JMC | 基于ATTEC技术开发DDR1降解剂

2024-05-15

蛋白降解靶向嵌合体

2024年5月7日，药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry在线发表了中国科学院上海有机化学研究所丁克教授和王震研究员团队的最新研究成果“Discovery of LLC355 as an Autophagy-Tethering Compound for the Degradation of Discoidin Domain Receptor 1”。该研究基于自噬小体绑定化合物(ATTEC)技术开发了一类降解DDR1的降解剂，代表性化合物LLC355在NCI-H23细胞中通过溶酶体介导的自噬途径有效降解DDR1。跨膜受体酪氨酸激酶Discoidin domain receptors（DDR1和DDR2）在细胞增殖和细胞分化等过程中发挥关键作用，是治疗癌症、纤维化疾病和炎症的潜在靶点。尽管一些选择性的DDR抑制剂和DDR1/2双靶点抑制剂在小鼠模型中展现出有希望的治疗效果，但目前尚无DDR抑制剂进入到临床研究阶段。已有研究表明除了DDR1的激酶功能，DDR1非酶结构域介导的功能在肿瘤的发生发展、转移和免疫排斥过程中发挥重要作用。因此，传统的DDR1抑制剂 DDR1抑制剂只能有效抑制DDR1的激酶功能，无法阻断DDR1非激酶结构域所介导的功能。目前需要探索新的方法来靶向DDR1的非酶结构域。与PROTAC类似，近年来发展起来的一种靶向蛋白质降解技术自噬小体绑定化合物(ATTEC)通过将靶蛋白招募至自噬关键蛋白LC3并最终经溶酶体途径诱导靶蛋白降解提供了一种潜在的策略。为了开发一类降解DDR1的ATTEC类降解剂，作者以高亲和力和选择性DDR1抑制剂 DDR1抑制剂作为靶蛋白配体，并通过Docking模拟了其与DDR1的结合模式。结果显示DDR1抑制剂 DDR1抑制剂化合物1的N-甲基哌嗪部分处于溶剂暴露区，是连接LC3配体的合适位点（图1）。在LC3配体部分，作者分别探索了已被成功用于ATTEC设计的GW5074和ispinesib。同时作者设计了合理的方案合成了一系列降解DDR1的ATTEC。图1 降解DDR1的ATTEC的设计首先，作者分析了这类ATTECs诱导DDR1降解的构效关系，化合物的DDR1降解效率在NCI-H23细胞中通过免疫印迹评估。结果显示以GW5074为LC3配体的ATTECs的降解效率相对较低，最有效的化合物10g在1 μM浓度下诱导60%的DDR1降解，在0.3 μM浓度下未观察到明显的DDR1降解。而以ispinesib为LC3配体的ATTECs的降解效率更高，10l − 10o在1 μM浓度下对DDR1的降解率超过70%。其中化合物10n (LLC355)的DDR1降解能力最强，在0.3 μM浓度下诱导40%的DDR1降解，而在1 μM浓度下诱导92%的DDR1降解。因此，作者以LLC355作为代表性化合物用于后续的研究。作者进一步分析了LLC355在NCI-H23细胞中诱导DDR1降解的效率。结果表明LLC355以剂量依赖的方式诱导DDR1降解，DC50 = 150.8 nM（图2A 和2B），但LLC355对DDR2的表达量没有明显影响（图2C）。此外，LLC355诱导DDR1降解呈时间依赖性，在24 h达到最大降解效率（图2D）。最后，作者还在两株胰腺癌ANC-1和MIA-PaCa-2细胞中观察到LLC355对DDR1降解（图2E）。这些结果充分证明了LLC355是一个有效的DDR1降解剂。图2 LLC355在肿瘤细胞中诱导DDR1降解为了进一步探究LLC355诱导DDR1降解的机制，作者通过qPCR分析了经LLC355处理后NCI-H23细胞中DDR1的mRNA的变化，结果表明在0.3 μM和1 μM两个浓度条件下均未观察到DDR1的mRNA水平的显著改变（图3A）。而在cycloheximide处理的NCI-H23细胞中，LLC355处理组DDR1的半衰期明显缩短（图3B）。为了验证LLC355是基于ATTEC的机制诱导了DDR1的降解，作者发现在自噬抑制剂bafilomycin A1和chloroquine处理的NCI-H23细胞中，LLC355诱导DDR1降解的效率被显著抑制（图3D）。而在自噬激动剂rapamycin处理的细胞中，LLC355诱导DDR1降解的效率被进一步增强（图3E）。这些结果共同表明了ATTEC化合物LLC355是通过溶酶体-自噬途径实现了对DDR1的降解。随后作者通过蛋白质组学分析探究了LLC355的选择性，经10 μM LLC355处理6小时的NCI-H23细胞虽然在Western blotting实验中观察到明显的DDR1降解，但在全蛋白质分析中并没观察到DDR1蛋白的显著改变。图3 LLC355通过溶酶体途径诱导DDR1降解最后，作者评估了LLC355诱导DDR1降解的细胞表型。Transwell实验显示LLC355在0.3μM浓度条件下显著抑制了NCI-H23细胞的迁移和侵袭，而DDR1抑制剂 DDR1抑制剂1无法产生明显的抗迁移效果（图4A）。进一步探究发现LLC355能够抑制EMT过程关键标志物N-cadherin（图4B）。此外，作者还探究了LLC355对细胞凋亡标志物cleaved-PARP的影响，结果显示0.3 μM LLC355对cleaved-PARP未产生影响，但1 μM LLC355能够导致NCI-H23细胞中cleaved-PARP水平的显著升高（图4C）。作者还通过集落形成实验评估了LLC355的抑瘤能力，结果显示DDR1抑制剂 DDR1抑制剂1和LLC355都能够明显抑制NCI-H23细胞的集落形成，但降解剂LLC355抑制集落形成能力优于DDR1抑制剂 DDR1抑制剂化合物1（图4D）。图4 LLC335抑制NCI-H23细胞的迁移、侵袭和集落形成原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.4c00162声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓