在非人灵长类动物中优化LNP，提升肝脏细胞蛋白表达水平。

2023-07-10

siRNA信使RNA临床研究核酸药物

与人体内药物递送过程最为相似的是非人灵长类动物（NHP），例如，食蟹猴或者恒河猴，但是，如果仅仅是作为早期药物筛选模型，选择 NHP 过于烧钱，显然不显示。所以，大家普遍选择啮齿动物模型作为初筛动物模型，寻找新型可电离脂质，筛选 LNP 制剂配方，测试 LNP 递送系统在体内的耐受性和效率。从啮齿动物模型中筛选到的数据转化到 NHP 时存在相当多的脱节现象，这使得临床前阶段获得的 LNP 最佳配方缺乏可转化性，增加了临床开发过程中的失败风险。2013 年，Martin A Maier 等人在筛选新型可电离脂质 L319 时小鼠尾静脉注射靶向 FVII 基因的 siRNA-LNP，48h 后，检测小鼠血清中 VII 蛋白（凝血因子）的含量。结果发现，最低剂量 0.01mg/kg 的敲低效率可达 75%，最高剂量 0.1mg/kg 的敲低效率可达到 90%。为确定基于 L319 的新型脂质体是否可转化到高等物种中，他们在食蟹猴中静脉注射剂量为 0.3mg/kg 的靶向 TTR 基因的 siRNA-LNP，48h 后，在肝脏中检测到的 TTR 蛋白（淀粉样变性关键蛋白）相对于对照组降低了 70%。引起研究者特别关注的是，在食蟹猴中的 TTR siRNA-LNP 的基因敲低效率是要低于小鼠中观察到的 FVII siRNA-LNP 敲低效率。他们分析，一部分原因可能是在两个物种中靶向基因的不同导致的（siRNA），还有一种可能是 L319-LNP 系统在两个物种中递送效率不同引发的。要使得 L319-LNP 在 NHP 中展现出最佳的递送效率可能需要进一步优化 LNP 制剂配方。为避免物种间基因沉默效率的差异，2023 年，James Heyes 团队选择 mRNA 作为 LNP 递送系统的负载药物。采用相同的组成和参数比例制备 hOTC mRNA-LNP，静脉注射到小鼠和食蟹猴中（注射剂量为 1mg/kg），24h 后，食蟹猴肝脏中 hOTC 蛋白表达水平要比小鼠中明显降低 10 倍。这个数据与 Martin A Maier 等人在 2013 年筛选新型可电离脂质 L319 时获得的数据说明相同的 LNP 递送系统在小鼠模型和 NHP 模型中存在显著的活性差异。肝血窦由有窗孔的内皮细胞单层排序形成，为血液和肝脏细胞之间提供有效沟通。静脉注射后，LNP 必须穿越肝血窦上面的窗孔才能抵达肝脏细胞。在肝脏中，正常窗孔尺寸在 100-160nm，并且，不同的物种之间存在差异。研究显示，NHP 的窗孔尺寸要小于啮齿类动物。因此，窗孔大小和 LNP 粒径大小会影响同一种 LNP 在不同物种间的递送效率。LNP 将 siRNA 递送至肝脏细胞的过程。PEG 脂质从 LNP 表面解离后，ApoE 吸附到 LNP 表面，LNP 穿越有孔的肝血窦内皮细胞，并与肝脏细胞上的低密度脂蛋白受体结合，进行胞吞作用。LNP 表面带正电荷的可电离脂质与内体膜上电负电荷的脂质相互作用，破坏内体膜，将 siRNA 释放至细胞质中。图片来源：The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs.👀 LNP 粒径影响小鼠/NHP 肝脏中的蛋白表达我们前面提到过，目前许多研究已经表明 PEG 脂质含量会影响 LNP 粒径大小，一般来说，PEG 脂质含量越多，LNP 粒径会越小。然而，PEG 脂质除了影响粒径，还会对 LNP 电位，稳定性等造成影响。为了保持单一变量，James Heyes 团队在制备 LNP 时，保持脂质体配方组成和比例相同，通过调整工艺参数来制备不同粒径大小的 LNP，研究同一种 LNP 递送系统在小鼠和 NHP 中的活性。在小鼠中，静脉注射 0.5mg/kg EGFP mRNA-LNP，24h 后，肝脏和脾脏中 EGFP 表面水平、触发的免疫刺激反应均显示与 LNP 粒径大小呈现正相关性。95nm LNP 在肝脏和脾脏中的 EGFP 表达水平最高，触发的血浆中的MCP-11 也高。在 NHP 中，不同粒径大小的 LNP（LNP1a 粒径为 74nm，LNP1b 粒径为 58nm）在血浆中的药代动力学以及肝脏中的积累是相似的。有意思的是，不同粒径的 hOTC mRNA-LNP 达到肝脏的数量虽然是相同的，但是，LNP1b 的在肝脏中的蛋白表达水平是 LNP1a 的 5 倍。此外，LNP1b 对肝脏的选择性高于对脾脏的。在 NHP 中，更小粒径的 mRNA-LNP，在肝脏中的蛋白表达水平更高，这与小鼠模型中是完全相反的情况。👀 PEGEG 脂质影响小鼠/NHP 肝脏中的蛋白表达增加 LNP 制剂配方中PEGEG 脂质比例，会导致制备出来的 LNP 粒径减小，在小鼠肝脏中的 EGFP 蛋白表达水平降低。小鼠肝脏中蛋白表达水平的降低有 2 种可能性：第一，PEG 脂质含量的增加；第二，LNP 粒径的减小。因此，为排除 LNP 粒径的干扰，研究人员在提升 PGE 脂质含量的同时，将 LNP 粒径严格控制在 67-71nm 狭窄范围内。结果发现，高 PEG 脂质含量的 LNP(3.3%)粒径虽然变得更大了，但是，肝脏中 EGFP 的表达水平并未得到提升，这就是说明小鼠肝脏中 EGFP 蛋白表达水平的降低是由于 PEG 脂质含量的增加导致的。在 NHP 中，更小粒径的 LNP 蛋白表达水平更强，由于粒径减小会造成比面积增加，因此，对于小粒径的 LNP 来说，最优的 PEG 脂质含量可能是不同的。当 PEG 脂质含量从 1.6%增加至 3.3%时，LNP 的粒径基本相似（52-57nm）。从小粒径 LNP 的肝脏蛋白表达水平来看，最优的 PEG 脂质范围在 2.2%-2.8PEGEG 脂质含量增加超过 3.2%时，肝脏中蛋白表达量发生明显下降。此外。PEG 脂质含量从 1.6 增加为 2.5%时，并不会影响 LNP 组分（mRNA，可电离脂质，PEG 脂质）在血清中的清除速率。相比于适宜小鼠体内的最优 LNP1a，优化后的 LNP47b 在 NHP 肝脏细胞中的蛋白表达量得到显著提升。将 LNP1a 粒径从 83nm 降低到 LNP1b 的 63nm，NHP 中肝脏细胞的蛋白表达量得到提升；接着，维持 LNP 粒径不变，再将 PEG 脂质含量从 1.6%（LNP1b）增加到 2.5%（LNP47b），NHP 中肝脏细胞的蛋白表达量得到更显著的增加。👀 结论临床前进行 NHP 高等物种的研究数据转化是迈向临床试验的关键步骤。影响 LNP 体内活性的因素非常多，例如，脂质结构，配方比例，电荷，粒径，PDI，要在 NHP 中对 LNP 进行优化成本过于高昂。因此，绝大部分的 LNP 优化数据都是从小鼠体内拿到的。但是，从啮齿类动物体内得到的优化数据移植到为 NHP 体内时，很难确保 LNP 具有相同的活性。正如 James Heyes 团队观察到的，相同的 mRNA-LNP 在 NHP 肝脏中的蛋白表达量要比小鼠肝脏中降低 10 倍，也就是说 mRNA-LNP 体内活性是物种依赖性的。这促使 James Heyes 团队开始研究影响 mRNA-LNP 在不同物种间活性差异的因素，主要聚焦 LNP 粒径和 PEG 脂质：第一，LNP 采用静脉注射途径，到达肝脏，递送效率会受到窗孔尺寸的限制。他们发现在 NHP 中，粒径更小的 LNP，在肝脏中的蛋白表达量会更高。PEGPEG 脂质在 LNP 表面的密度增加，会导致 ApoE 结合减少，从而降低 LNP 的与质膜的融合性。一般来说，为了提升 LNP 的体内活性，PEG 脂质浓度会保持在纳米颗粒组装和维系血液中结构稳定性所需要的最低限度。对于 NHP 来说，从注射部位抵达肝脏要通过更多的路径，这就会导致 LNP 在肝脏细胞摄取之前，从 LNP 编码脱落的 PEG 脂质数量变多，容易起 LNP 结构的不稳定。事实上，研究人员发现粒径较小的 LNP 最佳的 PEG 脂质比例范围在 2.2%-2.8%，可将 NHP 肝脏细胞中的蛋白表达水平显著提升 8 倍左右。未来还需要发掘更多影响 LNP 在 NHP 中表达活性的因素，才能推动 LNP 递送技术不断进步。参考文献：1.Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics2.Optimizing Lipid Nanoparticles for Delivery in Primates