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基于共价
STING
拮抗剂的双分子
STING激动剂
STING
激动剂的设计与合成
2024-04-16
·
精准药物
核酸药物
研究背景感受外源分子是免疫系统维持宿主完整性的第一步。
干扰素基因刺激因子(STING)
在2013年被表征为感知环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸(cG
AMP)
的细胞内衔接分子(图1),其由胞质双链DNA(dsDNA)传感器环GMP-AMP合酶(cGAS)产生。
STING
信号在抗病毒和抗
肿瘤
免疫中的节点作用使其成为潜在的药物靶点。在过去的几十年中,已经致力于开发
STING激动剂
STING
激动剂。天然
STING
配体cGAMP和其他环状二核苷酸(CDN)容易水解,因此,一类早期开发的
STING激动剂
STING
激动剂基本上是耐水解的cGAMP类似物。还开发了非核苷酸STING激动剂(图1)。除了小鼠特异性
STING
激活剂DMXAA(3),还有一些有前途的人
STING
激活剂包括
diABZI
(4),MSA-2(5),SR-717(6)和C53(7)等。 图1. 代表性STING激动剂和C-170大多数
STING激动剂
STING
激动剂目前被设计为靶向
STING
的配体结合结构域(LBD)。
STING激动剂
STING
激动剂表现出良好的活性,但并非它们的所有作用都是有益的,特别是在
肿瘤
治疗中。过热的
STING
信号传导导致T淋巴细胞凋亡。为了维持细胞稳态,严格控制
STING
活性以抑制生理条件下的过度自身免疫和异常
炎症
。因此,需要可持续的策略来开发
STING激动剂
STING
激动剂。C-170(8,图1)是一种共价
STING
拮抗剂,可与人和小鼠STING的Cys 91残基结合,并且Cys 91处的棕榈酰化是最佳
STING
活化所需的。相反,自动二聚化的
STING
突变会激活下游信号传导并导致
自身免疫性疾病
。青岛海洋大学大学江涛教授团队假设
STING
同源二聚体的稳定剂将激活
STING
,并且阻断Cys 91棕榈酰化将防止
STING
过度激活。在这项研究中,该课题组研究了
STING
的结构特性,并设计和合成了一系列基于共价
STING
抑制剂C-170的化合物。测试了它们对STING的生物活性,并讨论了它们的构效关系以及对各种病毒的广泛的抗病毒作用。研究内容C-170是STING的共价拮抗剂,可减轻小鼠自身
炎症性疾病
的病理特征。C-170和
STING
之间的共价键可以通过Cys91的亲核侧链与呋喃环的4位的亲核加成,随后进行分子内重排而形成。因此,5-硝基呋喃-2-甲酰胺片段是共价结合的药效团。该课题组假设,将C-170的两个5-硝基呋喃-2-甲酰胺单元组合成单个分子可能使其结合两个
STING
蛋白,并且使STING蛋白稳定二聚体构象或促进二聚体形成。因此,使用5-硝基呋喃-2-甲酰胺作为开发更有效的
STING激动剂
STING
激动剂的起点。由于硝基和呋喃部分对于化合物的生物活性都是必不可少的,因此该课题组保留了它们并使用不同的接头进行设计(图2)。与带负电荷的cGAMP不同,这些化合物主要是疏水性的,并且可能靶向
STING
的跨膜结构域(TMD)。 图2. 本文介绍了
STING激动剂
STING
激动剂的设计策略 方案1. 化合物12-30的合成 TANK结合
激酶1(TBK1)
的磷酸化是
STING
激活的标志物;因此,监测其磷酸化以筛选HT1080细胞中的
STING激动剂
STING
激动剂。构建
STING
缺陷细胞HT1080-
STING
-KO以确认
STING
依赖性
TBK1
磷酸化。化合物12-23用于处理细胞。天然激动剂cGAMP用作阳性对照。化合物23增加野生型HT1080细胞中的
TBK1
磷酸化,但不增加HT1080-
STING
-KO细胞中的
TBK1
磷酸化,这意味着它是有效的
STING激动剂
STING
激动剂(图3A和B)。化合物23还促进干扰素β(IFNβ)和
TNF-α
表达,表明其诱导
STING
依赖性基因表达(图3D和E)。为了进一步表征小分子23的STING-激动剂活性,设定梯度浓度以测试其剂量依赖性。该课题组在这项研究中使用了四种细胞系:
HT1080
、人
单核细胞白血病
细胞系
THP1
、小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。这表明随着23浓度的增加,会诱导
TBK 1
的磷酸化(图4)。 图3. 刺激剂的筛选还在所有细胞系中观察到可见的
STING
二聚化条带(图4A和B),表明23可以直接与h/mSTING相互作用并刺激h/mSTING。23处理的
HT1080
和
THP1
细胞系中的IFN-β和
TNF-α
表达水平(图4C和D)与蛋白质印迹结果一致,表明23以剂量依赖性方式诱导STING信号传导。 图4. 化合物23剂量依赖性地激活小鼠和人STINGSTING蛋白水平在用cGAMP转染后显著降低(图4A和B)。然而,在用23处理后,
STING
蛋白水平在
THP1
和BMDM细胞系中保持不变或甚至增加(图4A和B)。这是重要的,因为
STING
降解的减少可以增强
STING
信号传导和抗
肿瘤
反应。化合物23适度刺激
STING
,但由于
STING
降解延迟,因此活化效果可能是持久的。在这项研究中,该课题组筛选了23作为有效的
STING激动剂
STING
激动剂。与化合物12、14和17相比,化合物23显示出更好的生物活性,表明23的碳链是必需基团。当接头是五碳链时,它促进生物活性,这可能与柔性和疏水性有关。类似地,与化合物18-22的比较显示呋喃基团对于生物活性和特异性是必需的。化合物13增加了HT1080-WT和HT1080-STING-KO细胞中pTBK1的水平(图3C),但这种激活不依赖于STING。 由于C-170(10)是STING的共价拮抗剂,并且该课题组在先前的结果显示23处理诱导了明显的二聚STING条带(图4A和图B),因此假设23通过在两端的硝基呋喃基团与两个STING分子结合来促进STING形成稳定的二聚体,两个硝基呋喃基团之间的碳链长度可能与激动剂的生物活性有关。为了确定碳链长度23是否是刺激STING的最佳长度,合成了七种不同的23类似物(化合物24-30),其中两个硝基呋喃基团连接到不同长度的碳链(图5A)。为了更好地评估化合物24-30在细胞水平上的功能,该课题组使用了在先天免疫中起关键作用的两种细胞类型:BMDM和小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。
ADU-S100
和
cGAMP
用作阳性对照。Western blot结果显示,随着碳链的延伸,STING二聚化和TBK1磷酸化水平最初增加,然后降低(图5B),当碳长度为4时活性最低(化合物24),当长度为7-9个碳时活性最高(化合物26-28)。还研究了这些化合物对BMDM和
HT1080
细胞中I型干扰素的影响。不同化合物的活化作用在蛋白质水平上明显不同,但在RNA水平上的活化作用之间没有太大变化,尽管总趋势与蛋白质印迹结果一致(图5C和D)。该课题组在HEK-293T细胞中过表达
STING
(在C末端用Flag标记),然后用23、26或27处理细胞4小时。向细胞裂解物中加入抗-BIGG磁珠以富集STING,然后通过6% SDS-PAGE凝胶分离以观察高级寡聚体(图5E和F)。化合物23、26和27显著促进寡聚STING形成(图5F)。事实证明,即使虽然Cys91可以共价结合到23上,但由23形成的STING二聚体仍然可以进一步寡聚化并在TBK1磷酸化中起作用。 图5. 目标化合物的接头长度-活性关系虽然
26-28
在Western Blot中诱导较高水平的pTBK1,但
26-28
与23诱导的IFN表达没有显著差异;因此,该课题组选择23作为后续实验的代表。该课题组试图了解化合物23在人STING上的结合部位。化合物23是C-170的结构对称类似物,C-170通过其硝基呋喃基团共价结合到小鼠刺的Cys91上。考虑到23可以促进
STING
二聚化,假设它的结合部位在
STING
的TMD处,并将两个
STING
分子“拉”在一起,而不是LBD。STING的TMD包含四个跨膜螺旋(TM1-4),残基70-91形成TM2和TM3之间的连接物;除了连接器螺旋(141-149残基)和LBD外,该连接物在细胞质和跨膜区之间形成表面凹槽。有证据表明,该区域在
STING
激活中起着重要作用;因此,该课题组首先评估了化合物23与
STING
的Cys91结合的可能性。构建了以下
STING
突变体:STING-C91S、STING-C88S和C91S(Cys88是与Cys91最接近的半胱氨酸,也被认为是Cys91的棕榈酰化位点)。SING-C148A也被构建,因为Cys148在STING的TMD中充当另一个半胱氨酸残基,是STING的必需聚合和活化。早前发现了一种新的
STING激动剂
STING
激动剂C53,并在STING的TMD中发现了一个新的激动剂结合口袋。因此,该课题组在这个口袋里的关键残基上引入了几个突变(STING-V113Q、G114Q和P115Q)。将不同的
STING
表达载体导入HeLa细胞,在C末端用绿色荧光蛋白标记
STING
。24小时后,用23、cGAMP或两者的组合处理细胞。Western印迹结果表明,与野生型
STING
相比,带有C91S或C88,91S突变体的刺痛几乎失去了对23的反应,二聚体条带只有在长期暴露条件下才可见(图6A)。PTBK1的水平表明23刺激刺痛的能力显著降低(图6C)。另外两种突变的STING-C148A和STING-V113Q,G114Q和P115Q仍然可以被23在
STING
二聚化和pTBK1水平上刺激(图6B和C),这表明23可能直接与Cys91结合。 虽然Cys91被证明是STING的一个重要的棕榈酰化位点,但该位点在用23及类似物处理之前占据并不影响STING的二聚化。然而,由于棕榈酰化影响
STING
运输,这可能是23对
STING
的中等活化作用的原因。在本研究中,该课题组将
STING
(EGFP标记的)表达载体导入HeLa细胞24小时,并在23和cGAMP处理1h后固定细胞,我们观察到带有Cys91-丙氨酸替换的
STING
突变体导致细胞中
STING
的23诱导斑点形成的显著减少(图6D),这与先前的Western Blot结果相似。图6D的定量表明,由于
STING
的聚集,23和cGAMP处理的细胞显示出更高的平均荧光强度,而具有C91S或C88S/C91S突变体的
STING
只能被cGAMP刺激,而不能被23(图6e)刺激。值得注意的是,在实验中,在cGAMP的作用下,Western印迹没有观察到
STING
二聚体的出现,这表明在23的作用下,
STING
二聚体是稳定的。考虑到这些发现,该课题组假设23通过其两端的硝基呋喃基团与两个STING分子中的Cys91结合,形成二聚体。靶向刺痛激动剂C53(图1中的化合物7)和cGAMP的TMD共同触发了更高水平的TBK 1磷酸化。对23和cGAMP之间关系的评估证明,23显著增强cGAMP诱导的STING应答。23可以增强无论是人工合成的cGAMP还是由DNA病毒感染诱导的天然cGAMP(图6F和G)产生的免疫反应。虽然在RAW246.7细胞中观察到HSV的协同作用,但在
HT1080
细胞中几乎没有观察到HSV的协同作用。这可能是由于
HSV感染
HT1080细胞中
cGAS
的表达水平较低,
感染
6h后cGAMP不能被激活所致。另一项研究表明,
TLR3
途径而不是
cGAS
-STING途径主要在人HT1080细胞中响应
HSV感染
而起作用。该课题组连续检测到两种其他靶向LBD的
STING激动剂
STING
激动剂,包括CDN类似物ADU-S100(2)和非CDN激动剂diABZI(4),并且揭示了23也可以增加2和4的
STING
活化作用(图6h)。用23与不同处理组合处理的细胞中下游效应物
IFN-β
的表达水平显示出类似的增加趋势(图6I)。这些结果证实化合物23是可直接刺激
STING
或作为cGAMP激动剂起作用的中度
STING
激动剂。图6. 23的结合位点可能是Cys91近年来,多种病毒(SARS-CoV-2,儿童
肝炎
和
猴痘
)对全球健康构成严重威胁。天然免疫过程的药理学刺激是治疗
病毒感染
的有吸引力的策略。因此开发广谱抗病毒药物具有重要意义。STING的激活显著增加IFN的表达,其直接或通过下游JAK-STAT信号传导促进IFN刺激的基因(ISG)的表达,以多种方式广泛抑制病毒
感染
。研究23是否对病毒具有抑制作用是重要的,因为它可以激活
STING
并与cGAMP协同作用。为了研究这一点,该课题组首先检测了23对HSV的抗病毒作用。通过使用蛋白质印迹测量病毒蛋白ICP 0表达观察到23对HSV复制的抑制(图7A)。病毒RNA和23对HSV的EC50测定为6.15 μM(95%置信区间为5.48-6.92 μM)(图7B)。
STING激动剂
STING
激动剂主要通过激活宿主免疫细胞亚群发挥抗
肿瘤
作用,因此仅检测IC50显然是不够的。考虑
STING
在
肿瘤
细胞内的作用也很重要,因此,进一步研究23的体内抗
肿瘤
活性以及更深入地了解
STING
通路的生物学是未来工作的主要方向。 图7. 23的免疫刺激作用和抗病毒作用 结论与展望在这项研究中,该课题组确定了一种非环状二核苷酸小分子
STING激动剂
STING
激动剂,其靶向
STING
的表面凹槽。23的设计策略基于STING共价抑制剂C-170,这与传统激动剂的设计理念完全不同,是非常有特色的工作。同时探索了23与STING的结合位点,发现23可能与STING的Cys 91结合。Cys 91显示为STING的棕榈酰化位点。在该位点被23占据显著促进了STING的二聚化,并以适度但持久的方式刺激STING。 23和cGAMP(以及
ADU-S100
和
diABZI
)的组合触发了比任何单独的激动剂更高水平的IFN表达,表明当
STING
同时与23和LBD结合激动剂结合时,其生物活性增强。23的发现可能会为解决
STING激动剂
STING
激动剂有限的临床效果和增加对STING途径生物学的理解带来新的思路。作者:冀文淑校审:周金明编辑:郑一榕时间:2024年4月16日参考文献Ruochen Zang,et al, Tao Jiang. Design and syntheses of a bimolecular STING agonist based on the covalent STING antagonist. Eur J Med Chem. 2023, 250:115184. doi: 10.1016/j.ejmech.2023. 声明:发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要,并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断,后果自负。若有侵权,告知必删!长按关注本公众号 粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看,请点这里↓
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STING
MFAP1
TBK1
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Dimeric Amidobenzimidazole
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