制成核和增加干燥步骤的表面积。通过专注于能量传递，可以改进初级和次级干燥步骤，这在当前冻干柜中受到架子向玻璃小瓶传递热量以驱动蒸发的热量传递限制。连续工艺可以提高生产力和一致性。 泡沫干燥 泡沫干燥不需要冷冻，利用干燥过程中的蒸发冷却来维持产品温度。形成的气泡提供类似膜的表面和高表面积进行干燥；过程开发集中在控制气泡的大小和膜的厚度，以确保快速高效的干燥过程。泡沫干燥技术已经证明对疫苗、生物制药、微生物样本和农业产品的保存是有效的。 微波真空干燥（MVD） 微波能量可以用来替代架子中的加热流体，在传统冻干柜中应用，可以允许继续使用当前设备。微波场中快速循环的水分子导致在分子水平上加热和水分蒸发，而不会显著加热敏感产品。此外，能量立即穿透整个系统，不会产生传统冻干中观察到的局部热和质量传递效应。微波场的频率控制为个体产品在过程开发期间的系统优化提供了工具。 MVD技术已经用于疫苗和其他生物制药，连续工艺 Pisano和同事提出的一种用于原位干燥的连续工艺如图10b所示。小瓶通过模块移动，需要特别设计的转移模块在每个步骤之间保持适当的压力、温度和气体组成。该系统被设计为一个机会，以快速和连续的方式生产干燥产品，使用传统和熟悉的工艺操作。 图10 替代干燥工艺 (a) EnWave FreezeREV中试规模的示意图。图片转载自Mohammadi等人(2020)。(b) 小瓶产品的连续冻干。图片转载自Capozzi等人(2019)，WIPO PCT专利号WO 2018/204484 A1。(c) 层流PACE系统。图片转载自Ziccum AB(2023a)。(d) IMA Life Lynfinity连续喷雾冻干机。 操作复杂性，需要将每个小瓶通过冻干的各个阶段，导致了专注于生产大量干燥粉末的焦点。相对于原位干燥工艺，大量干燥工艺的替代方案如图9所示，大量干燥工艺的顺序是填充和干燥相反。这需要完全无菌的粉末或颗粒填充能力（“干填充”）。粉末填充已经有一段时间用于填充无菌抗生素粉末，尽管具有挑战性，但通过改进喷雾干燥材料的流动性，该工艺是可行的。颗粒也可以使用粉末填充设备的变体进行填充。大量干燥的优势在于，大量无菌粉末或颗粒可以填充到几乎任何类型的容器中，包括传统的小瓶和双室注射器，以及不适合原位干燥的新型复溶-注射系统。使用大量干燥和干填充可以大幅降低双室注射器的制造成本。已经开发了几种其他方法来解决干填充的问题和挑战。 喷雾干燥 无菌喷雾干燥现在可用，并允许连续干燥和粉末生产。一个例子是Aseptic SD™系统。在喷雾干燥中，含有产品的液体溶液流经喷嘴，将产品分散成细小颗粒。喷雾干燥的一个优势是通过调整喷雾喷嘴来控制粒径。必须提供无菌气体作为产品干燥的热传递介质；可以使用惰性气体如N2或Ar来限制氧化降解。在传统的喷雾干燥模式中，热气体流经系统以驱动蒸发。气体温度可达120°C，这可能会导致敏感生物产品的降解。然而，系统中迅速发生蒸发冷却以降低产品温度，并且热暴露非常短暂。这些系统已成功应用于生物生产。 另一个系统使用网格喷雾器在干燥氮气层流中产生球形液滴（图10c）。此外，干氮气在膜上提供逆流，以从气体中去除水分。系统在环境温度下运行，以限制对敏感产品的热应力。该技术的概念验证已经对mRNA-LNP产品进行了演示，结果非常好，保持了封装效率、粒径和分布，以及体外和体内mRNA活性。 喷雾冷冻干燥 也称为“散装冻干”的喷雾冷冻干燥包括在含有冷气体的塔中液滴冷冻，然后是冻干机中的真空升华。目前存在两个主要竞争对手，并且已成为最近一些综述的主题。第一种技术基于在塔中液滴冷冻，然后在独特的旋转鼓中真空干燥冻干颗粒。该技术已成功放大，产品产量高达97%。第二种技术是连续喷雾冷冻干燥机，如图10d所示。液滴从喷雾喷嘴产生，通过液氮冷却的柱子下落，导致形成小直径的球形颗粒。冻干球通过传送带在不同的压力和温度级别移动，以实现低水分产品。最终产品直接填充到适当的容器中，以无菌方式密封，用作粉末填充系统。 7、疫苗特征化的进展  新型疫苗技术平台（如mRNA和病毒载体疫苗）的引入，促进了分析技术的快速发展，以支持疫苗开发和质量分析。 7.1 生物物理和分析技术 现有生物物理和分析技术的分辨率和灵敏度的创新改进，允许对疫苗的纯度和异质性进行更严格的表征，包括灭活或减毒病毒、重组蛋白亚单位和病毒样颗粒（VLPs）、多糖结合物。这些进步有助于提高疫苗关键质量属性（CQAs）的定量评估的可靠性，并增强对批量释放的信心。 质谱（MS）在疫苗开发中的使用已经在之前进行了综述，并特别举例说明了重组蛋白抗原和糖结合物的应用。毛细管电泳（CE）与飞行时间（TOF）-MS联用，已用于结核菌抗原及其糖结合物的表征。电荷检测MS（CDMS），其中同时检测质量/电荷和电荷，已用于多种类别疫苗和多价疫苗的纯度和异质性的定量。 mRNA疫苗技术的显著成功，促进了分辨率和灵敏度的改进，以及分析方法的创新应用，如毛细管凝胶电泳（CGE）和离子对反相高效液相色谱（IP-RP-HPLC），用于评估疫苗结构的完整性和异质性。此外，对多价疫苗的分析具有足够的分辨率已变得更加可行。IP-RP-HPLC和MS的组合被用于检测和表征mRNA COVID-19疫苗的mRNA-LNP配方中脂质片段与mRNA核苷的加合物。这些加合物的形成被显示为随着储存时间和温度的降低而降低疫苗效力。 dsRNA是mRNA产品中的炎症性杂质，其水平必须尽可能接近零。虽然有可用的分析和免疫化学测定法，但提高灵敏度和通量将有助于过程和产品监测。为此，开发了一种采用微流控技术的CE方法，该方法利用两种不同荧光体的荧光强度差异来区分单链RNA和dsRNA。 动态和多角度光散射（DLS和MALS）技术的分辨率提高和数据分析改进，允许精确确定蛋白质抗原、病毒和病毒载体以及LNPs的大小异质性和聚集。mRNA-LNPs的大小分选使研究人员能够确定疫苗配方体内免疫原性的颗粒大小依赖性。最近的一项创新，基于光散射的质谱光度技术，可以确定单个颗粒的大小，从而确定颗粒集合体中的异质性。这项技术已被用于研究SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2受体之间的相互作用。 新的单颗粒检测方法允许观察溶液中的疫苗产品，如mRNA-LNPs，并提供动态视图，与静态电子显微镜（EM）图像相反。最近在溶液中单颗粒成像的创新是凸透镜诱导的限制或CLIC。CLIC是可视化和定量分析mRNA-LNP结构、大小和mRNA装载异质性的有前途的技术，用于mRNA疫苗候选物。平行的光散射技术进步使得单颗粒大小分析成为可能，与传统的平均集合测量相反。分辨率的提高以及模拟和基于机器学习（ML）的数据分析技术发挥了关键作用。 最近开发的可调电阻脉冲传感器（TRPS）方法被用于单颗粒分析，包括生物纳米颗粒（如LNPs）的尺寸分布和zeta脉冲，用于单颗粒分析，包括生物纳米颗粒如脂质纳米颗粒（LNPs）的尺寸分布和zeta电位。尺寸分选精度的提高通过测试不同尺寸的mRNA-LNPs对体内免疫原性的影响得到了证明。较小的（<80纳米）mRNA-LNPs似乎与较大的（100-140纳米）mRNA-LNPs相比，在小鼠中引起较低的免疫原性，尽管它们对人类免疫原性的影响尚不清楚。虽然SEC-MALS作为一项已建立的技术已有二十年历史，但场流分离（FFF）-MALS提供了无需与固体基质相互作用的基于尺寸分离的优势。这项技术被用于相关聚合度依赖性变化的亚单位融合蛋白基呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗候选物的效力，并用于包含封装mRNA的LNPs。 BioSAXS是最近引入的一种技术，结合了小角X射线散射（SAXS）和SEC-HPLC。与DLS类似，SAXS是一种用于低分辨率结构表征和蛋白质及蛋白质复合物建模的溶液散射技术。BioSAXS已被用于确定自复制mRNA疫苗（IMP-1）的半径，与DLS确定的水动力半径高度一致。 冷冻电镜分辨率的显著提高，使得观察充满mRNA的LNPs并确定每个纳米颗粒携带的mRNA构建数量成为可能。这些测量揭示了mRNA装载到LNPs中的异质性和给定群体中空LNPs的存在。此外，在一些mRNA-LNP颗粒中，观察到mRNA形成与脂质分离的水泡状结构。高分辨率冷冻电镜还被用于确定野生型和突变体S蛋白三聚体的结构，以支持COVID-19亚单位疫苗的开发。 无标记检测技术的创新为疫苗开发的几个方面做出了贡献，从抗原选择到DS和配方DPs的功能表征。例如，生物层干涉测量（BLI）提供了比表面等离子共振（SPR）更多的优势，尽管这两种技术都提供了大分子和配体之间结合和解离动力学的实时测量。BLI被用于评估SARS-CoV-2 S蛋白RBD三聚体与ACE2受体以及中和人单克隆抗体的结合动力学和亲和力。 7.2 免疫分析  除了继续使用流行的酶联免疫吸附测定（ELISA）技术外，还开发了一些其他技术，以期提高检测灵敏度、精确度、速度和通量。这些平台的例子包括AlphaLisa、VaxArray和Luminex，它们提供了相对容易的多重能力。已经报告了ELISA和Luminex免疫分析在检测和定量SARS-CoV-2抗体方面的比较。多重VaxArray已被用于麻疹和风疹疫苗以及流感疫苗的表征。VaxArray最近被应用于同时快速检测和定量肺炎球菌结合疫苗中常见的23种多糖血清型。在基于抗原-抗体的免疫分析的创新变化中，VaxArray已被用于使用互补寡核苷酸作为捕获试剂识别和表征mRNA构建。AlphaLisa是一种基于化学发光的高通量免疫分析，已被用于检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白。这些免疫分析可以用于细胞培养，例如，在细胞转染mRNA疫苗后评估蛋白质表达。由于mRNA、pDNA和病毒载体携带的转基因疫苗的功能取决于细胞内编码蛋白抗原的表达，免疫分析为这些类别的疫苗提供了有价值的定量表征。 上述新技术免疫分析越来越多地被用作诊断工具，用于检测病毒抗原诱导的血清中的抗体。它们还提供了一个平台，用于比较感染和预防性疫苗接种在未感染人群中诱导的免疫反应水平。与高量子产率的荧光团结合的抗体促进了在基于细胞的测定中，如流式细胞术，检测和可视化这些功能性事件的灵敏度。流式细胞术利用激光诱导的光散射和荧光检测的组合。荧光显微镜的进步也使得mRNA序列翻译成相应蛋白质的过程可视化成为可能。 7.3 测序和PCR技术 过去十年中测序技术的进步在几个方面对疫苗的质量测试产生了重大影响。下一代测序（NGS）比Sanger测序的准确性显著提高，使NGS成为测试核酸基疫苗的鉴定和遗传稳定性的无价工具。NGS被用作一种批准的COVID-19 mRNA疫苗的批量释放鉴定测试。 释放疫苗批量的一个监管要求是不存在外来病毒，这些病毒可能是未知的或新出现的。外来病毒的一个主要来源是生产中使用的细胞基质，包括哺乳动物、昆虫和细菌细胞系。必须证明主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）无此类外来病毒剂（AVA）。传统上，体内（在五种动物中）和基于细胞的体外感染性测试已被接受，以确保疫苗的病毒安全性。然而，在过去的十年中，有相当大的动力用NGS取代体内测试。许多这些倡议是由欧洲和美国的监管机构以及与生物制药行业和专家顾问合作的WHO推动的。NGS在检测病毒的灵敏度和广度方面的最新进展，生物信息学和参考数据库的改进，COVID-19大流行凸显的快速释放疫苗批量的需求，以及减少动物使用的推动，共同推动了这一进展。WHO和FDA分别发布了推荐的标准病毒参考列表和用于验证NGS的稳定细胞系。 在过去的十年中，已经取得了显著的进展，用NGS替代猴子神经毒力测试，作为口服减毒脊髓灰质炎疫苗生产过程中以及可能表现出神经毒力的其他病毒所需的安全测试。另一种体外方法，通过PCR和限制性内切酶切割（MAPREC）的突变分析，能够检测和定量主要负责神经毒力的逆转突变体的频率。NGS与MAPREC的比较分析产生了相同的结果。然而，NGS的全基因组测序能力和检测低频突变的能力使它成为确保减毒活病毒（LAV）疫苗生产中的病毒安全性和一致性的更有吸引力的工具。已经报告了将NGS验证为新型2型口服脊髓灰质炎疫苗批量释放安全测试的情况。除了成本和时间优势外，NGS可以取代基于动物的传统测试，具有明显的伦理优势。 液滴数字PCR（ddPCR）的引入是过去十年PCR技术中的一个重要进步。ddPCR是一种高通量和定量方法，可以应用于准确确定DNA和RNA病毒以及疫苗的基因组拷贝数。ddPCR检测的优势在于不需要标准曲线或参考标准进行定量。预计这项技术将在包括pDNA、mRNA、病毒载体和LAV疫苗在内的不同类别疫苗的身份和遗传稳定性测试中得到广泛应用。ddPCR已验证用于活减毒裂谷热（一种RNA病毒）疫苗的开发，用于定量RNA拷贝数，并检测逆转突变体。 尽管分析表征的进步导致了疫苗抗原的高纯度和结构完整性，但宿主依赖的生物学因素常常使得难以预测是否能够在体内引起所需的免疫反应。尽管如此，高分辨率结构分析辅以免疫分析和突变扫描，已被用于识别对产生病毒中和抗体至关重要的抗原位点。然而，当疫苗的主要机制是细胞介导的免疫（CMI）时，这种相关性更具挑战性。然而，最近有报道使用MS辅助识别HLA呈 现的T细胞表位和设计一种诱导CMI的mRNA疫苗。 8、分析放行检测  分析方法对于疫苗来说是关键的基础部分，需要持续监测和更新，以提供最佳信息，指导这些产品的开发和生产。分析质量源于设计（QbD）概述了一条开发稳健分析方法的路径，有几篇最近的参考文献详细讨论了这个话题。分析QbD中编纂的概念基于指导文件，包括ICH Q14（ICH和欧洲药品管理局，2022），它描述了开发和维护稳健方法的增强方法。将这些指导文件中概述的方法应用于传统方法可以带来显著的收益，但在将它们应用于旧技术时存在固有的限制。 SARS-CoV-2疫苗的开发和商业化的速度令人鼓舞，对未来的大流行响应来说，但我们必须做更多的工作，以缩短所有新型预防性疫苗的开发时间。疫苗生产过程难以控制，最终产品抵抗简单的定义和表征。投资于新的和新兴的分析技术将有助于项目更早地生成关键信息，以避免在临床开发的后期阶段停滞，并将导致更好的产品和过程理解。在分析QbD框架内，开发分析目标概况（ATP）时，应深思熟虑地考虑引入新技术。下面讨论了产品独立和产品特定方法的分析技术的选定进展。 8.1 产品独立方法 疫苗DS的安全测试包括微生物学测试，如无菌性、生物负荷、内毒素、支原体和外来因子测试；其中许多由药典权威机构（美国药典[USP]、欧洲药典[PhEur]、日本药典）详细描述。这些方法的优点是已经建立和理解，但可能非常费力和耗时，此外还引起了关于动物使用的伦理问题。最近的指导（欧洲委员会，2022；美国食品药品监督管理局，2020）鼓励考虑替代传统方法的方法。来自FDA的，“与USP、FDA指导或法规（CFR）概述的不同的分析程序在IND中可能是可以接受的，如果赞助商提供了关于测试特异性、灵敏度和稳健性的充分信息。”类似地，附件1规定，“制造商应考虑采用适当的替代监测系统，如快速方法，以加快微生物污染问题的检测，并降低产品风险。” 整合新的、快速的微生物学方法的势头正在增强，部分原因是对COVID-19大流行的响应，以及细胞和基因治疗产品的需要，这些产品的保质期非常短。由于样品大小和生长条件的限制，传统的基于生长的无菌性评估方法的限制众所周知。BacT/Alert 3D系统已经成为一个经过验证的无菌方法，与药典14天基于生长的无菌测试一起；其他一些测试，有些基于生长，有些不是，正处于不同的开发阶段。基于PCR和ELISA的检测方法现在已被广泛接受，用于检测支原体，基于NGS的方法也在开发中，如疫苗特征化部分所述。 外来因子测试需要能够检测广泛可能的污染物的方法。像激光力细胞测量这样的新技术正在被探索，以识别细胞病变效应并改进经典的基于细胞的测定。NGS技术不仅在检测微生物污染物方面具有重要意义，还有望取代目前用于检测AVA的体内、体外和PCR测试。 8.2 产品特定方法 除了药典放行检测外，疫苗还需要针对正在开发的疫苗的CQAs进行测试，如身份、效力、纯度和效力。用于这些属性的传统方法存在限制，而新兴技术在许多情况下可以缓解这些限制。 疫苗效力方法有各种各样的类型，以满足它们将提供有关患者预期免疫反应的信息的期望。体内效力测定充满了动物基础测定的变异性、不可重复性和长周转时间。因此，出于动物福利和成本考虑，体外测定的开发在疫苗的表征和批量放行中变得极为重要。了解疫苗的作用机制（MOA）仍然是开发最相关效力测定的关键，但现在比以往任何时候都拥有更多的工具可供开发科学家使用。在确切的保护性免疫反应性质未知的情况下，新技术正在提供有关疫苗基本工作原理的更丰富和更精确的信息。在某些情况下，抗原与佐剂的相互作用以产生预期的免疫反应仍然无法通过当前的方法和知识进行评估。 空斑测定几十年来一直是活病毒疫苗的病毒学主力，但近年来的科学和技术进步可以作为增强和/或替代病毒定量方法，如传统的空斑和TCID50方法。荧光成像技术分辨率和定量准确性的提高有助于用自动化焦点计数替代传统测定，并用PCR、激光力细胞测量和细胞电阻抗等替代细胞单层中的空斑或细胞病变效应（CPE）的视觉识别。在佐剂存在的情况下，这些技术的使用受到限制，微生理系统显示出作为模型系统的前景，用于将疫苗效力与体内效力相关联。使用这些系统还可能提供一种评估旧疫苗和过程变化影响的方法，而无需使用临床前动物模型或临床试验。 蛋白质亚单位和VLP疫苗通常依赖于体外效力测定的抗原性测定。基于AlphaLisa、荧光能量转移（FRET）、Luminex和电化学发光等技术的方法与标准ELISA方法相比，在速度、灵敏度、动态范围、数据密度和多重能力方面提供了优势。除了基于蛋白质的疫苗外，免疫分析也用于开发新型技术疫苗，如mRNA疫苗，其中最终抗原是蛋白质。例子包括人类狂犬病疫苗，已开发出基于包膜糖蛋白的ELISA和时间分辨免疫荧光，以及全细胞百日咳疫苗ELISA，已被证明是当前使用的体内Kendrick测试的有希望的替代品。流式细胞术，据推测使用荧光标记的抗刺突蛋白抗体，被用于首个批准的COVID-19 mRNA疫苗的效力测定。 在缺乏特定的免疫分析效力测定方法的情况下，可能会开发与效力相关的结构和功能测定作为替代品。WHO生物标准化专家委员会在2021年发布的一份报告中表明了对这一概念的监管开放性，作为mRNA疫苗开发的指南。实际上，这种替代测定法已被接受用于表征双价mRNA COVID-19疫苗的疫苗效力。 作为对旧技术进行改进的一个例子，用于纯度和完整性分析的毛细管电泳（CE）已成为比SDS-PAGE和免疫印迹技术更优越的替代品，为过程和产品理解提供了极大的改进。同样，质谱（MS）有望改进传统的基于ELISA的HCP检测方法。 SARS CoV-2疫苗的开发和放行测试为未来大流行疫苗以及承诺减少预防性疫苗开发时间表的方法铺平了道路。 9、过程监测分析 最近的COVID-19大流行凸显了实时或快速释放疫苗批量的需求，以最小化可预防的死亡和痛苦。此外，如果在GMP生产DS或DP的最后阶段批量不符合放行规格，可能会造成极大的损失。因此，通过在线或近线测试监控每个步骤的过程对于确保最终产品的高质量和快速释放至关重要。每个正在开发的新型疫苗通常都有一个明确定义的质量目标产品概况（QTPP）。实现目标QTPP的生物过程优化概念已通过支持分析数据为mRNA DS过程描述。这个基本原则与在开发所有生物制药产品的所有平台中实施QbD原则相关。 生产过程步骤应监测以保持效力所需的抗原表位。在许多情况下，提高在细胞基质存在下测量效力的能力已使这成为可能，从而避免过程失败并允许优化。例如，通过“流式病毒测量”在线监测缺陷病毒颗粒，结合基于激光力细胞测量的效力测量，已被用于改进LAV疫苗生产过程。结合电容工具和高内容成像实时监测细胞密度和峰值感染，这些过程分析技术（PAT）工具可能共同为LAV疫苗提供效力测定替代品。 PAT集成到生物过程中的好处最近已进行了综述。拉曼、核磁共振（NMR）、近红外和中红外（IR）光谱以及DLS越来越多地被用作PAT工具，因为这些生物物理测量提供了与功能相关的结构信息。NMR光谱在优化肺炎链球菌疫苗抗原的胶囊多糖质量的纯化过程开发中非常有价值。NMR已被用于监测在开发针对b型流感嗜血杆菌和脑膜炎球菌A亚群的结合疫苗过程中的多糖三级结构。 DLS和其他光散射技术多年来一直用于监测亚单位和VLP疫苗的聚集和多分散性 并优化纯化和配方条件，以防止聚集引起的效力损失。最近，DLS已被用于选择相对单分散的、尺寸最佳的LNPs用于mRNA-LNP疫苗。这些信息有助于控制微流体混合参数，特别是流速，在开发mRNA DP过程中。PAT将在QbD驱动的连续制造过程进一步开发和优化mRNA DS和DP方面继续发挥重要作用。 10、疫苗制造监管环境 为鼓励疫苗制造领域的创新，美国卫生与公众服务部于2021年1月19日发布了《2021-2025年疫苗国家战略计划》（美国卫生与公众服务部，2021），该计划更新了2010年的《国家疫苗计划》（在Josefsberg和Buckland，2012中讨论）。在2021-2025年疫苗计划中，几个主题仍然处于最前沿，包括疫苗供应和大流行响应、改进质量测试程序、全球监管协调以及发展中国家制造商参与疫苗供应。2021-2025年疫苗计划有五个主要目标，前两个目标涉及提高疫苗生产和安全性：（1）促进疫苗开发、制造和相关技术的创新；（2）保持尽可能高级别的疫苗安全性。第一个目标在整个综述中讨论，但第二个目标主要由政府监管批准程序的演变和行业过程控制系统的创新驱动，主要是当前的GMP和QbD。 监管批准程序的存在是为了确保患者安全。对COVID-19大流行的迅速响应为监管程序完成的速度树立了新的标准（11个月），并让许多人想知道我们是否可以在保持相同患者安全保证的同时，为所有疫苗候选者减少上市时间。COVID-19疫苗加速时间表的推动因素包括行业和政府投资风险（数十亿美元）、全球共享基因组序列、先前的冠状病毒研究、数十年的mRNA疫苗开发工作、监管机构接受在风险上进行药物开发的程序、无缝临床试验以及监管机构的快速审查。其中一些因素在非危机情况下无法复制，但其他因素可以缩短当前的疫苗开发到市场的时间表，即10-15年。 图11 过程中间测量关键质量属性(CQAs)可以推动关键工艺参数(CPP)和正常操作范围(NOR)的优化，从而实现mRNA药物物质(DS)所需的产量和质量目标产品概况(QTPP)。 大流行前，一些监管工具已经存在以提供灵活性，如FDA的EUA和EMA的有条件市场授权（CMA），以及FDA的快速通道指定和EMA的滚动数据提交。在大流行期间，对标准实践的调整加速了批准，包括依赖其他机构的检查和审查（依赖途径）、动态/滚动/实时审查、额外的机构指导、对数字化和电子标签技术的接受增加、减少硬拷贝文件以及放宽对单个批次放行测试和当地临床数据的限制。依赖途径是一种基于风险的方法，用于监管提交，并涉及识别其他当局和机构的数据、评估和/或决定。虽然这在某种程度上一直在发生，但大流行鼓励了数据共享以加速疫苗开发。国际药品监管机构理事会（ICMRA）COVID-19工作组创建了一个所有COVID-19主协议的清单，以通知政策讨论，并收集有关监管灵活性的知识（国际药品监管机构理事会，2022）。ICMRA还与国际协调会（ICH）、国际药品监管机构计划（IPRP）和药品检查合作计划（PIC/S）合作，开发药品质量知识管理（PQKM）能力（国际药品监管机构理事会，2023）。还创建了公共和私营实体之间的合作，包括获取COVID-19工具（ACT）加速器，以“加速开发、生产和公平获取COVID-19测试、治疗和疫苗”（世界卫生组织，2022）和COVID-19证据加速器（EA）以共享现实世界证据（RWE）。一些当局还使用依赖途径来简化评估过程，并加速他们国家的审查过程。一些国家监管当局接受药品证书（CPP），缩短了时间表，而EMA的一个名为“OPEN”的试点项目使国际机构能够参与他们的科学评估过程（需要保密安排），这促进了透明度和解决共同挑战。 基于风险的方法，如依赖途径，也可以用来加速批准后变更（PACs）。制造商和监管机构之间共享的批准后变更管理协议（PACMPs）允许快速实施变更，而宽限期和/或豁免允许PACs快速获批并向患者提供。依赖途径在中低收入国家（LMIC）中特别重要，那里的机构可能没有处理卫生紧急情况的成熟度和能力。 审查过程中的一个重大范式转变是将提交分成较小的包裹进行分段审查的概念，而不是在活动结束时提交完整的档案。数据可以在约定的里程碑或实时呈现。在某些情况下，这些间歇性的数据包可以与下一步的启动同时审查，有时被称为分阶段或滚动监管审查。一个例子是欧洲制药工业协会（EFPIA）及其动态监管评估（DRA）的概念，该概念涉及在完整的市场授权申请（MAA）之前很早就提交数据包。 在大流行期间，EMA和FDA提供了额外的指导并与制造商进行持续对话，作为加速开发和审查时间表的方法。例子包括EMA的PRIority MEdicines（PRIME）计划，该计划发布了补充问答文件，讨论了新指导和早期开发计划，以及FDA和EMA提供的详细要求的目标产品概况。这是大流行之前没有提供的信息。 数字化在COVID-19大流行期间增加了监管活动的连续性，并改善了所有利益相关者之间的互联互通，特别是由于虚拟会议和在线平台。使用电子文件、电子签名和电子提交推进了可持续性，减少了旅行和纸张的需求。使用既适用于人类又适用于机器的结构化数据集正在迅速发展，这使得自动化和基于云的平台的效率得以提高。生成性AI（Gen AI）也将在监管批准过程中发挥不可避免的作用。麦肯锡公司的一份最新报告提出，Gen AI启用的智能引擎将显著提高撰写提交文件和回应卫生当局查询（HAQ）的效率，通过预测潜在的HAQ模式，快速起草回应，并通知可以减少HAQ后续跟进的提交策略。报告还表明，Gen AI可以作为主要的提交内容撰写者，特别是起草基于协议、数据和统计分析计划的临床研究报告，以及创建表格和图表。医学作家随后可以集中精力处理需要更复杂临床解释的部分，改善团队之间的合作，降低成本，并限制质量问题。 数据和共享方法的协调将至关重要，以改善时间表。基于云的系统有潜力简化并行机构审查和依赖。论坛如ICH和ICMRA可以帮助促进这一点，并与利益相关者合作，避免出现分散或冲突的系统。大流行期间使用的额外灵活性可以应用于未来的疫苗计划，包括创新的临床试验策略（例如，平台方法，同时在临床测试多个候选者）、使用历史数据进行预测分析、利用其他试验中的安慰剂/标准护理数据，以及虚拟检查，这些已经得到接受，并且可以减少由于安排和旅行延迟而导致的时间表。其他选择包括放宽对单个批次放行测试的限制（例如，豁免重复批量放行/当地测试要求）、豁免当地临床数据的要求，以及豁免特定国家标签语言/艺术作品/细节的要求，包括接受包装上的QR码（电子标签）代替物理小册子。这些灵活性中的每一个在每种情况下都可能不可行；例如，由于缺乏技术，LMIC中使用电子标签可能不可行。总体而言，这些监管思维的转变有潜力彻底改变历史工作方式，这将在不损害质量、安全性和有效性的情况下提高效率和时间表。 除了过去十年中实施的监管创新和灵活性外，制造商的过程控制策略也有所进步。正如本节开头所讨论的，2021-2025年疫苗计划的第一个目标是促进疫苗开发、制造和相关技术的创新，这可以通过两个主要途径实现。在高层次上，CMC和cGMP都是过程控制策略（美国食品药品监督管理局，2022），具有确保产品始终满足既定质量要求的相同目标，但它们的区别在于它们的范围。CMC信息特定于产品，而cGMP是整个制造商运营的高层次框架。CMC需要对产品质量的细节进行细致的关注，并涉及定义CQAs及其相关的CPPs。一旦确定了这些，就可以为过程和产品规范定义一系列活动，以确保批次间的一致性。CMC计划将通过产品生命周期的每个阶段，通过产品组件、设备、制造条件、记录和人员的全面控制来展示。另一方面，cGMP是一组定义产品规划和开发以及设施设计和运营的高质量保证活动和指南的高层次集合。cGMP计划包括维护文件、设备、培训和设施，其中可追溯性是一个重要组成部分。CMC和cGMP系统经常交叉并且不是相互排斥的，两者都对产品成功至关重要。同步CMC和cGMP计划可能很复杂，方法可能因产品和制造商而异。 CMC和cGMP领域在过去十年中从创新中获益，例如，人工智能(AI)和机器学习(ML)，它们可以自动化数据分析、过程优化和质量控制等任务。大数据分析是强大的工具，可以用来识别趋势并改善决策制定。3D打印提供了快速创建产品和设备原型的前所未有的能力，加快了开发过程。甚至像虚拟现实(VR)和增强现实(AR)这样的技术也被用于培训员工和模拟流程。一个经常被忽视的进步是网络安全，它在保护知识产权和数据免受网络攻击方面至关重要。 在规划和执行方面的改进减少了向发展中国家的新兴制造商转让技术的时间表，这有助于全球可用性和可负担性，例如b型流感嗜血杆菌结合疫苗。在大流行之前，典型的疫苗技术转让需要27-29个月，因此缩短这个时间表对于迅速向全球人口供应COVID-19疫苗至关重要。技术转移的控制塔方法，涉及一系列定义好的事件和会议，确保有效沟通，特别是快速将问题升级到领导层，变得越来越受欢迎。其他敏捷的工作方式包括非等级制的高效决策制定、早期风险容忍投资、快速产能提升、在负面结果出现时的灵活性、确保跨学科团队成员中的高水平专业知识、在功能和公司之间使用共同的词汇，以及将质量要求视为推动者而不是障碍。行业、组织、监管机构和政府政治组织之间的合作和伙伴关系变得至关重要。 为了使国际技术转移成功，必须动员现有能力，建立新的能力，协调制造和监管流程，并分配资源——这些活动需要政治上的支持。CMC和cGMP中的另一个思维转变是集中式与分布式制造模型的概念。传统上，疫苗是在集中式地点生产的，这是由于技术转让到其他地点的高成本而经济驱动的。另一方面，分布式制造更接近最终用户生产产品，在大流行期间非常有用。由于过程平台，能够在多个地点建立过程变得更加可行，但批准每个地点的广泛监管要求仍然是一个障碍，以及对当地测试和质量保证的要求。尽管分布式制造无法提供与集中生产相似的规模经济，但灵活制造技术和监管流程的进步可能使这种方法在未来更加可行。 QbD涉及创建一个设计空间，这是一个多维组合的CPPs和CQAs，已被证明可以保证质量。为RNA疫苗合成生物反应器开发了一个迭代方法来创建生物过程QbD空间。在大流行情况下，迫切需要迅速反应，一个已经建立的疾病不可知平台过程，具有已建立的QTPP驱动的设计空间，将使团队能够在原材料可用时立即生成材料。从理论上讲，在强大的设计空间内的过程变化不需要额外的监管提交，从而创建具有更大灵活性的过程。QbD框架可以用来支持生产过程的开发和运营，并可以遵循迭代开发周期，这将在整个生命周期中提供持续改进。 11、结论  在过去几年中，疫苗开发能力取得了显著进步，这反映在对COVID-19大流行的加速响应中。mRNA和复制缺陷腺病毒已被确立为可以相对较快开发并扩大到以合理成本生产数十亿剂的主要新疫苗平台。在COVID-19疫苗的快速开发中取得的进展超出了所有预期。其他疫苗平台，如蛋白质抗原和活减毒疫苗(LAV)，仍然很重要，相关的技术进步已在本综述中强调。我们预计，基于对生物学和疾病理解的进步，疫苗开发将进一步取得显著进展。 疫苗制造创新，包括连续制造、一次性工艺、无细胞技术、过程分析技术以及放行检测，正在降低成本并提高效率。正在进行的创新也在取代传统的批量放行测试，以消除动物测试的需求。本综述中对疫苗分析进展的详细总结是故意的；这个领域在过去十年中取得了巨大的技术飞跃，影响了疫苗制造的各个方面，从而改善了一致性、生产力、产品质量、产品测试速度和运营规模。 近年来，在设计和开发旨在诱导T细胞介导的免疫反应的疫苗方面做出了重大努力。这一新兴领域有望提供针对诸如HPV、HIV和癌症等传染病的有效预防和治疗疫苗。也在开展努力，提供针对广泛的流感和SARS-CoV-2亚型的mRNA疫苗，这些疫苗提供基于T细胞的免疫，并比当前基于mRNA的COVID-19疫苗提供更长时间的保护。针对COVID-19的基于肽的T细胞靶向疫苗也处于早期临床开发阶段，支持开发和免疫原性评估的分析方法和检测正在取得进展。 随着疫苗和疫苗接种的发展，超越了预防应用到治疗领域，通过快速和详细的目标疾病分析，进一步推进该领域的机会范围有所增加。我们预测，在未来十年中，这一进展将以快速的速度继续，从而在全球范围内以合理的成本快速提供新疫苗，这得益于设计、技术和分析方面的创新。 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