颠覆现有认知，自复制RNA也可掺入修饰核苷，降低免疫原性，增强蛋白表达

2023-09-22

信使RNA疫苗寡核苷酸核酸药物

“四两拨千斤”是自复制 RNA 的看家本领，以极低剂量，实现媲美常规线性 mRNA 的表达效果。自复制 RNA 源自对正链 RNA 病毒双顺反子基因组的重构，保留编码 RNA 聚合酶复合物（RdRp）的非结构蛋白基因（NSP1-4），使用靶标基因序列替代病毒结构蛋白基因。对于自复制 RNA 机制的理解，需要注意以下几点，很多新手会问的比较多：第一，自复制 RNA 在体外合成的时候是需要加帽的。因为自复制 RNA（+）进入细胞质后，需要翻译表达出 NSP1-4。没有帽子结构，你是无法进行蛋白的翻译表达。第二，自复制 RNA 细胞内的活性取决于 RdRp 功能的正常发挥。NSP1-4 聚合形成RdRp，然后，RdRp 以正链 RNA 为模板，复制出全长负链 RNA 中间体。再以负链 RNA 中间体为模板，合成出一条全长的正链 RNA（原始基因组拷贝），还会合成一条编码靶标蛋白的亚基因组 RNA。也就是说，自复制 RNA 进入宿主细胞表达出有活性的 RdRp，才能保证以 RNA（+/-）为模板的复制和转录过程正常进行。第三，自复制 RNA序列掺入N1-甲基假尿苷(N1mΨ)会导致其丧失表达活性。从早期自复制 RNA 疫苗的临床试验数据来看，相比较常规 mRNA 疫苗，自复制 RNA 疫苗触发的中和抗体水平较低，免疫效果不佳，这可能是自复制 RNA 会触发强烈的 I 型干扰素反应，抑制 RNA 复制和抗原表达过程。人们尝试过一些降低自复制 RNA 免疫原性的方法，例如，序列演化，共表达病毒抑制性蛋白，递送载体优化等（详情见综述|自复制RNA质粒载体序列优化设计策略），但是，这些方法并不具备通用性。要说最通用的降低 RNA 免疫原性的方法，还是要当属修饰核苷。吊诡的是，许多课题组均发现，使用 N1-甲基假尿苷合成的自复制 RNA 会抑制蛋白表达活性。当前，较为合理的解释是 RNA 序列中修饰核苷的引入，改变了自复制 RNA 的序列结构，导致 RdRp 无法正常识别关键元件，例如，末端的保守序列元件（CSEs）或者 SGP（基因组启动子）。最近，波士顿大学 Grinstaff Lab 在 BioRxiv 上传文章：Complete substitution with modified nucleotides suppresses the early interferon response and increases the potency of self-amplifying RNA，首次筛选到与自复制 RNA 相兼容的修饰核苷酸，从而抑制了干扰素反应，相比未修饰自复制 RNA，掺入修饰核苷酸的自复制 RNA 可数倍提升蛋白表达水平，完全颠覆了当前主流的观念—自复制 RNA 中使用修饰核苷酸抑制表达活性。筛选增强自复制 RNA 表达的修饰核苷酸他们采用 27 种修饰核苷酸，合成 mcherry-saRNA，利用阳离子脂质转染 HEK293 细胞，以荧光蛋白信号作为转染效率的评估指标，筛选到 3 种转染效率最高的修饰核苷酸，分别是 5-羟甲基胞苷 (5OHmC)、5-甲基胞苷(5mC) 及 5-甲基尿苷(5mU)。与 N1mΨ-mcherry-saRNA 相比，转染效率分别提升 14 倍、10 倍及 8 倍。与未修饰的 WT-mcherry-saRNA 相比，筛选出的 3 中修饰核苷的转染效率也有显著提升或者相当。此外，我们可以明显看到，与未修饰的 WT-mcherry-saRNA 相比，一旦使用 N1mΨ，会导致 mcherry-saRNA 的转染效率坠崖式下降。帽结构类型的影响使用修饰核苷酸替换对应的天然核苷酸，同时，采用 GAU 合成携带 Cap1 帽结构的自复制 RNA 转染效率或者蛋白表达水平显然要比采用 ARCA 合成的携带 Cap0 帽结构的自复制 RNA 更高。修饰自复制 RNA 表达活性的增强可在多种类型细胞中重现使用 SM102 LNP，递送 10 ng Luc-saRNA 至各种不同类型细胞中。与未修饰的 Luc-saRNA相比，使用 5mC-Luc-saRNA 蛋白表达水平或者转染效率会提升数倍，与 N1-甲基假尿苷修饰的 Luc-saRNA 相比，更是可提升至数百倍。此外，5mC-Luc-saRNA 在细胞中的蛋白表达水平的增强可持续长时间。使用修饰核苷酸降低自复制 RNA 触发的干扰素反应细胞内有许多可识别外源 RNA 的模式识别受体，有些位于膜上，例如，TLR3/7/8，有些位于细胞质中，例如，识别双链和 5'-三磷酸修饰 RNA 的胞质受体 RIG-I 和 MDA-5 等。这些模式识别受体与外源 RNA 相结合会触发下游干扰素信号通路，激活天然免疫反应。外源 mRNA 的免疫原性是一把双刃剑，一方面可起到佐剂作用，另一方面，过强的天然免疫信号会导致RNA降解，抑制蛋白质合成。使用修饰核苷酸降低外源 mRNA 的免疫原性是 mRNA 技术应用过程中的里程碑事件，对此，我们也曾经专门介绍过（回溯|N1- Methyl-Pseudouridine破除Moderna公司前进障碍），当前，N1mΨ是常规线性 mRNA 疫苗及药物使用最为广泛的修饰核苷酸。在外周血单核细胞（PBMC）中，相比未修饰的 saRNA，用 5OHmC 或者 5mC 修饰核苷酸完全替换相应的天然核苷酸会大大减少 saRNA 诱导的干扰素基因的表达。评估自复制 RNA 疫苗的体内免疫效果构建编码 Spike 蛋白的自复制 RNA，转染细胞。在 HEK 细胞中，相比未修饰的 Spike-saRNA 相比，5OHmC/5mC 及/5mU-Spike-saRNA 蛋白表达量增加 2 倍多。在 C212 细胞中，相比未修饰的 Spike-saRNA 或者 N1mΨ-Spike-saRNA，5OHmC 和 5mC-Spike-saRNA 蛋白表达量分别可提升 2 倍和 8 倍。有意思的是，5mU-Spike-saRNA 在 C212 细胞中并未观察到蛋白表达量的显著提升。类似的是，5mU-HA-saRNA 转染 C212 细胞，同样也未表现出蛋白表达的增强。在小鼠体内注射 2.5μg Luc-N1mΨ-mRNA 或者 Luc-5mC-saRNA，观察自复制 RNA 的表达动力学特征。结果发现，Luc-5mC-saRNA 在注射后长时间内均能保持高水平蛋白表达，相反， Luc-N1mΨ-mRNA 在注射后 24 小时蛋白表达量迅速抵达峰值，随后，表达量随着时间增加而持续走低。在小鼠体内注射 Spike-saRNA 疫苗，评估免疫效果。在免疫注射 24h 时，与 Spike-5mC-saRNA 疫苗或者 Spike-N1mΨ-mRNA 疫苗免疫小鼠相比，未修饰的 Spike-saRNA 疫苗免疫小鼠血清中明显检测到更高水平的 IFN-α1，但是，在免疫注射 48h 时，所有免疫小鼠血清中均检测不到 IFN-α1。在攻毒试验中，注射 100ng 或者 1000ng Spike-5mC-saRNA 疫苗或者未修饰的 Spike-saRNA 疫苗的小鼠存活率为 100%，体重减低也最少的。注射 10ng 的未修饰Spike-saRNA 疫苗的小鼠体重下降严重，致死率为50%，相反，注射 10ng Spike-5mC-saRNA 疫苗的小鼠致死率仅为10%。此外，我们还可以观察到，虽然 Spike-N1mΨ-mRNA 疫苗免疫小鼠所需的注射剂量为 1000ng，但是，小鼠体重不会发生下降，存活率为 100%，免疫效果是最好的。结论大量的研究表明使用修饰核苷酸降低外源合成 mRNA 的免疫原性对于常规线性 mRNA 来说是具有通用性的，但是，在自复制 RNA 和 circRNA 领域的应用中遭遇到意想不到的阻碍。很长时间内，不同课题组的研究结果均显示在自复制 RNA 或者 circRNA 合成中一旦使用 N1mΨ会直接丧失蛋白表达活性。Grinstaff Lab 这项工作直接颠覆了先前的认知，自复制 RNA 和 circRNA 序列中仍然是可以掺入修饰核苷酸替代天然核苷酸，降低免疫原性，提升蛋白表达。先前那些吊诡的研究结果只是因为并未找到与 saRNA 或者 circRNA 序列相兼容的修饰核苷。当然，后续还需要对不同修饰核苷酸影响saRNA或者circRNA表达活性的机制做出更加深入的研究，比如，为什么有的修饰核苷酸酸在不同的细胞类型中对于saRNA免疫原性或者蛋白表达活性的影响是不同的？为什么修饰嘌呤核苷无法降低saRNA免疫原性？一周前，VLP Therapeutics公司创始人 Wataru Akahata 团队在 medrxiv 上传文章：Safety and immunogenicity of VLPCOV-02, a SARS-CoV-2 self-amplifying RNA vaccine with a modified base, 5-methylcytosine, in healthy individuals，他们在自复制 RNA 疫苗中掺入了修饰核苷 5-甲基胞嘧啶以减少先天反应，降低反应原性。在临床 1 期剂量递增研究中，接种 1、3、7.5 及 15 ug 5-甲基胞嘧啶修饰的自复制 RNA 新冠疫苗的免疫者血清中的抗体滴度在第 28 天会增加 3 倍左右，证实了修饰自复制 RNA 临床应用的安全性和有效性。为促进抗体行业的交流与创新，2023年10月14-15日第六届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。会议内容时间：2023年10月14-15日地点：苏州（酒店定向通知）规模：600-800人主办单位：生物制品圈、抗体圈指导单位：康维讯生物、夏尔巴生物会议费用：免费FREE!（仅收取50元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），9月15日报名定金提高到100元，先到先得，报完即止，超过9月20日预登记将收取会议费！报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。日程安排更多嘉宾仍在邀请中。。。。。。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。