Cell+Dev Cell | 许靖蔚等揭示代谢酶纤维有效帮助芽殖酵母从细胞休眠中复苏

2024-06-24

引言面临各种环境胁迫，生物有机体具备有相应机制来适应不利环境。其中较为常见的方式是进入细胞休眠状态（dormancy）。进入休眠状态时，细胞会降低代谢活动能力并停止增殖，同时还可能会激发特定的发育进程。双倍体芽殖酵母在饥饿环境下会进入配子发生（gametogenesis）过程：其通过减数分裂形成单倍体进而形成具有环境抗性的孢子【1】。在这整个过程中，细胞将会发生大规模重塑，其中有部分代谢酶可以通过形成纤维或多聚合物的形式来调控代谢活动【2-5】。然而，这些代谢酶多聚纤维在不同细胞状态下，尤其是配子发生后的细胞长时间休眠期的功能，目前还不太清楚。 2024年6月20日，瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH）Martin Pilhofer和维亚纳大学Joao Matos组在Cell杂志发表了题为 FilamentID reveals the composition and function of metabolic enzyme polymers during gametogenesis 的研究论文，综合多种成像技术鉴别并揭示了代谢酶多聚纤维的形成能够帮助芽殖酵母从细胞休眠中有效复苏。作者首先利用低温聚焦离子束刻蚀（cryo-focused ion beam milling， cryoFIB）和冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryoET）观察在饥饿环境下进行减数分裂的双倍体酵母内细胞重塑过程。令人惊喜的是，作者在不同细胞器和细胞质中发现大量不同类别的多聚纤维。该观察结果也与之前在老鼠卵母细胞原位成像中观察到大量纤维结构相吻合【6】。对于减速分裂酵母内观察到的多聚纤维，作者主要发现有两种：一种分布在细胞器线粒体内；另一种分布在细胞质和细胞核内。该两种多聚纤维符合之前其他组的相关报道描述【7-9】，但目前其蛋白组成成分仍未知。鉴于该类多聚纤维形态复杂、丰度低、分布不均，常用的结构生物学方法，如冷冻电镜单颗粒三维重构（cryo-electron microscopy single particle analysis, cryoEM-SPA）以及亚断层结构平均（sub-tomogram averaging），无法单独应用于该类纤维的结构解析。为此，作者结合cryoET和cryoEM-SPA建立了一套系统性多聚纤维鉴定方法：FilamentID （Filament IDentification) 。 FilamenID流程主要包括样品制备、冷冻数据收集和分析、蛋白组成成分鉴定和验证。在样品制备方面，作者避免了蛋白纯化以及繁琐低效的cryoFIB，对传统细胞染色体显示方法并进行改良，既保证了样品丰度也提高了样品衬度（step 1-2）：首先分离得到处于减速分裂中的酵母原生质体或细胞器；再利用渗透膨胀将原生质体或者细胞器局部裂解，释放内部成分，用于制备冷冻样品。随后，作者用cryoET和cryoEM-SPA分别对冷冻样品成像和后期数据处理（step 3-4）：首先通过cryoET以及亚断层结构平均得到一个低分辨三维结构，进而获取多聚纤维结构的对称性以及粗略的螺旋参数信息；这些信息可以应用于 cryoEM-SPA的初步数据处理中得到初始模型；再通过对初始模型的螺旋参数进行精确估算和优化，并用于最后的结构解析。根据解析后纤维结构的分辨率，作者采用不同方法对多聚纤维的蛋白组成成分进行鉴定（step 5）：如果分辨率高于4 Å时，可以直接根据电子密度搭建蛋白主链，再通过Dali search获得其同源蛋白结构信息，进而知道蛋白组成成分；若分辨率仅为亚纳米时，需要综合利用蛋白质组学分析以及AlphaFold结构预测对候选蛋白进行分析。在获知潜在组分后重新优化cryoEM-SPA数据处理方法从而得到较高分辨率结构。由于蛋白异构体（isoform）的存在，作者在解析蛋白结构并获悉其成分信息后，采用基因敲除和突变的方法进一步验证结果的准确性（step 6）。图1: FilamentID方法流程图（Credit: Cell）通过FilamentID，作者鉴定了两种可以形成多聚纤维的代谢酶：乙酰辅酶A合成酶1（acetyl-CoA synthetase 1， Acs1）和乙醛脱氢酶4（aldehyde dehydrogenase 4， Ald4）。其中Acs1在细胞质和细胞核内形成多聚纤维，Ald4通过两种不同堆积方式在线粒体内形成多聚纤维。该研究组对代谢酶Ald4多聚纤维进一步的研究成果以Waves of regulated protein expression and phosphorylation rewire the proteome to drive gametogenesis in budding yeast为题同时发表于Development Cell 。在论文中，作者通过蛋白质组学分析发现Ald4的多个位点在酵母配子形成过程中会被磷酸化，并且其磷酸化会对于多聚纤维的形成有很大影响。在鉴定不同多聚纤维的蛋白组成成分后，作者着重针对Acs1代谢酶进一步探究其形成多聚纤维后的生物活性状态。乙酰辅酶A是能量代谢途径的枢纽物质，Acs1通过两步酶促反应催化生成乙酰辅酶A。作者首先探究了Acs1多聚纤维处于何种酶促反应状态。通过结构分析，作者发现多聚纤维中的Acs1结合着第一步酶促反应产物。通过与不同酶促反应状态下Acs1同源结构的对比也证明了Acs1可以通过形成多聚纤维来阻止第二步酶促反应的继续，使得Acs1在形成多聚纤维时处于第一步酶促反应结束状态。作者采用点突变方式证实了第一步酶促反应对于Acs1形成多聚纤维是必需的。除了第一步酶促反应产物分子，作者还在相邻的Acs1蛋白层间发现另一代谢小分子，并通过点突变证实该小分子对于介导多聚纤维的形成至关重要。因此，Acs1蛋白需要通过两种不同的小分子来介导其多聚纤维的形成。随后作者继续探究Acs1多聚纤维的功能。通过免疫荧光成像观察Acs1多聚纤维在酵母减速分裂中的形成过程，作者发现Acs1多聚纤维的形成不局限于特定减速分裂的时期，而且其也可以在减速分裂后形成的孢子中观察到。为进一步探知Acs1在酵母减速分裂和休眠状态中的功能，作者利用不同Acs1突变体分析了其对于酵母孢子形成和孢子休眠复苏的影响。最终作者发现对于无法形成Acs1纤维的酵母突变体，饥饿能诱导孢子形成，但它的孢子却无法在长时间休眠后顺利复苏。另外，作者通过对于饥饿环境下酵母单倍体成像分析也发现Acs1多聚纤维，并指出Acs1多聚纤维的形成可能是细胞应对饥饿环境胁迫下的普遍反应，以及细胞可以利用该类多聚纤维帮助其顺利有效地从休眠状态中复苏。图2: Acs1多聚纤维功能模型（Credit: Cell）综合结构以及细胞实验结果，本研究对于Acs1代谢酶多聚纤维提出了以下模型：1.当细胞面对饥饿环境时，Acs1代谢酶能够通过形成多聚纤维的方式使其停滞于完成第一步酶促反应状态。该多聚纤维的形成可能避免在细胞受到环境胁迫后对Acs1蛋白进行降解，从而起到一个保护储存库的作用。2.对于酵母双倍体来说，该多聚纤维可以进一步通过减速分裂的方式分配到相应的单倍体以及后续形成的孢子中。3.在孢子萌发或者单倍体解除休眠过程中，Acs1多聚纤维能够解聚，进而使得游离的Acs1能够继续执行第二步酶促反应生成最终产物乙酰辅酶A。乙酰辅酶A的形成能够帮助细胞可以有效快速的从休眠状态中复苏。参考文献 1. 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