基于USP7的去泛素酶靶向嵌合体稳定 AMPK

2024-05-05

临床终止临床1期

2024年4月10日，哈佛医学院Wenyi Wei课题组在JACS上发表了一篇题为USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK的文章。文章首次证实了去泛素化酶 USP7可用于DUBTAC的开发。作者使用两种不同的USP7非共价配体（图1A）开发了第一个AMPK DUBTAC，其选择性地稳定AMPKβ的不同亚型，导致AMPK信号转导升高。首先，作者选择使用先前报道的可以结合并抑制细胞中的USP7的配体#1（图1B），以募集USP7去泛素化酶。复合物共晶结构分析表明，USP7 抑制剂的氨基不在结合口袋中（图1B-C），可用于连接子连接。将USP7配体#1与CFTR配体Lumacaftor通过连接子连接产生化合物 1-13（图2A）。在这13种化合物中，7（MS6869）和13两种化合物可以稳定表达CFBE41o-4.7ΔF508-CFTR的人囊性纤维化支气管上皮细胞中的ΔF508-CFTR突变蛋白（图2B），其有效性与先前报道的基于OTUB1的CFTR DUBTAC NJH-2-057相当。图1：基于USP7的DUBTAC用于稳定靶蛋白通过MS6869进一步研究基于USP7的CFTR DUBTAC的机制，他们发现MS6869引入了USP7和CFTR蛋白之间的新相互作用（图2C），随后降低了 CFTR的泛素化水平（图2D）。此外，MS6869以浓度和时间依赖性方式稳定CFTR（图2E-F）。更重要的是，CFTR蛋白水平的增加可能是功能性的，因为它主要位于质膜上（图2G）。此外，与USP7配体或CFTR配体的共同处理在很大程度上消除了MS6869对稳定ΔF508-CFTR突变蛋白的作用（图2H）。与此一致，CFBE41o-4.7 ΔF508-CFTR 细胞中USP7的耗竭阻断了MS6869稳定CFTR 的作用（图 2I），表明MS6869诱导的CFTR稳定可能取决于USP7的去泛素化酶活性。此外，他们进一步进行了TMT标记质谱（MS）测定，发现MS6869以相对特异性的方式促进CFTR的稳定（图2J-K）。这些结果共同表明，USP7 可用于使用非共价USP7配体稳定靶蛋白。图2.基于USP7的CFTR DUBTAC可稳定细胞中的ΔF508-CFTR突变蛋白为了进一步证明基于USP7的DUBTAC可以稳定靶蛋白，作者设计并合成了一系列基于USP7的AMPK DUBTAC化合物14-25，通过将USP7配体#1与AMPK激动剂991连接起来 (图3A）。AMPK激动剂991与AMPK ADaM位点结合，该位点位于α亚基的激酶结构域和β亚基的碳水化合物结合模块之间的界面，991可以选择性激活AMPKβ1亚基而不是AMPKβ2亚基。他们测量了DUBTACs处理后AMPK激酶的α和β亚基水平发现三种化合物22、23和24可以稳定AMPKβ1，但不能稳定HeLa细胞中的AMPKβ2亚型和AMPKα亚基（图3B）。对这些先导化合物的进一步评估表明，MS8118（化合物24）在稳定AMPKβ1方面最有效，同时伴随AMPK下游底物乙酰辅酶A羧化酶（ACC）磷酸化升高（图3C），而AMPKβ1的mRNA水平不受影响，表明AMPK DUBTAC在翻译后水平起作用。选择 MS8118代表AMPKβ1进行进一步的功能测定发现MS8118 引入了USP7和AMPKβ1 之间的新相互作用（图3D），这导致细胞内泛素化测定指示的AMPKβ1泛素化水平降低（图 3E）。此外，MS8118对AMPKβ1稳定的作用可能被USP7配体和AMPK配体（图3F）或通过消耗内源性USP7（图3G）阻断，表明MS8118对AMPKβ1蛋白稳定性的影响可能是通过募集USP7去泛素化AMPKβ1。图3.USP7配体#2，GNE6776衍生的USP7-AMPK DUBTAC稳定细胞中的AMPKβ2作者还使用另一种USP7非共价抑制剂GNE6776（图1C），其与AMPK亚基具有不同的结合模式，作为USP7配体产生一系列新的基于USP7的AMPK DUBTAC化合物26-36（图4A）。与USP7配体#1衍生的AMPK DUBTAC相比，GNE6776衍生的AMPK DUBTAC 对AMPKβ1的稳定性影响最小（图4B）。相反，55（MS8655）、56（MS8656）和57（MS8657）三种化合物优先增加了 HeLa 细胞中 AMPKβ2的蛋白质稳定性（图4B）。进一步的分析表明，MS8655、MS8656和MS8657以浓度依赖性方式主要稳定AMPKβ2，而AMPKβ1仅受到中度影响（图 4C）。接下来，使用AMPKβ2的一个代表性DUBTAC MS8657进行进一步的功能测定，结果与 MS8118 类似。图4.USP7配体#2，GNE6776衍生的USP7-AMPK DUBTAC稳定细胞中的AMPKβ2总体而言，这篇文章提出了第一个可以稳定CFTR和AMPK蛋白的基于USP7的DUBTAC，这表明USP7可以用来稳定其他感兴趣的蛋白质，显著扩展了靶向蛋白稳定的有限工具箱。本文作者：HYN声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓