ADUS-100

研究背景感受外源分子是免疫系统维持宿主完整性的第一步。干扰素基因刺激因子（STING）在2013年被表征为感知环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸（cGAMP）的细胞内衔接分子（图1），其由胞质双链DNA（dsDNA）传感器环GMP-AMP合酶（cGAS）产生。STING信号在抗病毒和抗肿瘤免疫中的节点作用使其成为潜在的药物靶点。在过去的几十年中，已经致力于开发STING激动剂。天然STING配体cGAMP和其他环状二核苷酸（CDN）容易水解，因此，一类早期开发的STING激动剂基本上是耐水解的cGAMP类似物。还开发了非核苷酸STING激动剂（图1）。除了小鼠特异性STING激活剂DMXAA（3），还有一些有前途的人STING激活剂包括diABZI（4），MSA-2（5），SR-717（6）和C53（7）等。    图1. 代表性STING激动剂和C-170大多数STING激动剂目前被设计为靶向STING的配体结合结构域（LBD）。STING激动剂表现出良好的活性，但并非它们的所有作用都是有益的，特别是在肿瘤治疗中。过热的STING信号传导导致T淋巴细胞凋亡。为了维持细胞稳态，严格控制STING活性以抑制生理条件下的过度自身免疫和异常炎症。因此，需要可持续的策略来开发STING激动剂。C-170（8，图1）是一种共价STING拮抗剂，可与人和小鼠STING的Cys 91残基结合，并且Cys 91处的棕榈酰化是最佳STING活化所需的。相反，自动二聚化的STING突变会激活下游信号传导并导致自身免疫性疾病。青岛海洋大学大学江涛教授团队假设STING同源二聚体的稳定剂将激活STING，并且阻断Cys 91棕榈酰化将防止STING过度激活。在这项研究中，该课题组研究了STING的结构特性，并设计和合成了一系列基于共价STING抑制剂C-170的化合物。测试了它们对STING的生物活性，并讨论了它们的构效关系以及对各种病毒的广泛的抗病毒作用。研究内容C-170是STING的共价拮抗剂，可减轻小鼠自身炎症性疾病的病理特征。C-170和STING之间的共价键可以通过Cys91的亲核侧链与呋喃环的4位的亲核加成，随后进行分子内重排而形成。因此，5-硝基呋喃-2-甲酰胺片段是共价结合的药效团。该课题组假设，将C-170的两个5-硝基呋喃-2-甲酰胺单元组合成单个分子可能使其结合两个STING蛋白，并且使STING蛋白稳定二聚体构象或促进二聚体形成。因此，使用5-硝基呋喃-2-甲酰胺作为开发更有效的STING激动剂的起点。由于硝基和呋喃部分对于化合物的生物活性都是必不可少的，因此该课题组保留了它们并使用不同的接头进行设计（图2）。与带负电荷的cGAMP不同，这些化合物主要是疏水性的，并且可能靶向STING的跨膜结构域（TMD）。 图2. 本文介绍了STING激动剂的设计策略  方案1. 化合物12-30的合成 TANK结合激酶1（TBK1）的磷酸化是STING激活的标志物；因此，监测其磷酸化以筛选HT1080细胞中的STING激动剂。构建STING缺陷细胞HT1080-STING-KO以确认STING依赖性TBK1磷酸化。化合物12-23用于处理细胞。天然激动剂cGAMP用作阳性对照。化合物23增加野生型HT1080细胞中的TBK1磷酸化，但不增加HT1080-STING-KO细胞中的TBK1磷酸化，这意味着它是有效的STING激动剂（图3A和B）。化合物23还促进干扰素β（IFNβ）和TNF-α表达，表明其诱导STING依赖性基因表达（图3D和E）。为了进一步表征小分子23的STING-激动剂活性，设定梯度浓度以测试其剂量依赖性。该课题组在这项研究中使用了四种细胞系：HT1080、人单核细胞白血病细胞系THP1、小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。这表明随着23浓度的增加，会诱导TBK 1的磷酸化（图4）。    图3. 刺激剂的筛选还在所有细胞系中观察到可见的STING二聚化条带（图4A和B），表明23可以直接与h/mSTING相互作用并刺激h/mSTING。23处理的HT1080和THP1细胞系中的IFN-β和TNF-α表达水平（图4C和D）与蛋白质印迹结果一致，表明23以剂量依赖性方式诱导STING信号传导。   图4. 化合物23剂量依赖性地激活小鼠和人STINGSTING蛋白水平在用cGAMP转染后显著降低（图4A和B）。然而，在用23处理后，STING蛋白水平在THP1和BMDM细胞系中保持不变或甚至增加（图4A和B）。这是重要的，因为STING降解的减少可以增强STING信号传导和抗肿瘤反应。化合物23适度刺激STING，但由于STING降解延迟，因此活化效果可能是持久的。在这项研究中，该课题组筛选了23作为有效的STING激动剂。与化合物12、14和17相比，化合物23显示出更好的生物活性，表明23的碳链是必需基团。当接头是五碳链时，它促进生物活性，这可能与柔性和疏水性有关。类似地，与化合物18-22的比较显示呋喃基团对于生物活性和特异性是必需的。化合物13增加了HT1080-WT和HT1080-STING-KO细胞中pTBK1的水平（图3C），但这种激活不依赖于STING。   由于C-170（10）是STING的共价拮抗剂，并且该课题组在先前的结果显示23处理诱导了明显的二聚STING条带（图4A和图B），因此假设23通过在两端的硝基呋喃基团与两个STING分子结合来促进STING形成稳定的二聚体，两个硝基呋喃基团之间的碳链长度可能与激动剂的生物活性有关。为了确定碳链长度23是否是刺激STING的最佳长度，合成了七种不同的23类似物（化合物24-30），其中两个硝基呋喃基团连接到不同长度的碳链（图5A）。为了更好地评估化合物24-30在细胞水平上的功能，该课题组使用了在先天免疫中起关键作用的两种细胞类型：BMDM和小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）。ADU-S100和cGAMP用作阳性对照。Western blot结果显示，随着碳链的延伸，STING二聚化和TBK1磷酸化水平最初增加，然后降低（图5B），当碳长度为4时活性最低（化合物24），当长度为7-9个碳时活性最高（化合物26-28）。还研究了这些化合物对BMDM和HT1080细胞中I型干扰素的影响。不同化合物的活化作用在蛋白质水平上明显不同，但在RNA水平上的活化作用之间没有太大变化，尽管总趋势与蛋白质印迹结果一致（图5C和D）。该课题组在HEK-293T细胞中过表达STING（在C末端用Flag标记），然后用23、26或27处理细胞4小时。向细胞裂解物中加入抗-BIGG磁珠以富集STING，然后通过6% SDS-PAGE凝胶分离以观察高级寡聚体（图5E和F）。化合物23、26和27显著促进寡聚STING形成（图5F）。事实证明，即使虽然Cys91可以共价结合到23上，但由23形成的STING二聚体仍然可以进一步寡聚化并在TBK1磷酸化中起作用。       图5. 目标化合物的接头长度-活性关系虽然26-28在Western Blot中诱导较高水平的pTBK1，但26-28与23诱导的IFN表达没有显著差异；因此，该课题组选择23作为后续实验的代表。该课题组试图了解化合物23在人STING上的结合部位。化合物23是C-170的结构对称类似物，C-170通过其硝基呋喃基团共价结合到小鼠刺的Cys91上。考虑到23可以促进STING二聚化，假设它的结合部位在STING的TMD处，并将两个STING分子“拉”在一起，而不是LBD。STING的TMD包含四个跨膜螺旋（TM1-4），残基70-91形成TM2和TM3之间的连接物；除了连接器螺旋（141-149残基）和LBD外，该连接物在细胞质和跨膜区之间形成表面凹槽。有证据表明，该区域在STING激活中起着重要作用；因此，该课题组首先评估了化合物23与STING的Cys91结合的可能性。构建了以下STING突变体：STING-C91S、STING-C88S和C91S（Cys88是与Cys91最接近的半胱氨酸，也被认为是Cys91的棕榈酰化位点）。SING-C148A也被构建，因为Cys148在STING的TMD中充当另一个半胱氨酸残基，是STING的必需聚合和活化。早前发现了一种新的STING激动剂C53，并在STING的TMD中发现了一个新的激动剂结合口袋。因此，该课题组在这个口袋里的关键残基上引入了几个突变（STING-V113Q、G114Q和P115Q）。将不同的STING表达载体导入HeLa细胞，在C末端用绿色荧光蛋白标记STING。24小时后，用23、cGAMP或两者的组合处理细胞。Western印迹结果表明，与野生型STING相比，带有C91S或C88，91S突变体的刺痛几乎失去了对23的反应，二聚体条带只有在长期暴露条件下才可见（图6A）。PTBK1的水平表明23刺激刺痛的能力显著降低（图6C）。另外两种突变的STING-C148A和STING-V113Q，G114Q和P115Q仍然可以被23在STING二聚化和pTBK1水平上刺激（图6B和C），这表明23可能直接与Cys91结合。    虽然Cys91被证明是STING的一个重要的棕榈酰化位点，但该位点在用23及类似物处理之前占据并不影响STING的二聚化。然而，由于棕榈酰化影响STING运输，这可能是23对STING的中等活化作用的原因。在本研究中，该课题组将STING（EGFP标记的）表达载体导入HeLa细胞24小时，并在23和cGAMP处理1h后固定细胞，我们观察到带有Cys91-丙氨酸替换的STING突变体导致细胞中STING的23诱导斑点形成的显著减少（图6D），这与先前的Western Blot结果相似。图6D的定量表明，由于STING的聚集，23和cGAMP处理的细胞显示出更高的平均荧光强度，而具有C91S或C88S/C91S突变体的STING只能被cGAMP刺激，而不能被23（图6e）刺激。值得注意的是，在实验中，在cGAMP的作用下，Western印迹没有观察到STING二聚体的出现，这表明在23的作用下，STING二聚体是稳定的。考虑到这些发现，该课题组假设23通过其两端的硝基呋喃基团与两个STING分子中的Cys91结合，形成二聚体。靶向刺痛激动剂C53（图1中的化合物7）和cGAMP的TMD共同触发了更高水平的TBK 1磷酸化。对23和cGAMP之间关系的评估证明，23显著增强cGAMP诱导的STING应答。23可以增强无论是人工合成的cGAMP还是由DNA病毒感染诱导的天然cGAMP（图6F和G）产生的免疫反应。虽然在RAW246.7细胞中观察到HSV的协同作用，但在HT1080细胞中几乎没有观察到HSV的协同作用。这可能是由于HSV感染HT1080细胞中cGAS的表达水平较低，感染6h后cGAMP不能被激活所致。另一项研究表明，TLR3途径而不是cGAS-STING途径主要在人HT1080细胞中响应HSV感染而起作用。该课题组连续检测到两种其他靶向LBD的STING激动剂，包括CDN类似物ADU-S100（2）和非CDN激动剂diABZI（4），并且揭示了23也可以增加2和4的STING活化作用（图6h）。用23与不同处理组合处理的细胞中下游效应物IFN-β的表达水平显示出类似的增加趋势（图6I）。这些结果证实化合物23是可直接刺激STING或作为cGAMP激动剂起作用的中度STING激动剂。图6. 23的结合位点可能是Cys91近年来，多种病毒（SARS-CoV-2，儿童肝炎和猴痘）对全球健康构成严重威胁。天然免疫过程的药理学刺激是治疗病毒感染的有吸引力的策略。因此开发广谱抗病毒药物具有重要意义。STING的激活显著增加IFN的表达，其直接或通过下游JAK-STAT信号传导促进IFN刺激的基因（ISG）的表达，以多种方式广泛抑制病毒感染。研究23是否对病毒具有抑制作用是重要的，因为它可以激活STING并与cGAMP协同作用。为了研究这一点，该课题组首先检测了23对HSV的抗病毒作用。通过使用蛋白质印迹测量病毒蛋白ICP 0表达观察到23对HSV复制的抑制（图7A）。病毒RNA和23对HSV的EC50测定为6.15 μM（95%置信区间为5.48-6.92 μM）（图7B）。STING激动剂主要通过激活宿主免疫细胞亚群发挥抗肿瘤作用，因此仅检测IC50显然是不够的。考虑STING在肿瘤细胞内的作用也很重要，因此，进一步研究23的体内抗肿瘤活性以及更深入地了解STING通路的生物学是未来工作的主要方向。    图7. 23的免疫刺激作用和抗病毒作用      结论与展望在这项研究中，该课题组确定了一种非环状二核苷酸小分子STING激动剂，其靶向STING的表面凹槽。23的设计策略基于STING共价抑制剂C-170，这与传统激动剂的设计理念完全不同，是非常有特色的工作。同时探索了23与STING的结合位点，发现23可能与STING的Cys 91结合。Cys 91显示为STING的棕榈酰化位点。在该位点被23占据显著促进了STING的二聚化，并以适度但持久的方式刺激STING。   23和cGAMP（以及ADU-S100和diABZI）的组合触发了比任何单独的激动剂更高水平的IFN表达，表明当STING同时与23和LBD结合激动剂结合时，其生物活性增强。23的发现可能会为解决STING激动剂有限的临床效果和增加对STING途径生物学的理解带来新的思路。作者：冀文淑校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年4月16日参考文献Ruochen Zang，et al, Tao Jiang. Design and syntheses of a bimolecular STING agonist based on the covalent STING antagonist. Eur J Med Chem. 2023, 250:115184. doi: 10.1016/j.ejmech.2023.    声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓