JAFC | 细胞外γ-氨基丁酸正交无泄漏生物传感的工程嵌合化学受体和双组分系统

2024-06-24

微生物疗法

01 遇见/内容近日，Journal of Agricultural and Food Chemistry在线发表了山东大学祁庆生团队王倩教授的研究成果“Engineering Chimeric Chemoreceptors and Two-Component Systems for Orthogonal and Leakless Biosensing of Extracellular γ-Aminobutyric Acid.” 。山东大学2020级硕士研究生赵静宇为论文第一作者，王倩教授为论文通讯作者。 γ-氨基丁酸(GABA)是天然的非蛋白氨基酸，可用作食品、饲料、肥料和化妆品的添加剂，也是合成尼龙的单体。微生物如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和甲醇芽孢杆菌已经被广泛开发用于GABA的发酵生产。一种有效的GABA生物传感器可以促进GABA的快速简便测量和高通量筛选。双组分系统(TCSs)广泛存在于微生物众多信号通路中，能够感知和响应各类细胞内外刺激，是开发具有合成生物学应用的生物传感器的宝贵资源。然而，天然的双组分传感元件存在信号串扰、过高的本底泄露、激活能力有限等问题，使其很难被开发为高性能的生物传感器。针对以上问题，山东大学微生物生物合成与代谢调控团队设计将化学趋化受体和双组分系统的组氨酸激酶形成嵌合受体PctC/PhoQ，通过嵌合体文库筛选构建正交绝缘的双组分突变体对PhoQ*PhoP*，构建得到了GABA的生物传感器。通过响应调节子PhoP 的DBS工程、传感器启动子和RBS强度的精调以及在传感器中引入TEV蛋白降解系统，进一步降低了GABA传感器的本底泄漏。优化后的生物传感器具有增大的动态范围(15.8倍)和较高的检测阈值 (22.7 g/L)。最终研究者将该传感器与微滴微流控技术结合，高通量筛选ARTP获得的GABA谷氨酸棒状杆菌高产菌株，证明了该生物传感器胞外检测GABA的有效性，为GABA的进一步代谢工程提供了方便有效的工具。图1 五种嵌合GABA生物传感器的构建铜绿假单胞菌中化学趋化受体PctC可以天然响应GABA。将其与大肠杆菌的五种组氨酸激酶融合组成嵌合受体，分别选择PctC二次跨膜结束时及各组氨酸激酶二次跨膜后胞内肽段进行融合。通过测试发现嵌合体PctC/PhoQ对GABA有一定响应效果。为了优化PctC/PhoQ嵌合体的性能，利用PATCHY策略构建了一个PctC感知结构域和PhoQ激酶域不同程度截短的融合文库，利用荧光激活流式分选(FACS)对文库进行筛选，以鉴定GABA依赖性生物传感器变体(图2A)。筛选出三株生物传感器诱导倍数高于原始菌株，该嵌合体融合位置为PctC294位点与PhoQ264位点。图2 PctC/PhoQ嵌合体文库的构建、筛选与表征响应调节子PhoQ天然受低浓度Mg2+激活，高浓度Mg2+抑制。培养基中的Mg2+ 浓度可能诱导PhoQ磷酸化从而造成信号串扰。因此敲除基因组中PhoQ以期Mg2+不再对传感器形成干扰。实验结果发现，传感器的本底泄露的确降低了，动态范围从2.01倍提高到2.97倍。接着，为避免大肠杆菌中其它双组分系统对传感器中响应调节子PhoP进行激活从而造成串扰，将PhoQ与PhoP互作界面的关键氨基酸突变为保守氨基酸使其更加正交，传感器的本底泄露进一步降低，动态范围提高至3.49倍。图3 GABA嵌合生物传感器的正交性实验接下来，研究人员又通过三种策略对生物传感器的本底泄露和动态范围进行优化。大肠杆菌中PhoP的DNA结合位点较多，选择与共有序列相似的9个DNA结合位点利用荧光偏振法验证PhoP与DNA序列的亲和力。经乙酰磷酸磷酸化处理后，OyrbL和PhoP具有最强的亲和力。该结合位点对于传感器的激活效果也最好。另外，调整降低传感器启动子和RBS强度均能降低本底泄露且提高动态范围。使用J23117-B0034使动态范围达到8.1倍。为在不影响最大荧光表达的基础上降低基础泄露，作者利用基于蛋白酶和降解标签的报告蛋白降解控制系统。利用嵌合双组分传感器控制蛋白酶(TEV)和GFP表达。动态范围最高达到15.8倍，具有较小的基础泄露，检测阈值提高到22.7 g/L。图 4 对响应调节子PhoP具有不同亲和力的DBSs生物传感器的表征图5 通过调节合成启动子的强度和RBS降低嵌合生物传感器的本底泄漏图6 利用TEV-Ssr系统降低生物传感器的本底泄露和增大阈值一株产GABA的谷氨酸棒状杆菌G4129经ARTP诱变后，将突变文库包封在液滴中培养48h，然后将大肠杆菌传感器细胞注入液滴继续培养24h，经过高通量微滴分选谷氨酸棒杆菌基因组突变细胞文库。随机选取24株突变菌株，所有突变体菌摇瓶发酵的GABA产量均高于G4129。突变株M24的GABA产量最高，滴度为9.3 g/L，是菌株G4129的1.7倍。图7 利用全细胞生物传感器对GABA高产谷氨酸棒状杆菌的高通量液滴分选上述研究工作得到了国家重点研发计划(2019YFA0904900)及国家自然科学基金(32270089)的资助。感谢中科院天津工业生物技术研究所刘君教授对于菌株的馈赠和山东大学毕双玉教授的帮助。 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jafc.4c00041 02 遇见/致谢感谢山东大学王倩教授课题组对本号的支持，感谢该组提供本文稿件支持！关注我，更多资讯早知道↓↓↓