通过切向流深层过滤（TFDF）生产重组水泡性口炎病毒载体

2024-03-22

疫苗临床研究

基于细胞培养的载体疫苗和病毒治疗药物的生产越来越受到人们的关注。所使用的载体不仅截留了感染细胞的能力，而且还诱导了强大的免疫反应。使用两种基于重组水泡性口炎病毒（rVSV）的构建体，我们对集成的封闭式一次性灌流系统进行了概念验证研究，该系统允许连续的病毒收获和澄清。使用悬浮 BHK-21 细胞以及水疱性口炎病毒和新城疫病毒 (rVSV-NDV) 的融合溶瘤杂交体，利用改良的交替切向流装置 (mATF) 或切向流深层过滤 (TFDF) 系统进行细胞截留。由于前者的中空纤维具有较大的内腔（0.75 mm；孔径0.65μm），因此可以防止感染过程中形成的多核合胞体造成的膜阻塞。然而，病毒颗粒被完全截留。相比之下，TFDF过滤单元（内径3.15 mm，孔径2-5μm）不仅可以实现高活细胞密度（VCC，16.4-20.6×10 ^6 cells/mL），而且可以连续收获和澄清载体。与优化的批次工艺相比，在澄清的滤液中获得了高11倍的传染性病毒滴度（最大7.5×10 9 TCID 50 /mL）。使用HEK293-SF细胞和表达绿色荧光蛋白的rVSV载体，灌流培养实现的最高VCC为11.3×10 ^6 cells/mL，滤液中感染性病毒滴度高达7.1×10 10 TCID 50 /mL。不仅可以连续收获，还可以进行澄清。虽然单位细胞病毒产量相对于作为对照的批次工艺有所下降，但获得了增加的时-空产量。关键点•使用 TFDF 灌流系统生产病毒载体使时-空产量提高 460%•使用 TFDF 系统可以连续收获和澄清病毒•TFDF 灌流系统在建立强化载体生产方面具有巨大潜力在对抗传染病的不懈追求中，在细胞培养中生产的重组载体疫苗在过去十年中受到了欢迎。与其它疫苗平台相比，基于病毒载体的疫苗保留了感染细胞的能力，从而通过增加体液和细胞免疫来诱导强大的免疫反应。基于腺病毒载体的SARS-CoV-2 疫苗成功大规模应用及其针对多种传染病的潜在应用，推动了开发新型重组载体疫苗以及改进当前生产工艺的巨大研究努力（到 2023 年将占全球疫苗研发领域的 14%）。其中一种载体基于重组水泡性口炎病毒（rVSV）。由于其广泛的向性、高滴度的快速复制动力学、低病毒致病性、人类中罕见的预先存在的抗载体免疫力以及易于基因操作，rVSV 在疫苗和溶瘤应用中受到欢迎。将 rVSV 的天然糖蛋白替换为任何目的糖蛋白，可以递送外源抗原，从而为疫苗应用引发强大的体液和细胞免疫，同时降低与生产相关的生物安全标准（例如，针对高致病性病毒）。使用 rVSV 生产平台生产的各种候选疫苗已显示出对埃博拉病毒、SARS-CoV-2、马尔堡病毒、拉沙病毒、安第斯病毒、乙型肝炎病毒、鼠疫耶尔森氏菌、呼吸道合胞病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒、尼帕病毒、寨卡病毒、人乳头瘤病毒、动物模型中的流感病毒的预防效果；有些正在临床试验中进行测试。尽管预防功效得到充分证明，但目前只有一种基于 VSV 的扎伊尔埃博拉病毒疫苗 (rVSV-ZEBOV) 于 2019 年获得 FDA 和 EMA 批准。rVSV 作为溶瘤药物的使用特别令人感兴趣，因为其高致细胞病变性、快速复制周期、不整合到宿主基因组中、IFN 敏感性、选择性感染和有效诱导肿瘤细胞凋亡，满足病毒疗法的所有关键特征。进一步的基因修饰方法，例如用异源融合糖蛋白假型化先天糖蛋白，生成可以递送基于融合的病毒繁殖的嵌合构建体，进一步增强基于 rVSV 的构建体的溶瘤能力。一种基于 rVSV 的新型构建体含有新城疫病毒 (NDV) 的融合突变蛋白，并在各种肿瘤模型中显示出有希望的临床前功效。为了满足前所未有的需求以及许多基于 rVSV 的疗法所需的高输入剂量，需要强化当前基于批次的生产策略。与传统的贴壁生产相比，在化学成分确定的培养基中使用悬浮细胞系可以设计更容易规模放大的工艺，以获得更高的细胞密度和更小的占地面积。通过建立灌流培养，用新鲜培养基不断更换营养耗尽的培养基，同时使用细胞截留装置将细胞截留在生物反应器中，甚至可以获得更高的细胞密度。灌流模式下的工艺强化可提高病毒滴度、单位细胞病毒产量 (CSVY)、时-空产量 (STY) 和单位体积病毒生产率 (VVP)，已针对不同病毒和载体（例如寨卡病毒、甲型流感病毒（IAV）、慢病毒载体（LV）、腺相关病毒（AAV）、rVSV-COV-2、改良安卡拉痘苗病毒）进行了详细阐述。然而，通过瞄准更高的细胞密度，CSVY可能会降低（高细胞密度效应），从而降低STY和VVP。对于高细胞密度培养，广泛采用基于膜的系统，即交替切向流（ATF）和切向流过滤（TFF）组件。这些系统的一个主要缺点是过滤器污染的风险（尽管 ATF 具有自清洁反冲功能）和病毒颗粒截留，这会导致病毒在细胞环境中的生物反应器内积聚，直到完全收获生物反应器培养液。由于病毒释放通常会导致细胞裂解，细胞碎片和 DNA 随着时间的推移而增加，同样增加了培养液的粘度，并进一步增加了膜堵塞的风险。由于细胞蛋白酶的释放、病毒颗粒对细胞碎片的吸附以及病毒温度敏感性，在生物反应器内长时间停留会对病毒感染性产生负面影响。此外，rVSV-NDV 等融合溶瘤构建体会在灌流培养物中形成大型多核合胞体（>100 μm），可能会阻塞常用中空纤维膜的小尺寸管腔。克服这一问题的一种方法是使用非膜系统，例如声学过滤器或倾斜沉降器；然而，这些系统通常很复杂或与工业规模的生物反应器不兼容，并且细胞截留效率较低。或者，可以使用允许病毒颗粒通过的膜。最近，这一点已在利用与 ATF 系统连接的管状膜（VHU，孔径约 10 μm）生产 IAV 缺陷型干扰颗粒中得到证实。使用切向流深层过滤 (TFDF) 灌流组件（孔径 2–5 μm），已显示可以连续收获 LV 和 AAV。这使得感染性病毒颗粒的停留时间更短，并且可以立即将收获的材料储存在冷却罐中，以提高病毒稳定性，从而提高病毒产量和生产率。例如，使用用于 IAV 生产的声学沉降器进行连续病毒收获，相对于使用带有 PES（孔径0.2 μm）的中空纤维膜的灌流运行，将 CSVY 和 VVP 提高了 1.5 倍。此外，TFDF 组件可以将连续病毒收获和澄清结合在一个步骤中，减少单元操作数量，从而节省时间和金钱。总而言之，这可以实现上游（病毒生产）和下游工艺（病毒纯化）的直接整合，进一步降低成本，同时提高灵活性和生产力。在这项研究中，我们评估了 TFDF 灌流系统作为新型细胞截留装置的适用性，以及在单次操作中实现灌流培养和连续收获过滤以及澄清（降低浊度）的适用性。将两种不同的基于 rVSV 的载体（一种诱导经典的细胞病变效应，另一种介导细胞融合反应）的生产工艺强化与优化的批次工艺进行比较。详细的试验操作和结果，请参考原文。用于灌流培养的 TFDF 设置方案，具有手动调整 (I) 或自动 (II) 灌流控制。BHK-21 细胞通过 Levitronix 磁力离心泵以单向流连续泵入 30 cm 2 TFDF 组件（孔径 2–5.0 μm）。分别使用天平和 KrosFlo 的集成流量传感器控制进料和入口的流量。对于细胞生长期，滤液流量可以手动调节（I，使用 KrosFlo 控制器）或控制（II，使用电容探针）。较大的橙色圆圈表示细胞，黑色椭圆表示病毒颗粒，虚线表示不同类型的信号传输。使用配备 3-L 模块化适配器并连接到 mATF 的 SB10-X，在灌流模式下，在 BHK-21 细胞中生产 rVSV-NDV。以0.9×10 ^6 cells/mL接种BHK-21细胞，并在批次生长期后56小时开始灌流。随着时间的推移手动调整灌流速率。对于细胞截留，使用 0.65 μm mPES 中空纤维膜。一旦达到44.5×10 ^6 cells/mL的VCC （MOI为1E-4），进行感染，将温度降低至34℃，并暂停灌流4小时。A VCC（实心符号）和活性（空心符号）。B单位细胞灌流速率（实心符号）和灌流速率（虚线，收集的滤液重量除以 WV）。C在生物反应器（实心符号）和滤液（空心符号）内测量的感染性病毒滴度。使用与 TFDF 系统连接的 3-L STR 在灌流模式下在 BHK-21 细胞中生产 rVSV-NDV 的关键工艺参数。BHK-21细胞以0.8×10 ^6 cells/mL接种，并在批次生长期后46-51小时使用TFDF组件（孔径2-5μm）开始灌流。第一次 TFDF 运行（TFDF1，紫色方块）是手动调整的，而第二次 TFDF 运行（TFDF2，粉色圆圈）是根据电容探针测量的生物量进行控制。一旦达到14×10 ^6 cells/mL的VCC （MOI为1E-4），进行感染，温度降至34℃，并暂停灌流1-2小时。A活细胞密度（实心）和活性（空心）。B单位细胞灌流速率（实心）和灌流速率（虚线，收集的滤液重量除以 WV）。C生长和感染过程中 TFDF 膜的细胞截留效率（实心）和浊度降低（空心）。D细胞生长和感染阶段的跨膜压 (TMP)。虚线表示感染时间。BHK-21 细胞在TFDF1（紫色方块）和 TFDF2（粉色圆圈）灌流模式下生成的 rVSV-NDV。在反应器（实心）和滤液（空心）中测量的A感染性病毒滴度 (TCID 50 /mL)、C双链 DNA (μg/mL) 和E总蛋白 (mg/mL)的时间进程。TFDF 膜允许通过滤液连续收获 rVSV-NDV。B、D、F将滤液收集在多个部分（“收获瓶 1-4”）中，每 12-24 小时更换一次，以防止病毒感染性丧失。瓶 1 指从 0 至 24 hpi 收集的滤液，瓶 2 指 24–36 hpi，瓶 3 指 36–48 hpi，瓶 4 指 48–60 hpi。“最终收获”是指在最终收获步骤中回收的材料（浓度1，洗滤；最终浓度2）。“累计”是指所有瓶子的累计产量和最终收获量。使用不同生产模式和工艺的 rVSV-NDV 溶瘤病毒效力值的比较。在 48 hpi 时测定了Huh7 肿瘤细胞的活性，包括批次模式（红色三角形）、声学沉降器灌流（AS1，蓝色实心三角形；AS2，空心蓝色三角形）和 TFDF 灌流（TFDF1，紫色方块；TFDF2，粉色圆圈）。非线性回归分析后，从剂量反应曲线确定IC 50和log IC 50值。所有值均以三次重复的平均值报告，其中n =3。在 HEK293-SF 细胞中以批次模式生产 rVSV-GFP。使用一个摇瓶（SF 1，50 mL WV，红色圆圈）、一个 1 L STR（STR 1，700 mL WV，浅绿色方块）和一个 3 L STR（STR 2，2100 mL，深绿色方块）进行三批生产运行）。细胞以0.3–0.4×10 ^6 cells/mL接种并培养至1.1–1.3×10 ^6 cells/mL。感染前，温度从 37°C 降至 34°C。细胞以 1E-3 的 MOI 被感染。A VCC（实心符号）和活性（空心符号）。B传染性病毒滴度（TCID 50 /mL）。使用与 TFDF 系统连接的 3-L STR 在灌流模式下在 HEK293-SF 细胞中生产 rVSV-GFP。循环在接种前开始。HEK293-SF细胞以0.8×10 ^6 cells/mL接种，并在批次生长24小时后使用TFDF组件（孔径2-5μm）开始灌流。随着时间的推移手动调整灌流速率。感染前，温度降至34°C。以1E-3的MOI感染细胞(10×10 ^6 cells/mL)，并暂停灌流1小时。A活细胞密度（实心）和活性（空心）。B单位细胞灌流速率（实心）和灌流速率（虚线，收集的滤液的重量除以 WV）。C生长和感染期间 TFDF 膜的细胞截留效率（实心）。D反应器（实心符号）和滤液（空心符号）中的感染性病毒滴度 (TCID 50 /mL) 相对于感染后时间 (h) 进行绘制。渗透线显示的最后时间点 (31 hpi) 是指最终收获步骤。讨论第一种基于 rVSV 的疫苗，即埃博拉病毒疫苗 Ervebo®，已于 2019 年获得批准（EMA 2019；FDA 2019）。此外，用于疫苗和溶瘤应用的多种基于 rVSV 的构建体目前正在进行临床试验。因此，无论用途如何，开发高产量的生产平台对于满足临床试验和市场需求都至关重要。与传统载体平台相比，rVSV-NDV 诱导合胞体给生产工艺带来了额外的挑战。在这项概念验证研究中，我们评估了 TFDF 系统在强化高细胞密度生产方面的通用性，适用于两种不同的基于 rVSV 的构建体（rVSV-NDV 和 rVSV-GFP），以实现连续的病毒收获和澄清。使用 mATF 生产 rVSV-NDV中空纤维膜的产物截留是基于 ATF 的细胞培养生产的一个众所周知的挑战，它阻止了病毒颗粒等的连续收获。为了评估中空纤维膜用于生产形成大型多核合胞体的融合溶瘤病毒的适用性，选择了市售的 0.65 μm mPES 膜，其内腔尺寸比之前观察到的合胞体 (120–140 μm) 大，连接到 mATF，并表征病毒截留。膜材料对产物截留的影响尚未完全阐明。虽然一些研究发现，由于负电荷密度较高，使用聚砜 (PS) 膜的抗体截留率比聚醚砜 (PES) 和 mPES 更明显，但其它研究报告了更有利的理化和结构特性 (PS 膜开放的孔结构和高孔隙率，即使在 0.34 μm 的低孔径值下也能收获黄热病病毒颗粒（~50 nm）)。除了膜材料之外，孔径大小对于产物截留也起着至关重要的作用。令人惊讶的是，与较低孔径（例如 0.2 μm）相比，具有较高孔径（例如 0.65 μm）的膜通常表现出更高的产物截留率。较大孔径更明显的异质孔隙分布会增加污染的敏感性，因为沿膜的滤液通量的变化使得较大的孔隙容易沉积颗粒和浓差极化。此外，由病毒诱导的细胞裂解引起的小尺寸细胞碎片（0.2-0.5 μm）可以进入较大的膜孔，导致膜堵塞和产物滞留，但不会进入较小的膜孔。使用 HEK293 细胞进行 rVSV-NDV ATF 生产时，使用 0.2 μm PES 中空纤维膜，在观察到第一次合胞体形成后，即在 18 hpi 时，导致膜完全堵塞。因此，膜的选择主要基于内部纤维腔而不是孔径或材料。与使用 0.2 μm PES 膜 (0.8 L/min) 的初始 ATF 运行相比，选择了更高的中空纤维内部流速 (1.5 L/min)，以通过提高剪切应力，增加膜上的反冲洗，并防止或阻碍合胞体的形成。令人惊讶的是，所产生的 5490 s-1 剪切速率不会影响细胞生长，因为高VCC 值44.5×10 ^6 cells/mL 达到了 0.031 1/h 的高细胞特异性生长速率，也没有阻止合胞体的形成。然而，正如之前用声学沉降器观察到的那样，形成的合胞体较小（直径最大为 75 μm），允许进入较大的纤维，这可能防止完全堵塞。然而，高中空纤维流速与1.91 L/h/m 2的低滤液通量的组合并没有阻止膜对rVSV-NDV的截留。18 hpi 时，97% 的感染性病毒已被截留，这进一步凸显了使用中空纤维膜连续收获病毒颗粒的挑战。使用 TFDF 生产 rVSV-NDV作为概念验证，我们开始利用 TFDF 系统作为细胞截留装置，用于灌流和随后的连续收获过滤。性能通过细胞生长、TMP、生物反应器和滤液浊度以及病毒渗透性的量化来表征。TFDF 系统的使用使 BHK-21 细胞能够获得高 VCC，尽管剪切应力大大降低，但与 mATF 系统相比，其生长行为相似。由于之前实验中在非常高的 VCC 下获得的 CSVY 较低，因此感染的目标细胞密度大幅降低。与之前报道的批次培养相比，所有灌流培养的代谢摄取率均略有增加。剪切应力的增加，特别是在 ATF 和 TFF 系统中，已被确定为底物吸收率增加的原因之一。通过电容探针控制灌流速率并没有改善整体工艺性能，但在整个生长阶段稳健地保持稳定的 CSPR 值（图3），从而减少了 15% 的培养基消耗。与 TFDF1 的手动灌流控制相比，由于部分过度补料，CSPR 值较高，葡萄糖水平无法稳定维持，在感染前降至 5 mM 以下。TFDF2 生长速率的略微增加很可能导致葡萄糖摄取增加，从而增加乳酸形成。为了支持更高的 VCC，应增加 CSPR 的设定点以用于未来的电容控制运行。深层过滤（DF）与切向错流过滤（TF）的组合提供了多种好处，例如膜表面的剪切、最大限度地减少过滤器内颗粒的沉积，同时允许在 DF 的通道内捕获一些颗粒，而不会阻塞通过同一通道的液体流动。即使在病毒感染后，两次 TFDF 运行的 TMP 值也较低（低于 0.3 psi），细胞截留效率较高（>99%），滤液浊度较低（降低>95%），表明颗粒突破最小。先前的研究已经证明了 TFDF 系统连续收获 AAV 和 LV 的适用性。正如预期的那样，我们还在同时采集的生物反应器和滤液样品中实现了相同密度的感染性病毒。对于两次运行，计算出的感染性病毒穿过膜的百分比都超过 100% 是不可能的，只有在滤液样品中测得的滴度高于生物反应器样品时才能实现。虽然与理论产量相比仅得出 78% 的总回收率，但这很可能是由于在室温下储存收获物时部分功能损失，以及 TCID 50测定本身的相当大的误差（±0.3 log）。蔗糖对蛋白质和有囊膜病毒载体的稳定作用是众所周知的，然而，它主要作为冷冻保护剂，或者只是复杂储存配方的一小部分。因此，过早添加蔗糖可能不足以防止降解，应优先将收获的大部分料液直接冷却至 4°C。在病毒生产方面，我们的强化 TFDF 工艺在滤液中实现了迄今为止报道的最高感染性病毒滴度 5.6–7.5x10 ^9 TCID 50 /mL。与优化的批次工艺相比，VCC 增加了 5 至 6 倍，但感染性病毒滴度甚至高出 11 倍以上。此外，CSVY 提高了一倍，STY 提高了 460%（5.6 倍），并且达到了类似的 VVP。最后，将 TFDF 运行与使用相同细胞系、但不同细胞截留装置的其它灌流培养进行比较。与 AS 和 ATF 灌流相比，TFDF 系统中达到的最大滴度分别高出3倍和 1.5 倍。这也反映在 VVP 和 STY 方面，对于 TFDF 运行，它们始终高出两倍以上。令人惊讶的是，随着各个系统 VCC 的增加，CSVY 急剧下降。对于 ATF 培养，达到最高 VCC 44.5×10 ^6 cells/mL，获得最低 CSVY，清楚地表明存在“高细胞密度效应”。造成这种效应的一个主要原因通常是营养物质的缺乏或抑制性铵和葡萄糖的积累。一项研究表明，铵和乳酸浓度分别为 2-3 mM 和高于 20-30 mM，会对病毒生产力和细胞生长产生负面影响。然而，在任何运行中都没有观察到营养限制或乳酸和铵积累到过高浓度。这表明其它原因，包括非监测代谢物或未知细胞因素的限制或积累，可能发挥了作用，并有待进一步研究。另一个原因可能是合胞体的形成，根据所使用的系统，观察到合胞体发生差异延伸。如果细胞不融合，病毒复制可能会更有效，因为我们观察到，尽管溶瘤水平相似，但使用非融合 VSV 时，在溶瘤应用中会产生更高的滴度；然而，悬浮培养系统中是否也是如此，尚不完全清楚，需要进一步研究。无论如何，应该非常仔细地考虑三种灌流系统的直接比较，因为各种生产参数是不同的。为了公平比较，重新评估应包括相同的生物反应器设置和相似的感染细胞密度。然而，对于我们的概念验证研究来说，这超出了范围。融合溶瘤病毒和合胞体的形成给过程控制和生产过程的放大带来了新的挑战。我们假设细胞融合取决于三个因素：高 VCC、低剪切应力和长细胞间接触时间。所有三个因素的组合最有可能促进大型多核合胞体的形成。批次模式生产与低VCC（高达3.2×10 ^6 cells/mL）、低剪切应力和短细胞间接触时间相关，并且不会导致合胞体的形成。使用 ATF 或 TFDF 系统进行生产可实现高 VCC（高达 44.5×10 ^6 cells/mL）；然而，剪切率急剧增加（高达 5490 1/s），并且细胞与细胞的接触时间很短，导致小尺寸合胞体的形成。AS 等截留系统结合了高 VCC（高达 29.7×10 ^6 cells/mL）、低剪切率（约 340 1/s）和较长的细胞间接触时间。声场和再循环回路（3-12 分钟，促进大型多核合胞体的形成。在批次模式下，通过在低 VCC 下补充 CaCl 2诱导聚集来增加细胞间接触，但不会导致合胞体的形成，突出了所有三个因素的复杂相互作用。未来的研究可以考虑调查悬浮培养中合胞体形成的实际原因，以更好地控制其形成。然而，生产过程中悬浮培养物是否形成合胞体与病毒固有的融合性无关，因为融合蛋白在其基因组内编码，需要表达才能进行感染。尽管如此，还是进行了效力测定，以评估生产方式以及生产过程中合胞体的形成或不形成对病毒诱导溶瘤能力的潜在影响。正如所预期的，溶瘤效力不受生产模式或合胞体发生的影响（图5）。批次和灌流模式下的 rVSV-GFP 生产为了使我们的概念验证研究更进一步，我们还想评估基于 rVSV 的载体的高产病毒生产工艺的 TFDF 性能，以使用模式载体 rVSV-GFP 作为疫苗的可能应用。与批次模式下的 STR 1 工艺相比，使用灌流模式和 TFDF 组件的工艺强化使 VCC 提高了6倍，达到 11.3×10 ^6 cells/mL，STY 提高了 1.9 倍，从而缩小了生物反应器的占地面积。然而，与 STR 批次相比，观察到 VVP 降低了 3.3 倍以上，CSVY 降低了 1.6 倍以上。如前所述，这种下降很可能是由于“高细胞密度效应”。由于既没有观察到受监测营养物质的限制，也没有观察到抑制性副产物的积累，很明显，这种灌流工艺肯定还有优化的空间，希望能获得更高的 VCC。目前，该灌流运行只是概念验证运行，仅用于评估 TFDF 系统。下一步可以设想测试不同的补料方案、培养基成分或添加物。使用 TFDF 组件，我们能够直接收获 rVSV-GFP 颗粒，同时通过深层过滤进行澄清并完全回收。我们的概念验证研究以及 LV和 AAV的数据似乎表明，用于灌流中连续收获病毒的 TFDF 将在下一代工艺中发挥重要作用，也可能适用于其它病毒。此外，所有 HEK293-SF 细胞均截留在生物反应器内，从而实现全部产能。与批次生产（0.034至0.028 1/h）相比，使用TFDF组件的灌流培养显示出略低的单位细胞生长速率（0.022 1/h），这表明这里还有改进的空间，需要进一步优化。如前所述，将收获物冷却至 4 °C 可提高病毒稳定性。事实上，我们发现最终收获批次的回收率为 103.5%。总体而言，TFDF 组件作为我们测试的基于 rVSV 的载体和细胞系的灌流系统表现出了非常好的性能。此外，连续的病毒收获以及通过 TFDF 组件一步进行的澄清可以简化工艺操作，并有助于为未来开发一种集成的、可放大的（高达 2000 L）且经济的工艺。原文：S. Göbel, L. Pelz, C. A. T. Silva, et al., Production of recombinant vesicular stomatitis virus-based vectors by tangential flow depth filtration. Applied Microbiology and Biotechnology, 2024.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。