Moderna团队未检测到注射部位肌纤维摄入mRNA-LNPs

2023-12-01

信使RNA疫苗

由于体液含有丰富的 RNases，裸露的 mRNA 在体液里面极不稳定，会快速降解。大分子、亲水性及负电性等固有化学特性使得 mRNA 难以跨越细胞膜。LNP 是非常理想的递送系统，包封 mRNA，避免其发生降解，还可从注射部分将 mRNA 递送至靶标位置。一旦进入靶标组织，LNP 可快速被细胞摄取，内体逃逸的 mRNA 进入细胞质，完成蛋白表达。我们知道，人体免疫器官可分为中枢免疫器官和外周免疫器官。中枢免疫器官（初级免疫器官）是免疫细胞产生、分化、发育成熟的场所，包括胸腺和骨髓。骨髓是 B 淋巴细胞分化和发育成熟的场所。胸腺是 T 淋巴细胞发育成熟的场所。外周免疫器官（次级免疫器官）是成熟的 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞及其他免疫细胞定居和发生免疫应答的场所，包括淋巴结（LNs），脾脏及粘膜相关组织。mRNA 疫苗要想成功触发强烈的免疫反应，必须保证其顺利递送至关键免疫器官。LNP 尺寸小于 200nm，以便使得它们与注射部位细胞相互作用，或者通过淋巴系统回流至淋巴结。研究人员认为，mRNA 疫苗编码的抗原有两条途径抵达引流淋巴结：第一，通过抗原呈递细胞（APCs）主动运输。在注射部位，mRNA-LNPs 可快速募集免疫细胞，触发天然免疫反应。APCs（例如，DC 树突细胞和巨噬细胞）内化 mRNA-LNPs。接着，APCs 将细胞内表达产生的疫苗抗原输送至引流淋巴结（dLNs），从而触发适应性免疫反应。第二，通过淋巴系统被动运输至引流淋巴结。mRNA-LNPs 会随着淋巴循环系统回流至引流淋巴结，与此处的 APCs 直接相互作用。总的来说，mRNA-LNPs 对天然免疫反应的短暂激活最终导致 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞在引流淋巴结中的活化。肌肉注射（IM）是最为常见的疫苗接种途径。最近，Moderna 团队对 mRNA-LNPs 疫苗注射后体内递送途径展开研究，定量研究注射部位、淋巴结及特定组织中 mRNA 和编码蛋白随时间发生的动态变化。相关研究发表在 Molecular Therapy: Nucleic Acid：mRNA Vaccine Trafficking and Resulting Protein Expression After Intramuscular Administration，这篇文章打破过往认知，并未在肌纤维中观察到 mRNA 或者抗原蛋白表达。对于 mRNA 疫苗从业者来说，这是篇必读的重要文献，有助于我们更好地理解 mRNA 疫苗在机体内的递送途径。 mRNA-LNPs 肌注进入啮齿动物体内的递送途径在小鼠左侧股四头肌注射 3μg eGFP mRNA-LNPs，通过免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）技术检测蛋白表达和 eGFP mRNA。在注射部位，许多中性粒细胞、巨噬细胞及少量淋巴细胞浸润到肌肉间的脂肪组织和结缔组织。在注射后 6h/24h，在注射部位的巨噬细胞、成纤维细胞及脂肪细胞中可观测到 mRNA 和 eGFP 蛋白。让人深感意外的是，在肌纤维中，两个检测点均未观察到 eGFP mRNA 或者 eGFP 蛋白。接着，研究人员检测引流淋巴结部位的 eGFP mRNA 或者 eGFP 蛋白水平。在腘窝淋巴结(popliteal LN)和腹股沟淋巴结（inguinal LN）检测到 eGFP 蛋白。在引流淋巴结内部，eGFP 蛋白主要表达于皮下窦（subcapsular sinus）和髓窦内(medullary sinus)的巨噬细胞，并且在注射后 6h 达到最高水平。在注射 24h 后，许多 eGFP mRNA 在引流淋巴结已消失，残存的 mRNA 信号定位于滤泡 B 细胞（B-cell follicles )和滤泡间区域。此外，在大鼠的注射部位和引流淋巴结部位，检测 eGFP mRNA 或者 eGFP 蛋白水平也发现类似的趋势。检测啮齿动物类动物（小鼠和大鼠）肌肉注射 mRNA-LNPs 部位和引流淋巴结部位的 mRNA 和蛋白表达。 mRNA-LNPs 肌注进入 NHP 体内的递送途径考虑到啮齿动物和 NHP 之间体重差异，在 NHP 动物模型中，研究者将 eGFP mRNA-LNPs 注射积累提升至 300μg。在不同时间收集特定组织和血浆，检测 eGFP mRNA 浓度。如下图所示，不同免疫组织的最高 eGFP mRNA 浓度分布为：脾脏>引流淋巴结>注射部位>血浆>肝脏。在注射完成后第 24h，注射部位、淋巴结及肝脏中已完全检测不到 eGFP mRNA，而血浆和脾脏中的 mRNA 也会发生显著减少。这些数据说明，在免疫组织中，游离 mRNA 很快会被降解。完成肌肉注射后，NHP 注射部位和不同免疫组织中的 mRNA 浓度随时间变化趋势。在 NHP 注射部位，完成注射后第 8h，eGFP mRNA 信号达到峰值。随时间增加，eGFP mRNA 信号减少，至注射后第 72h，eGFP mRNA 信号接近消失殆尽。与此形成对比的是，eGFP 蛋白信号在注射完成 24h 后达到峰值。与啮齿动物一致，NHP注射部位的 eGFP mRNA 信号主要分布在炎症浸润的巨噬细胞、成纤维细胞及脂肪细胞。肌纤维中检测不到 eGFP mRNA 信号。同样，表达 eGFP 蛋白的细胞主要为巨噬细胞、成纤维细胞及脂肪细胞。此外，在 NHP 注射部位的内皮细胞中也发现表达 eGFP 蛋白，这样的情况没有出现在啮齿动物注射部位。在 NHP 注射部位，eGFP mRNA 随时间动态变化趋势。在 NHP 注射部位，eGFP 蛋白随时间动态变化趋势。NHP 髂骨引流淋巴结中的 eGFP mRNA 信号要高于腘窝淋巴结和腹股沟淋巴结。在注射完成后 8h，引流淋巴结内部的 eGFP mRNA 信号主要分布皮下窦和髓窦。随后，在滤泡 B 细胞区会检测到少量 eGFP mRNA。在髓质中可观察到 eGFP 蛋白信号，主要见于组织细胞、网状细胞及树突细胞。此外，在髓窦和皮下窦也观察到 eGFP 蛋白信号，主要见于组织细胞、网状细胞及窦内皮细胞。在卵泡的边缘区域，极少的组织细胞和网状细胞也表达 eGFP 蛋白。在 NHP 引流淋巴结，eGFP mRNA（A）和 eGFP 蛋白(B)随时间动态变化趋势。小结在 mRNA-LNPs 肌肉注射后，研究人员证明在 NHP 和啮齿动物的注射部位中，mRNA 分布和编码蛋白质表达主要出现在浸润的免疫细胞中，随后，出现于引流淋巴结。在引流淋巴结内部的皮下窦和髓窦巨噬细胞中表现出高水平的蛋白表达。有意思的是，不管是 NHP，还是啮齿动物，注射部位的肌纤维中均未检测到 mRNA 和蛋白表达，说明 mRNA-LNP 未转染进入肌肉细胞。这些数据将帮助我们优化 LNP 递送系统，为开发 mRNA 疫苗提供重要指导。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。