机制建模优化基因治疗中rAAV的生产

2023-08-13

基因疗法临床研究

基因疗法有可能通过将治疗基因导入患者的细胞来治疗严重疾病。重组腺相关病毒(rAAV)具有相对低的免疫原性、广泛的组织嗜性和长期的基因表达能力，是目前最常用的体内基因递送载体。近年来，FDA批准了越来越多基于rAAV的基因疗法用于各种疾病的治疗，包括导致失明的遗传性疾病、肌营养不良和血液疾病。制造过程对于基于rAAV的基因疗法而言是一个重大挑战，限制了非临床和临床新疗法的发展。目前的rAAV制造过程通常难以扩展，并且产量低，耗材成本高。因此，单剂rAAV基因疗法的生产成本（销售成本，COGS）可能在10万到30万美元之间。这种经济负担影响了获得高质量的研究级rAAV，对基于rAAV的新型基因疗法的发展产生了重大影响。与此同时，目前的制造能力无法满足对rAAV的不断增长需求，特别是考虑到对全身给药载体的兴趣不断增加，以及数百项正在进行的rAAV治疗的临床和非临床研究。因此，迫切需要开发高效和可扩展的制造流程，将基于rAAV的基因疗法提供给患者。目前有两种成熟且广泛使用的rAAV制造平台。最常用的rAAV制造技术基于哺乳动物细胞的短暂转染。虽然实施快速，但短暂转染对向细胞提供质粒DNA具有较高的固有成本。此外，通过这种方法生产的rAAV通常只有很小比例（5%-20%）的颗粒中含有治疗基因。其余的rAAV颗粒是空的壳体，没有治疗效果，因此被认为是产品杂质。在向患者投放载体之前，通常需要昂贵的下游处理步骤来富集含有治疗基因的颗粒。第二个成熟的制造平台是基于昆虫杆状病毒表达载体系统（BEVS）在无脊椎动物Sf9细胞系中制造rAAV。这一过程已经成为HEK293短暂转染的可扩展和高效替代方法，产生高滴度的rAAV载体，其中高达80%的颗粒填充有治疗基因。这种方法使用自复制的重组昆虫杆状病毒将rAAV生产所需的基因输送到昆虫细胞中，是短暂转染的一种更具成本效益的替代方案。值得注意的是，美国FDA最近首次批准了一种使用BEVS和昆虫细胞制造的基于rAAV的基因疗法。还有几个未解决的问题需要解决，以进一步提高基于BEVS的rAAV生产。从工艺的角度来看，需要确定感染时的最佳细胞密度和昆虫杆状病毒与细胞的比例（感染度，MOI）。从分子生物学的角度来看，尚不清楚相对于哺乳动物细胞方法，昆虫细胞基于的过程中哪些遗传元素和途径负责提高产量。已经使用了多种昆虫杆状病毒构建，采用不同的启动子和重组片段用于rAAV在昆虫细胞中的生产。这些不同的昆虫杆状病毒构建在rAAV滴度和填充与空壳体比例方面表现出不同的效率。对导致更高滴度的填充型rAAV的细胞内机制有更深入的了解，可用于设计增强rAAV生产的昆虫杆状病毒构建。为了实现这些目标，麻省理工学院的一组科学家和工程师与UMass Chan医学院的团队合作，该团队开创了使用BEVS进行rAAV生产的方法。在最近的一篇发表的论文中，研究人员开发了一个机制模型，定量描述了在昆虫细胞中发生的昆虫杆状病毒感染和rAAV病毒颗粒生产过程中的关键细胞内现象。该模型使用微分方程来数学地表示涉及该过程的物理、化学和生物现象。机制建模相对于机器学习等替代方法需要更少的训练数据，这使得在数据有限且昂贵的情况下，这种建模特别有用。在经过训练后，该模型在未用于训练过程的数据集上展现出了非凡的验证性能。该模型准确预测了填充型和空壳体rAAV的滴度，以及rAAV生产和昆虫杆状病毒扩增的关键中间产物。因此，该模型代表了对该过程可用的机制知识的定量和可解释的总结，可以用来发现和解决限制BEVS中rAAV制造效率的瓶颈问题。该模型已经开发出用户友好的实现，并可在线使用。该平台允许用户以批量模式在摇瓶或生物反应器中模拟rAAV的生产过程。要运行模拟，用户只需选择感兴趣的实验条件，包括要使用的昆虫杆状病毒构建类型（TwoBac或ThreeBac）、感染时的细胞浓度、系统中每种昆虫杆状病毒的感染度，以及预期的批次持续时间。可选地，用户还可以修改某些在实验室之间可能有所不同的特定现象的默认参数，例如细胞生长或死亡动力学。然后，模拟器在虚拟环境中以所选条件进行实验，并在几秒钟内无需费用提供结果。生成的结果包括批次期间填充型和空壳体rAAV浓度的模型估计值。此外，模型生成的结果还包括几种在rAAV形成中起作用的细胞内物种的浓度：载体基因组、mRNA、空壳体以及病毒复制和结构蛋白。用户可以根据需要调整模拟设置，快速探索不同的实验情景。通过合适的虚拟实验设计，用户可以了解细胞密度和感染度如何影响生产过程，从而确定最大化填充型rAAV产量的最佳条件。了解细胞内物种（如载体基因组和复制蛋白）的水平对于识别rAAV生产过程中细胞内级联反应中的瓶颈至关重要。通过模拟器的输出，用户可以轻松绘制参与rAAV形成的几种细胞内物种的浓度。有趣的是，模拟器的输出显示，对于所考虑的昆虫杆状病毒构建，产生rAAV的细胞中空壳体的浓度远大于用于封装的自由载体基因组的浓度。因此，该模型表明，对于当前的昆虫杆状病毒构建，由低复制蛋白水平所决定的低rAAV基因组扩增是限制填充型rAAV产量的主要因素。这个结论在实验研究中以前从未得出过，因为高昂的实验成本大大限制了有关产生rAAV细胞内蛋白和核酸测量的研究报告数量。该模型还表明，文献中提出的一些被假设为限制步骤的现象，如昆虫杆状病毒感染效率低，实际上并不是阻碍AAV生产的真正瓶颈。该模拟器允许测试广泛的条件和假设，否则在实验室环境中可能不实际或不可行。例如，通过改变模型的动力学参数，用户可以探索在rAAV生产中涉及的几个基因的过度表达或低表达对填充型壳体产量的影响。总之，这个机制模型为实验设置提供了一个虚拟的表示，使研究人员能够预测不同工艺参数和昆虫杆状病毒构建下的rAAV产量。这个强大的工具提供了克服当前瓶颈的建议，促进快速决策，并优化实验设计以最大化rAAV产量。参考文献：Destro, F., Joseph, J., Srinivasan, P., Kanter, J.M., Neufeld, C., Wolfrum, J.M., Barone, P.W., Springs, S.L., Sinskey, A.J., Cecchini, S., Kotin, R.M. and Braatz, R.D. (2023). Mechanistic modeling explains the production dynamics of recombinant adeno-associated virus with the baculovirus expression vector system. Mol Ther Methods Clin Dev, 30, 122-146.作者介绍：Francesco Destro是麻省理工学院的博士后研究员。他的研究专注于使用机制建模和机器学习来设计和优化先进生物治疗品的制造系统。他在意大利帕多瓦大学获得化学工程博士学位。John Joseph是麻省理工学院的研究科学家。他的研究专注于使用rAAV载体进行基因治疗。他的研究兴趣包括生物医学设备、免疫工程和基因治疗。| 编译：CrystalEND