Adenosine

引言 腺苷和特定腺苷受体亚型促进阴茎康复的机制尚不清楚。 2024年6月14日，四川大学袁久洪团队在Advanced Science 在线发表题为“Targeting Adenosine A2b Receptor Promotes Penile Rehabilitation of Refractory Erectile Dysfunction”的研究论文，该研究靶向腺苷A2b受体能够促进难治性勃起功能障碍的阴茎康复。该研究对人海绵体、腺苷脱氨酶(ADA)和腺苷受体敲除小鼠(ADA−/−、A1−/−、A2a−/−、A2b−/−和A3−/−)以及原代海绵体平滑肌细胞进行单细胞RNA测序，以确定腺苷诱导勃起的受体亚型。该研究建立了三种大鼠模型来表征难治性勃起功能障碍(ED)：年龄相关性ED、双侧海穴神经挤压相关性ED (BCNC)和糖尿病性ED。 在单细胞RNA测序数据中，ED患者海穴体显示腺苷A1、A2a和A2b受体减少。在体内，A2b受体敲除可消除腺苷诱导的勃起，而A1、A2a或A3受体则不能。体外缺氧条件下，激活A2b受体增加HIF-1α，降低PDE5表达。在难治性ED模型中，用Bay 60-6583激活A2b受体可改善勃起功能，下调HIF-1α和TGF-β。给予BCNC大鼠双嘧达莫(40mg Kg−1)可改善阴茎腺苷水平和勃起功能。该研究表明A2b受体介导腺苷诱导的阴茎勃起。激活A2b受体通过缓解缺氧和纤维化促进难治性ED的阴茎康复。 勃起功能障碍(ED)是一种常见的临床疾病，影响30-50%的> 40岁男性。目前，磷酸二酯酶5型抑制剂(PDE5i)仍然是ED患者的首选治疗方法，并在早期显示出令人满意的效果。然而，PDE5i在某些情况下仍然不起作用。对于糖尿病或根治性前列腺切除术引起的难治性ED患者，PDE5i的疗效在60-70%之间，甚至进一步降低。此外，近50%的ED患者在1年后报告停止使用PDE5i。缺乏疗效是最重要的原因之一。其他治疗方法，如海绵体内注射前列腺素E和真空勃起装置是侵入性的和不愉快的。因此，寻找新的治疗靶点和治疗策略势在必行。 腺苷，像一氧化氮一样，是一种血管扩张剂，长期以来一直与调节阴茎勃起有关。先前的研究表明腺苷可以诱导海绵体内压力(ICP)的剂量依赖性增加，并导致阴茎完全勃起。过量的腺苷与勃起功能障碍有关。对小鼠和人海绵体条的进一步实验表明，腺苷可以通过激活A2受体诱导阴茎松弛。此外，研究发现A2b受体拮抗剂可以消除腺苷诱导兔海绵状条带松弛或小鼠镰状细胞病引起的阴茎勃起。这些数据表明A2b受体可能与腺苷的促勃起作用有关。相反，Noto T等人报道了选择性A2a受体抑制剂可以消除腺苷诱导的勃起。 腺苷受体在人阴茎海绵状组织单细胞测序中的表达（Credit: Advanced Science） 此外，激活A3或A2b受体可以改善糖尿病相关性ED (DMED)大鼠的勃起功能。这些研究表明腺苷信号通路可能是阴茎康复的潜在靶点。然而，具体的腺苷受体亚型介导腺苷诱导勃起和促进阴茎康复仍然存在争议。腺苷和腺苷受体(A1, A2a, A2b和A3)在难治性ED(如DMED，年龄相关性ED (AED)和双侧海绵体神经挤压(BCNC)相关ED)的阴茎康复中的作用尚未明确。 该研究旨在探讨腺苷和腺苷受体亚型在调节勃起功能和促进阴茎康复中的作用及其机制。基于单细胞测序技术和腺苷受体敲除小鼠，研究结果表明A2b受体介导腺苷诱导勃起。激活A2b受体通过缓解缺氧和纤维化促进难治性ED的阴茎康复。一种口服药物DIP通过减轻缺氧和纤维化对难治性ED有显著的治疗效果。该药对难治性ED患者无创，具有临床治疗潜力。 参考文献 https://onlinelibrary-wiley-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/10.1002/advs.202306514 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“iNature” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

N6-甲基腺苷（m6A）是常见于信使RNA中的一种修饰，其调节异常与各种疾病的发生发展有着十分紧密的关系。METTL3-METTL14甲基转移酶复合物是负责催化m6A的关键元件，其中METTL3起主要催化功能，METTL14维持结构完整与RNA结合。研究表明METTL3在多种癌症中异常表达，是表观遗传最热门的靶点之一。自2016年METTL-METTL14晶体结构被解析以来，科学家一直尝试开发针对METTL3的抑制剂，直到2021年英国STORM Therapeutic开发首个METTL3小分子抑制剂STM2457用于白血病的治疗，虽已进入临床一期，但其在实体瘤上的效果未知。与小分子药物相比，多肽药物具有高度特异性和良好的安全性，且能作用于被认为不具有成药性的蛋白-蛋白相互作用（PPI）区域，具有极大的研究与应用潜力。 2024年4月12日，湖南大学生命交叉研究院史俊峰和张定校团队合作在Angew Chem Int Ed Engl（IF=16.6）上发表题为“A Stapled Peptide Inhibitor Targeting the Binding Interface of N6-Adenosine-Methyltransferase Subunits METTL3 and METTL14 for Cancer Therapy”的文章，该研究基于METTL3-METTL14蛋白结构，设计了靶向METTL3的多肽抑制剂RM3。进一步优化获得更高活性的订书肽抑制剂RSM3，该多肽具有广谱的抑癌特性，能够杀伤多种METTL3高表达的肿瘤细胞，同时在多种肿瘤模型中显示出优异的抗肿瘤效果，且具有高度特异性和良好的安全性。 1、肽抑制剂设计与验证 使用先前报道的METTL3-METTL14复合物（PDB：5IL1）的晶体结构，作者确定了复合物形成所需的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）可能必不可少的两个不同结构域。基于这些结构信息设计了M1、M2和M3候选肽，并将每个肽融合到经典的细胞穿透肽R9中以增强细胞渗透，形成了RM1、RM2和RM3候选肽（图1）。 图1 肽抑制剂的设计 考虑到METTL3在前列腺癌细胞中高度上调并在癌症发展中起重要作用，作者使用PC3和DU145细胞系开展MTT测定评估了肽抑制剂的能力，发现与RM1和RM2相比，RM3表现出更大的抗癌作用。克隆形成测定同样表明RM3比RM1或RM2具有更强的抑制作用。这些结果表明RM3作为一种有前途的候选抗癌药物，值得进一步优化（图2）。 图2 肽抑制剂的评价 2、体外M3衍生物的理化性质和活性 为了增强 RM3肽的作用，作者采用了肽吻合技术从RM3生成RSM3吻合肽。订书位点的选择和设计旨在最大限度地减少潜在的空间冲突，这些空间冲突可能会干扰结合事件，同时保留肽构象。通过MST和SPR检测发现RSM3与METTL3–METTL14复合物表现出高亲和力结合，而非吻合肽RM3的亲和力较低。为了评估肽与METTL3的细胞互作，作者通过pulldown成功地拉下了PC3细胞中的METTL3和METTL14。圆二色谱（CD）测量进一步验证了RSM3在溶液中可以采用α螺旋构象，而非钉合的RM3肽片段主要存在于随机螺旋构象中。功能分析表明RSM3可有效抑制METTL3-METTL14复合物转移酶活性，且强于RM。此外，RSM3表现出更高的生物稳定性，没有明显的毒性（图3）。 图3 肽抑制剂的物理化学表征 3、RSM3体外抗癌效果的评估 METTL3在许多癌症类型中作为促癌因子，细胞实验发现RSM3对PC3、HeLa、HepG2等多种癌细胞均表现出广泛的毒性，且细胞毒性显著高于非吻合RM3肽。细胞迁移和集落形成实验显示RSM3和RM3对有效抑制癌细胞侵袭性，EdU标记荧光检测和流式细胞术分析显示RSM3有效地诱导细胞周期停滞，膜联蛋白V-FITC和TUNEL染色、流式细胞术表明RSM3可以比RM3诱导更高水平的细胞凋亡。WB测定证实，裂解的caspase-3在肽处理的细胞中积累。这些结果说明RSM3通过诱导细胞凋亡和细胞周期停滞的抗癌活性（图4）。 图4 RSM3抗癌效果的评估 4、RSM3与METTL3–METTL14的相互作用会降低复合物的稳定性和功能 为了探索肽抑制剂与METTL3之间的相互作用，免疫染色证实RSM3与METTL3的荧光信号共定位。RSM3处理METTL3和METTL14信号强度均降低，表明RSM3可能导致功能改变和METTL3-METTL14复合物的降解。WB分析进一步证实，RSM3处理后PC3细胞中的METTL3和METTL14水平降低，支持RSM3既可以抑制催化活性，也可以触发METTL3-METTL14复合物的降解。随后使用 m6A ELISA表明RSM3处理后m6A修饰显著减少。此外，RSM3处理可以通过蛋白酶体途径激活METTL3降解。CO-IP实验发现RSM3 处理后METTL3和METTL14的互作减少，这些结果表明RSM3有效破坏了METTL3-METTL14复合物的稳定性，随后通过蛋白酶体途径促进降解（图5）。 图5 RSM3与METTL3–METTL14的互作会降低复合物的稳定性和功能 5、PCa细胞对肽处理的转录组 为了进一步揭示RSM3抑制癌细胞的分子机制，作者用载体或RSM3处理的PC3细胞中进行RNA-seq，GO分析发现上调的基因富集在参与程序性细胞死亡、p53 肿瘤抑制因子信号传导、分化和免疫的通路中，下调基因主要富集在促进癌症侵袭性、干性和增殖的通路，GSEA进一步证实了GO结果，qPCR分析验证了RNA-seq结果，即与炎症和细胞凋亡相关的NF-κB反应基因上调，与细胞周期和增殖相关的基因下调。此外，结合M6 A2Target数据库分析发现RSM3 处理的PCa细胞中检测到的差异基因确实显著富集了受m6A调节的基因，说明了RSM3抑制METTL3的靶向效应。此外，在RSM3处理的细胞中，GO显示MAPK信号级联基因显著富集，WB验证RSM3组中p42/44的磷酸化水平较低，表明RSM3处理导致ERK/MAPK活性降低。结果表明RSM3抑制METTL3可以以m6A依赖性方式通过抑制MAPK有丝分裂途径以及诱导分化来延缓癌细胞生长并诱发细胞凋亡（图6）。 图6 PCa细胞对RSM3处理的转录组 6、RSM3 在体内的安全性和抗肿瘤功效 接着通过单次腹腔内注射RSM3到小鼠体内检查其体内急性毒性，血液常规分析和主要器官的组织病理学检查结果显示RSM3没有明显的毒性迹象。然后，作者评估了RSM3在PC3异种移植肿瘤模型中的抗癌活性，发现RSM3治疗可显著抑制肿瘤生长，且在在整个治疗过程中，所有组的体重均未受到影响，多种器官的组织病理学检查未发现明显异常或病变。肿瘤样本的免疫组织化学分析表明RSM3治疗导致METTL3表达和m6A水平降低。此外，caspase-3表达增加，而Ki67降低，表明RSM3诱导细胞凋亡和抑制增殖（图7）。 图7 RSM3抑制剂的毒性和抗肿瘤疗效研究 总结 该论文基于METTL3-METTL14的晶体结构，在蛋白之间的两个相互作用界面(interface loop，residues 462-479), helix a2，residues 435-447)和一个底物催化中心（residues 534-541）中鉴定和设计了一系列多肽序列，并结合穿膜肽R9用于细胞内递送。通过体外酶活力测定、细胞存活、亲和力测定以及多肽Pulldown等实验筛选获得一段有生物活性的多肽RM3（源于residues 435-447），具有靶向METTL3、抑制METTL3酶催化活性和抑制癌细胞生长迁移等功能。同时，为了保持多肽的a二级结构和提高稳定性，进一步构建了订书肽化的多肽抑制剂RSM3。进一步细胞实验发现，该多肽可有效的降低细胞的mRNA甲基化水平，还能抑制多种癌细胞的生长和引起细胞凋亡，显示出较强的广谱抑癌性。机制研究发现多肽抑制剂处理的细胞中METTL3表达量显著下降，推测其可引起METTL3的降解。进一步研究发现，该多肽主要通过蛋白酶体途径引发METTL3降解，而小分子抑制剂STM2457并未引起METTL3的蛋白含量下降，说明多肽抑制剂RSM3具有不同的作用机制。最终，在小鼠前列腺癌和胰腺癌等肿瘤模型中，RMS3等多肽抑制剂展现出较好的抑瘤能力，并具有较好的安全性。此外，在活体水平RSM3的效果也略优于STM2457。上述结果说明该多肽具有较好的应用潜力。 图8 订书肽抑制剂（RSM3）的设计及作用机制 参考文献 Li Z, Feng Y, Han H, Jiang X, Chen W, Ma X, Mei Y, Yuan D, Zhang D, Shi J. A Stapled Peptide Inhibitor Targeting the Binding Interface of N6-Adenosine-Methyltransferase Subunits METTL3 and METTL14 for Cancer Therapy. Angew Chem Int Ed Engl. 2024 Apr 12:e202402611. doi: 10.1002/anie.202402611. Epub ahead of print. PMID: 38607929. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓