University of Colombo

作者｜田丰：Luxvitae Therapeutics联合创始人/CEO and President 我们常说无论白猫黑猫，能抓到老鼠就是好猫。在下结论前，我们要给老鼠下个定义。我们要抓的是什么老鼠。今天抓得住的老鼠，我们明天还能抓得着吗？这些要抓的老鼠的定义，可以从是商业及临床的角度来下，也可以从技术角度来下。今天我们试图从技术角度下手，来探讨这个问题。希望从这个视角能引导我们走向下一个临床的成功，并带来商业上的成果。 如果ADC是一只猫，它的任务是去抓老鼠，第一只老鼠是疗效（Efficacy Mouse; “EM”），还有两只关于毒性的老鼠， 它们分别是脱靶毒性（Off-target toxicity; Toxicity Mouse 1;“TM1”）和在靶毒性（On-target toxicity; Toxicity Mouse 2;“TM2”）。我们今天来分析一下，目前的ADC，到底抓了那些老鼠。如果我们想找到一个规律，来提高未来的研发效率，还要探究一下，它们到底是白猫还是黑猫？是哪个猫抓了哪个老鼠？ 2024年6月27日，田丰博士受BiG 10周年邀请出席会议并做主题报告，本文为节选整理。文章仅供行业交流分享，不构成任何投资及用药建议！ 1.经历了寒冬期和冰川期，近些年来ADC获批密度越来越快，全球已有十几种ADC药物获批上市（图1），预计未来会有更多的ADC获批上市。 图1. 全球获批上市的ADC药物（截至2022）Adopted from Abzena Presentation 2.ADC由抗体、连接子和细胞毒素三部分组成，连接子包括可裂解和不可裂解连接子，细胞毒素包括微管抑制剂、微管稳定性破坏剂、DNA双螺旋结构破坏剂、拓扑异构酶抑制剂等。ADC的偶联方法也有很多，包括对天然抗体和工程化抗体进行修饰（图2）。 图2A：多种ADC偶联方法（天然抗体）Adopted from Abzena Presentation 图2B. 多种ADC偶联方法（工程化抗体）Adopted from Abzena Presentation 3.ADC的主要挑战是在维持一定抗癌活性的同时降低毒性 据计算，ADC药物在进入人体后，只有大约0.1%的药物能够到达目标靶向的癌细胞，而绝大部分ADC会在人体内及健康细胞中分解(Nguyen)。这种“离位” 现象导致药物产生毒性：一种是脱靶毒性（Off-target toxicity， TM1），另一种是在靶毒性（On-target toxicity, TM2）。  脱靶毒性：完整的ADCs可以通过非特异性内吞作用, 及与Fc/C型凝集素受体结合时的内化而被正常细胞吸收；或在血液及正常组织中，ADC的linker断裂，释放的有效载荷可以渗透通过细胞膜而被动扩散地进入正常细胞（图3）。 在靶毒性：几乎没有仅在癌细胞上表达，而不在正常细胞中表达的ADC靶标。靶标不仅会在肿瘤细胞上表达，也会在正常细胞表达，只是或多或少的问题。当这些ADC靶向正常组织细胞上的靶标，而通过内吞，进入正常细胞时，就会引起在靶毒性。 图3.毒性老鼠1 TM1(脱靶毒性) 和毒性老鼠2 TM2(在靶毒性) 4.ADC的治疗效果及毒副作用主要由上述的疗效、脱靶毒性、在靶毒性这三个方面综合形成。 本文主要从技术上来分析形成机理，探讨未来ADC的发展方向。 目前ADC大多用抗体上半胱氨酸的SH偶联毒素上的马来酰亚胺官能团。早前一直认为这个偶联是稳定的。近些年来，新的实验证据表明这个偶联是可逆的，不稳定的。小分子药物在人体血液中可以自动从抗体上脱落下来。 以Jackson等做的对照研究为例，可以看到，半胱氨酸偶联的小分子药物（橘黄色）是不稳定的，第5天时已经自行脱落近50%。而掉落的小分子药物会马上结合到人血清白蛋白（HSA）的半胱氨酸上。使用这种化学偶联的小分子会在抗体和血清白蛋白间来回跳，巧妙地形成一种稳定的平衡。一旦没有跳上抗体或HAS，游离的小分子就会被快速清除（图4）。 图4. 细胞毒素在ADC和HSA形成平衡 5.这种巧妙的平衡可能就发生在Enhertu上。Enhertu是目前最畅销的ADC药物，它的连接子是可裂解的。临床发现，当它进入体内，ADC达到c-max时，小分子药物也同时达到c-max。这意味着小分子药物从ADC上的脱落，主要发生在血液循环中，在进入细胞之前。根据上述机理，脱落的小分子药物很可能和HSA发生了结合（图5）。 在体内，ADC上的小分子药物，脱落的小分子药物以及其与HSA结合的小分子药物都贡献了小分子毒素的类似缓释的药物动力学及血浆暴露量。 最近，Tarcsa等的分析文章指出，在人体中，许多ADC的脱落游离的小分子毒素浓度高于其IC50值（可以认为是药物起效浓度）。如此，游离的DxD在一定程度上会在临床呈现类似长效化疗的疗效及毒性。 图5. Enhertu结构与PK性质 6.Enhertu是抗体与小分子上的马来酰亚胺偶联。而另一个HER2的ADC，T-DM1也使用这一化学来偶联，只是方向是反过来的。T-DM1的细胞毒素上的SH与修饰过的抗体上的马来酰亚胺偶联。如此，当细胞毒素从抗体上自行脱落掉下来后，因没有马来酰亚胺官能团，无法与HSA结合，从而会像普通化疗药物一样，被快速被排出人体，导致它的失去相当部分的由游离小分子造成的类似长效化疗的药效。如果当年Immunogen的科学家发明这个ADC时，把这个化学链接反过来，马来酰亚胺不在抗体上，而是在小分子毒素一边，T-DM1今天是否会有不同的疗效和安全性的临床表现，就不得而知了。（图6）。 图6. T-DM1结构与小分子PK性质 7.一般认为，ADC通过提高耐受剂量（MTD），降低起效剂量（MED）来拓宽治疗窗口。而最近根据Colombo等的2022年的分析，其涵盖了当时几乎所有的ADC， ADC的MTD（有时用RP2D）跟其相对应的细胞毒素小分子的MTD是一样的。不论什么ADC，什么靶点，什么抗体，都没有提高小分子毒素的MTD，只提高了对癌细胞的ADC的活性（MED）（图7）。根据他们的观察而得出的结论是，使用同一技术的ADC，无论抗体针对靶点如何变化，抗体如何变化， 其MTD都是都是一样的。然而，最近公布临床数据，却展示了一个例外。ARX788 的RP2D为1.5 或1.7 mg/kg； 而使用完全一样技术的ARX517，目前在一期临床已经爬到2.88 mg/kg, 而且剂量还在继续爬升。这与Colombo的模型不符。我们不禁要问，为什么呢？ 图7. 对当前ADC的MTD的解析 8.ARX788 是定点偶联 HER2 ADC，它使用独特的非天然氨基酸结合技术和不可切割的药物接头偶联而得。 其与Enhertu和T-DM1的小分子毒素的PK不同。Enhertu和T-DM1进入体内后小分子药物的峰值立即出现，而ARX788进入体内后小分子毒素与非天然氨基酸的偶合物的浓度很低，而且缓慢爬升，其峰值直到五天或七天之后才达到。说明小分子药物在血液中释放的很少， 药物的释放是ADC进入细胞后，经过溶酶体降解才释放出来。这会降低由游离小分子造成的脱靶毒性（图8）。Colombo 的模型之所以可以解释当前几乎所有的ADC，而不能解释ARX788和ARX517，是因为Colombo的模型所适用的是，本身具有的相当的长效化疗成分性质的ADC。它们的MTD（有时用RP2D）是由释放的游离小分子毒素主导的。所以，这类ADC临床呈现的MTD，与其相对应的细胞毒素小分子的MTD一致，是理所当然的。Ambrx技术平台上的两款ADC，基本上没有或很少有长效化疗的性质成分，所以无法用Colombo的模型来解释。 图8. ARX788结构与PK性质（Ambrx public information） 9.研发ADC是一项复杂的工程，要综合靶标、适应症、偶联方法，小分子药物、连接子和抗体等多种要素。目前的ADC大面上有两类路线。第一类路线，也是目前最普遍的，使用可断裂链，兼备长效的化疗性质（L）及ADC靶向递送（A）的ADC，以Enhertu为代表（图10）。其疗效和毒性由L及A共同提供。其L和A的成分比重，由可断裂链的稳定性的高低来调节。就临床展现的毒性来讲， 较不稳定的linker的ADC，其毒性呈现会更像化疗般的脱靶毒性， 比如Tredolvy；较稳定的linker的ADC，其毒性呈现会偏向脱靶毒性加上在靶毒性。从技术角度来分析，这类ADC应该是既没有抓住毒性的第一只老鼠（TM1，脱靶毒性），也没有抓住第二支关于毒性的老鼠（TM2，在靶毒性）。它既不是白描（A），也不是黑猫（L），更像一只灰猫。目前临床上，绝大多数ADC所呈现的毒性为类似化疗的系统性脱靶毒性。展望未来，这种用调节linker 的稳定性，在A和L 间玩平衡的游戏的技术走向， 目前还看不清楚（图10）。这一类ADC目前属于主流，而且取得了商业上的巨大成功。 此外，也有团队在这一类ADC平台的基础上，设计各类活性开关，试图来解决在靶毒性问题（图9）。但到目前为止，在临床上，这一问题还有待突破（Liu） 。 图9 试图解决实体瘤在靶毒性问题的ADC设计 10.第二类路线的ADC，为数不多，以ARX788和ARX517为代表，使用不可断裂连。这种ADC的长效化疗的性质（L）几乎没有，主要呈现为ADC靶向递送（A）的ADC。就毒性来讲， 脱靶毒性问题得到部分缓解：其由小分子脱落造成的脱靶毒性问题得以解决，而由非特异细胞内吞造成的脱靶毒性， 还有待观察。和第一类ADC相比，这类ADC，更像一只白猫（A）。 它部分缓解了脱靶毒性问题，抓住了毒性的第一只小老鼠 （脱靶毒性的老鼠，TM1）；没有抓住第二支关于毒性的老鼠（TM2，在靶毒性）。对这类ADC而言，如果肿瘤靶点在某些正常组织中有相当程度的表达，在靶毒性会是一个严峻的挑战。ADC的在靶毒性（TM2）问题，相较与脱靶毒性（TM1）问题，在难度上要大很多（Liu）。即便如此，对这第二类ADC的未来技术走向，我认为应该是往前走，迎着困难上，去解决在靶毒性问题。在第一类ADC平台基础上，那只灰猫未能解决的在靶毒性问题，或许是第二类ADC平台，这只白猫的一个机遇（图10）。 图10 ADC当下势态和未来走向  主要参考文献  1.Raffaele Colombo and Jamie R. Rich, “The therapeutic window of antibody drug conjugates: A dogma in need of revision”, Cancer Cell, 40, November 14, 2022, 1225. 2.Tarcsa E, et al. “Antibody-drug conjugates as targeted therapies: Are we there yet? A critical review of the current clinical landscape”, Drug Discov Today: Technol (2020). 3.Toan D. Nguyen, Brandon M. Bordeau and Joseph P. Balthasar， “Mechanisms of ADC Toxicity and Strategies to Increase ADC Tolerability”, Cancer, 2023, 15, 713. 4.Dowdy Jackson, et al. “In Vitro and In Vivo Evaluation of Cysteine and Site Specific Conjugated Herceptin Antibody-Drug Conjugates”, PLOS ONE, 2014 , Volume 9 , Issue 1 , e83865. 5.Yutong Liu et al, “Engineering antibodies for conditional activity in the solid tumor microenvironment”, Current Opinion in Biotechnology,  2022, 78, 102809. 共建Biomedical创新生态圈！ 如何加入BiG会员？

A team of researchers has found a potential way to treat conditions like depression and anxiety with fewer side effects. Drugs that treat conditions like depression and anxiety often come with varying side effects, as they regulate various functions within the human body at the same time. What if these drugs could activate only the functions that target the specific conditions that they are designed to treat? A team of researchers has found a potential way to treat these conditions with fewer side effects. Led by Professor Gavin Dawe, Head of the Department of Pharmacology at the Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore (NUS Medicine), the team conducted modifications of relaxin-3 -- a neuropeptide, or molecule, found mainly in the human brain and nervous system -- which regulates a wide range of physiological functions, including stress responses, appetite, mood and pain perception. When relaxin-3 is released in the brain, it binds to a target receptor RXFP3 -- to trigger a variety of signalling responses among the cells, which affect the body's physiological processes. However, as RXFP3 is involved in many different functions, a drug developed to treat certain conditions may cause unwanted side effects -- because several of RXFP3's signalling pathways are activated at the same time. For example, a drug that treats depression may cause adverse effects related to another function, such as feeding behaviour, which is related to eating disorders and obesity. The receptor has also been demonstrated in much existing research, including earlier work by Prof Dawe, to be a potential new target for drugs to treat these conditions. To develop better drug treatments with fewer side effects, the key is to activate only specific signalling pathways of RXFP3 that target specific conditions. Prof Dawe's team modified the relaxin-3 molecules, such that they activated only a part of the RXFP3 response in their interaction, instead of all the different signalling pathways. Their work, published in Science Signaling, is the first discovery that modifications of relaxin-3 can lead to selective activation of some RXFP3-led signalling pathways, which is a mechanism known as biased agonism. Prof Dawe said, "Our study has pointed to potential ways of developing drugs by modifying relaxin-3, or other neuropeptides, that can selectively activate specific functions within the body. This is important as it means drugs could be designed to have more specific effects and less undesired, adverse effects, making them more effective in managing a range of conditions like anxiety, depression, eating disorders, obesity, and addiction." Through a technique known as peptide stapling, the research team modified the B-chain of relaxin-3, replacing blocks of amino acids within them with artificial ones that introduce 'chemical bridges' between them. Alone, the B-chain is highly flexible and can twist and bend into many different shapes, reducing its ability to be stabilised for more effective binding and activation of the receptor RXFP3. The stapling process locks the shape of the specific B-chain in relaxin-3, stabilising it for a more efficient interaction with the receptor RXFP3, where it triggers certain signalling pathways in the brain that affect the body's physiological functions. Dr Tharindunee Jayakody, first author of the study and PhD alumna of the Department of Pharmacology at NUS Medicine, said, "We are at very early stages in terms of the journey in making clinically useful drugs. However, the promising findings from our study are a significant step in our aspiration to separately design stapled peptides that have selective effects on anxiety, depression, eating disorders and addiction. Our collaborative work would also strive to understand how proteins like RXFP3 function at a molecular level, with the help of biased agonists." She is leading a team of researchers to understand the molecular properties of proteins such as RXFP3 at the Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Colombo, Sri Lanka, where she is a lecturer in biochemistry and molecular biology. With the conclusion of the study, the research team plans to use different stapled peptides to understand how the signalling functions, activated by the interactions between relaxin-3 and RXFP3, affect the body's physiological functions and human behaviour.