冲击！环状RNA或会致癌？需要先认清这几件事！
2023-08-15
信使RNA
40多年以前，人类首次在真核细胞细胞质中发现了环状RNA（circRNA）的存在。CircRNA是由前体mRNA经非规范反向剪接产生的共价闭环RNA分子，在调控生理和病理进程中，通过不同的机理发挥重要作用。2014年，在北卡罗来纳大学任教的王泽峰教授和汪洋博士首次报导了环形RNA在细胞内可通过非帽依赖的翻译机制来表达蛋白，人们首次认识到circRNA也具有编码与表达蛋白的能力。此后，随着体外环化技术的发展，比线性mRNA稳定性更强的合成circRNA成为mRNA治疗领域备受关注的新技术，有望以mRNA药物相似的递送方法，实现疾病的治疗。随着测序检测和表征技术的发展，目前已经在真核生物中检测到数千个circRNA，其中一些甚至比线性mRNA表达更多。circRNA在人体中的分布具有器官特异性，主要集中在大脑中。各种类型的circRNA已被证实与疾病进展有关，如癌症、糖尿病、神经精神疾病和心血管疾病，是潜在的生物标志物或治疗靶点。虽然目前针对circRNA引发炎症相关疾病或癌症的研究仅限定了内源性circRNA的致病机制，同时体外合成circRNA的in vivo安全性研究也未见造成相关疾病的风险，但人们还是不可避免的生出疑虑：体外合成的circRNA药物是否会导致炎症疾病或者癌症发生？为回答该问题，我们整理了大量有关论文，将通过总结circRNA可能导致癌症发生的有关机制，梳理问题的来龙去脉。轰炸朋友圈的“CircRNA致癌”论调之由来参考迄今为止的大多数研究所表征的circRNA分布，特别是外显子circRNA，主要定位在细胞质中，并通过多种类型的非编码或编码机制影响基因表达和蛋白质功能。在细胞核中发挥分子功能的circRNA与细胞质中的模式部分相似，例如形成蛋白质海绵。不同的是，细胞核内（注意是细胞核内哦！）的circRNA可以通过产生circRNA：DNA杂交环（circR loop）直接调节转录和剪接。这类circR环较线性RNA:DNA杂交环具有更强的连接稳定性，但其潜在的分子机制和生物学意义仍不明确。CircR-loop导致白血病2023年6月8日，来自弗林德斯癌症创新中心的Simon Conn教授和Vanessa Conn博士团队在Cancer Cell上发表了题为“Circular RNAs drive oncogenic chromosomal translocations within the MLL recombinome in leukemia”的研究论文。该团队发现， circRNA在混合谱系白血病（MLL）重组基因组（Recombinome）中富集，并结合DNA在其同源位点形成circR loop。这些circR loop被发现具有促进转录暂停（暂停RNA聚合酶II，RNA Pol II），抑制蛋白酶体，染色质易位重组和DNA双链断裂（DSB）的效应。通过这些效应将会共同导致致癌染色体易位并最终导致白血病。针对HEK293细胞circR环基因集的过表达富集分析(Over-representation enrichment analysis, OEA)显示，circR环富集在白血病发病后出现的染色体变化中。研究人员解释，因为在急性白血病的起始阶段，混合谱系白血病(MLL)基因和伴侣基因（例如MLLT1）之间的染色体易位形成有效的融合癌基因是一个起始因素，可以在超过70%的婴儿白血病中观察到该染色体易位的形成。图1. circMLL(9, 10)验证过程研究人员以此构建了不同的circR环结构——circMLL，其中circMLL(9, 10)是通过在MLL重组基因组断点簇区（bcr）内的外显子9−10处结合其同源DNA形成最显著的circR环。通过一系列体外和体内实验，研究人员证实circMLL(9, 10)的过表达并未直接改变MLL基因全转录组或引起选择性剪接，而是暂停RNA Pol II，促进DSB从而引起染色体重组，并观察到对DNA修复相关的20S蛋白酶体的抑制，最终导致MLL致癌染色体易位发生，降低了HL-60细胞异种移植小鼠的存活率。本研究还发现在所有检测到的R环中circR环的比例约为6%，证明circR环普遍存在于人类基因组中。此外，研究还发现circMLL(9, 10)水平在白血病症状发作之前也会显著增加，表明circRNA是内源性RNA致癌物而不是发病后的产物。最关键的是，常规线性R环具有10-20分钟的半衰期，会随时间动态分离，减轻R环形成对基因组稳定性的负面影响。然而，circR环比同源线性RNA形成的R环更强，更稳定的结构也意味着将有更大可能导致基因组的不稳定。因此，有很多看过该文章的同僚不禁开始担心，circRNA既然会造成DNA双链断裂引起染色体致癌易位，并且抑制蛋白酶体的DNA修复作用，以如此“危险”的circRNA成药并打入人体，难道不会增加人体患癌的风险吗？！CircRNA调控促炎症/癌症信号通路无独有偶，2023年6月7日，来自多伦多大学桑尼布鲁克研究所的研究团队在Molecular Therapy上发表了题为“CircRNAs regulate the crosstalk between inflammation and tumorigenesis: The bilateral association and molecular mechanisms”的综述文章。本综述中探究了炎症与癌症发生之间的分子关联，并且总结了circRNA介导的炎症/癌症信号通路调控潜在机制。据报道，circRNA可以充当miRNA海绵，也可以通过与cRBP结合和蛋白质翻译来调节（激活或抑制）肿瘤/炎症信号通路。其中circRNA与cRBP结合形成的circRNA-蛋白质复合物可能会造成RBP（RNA结合蛋白）失调从而导致慢性炎症和/或自身免疫缺陷，并引起癌症发生。以人类抗原R(HuR)为例，由于circRNA和HuR在炎症和癌症中的相互串扰作用，将改变原有信号通路并可能造成HuR的过表达，继而驱动促炎表型的激活。已有研究验证，PRKAR2A衍生的mmu_circ_0001845通过与β-catenin相互作用，激活体内外Wnt/β-catenin信号通路，会加速导致结肠炎到炎症相关结直肠癌的转化。不仅如此，circRNA还可以通过激活肿瘤逃逸机制和改变T细胞介导的免疫反应来引起免疫抑制，改变肿瘤进展。图2. 已知circRNA涉及的炎症/癌症信号通路结合上述两篇文章和目前井喷式涌现的circRNA与癌症发生机制相关的研究看，不免让人担忧“如狼似虎”的circRNA似乎要和“致癌”画上明确等号。尽管许多研究包括上述两篇文章都强调，circRNA在癌症进展不同阶段具有正相关机制外，同样存在抑制癌症发生的机制和通路，但按照生物医药行业遵循“疑罪从有”的基本方针，“circRNA=致癌”的声音也是甚嚣尘上，具有“致癌”风险的circRNA貌似只能被“打入冷宫”。事实真的如此吗？“我知道你很急，但你先别急。”在下结论之前，我们首先要理清以下几个概念：circR loop离“致癌”还隔了千山万水细胞中存在一类被称作R-loop的特殊三链核酸结构，由DNA-RNA杂交和相关的非模板单链DNA组成。哺乳动物细胞中，约有5%的区域会形成R-loop，多数集中在转录起始区和转录终止区，由RNA Pol I, II与III转录的RNA均可与DNA形成R-loop，表明其可来源于几乎所有类型的RNA。据Simon Conn教授团队报道，circRNA可以比线性RNA更有效地与同源DNA杂交形成R loop。R-loop的形成与转录过程密不可分，所以其水平也受转录的调控，很多研究表明Pol II在DNA上的暂停（pausing）会诱导R-loop的产生。在分布方面，基因密度高的转录活跃的基因上通常可以检测到更多的R-loop；反之，基因密度较低的区域上R-loop则较少。图3. 转录过程中R-loop的形成R-loop的功能是一把“双刃剑”。具体而言，R-loop是很多重要生物学过程必需的中间产物，例如S区的R-loop是免疫球蛋白类开关重组过程的天然来源。CRISPR-Cas9系统中，由gRNA和双链DNA形成的R-loop直接引导Cas9核酸酶激活，产生DNA双链断裂。此外，R-loop还可以在DNA损伤修复过程中充当关键中间体，但异常产生的R-loop积累又会给基因组带来不稳定性，因此其失调与许多人类疾病的发生发展有关，包括癌症、神经退行性变和自身免疫病等。按上面的说法，岂不是circRNA引起circR环形成并引发疾病是很常见的事情？答案并非如此！真相1：并非所有CircRNA都能入核在一篇综述中，总结了circRNA的分布和定位特点[3]。分布于细胞核内的circRNA可能均为仅由内含子形成的内含子circRNA（ciRNA）或外显子-内含子circRNA（EIciRNA），而外显子circRNA（ecircRNA）均分布在细胞质或外泌体当中。值得注意的是，目前研发中最常使用基于置换内含子外显子 (PIE，permuted intron exon) 方法合成circRNA，若质量控制得当，产物将类似外显子circRNA（ecircRNA）不含内含子片段，其体内分布也将固定在体液循环和细胞质中。甚至通过目前环化生产方法的革新，也可以不需要作为连接元件的外显子片段。据研究报道[4]，需要由易位连接上游和下游内含子中的互补序列并列才有可能引起染色体易位并促进癌症发展，而体外合成circRNA并不具备内含子序列并列的能力。此外，有研究发现[5]，m6A对circRNA的修饰除了调控circRNA的翻译机制，同样也决定了circRNA的细胞分布。据报道，m6A可以被特定的细胞核阅读器（nuclear readers，如YTHDC1）识别，并促进circRNA的核输出。因此，想要请circRNA入核跟DNA发生些什么故事，也不是那么简单的。图4. 现有体外环化生产circRNA的工艺原理真相2：核内CircRNA≠形成CircR环≠致癌事实上广泛研究的由共转录线性RNA形成的R环很少与致癌易位相关。据Simon Conn教授团队报道，在本研究中进行的circRNA筛选后发现，并非每个circRNA都可能对基因组完整性构成威胁。许多circRNA在细胞核内的富集并不意味着会形成更多circR环，形成circR环的基因点位也并非均为致癌易位突变。他们的研究发现，容易构建circR环的circRNA在细胞核中的含量并不高且只表现为轻度富集。本研究在筛选过程中也一再强调，其候选circRNA皆需要在同源位点才能驱动特定DSB。此外，本研究还强调，circR环的形成只是前提条件，造成致癌染色体易位还需要RNA Pol II暂停转录，染色体重组，DSBs和蛋白酶体抑制共同作用（图5）。circR环的形成并不意味着“致癌”是必然结果！图5. circR-loop的致癌机制来自清华大学医学院的陈默研究员对此发表评论[6]，本研究只表明游离circRNA而不是circR环可以在体外抑制蛋白酶体活性，因此验证circR环是否可以抑制蛋白酶体活性仍需要进一步的实验。染色体易位发生的下一个关键要求是断裂染色质的两端靠近，CircMLL(9, 10)或circMLLT1单独可引起DSB，但只有当它们一起表达时，它们才能诱导致癌易位（图6）。为什么circR-loop优先富集在MLL易位区，以及circR-loop富集途径中的其他基因是否也具有更高的基因组易位倾向，仍是需要深入探究的关键问题。图6. CircMLL(9, 10)或circMLLT1单独可引起DSBCircRNA致病“可能性”渺茫循环系统中的circRNA主要通过miRNA海绵机制与靶基因竞争结合miRNA，从而上调其表达，也称为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）机制。该机制也是目前研究已知circRNA在癌症进展和转移中起到促进作用的主要形式。真相3：circRNA与癌症：是因是果尚无定论学术界普遍对circRNA的海绵机制与癌症的关联仍存在争论，并不能准确验证是癌症导致circRNA丰度变化还是circRNA丰度变化导致的癌症。声称具有microRNA（miRNA）海绵特性并有助于癌症进展的circRNA列表正在迅速扩大，但大多数研究报告仅表明，相对于相邻的非恶性组织，circRNA在肿瘤中高表达，并以此关联circRNA和癌症进展的“可能”关系。需要注意，尽管不能确认circRNA与癌症发生的直接关联，但circRNA仍可作为癌症进展标志物进行诊断。有研究者指出[7]，在不同肿瘤细胞中，随着细胞的不断增殖，可以观察到circRNA总丰度的下调，这可以解释为细胞分裂稀释了浓度。因此，虽然该发现也可以帮助检测癌症进展、评估癌症预后，但很明显，circRNA的丰度上调并不能决定一定会促进癌症进展。所以，要想体外合成circRNA靠量的堆积直接导致癌症，可谓“困难重重”，首先得满足该circRNA分子要与蛋白质或microRNA结合并形成具有海绵效应的复合物，其次该复合物介导的通路必须是促癌的而不是抑制癌症进展。真相4：仍要分清内/外源性的区别当然，前面所说circRNA介导的信号通路，一个很大的前提便是“内源性”。上一板块中，我们同样讲到了体外合成circRNA不具备内含子甚至也可以不带外显子序列，仅保留目标基因片段。而调控各种通路的内源性circRNA，其序列结构均要比体外合成circRNA复杂许多。体外合成的circRNA并没有想象的那样神通广大。但话却不能说这么满。有研究报道，在不同癌细胞系中转染circRNA可驱动特定细胞因子相关基因的过表达和NF-kB信号传导，从而激活先天免疫反应。然而，目前未有足够研究证据表明circRNA是否由于其组织特异性表达而在持续炎症成瘤方面有任何作用。因此，了解这些机制背后的分子事件和信号级联（即炎症和癌症发生）以及circRNA的功能复杂性至关重要。图7. 部分circRNA在癌症发生过程中的炎症细胞反应调节功能总结要将circRNA打上“致癌”的标签，不能通过简单的理解断章取义。结合目前为止针对circRNA的机制研究总结，基于现有环化工艺合成的circRNA，要将其送入细胞核与DNA形成circR-loop并最终导致染色体致癌易位，就如同把一块表的零件扔入游泳池随着水流组装成一块新表一样，不是那么简单。首先，在进入细胞核这一项上，体外合成circRNA就有多项特征不支持完成该途径。其次，形成circR环并导致同源点位共定位也同抑癌基因突变一样，即时有伴侣基因的双过表达，也不一定会导致癌症发生。此外，目前仍不清楚circRNA的海绵效应是否是导致癌症发生的罪魁祸首，也无法解释circRNA的富集是否为响应癌症。相对的，现有证据表明，目前仅有3%的circRNA被证明具有肿瘤标志物的潜力。其中，能够促进炎症/癌症进展的更是少之又少。就算有人不严谨地得出“circRNA致癌”的结论，也一定要警惕，内源性circRNA与外源性circRNA药物的区别，切不可以此推断“circRNA致癌”，严重违背科学该有的严谨。说一千道一万，当下我们对circRNA的认知还很有限，未来仍需要加强对circRNA功能复杂性的研究，至于外源性circRNA药物的安全性也需要更多的实验论证，既不能随意推断，更不该为了流量曲解科学，给行业发展带来消极影响。参考资料：[1] Conn VM, Gabryelska M, Toubia J, Kirk K, Gantley L, Powell JA, Cildir G, Marri S, Liu R, Stringer BW, Townley S, Webb ST, Lin H, Samaraweera SE, Bailey S, Moore AS, Maybury M, Liu D, Colella AD, Chataway T, Wallington-Gates CT, Walters L, Sibbons J, Selth LA, Tergaonkar V, D'Andrea RJ, Pitson SM, Goodall GJ, Conn SJ. Circular RNAs drive oncogenic chromosomal translocations within the MLL recombinome in leukemia. Cancer Cell. 2023 Jul 10;41(7):1309-1326.e10. doi: 10.1016/j.ccell.2023.05.002.[2] Qadir J, Wen SY, Yuan H, Yang BB. CircRNAs regulate the crosstalk between inflammation and tumorigenesis: The bilateral association and molecular mechanisms. Mol Ther. 2023 Jun 7;31(6):1514-1532. doi: 10.1016/j.ymthe.2022.12.005.[3] Caba L, Florea L, Gug C, Dimitriu DC, Gorduza EV. Circular RNA-Is the Circle Perfect? Biomolecules. 2021 Nov 24;11(12):1755. doi: 10.3390/biom11121755. [4] Kristensen LS, Jakobsen T, Hager H, Kjems J. The emerging roles of circRNAs in cancer and oncology. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Mar;19(3):188-206. doi: 10.1038/s41571-021-00585-y. [5] Wu J, Guo X, Wen Y, Huang S, Yuan X, Tang L, Sun H. N6-Methyladenosine Modification Opens a New Chapter in Circular RNA Biology. Front Cell Dev Biol. 2021 Jul 23;9:709299. doi: 10.3389/fcell.2021.709299.[6] Chen M. CircR-looping the leukemic translocations: The cause of MLL translocations explained. Mol Cell. 2023 Jul 6;83(13):2164-2166. doi: 10.1016/j.molcel.2023.05.037. [7] Vo JN, Cieslik M, Zhang Y, Shukla S, Xiao L, Zhang Y, Wu YM, Dhanasekaran SM, Engelke CG, Cao X, Robinson DR, Nesvizhskii AI, Chinnaiyan AM. The Landscape of Circular RNA in Cancer. Cell. 2019 Feb 7;176(4):869-881.e13. doi: 10.1016/j.cell.2018.12.021.
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