【Angew】靶向METTL3-METTL14的抑制剂，用于癌症治疗

2024-06-12

临床1期临床2期

N6-甲基腺苷（m6A）是常见于信使RNA中的一种修饰，其调节异常与各种疾病的发生发展有着十分紧密的关系。METTL3-METTL14甲基转移酶复合物是负责催化m6A的关键元件，其中METTL3起主要催化功能，METTL14维持结构完整与RNA结合。研究表明METTL3在多种癌症中异常表达，是表观遗传最热门的靶点之一。自2016年METTL-METTL14晶体结构被解析以来，科学家一直尝试开发针对METTL3的抑制剂，直到2021年英国STORM Therapeutic开发首个METTL3小分子抑制剂STM2457用于白血病的治疗，虽已进入临床一期，但其在实体瘤上的效果未知。与小分子药物相比，多肽药物具有高度特异性和良好的安全性，且能作用于被认为不具有成药性的蛋白-蛋白相互作用（PPI）区域，具有极大的研究与应用潜力。 2024年4月12日，湖南大学生命交叉研究院史俊峰和张定校团队合作在Angew Chem Int Ed Engl（IF=16.6）上发表题为“A Stapled Peptide Inhibitor Targeting the Binding Interface of N6-Adenosine-Methyltransferase Subunits METTL3 and METTL14 for Cancer Therapy”的文章，该研究基于METTL3-METTL14蛋白结构，设计了靶向METTL3的多肽抑制剂RM3。进一步优化获得更高活性的订书肽抑制剂RSM3，该多肽具有广谱的抑癌特性，能够杀伤多种METTL3高表达的肿瘤细胞，同时在多种肿瘤模型中显示出优异的抗肿瘤效果，且具有高度特异性和良好的安全性。 1、肽抑制剂设计与验证使用先前报道的METTL3-METTL14复合物（PDB：5IL1）的晶体结构，作者确定了复合物形成所需的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）可能必不可少的两个不同结构域。基于这些结构信息设计了M1、M2和M3候选肽，并将每个肽融合到经典的细胞穿透肽R9中以增强细胞渗透，形成了RM1、RM2和RM3候选肽（图1）。图1 肽抑制剂的设计考虑到METTL3在前列腺癌细胞中高度上调并在癌症发展中起重要作用，作者使用PC3和DU145细胞系开展MTT测定评估了肽抑制剂的能力，发现与RM1和RM2相比，RM3表现出更大的抗癌作用。克隆形成测定同样表明RM3比RM1或RM2具有更强的抑制作用。这些结果表明RM3作为一种有前途的候选抗癌药物，值得进一步优化（图2）。图2 肽抑制剂的评价 2、体外M3衍生物的理化性质和活性为了增强 RM3肽的作用，作者采用了肽吻合技术从RM3生成RSM3吻合肽。订书位点的选择和设计旨在最大限度地减少潜在的空间冲突，这些空间冲突可能会干扰结合事件，同时保留肽构象。通过MST和SPR检测发现RSM3与METTL3–METTL14复合物表现出高亲和力结合，而非吻合肽RM3的亲和力较低。为了评估肽与METTL3的细胞互作，作者通过pulldown成功地拉下了PC3细胞中的METTL3和METTL14。圆二色谱（CD）测量进一步验证了RSM3在溶液中可以采用α螺旋构象，而非钉合的RM3肽片段主要存在于随机螺旋构象中。功能分析表明RSM3可有效抑制METTL3-METTL14复合物转移酶活性，且强于RM。此外，RSM3表现出更高的生物稳定性，没有明显的毒性（图3）。图3 肽抑制剂的物理化学表征 3、RSM3体外抗癌效果的评估 METTL3在许多癌症类型中作为促癌因子，细胞实验发现RSM3对PC3、HeLa、HepG2等多种癌细胞均表现出广泛的毒性，且细胞毒性显著高于非吻合RM3肽。细胞迁移和集落形成实验显示RSM3和RM3对有效抑制癌细胞侵袭性，EdU标记荧光检测和流式细胞术分析显示RSM3有效地诱导细胞周期停滞，膜联蛋白V-FITC和TUNEL染色、流式细胞术表明RSM3可以比RM3诱导更高水平的细胞凋亡。WB测定证实，裂解的caspase-3在肽处理的细胞中积累。这些结果说明RSM3通过诱导细胞凋亡和细胞周期停滞的抗癌活性（图4）。图4 RSM3抗癌效果的评估 4、RSM3与METTL3–METTL14的相互作用会降低复合物的稳定性和功能为了探索肽抑制剂与METTL3之间的相互作用，免疫染色证实RSM3与METTL3的荧光信号共定位。RSM3处理METTL3和METTL14信号强度均降低，表明RSM3可能导致功能改变和METTL3-METTL14复合物的降解。WB分析进一步证实，RSM3处理后PC3细胞中的METTL3和METTL14水平降低，支持RSM3既可以抑制催化活性，也可以触发METTL3-METTL14复合物的降解。随后使用 m6A ELISA表明RSM3处理后m6A修饰显著减少。此外，RSM3处理可以通过蛋白酶体途径激活METTL3降解。CO-IP实验发现RSM3 处理后METTL3和METTL14的互作减少，这些结果表明RSM3有效破坏了METTL3-METTL14复合物的稳定性，随后通过蛋白酶体途径促进降解（图5）。图5 RSM3与METTL3–METTL14的互作会降低复合物的稳定性和功能 5、PCa细胞对肽处理的转录组为了进一步揭示RSM3抑制癌细胞的分子机制，作者用载体或RSM3处理的PC3细胞中进行RNA-seq，GO分析发现上调的基因富集在参与程序性细胞死亡、p53 肿瘤抑制因子信号传导、分化和免疫的通路中，下调基因主要富集在促进癌症侵袭性、干性和增殖的通路，GSEA进一步证实了GO结果，qPCR分析验证了RNA-seq结果，即与炎症和细胞凋亡相关的NF-κB反应基因上调，与细胞周期和增殖相关的基因下调。此外，结合M6 A2Target数据库分析发现RSM3 处理的PCa细胞中检测到的差异基因确实显著富集了受m6A调节的基因，说明了RSM3抑制METTL3的靶向效应。此外，在RSM3处理的细胞中，GO显示MAPK信号级联基因显著富集，WB验证RSM3组中p42/44的磷酸化水平较低，表明RSM3处理导致ERK/MAPK活性降低。结果表明RSM3抑制METTL3可以以m6A依赖性方式通过抑制MAPK有丝分裂途径以及诱导分化来延缓癌细胞生长并诱发细胞凋亡（图6）。图6 PCa细胞对RSM3处理的转录组 6、RSM3 在体内的安全性和抗肿瘤功效接着通过单次腹腔内注射RSM3到小鼠体内检查其体内急性毒性，血液常规分析和主要器官的组织病理学检查结果显示RSM3没有明显的毒性迹象。然后，作者评估了RSM3在PC3异种移植肿瘤模型中的抗癌活性，发现RSM3治疗可显著抑制肿瘤生长，且在在整个治疗过程中，所有组的体重均未受到影响，多种器官的组织病理学检查未发现明显异常或病变。肿瘤样本的免疫组织化学分析表明RSM3治疗导致METTL3表达和m6A水平降低。此外，caspase-3表达增加，而Ki67降低，表明RSM3诱导细胞凋亡和抑制增殖（图7）。图7 RSM3抑制剂的毒性和抗肿瘤疗效研究总结该论文基于METTL3-METTL14的晶体结构，在蛋白之间的两个相互作用界面(interface loop，residues 462-479), helix a2，residues 435-447)和一个底物催化中心（residues 534-541）中鉴定和设计了一系列多肽序列，并结合穿膜肽R9用于细胞内递送。通过体外酶活力测定、细胞存活、亲和力测定以及多肽Pulldown等实验筛选获得一段有生物活性的多肽RM3（源于residues 435-447），具有靶向METTL3、抑制METTL3酶催化活性和抑制癌细胞生长迁移等功能。同时，为了保持多肽的a二级结构和提高稳定性，进一步构建了订书肽化的多肽抑制剂RSM3。进一步细胞实验发现，该多肽可有效的降低细胞的mRNA甲基化水平，还能抑制多种癌细胞的生长和引起细胞凋亡，显示出较强的广谱抑癌性。机制研究发现多肽抑制剂处理的细胞中METTL3表达量显著下降，推测其可引起METTL3的降解。进一步研究发现，该多肽主要通过蛋白酶体途径引发METTL3降解，而小分子抑制剂STM2457并未引起METTL3的蛋白含量下降，说明多肽抑制剂RSM3具有不同的作用机制。最终，在小鼠前列腺癌和胰腺癌等肿瘤模型中，RMS3等多肽抑制剂展现出较好的抑瘤能力，并具有较好的安全性。此外，在活体水平RSM3的效果也略优于STM2457。上述结果说明该多肽具有较好的应用潜力。图8 订书肽抑制剂（RSM3）的设计及作用机制参考文献 Li Z, Feng Y, Han H, Jiang X, Chen W, Ma X, Mei Y, Yuan D, Zhang D, Shi J. A Stapled Peptide Inhibitor Targeting the Binding Interface of N6-Adenosine-Methyltransferase Subunits METTL3 and METTL14 for Cancer Therapy. Angew Chem Int Ed Engl. 2024 Apr 12:e202402611. doi: 10.1002/anie.202402611. Epub ahead of print. PMID: 38607929. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓