Zanidatamab Zovodotin

摘要：双特异性抗体（bpAbs）能够结合抗原上不同且不重叠的表位。这种独特的结合模式使得bpAbs除了单特异性抗体和双特异性抗体（bsAbs）之外，还能发挥新的机制作用，使其成为多种适应症（包括肿瘤学和传染病）的有效治疗手段。双特异性结合可以带来更高的亲和力和特异性，促进拮抗作用，锁定目标构象，并导致高阶目标聚集。这些抗体-目标复合物可以引发强烈的激动作用，增强免疫效应功能，或导致目标快速下调调节和溶酶体转运。这些特性不仅对治疗性抗体具有吸引力，而且越来越多地被探索用于其他模式，如抗体-药物偶联物、T细胞接合器和嵌合抗原受体。近期在bpAb工程上的进展已经使得构建越来越复杂的格式成为可能，这些格式开始在临床上显示出希望。 1.引言 在2022年美国新批准的药物中，抗体疗法占了30%。在开发中的抗体中，观察到高度工程化分子的数量显著增加，包括双特异性抗体（bsAbs）。双特异性抗体（bpAbs）是bsAbs的一个子集，对同一分子靶标的特有、不重叠的表位具有特异性。这种独特的结合模式建立于30多年前，能够实现差异化的作用机制（MoAs）。在过去十年中，随着临床试验中首次取得成功，bpAbs的治疗潜力已变得明显。这些开创性的分子为当今临床开发中越来越多的bpAbs铺平了道路（表1）。本综述提供了bpAbs的不同格式和MoAs、当前的临床管线和前景的概述。 2.双特异性格式 在抗体发现和工程方面的进展使得组装针对不同表位的结合域的bpAb格式越来越复杂，这些格式采用不同的架构。格式的选择取决于目标生物学和提议的MoA。关键的设计考虑因素包括目标表位、单个结合域的数量和性质、半衰期延长和效应功能介导域的添加，以及确保所有域正确组装成功能性bpAb的策略。后者可以简单到将单个域与灵活的链接器串联在一个单一蛋白中，或者在含有结晶片段（Fc）域的bpAbs中，取决于多达四个不同蛋白与相应的引导突变在重链（HCs）和轻链（LCs）中的配对。预测有效的表位对是困难的，无论是通过理性设计还是通过抗体混合物。因此，能够高效地生成和筛选给定bpAb格式中的大量表位对矩阵是关键。除了功能性和可行性之外，在选择bpAb格式时，开发性考虑至关重要。早期对bpAbs的生物物理责任进行测试可以减少动物研究和临床试验中失败的风险。同样，bpAb格式的选择可能影响下游制造和质量控制，因为bpAb格式复杂性可能导致不良的开发性或由于bpAb格式复杂性导致的错配副产品。 迄今为止在临床上测试的bpAbs不仅具有多样的格式，而且还涉及大量单个结合域（图1）。单链抗体格式，如单域抗体（sdAbs）和单链可变片段（scFvs）特别容易在双特异性格式中配对。因此，首批进入临床的两种bpAbs，ALX-0651和BI 1034020，由串联的sdAbs组成。基于抗体片段的bpAbs通常在循环中的半衰期较短，需要进一步工程化以提高暴露量。小尺寸使sdAbs成为嵌合抗原受体（CARs）的理想构建块，如双特异性CAR-T疗法ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）和OriCAR-017所突出的。 迄今为止在临床上测试的大多数bpAbs具有更规范的、含有Fc的架构，可以根据HC轴的对称性进行分类（图1）。对称bpAbs由相同的HC或HC/LC对组成，而不对称分子由具有不同结合域的不同半部分组成。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称bpAbs的例子。 图1. 在临床试验中评估的双特异性抗体结构。条纹域代表常见的轻链VL或IgG4 Fc。REGN5093-M114每个抗体平均含有3.2个非特异性结合的药物。MBS301不包含增强六聚体化的突变；*药物与抗体的比例和结合位点与所示示例不同。 对称型双特异性抗体（bpAbs）由相同的重链（HC）或重链/轻链（HC/LC）对组成，而不对称型分子则由不同的两半组成，具有不同的结合域。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称型bpAbs的例子，具有2+2的价数（每个整数描述分子中存在的相同亲和位点的数量），并且单链可变区片段（scFv）或单域抗体（sdAb）分别附加在HC的N端或C端。 另一方面，KN060是一个对称型双特异性抗体，具有串联的sdAb臂，没有轻链。类似于KN060，三特异性抗体TAVO412通过串联的sdAb臂实现双亲和位点靶向，该臂嵌入在更复杂的不对称格式中。 不对称型双特异性抗体通常依赖于Fc突变，以促进双特异性抗体产品的纯化或指导异二聚体形成。例如，REGN5093的两个HC被设计成对蛋白A具有不同的亲和力，允许纯化异二聚体产品。 另一方面，GEN3009是一个不对称型双特异性抗体，具有Fc域导向突变，确保两个不同的HC正确配对。除了HC异二聚体外，正确的LC配对对不对称型双特异性抗体来说可能是一个挑战。在GEN3009的例子中，通过两个亲本抗体的温和体外反应实现正确的配对，允许HC重组而不打乱原始的LC配对。REGN5093展示了一种避免LC配对问题的整体策略，它由两个不同的HC与两个相同的LC配对组成。这些共同的LC可以直接从具有定义的LC多样性的发现平台中获得，如REGN5093的例子，或者从现有的LC中工程化，如anbenitamab和GR2002。 ISB 1442和SAR441236是不对称型双特异性抗体的例子，它们通过增加Fab或scFv结构域扩展了免疫球蛋白G（IgG）结构，分别实现更高的价数，甚至在SAR441236的情况下实现三亲和位点结合。较小的不对称格式，如基于片段-Fab的zanidatamab或基于片段的TNB-738也可以被利用。Zanidatamab将scFv结构域与完整的Fab臂配对，而TNB-738从两个sdAb中衍生出其结合臂，并添加了一个惰性的LC以便于制造。除了免疫球蛋白折叠，双亲和位点设计的ankyrin重复蛋白（DARPin），MP0274，突出了替代框架的潜力。 Labrijn等人全面回顾了所有双特异性格式。 图2. 双特异性抗体的作用机制。(a) 双特异性抗体在顺式或反式中的强靶标结合的示意图。双特异性抗体可以解锁新的生物学活性，例如 (b) 双通路抑制，(c) 锁定外域在酶学上不活跃的状态，或 (d) 双特异性受体靶向以形成更高阶的复合物并引发激动作用。 (e) 另外，双特异性抗体在反式中的结合可以导致受体和Fc结构域聚集，从而快速内化和溶酶体运输或强烈的效应功能，特别是补体依赖的细胞毒性。 3.双特异性抗体的作用机制 3.1.双亲和位点靶向通过亲和力增强结合 与同一目标上的两个不同、不重叠的表位结合，导致双特异性抗体与其它抗体相比具有独特的属性。许多双特异性抗体显示出比它们的单亲和位点亲本抗体更强的结合力和更慢的解离速度。这是由于对同一（顺式）或不同（反式）目标分子上的两个不同表位的亲和力结合。亲和力定义为单个分子通过多个非共价相互作用的组合以及一旦建立了第一次相互作用，结合和重新结合事件的可能性增加。 针对不同表位的抗体片段可以通过亲和力链接来增加目标亲和力，如基于sdAb的、临床评估的双特异性抗体ALX-0651和BI 1034020所强调的。与单价或双价单克隆抗体（mAbs）相比，双特异性抗体的解离可以显著更慢，使它们成为优越的拮抗剂、反向激动剂或反向拮抗剂。顺式结合形成1:1的双特异性抗体目标复合物对于这些应用来说可能很重要，以避免不需要的激动剂活性。 除了表位选择，结合域的几何排列、sdAb连接优化和亲和力调节对于实现期望的作用机制（MoA）和最大化效果至关重要。Kast及其同事证明，结合域的几何形状对于人表皮生长因子受体2（HER2）的双特异性及四价融合蛋白的拮抗作用至关重要，某些配置显示出激动剂活性。同样，针对表皮生长因子受体（EGFR）的三价抗纤维连接蛋白融合蛋白的不同结构在受体下调中显示出不同的效果。对于基于sdAb的拮抗剂，最佳的取向和连接属性可以通过顺式结合实现超高亲和力。最后，临床双特异性抗体ISB 1442依赖于仔细调节的CD38和CD47亲和力以减少靶向毒性。ISB 1442的抗CD47 Fab已被设计为弱亲和力，以实现对CD47阳性红细胞的最小反应性。高亲和力的双特异性抗CD38臂能够在CD38低表达的肿瘤细胞上实现强烈的目标参与和高特异性。 双特异性抗体的高亲和力和缓慢解离也适合于招募免疫细胞。例如，刘及其同事通过融合两个针对不重叠表位的sdAbs与一个抗CD3 Fab，设计了一种T细胞结合抗HER2双特异性抗体。得到的构建物在HER2阳性细胞上的结合比相应的单特异性亲本分子增加了30倍，并在体内HER2低表达模型中显示出优越的肿瘤抑制活性。同样，Rennert等人设计了一种针对C型凝集素结构域家族12成员A（CLEC12A）的双特异性桥接蛋白，该蛋白由其分泌并招募抗CD19 CAR-T细胞。双特异性靶向实现的高亲和力导致增强的抗CD19 CAR-T细胞毒性。由于sdAbs的小尺寸，CAR可以直接配备双特异性抗体，如cilta-cel和OriCAR-017所示。这些CAR的高亲和力双特异性结合可以实现增强和持久的效果。如上所述，对于基于sdAb的拮抗剂，仔细选择表位和连接优化可能是关键。3.2.双特异性抗体能够实现双途径抑制，并且可以锁定受体和外酶的构象 结合两个不重叠的表位可以为双特异性抗体（bpAbs）解锁独特的活性。例如，通过针对低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）的双特异性抗体实现了双通路抑制，同时阻断Wnt1和Wnt3a介导的β-连环蛋白信号通路，显著地没有激动剂活性。 或者，双特异性抗体可以通过物理限制其靶标来使其失活。针对HER2的双特异性DARPin的晶体结构揭示了结合和扭曲两个HER2受体，阻止了与EGFR家族成员形成具有信号能力的二聚体。 此外，针对CD38和CD73的双特异性抗体，包括临床双特异性抗体TNB-738，被证明通过将各自的细胞外结构域锁定在催化非活性状态来作为酶抑制剂。 尽管单独的亲本抗体没有显示出任何活性，但针对CD73的双特异性抗体具有亚纳摩尔级的活性，并实现了超过90%的抑制。 双特异性抗体可以形成免疫复合物，导致激动剂活性、快速目标内化、溶酶体运输和改善的免疫效应功能。 双特异性抗体的一个独特特性是它们能够通过同时在反式中结合两个不重叠的表位来形成高阶免疫复合物。目标交联是多种作用机制的基础，包括增强的激动剂活性、Fc介导的效应功能或清除可溶性目标以及受体下调。 双特异性抗体的聚集可以促进激动剂活性，特别是对于依赖交联以实现有效下游信号传导的受体。 双特异性抗体也可能独特地激活多组分受体复合物。例如，Shi等人设计了一种针对β-klotho的两个不同表位的双特异性抗体，β-klotho是成纤维细胞生长因子受体1c（FGFR1c）的共受体。 双特异性靶向既必要又足以引发强大的激动剂活性。双特异性抗体通过双特异性抗体增加Fc结构域的局部浓度，从而可以改善效应功能。 这种效应已在被单克隆抗体靶向的多价复合物中观察到，例如被治疗性单克隆抗体利妥昔单抗靶向的B细胞标记CD20。 双特异性抗体的结合可以扩展这种机制到更多的目标。例如，zanidatamab形成的大HER2聚集被证明比亲本单克隆抗体的组合导致更强的补体依赖性细胞毒性（CDC），这是由于Fc结构域的预组织和C1q沉积的增加。 这种效应在引入六聚体增强点突变的Fc结构域的针对CD37的双特异性抗体GEN3009中进一步放大。 尽管Fc聚集的效果不那么明显，但双特异性抗体已被证明也可以通过增加与自然杀伤（NK）细胞上的FcγRIII受体的结合来改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。 类似地，通过针对白细胞介素6（IL6）的双特异性抗体聚集，增加了Fcγ受体在吞噬细胞上的结合，并促进了可溶性目标的快速清除。 交联的受体筏已被证明可以迅速内化并运输到溶酶体，导致目标的快速下调。 值得注意的是，交联效率及其相关效应可能取决于表位选择以及双特异性抗体：目标几何形状。 快速内化和溶酶体运输使双特异性抗体成为抗体药物偶联物（ADCs）中越来越受欢迎的构建模块，它们推动了肿瘤输送和细胞毒素有效载荷的细胞内释放，如MEDI4276、REGN5093-M114和zanidatamab zovodotin所示。 与单特异性药物相比，针对叶酸受体α（FRα）的双特异性ADC IMGN151显示出优越的有效载荷输送。 由于这种效应与细胞表面FRα密度无关，人们推测IMGN151增加的有效载荷输送是通过增强FRα阳性细胞上的结合事件而不是聚集，这应该随着受体密度的增加而减少。然而，这两种机制并不是相互排斥的，需要进一步的研究来阐明IMGN151的作用机制。3.3.同时结合不同的表位可以克服抗性机制 在治疗病毒感染中常见的挑战是找到一种广泛中和抗体（bnAb），它结合在衣壳蛋白的保守区域，并产生持久的反应。单价抗体可以针对保守区域，但容易受到突变逃逸的影响，因为它们对病毒施加了选择性压力。类似于小分子药物的鸡尾酒疗法，bnAbs的组合已被证明通过降低单次突变逃逸变体的机会，有效减少单药治疗的抗性。 双特异性广泛中和抗体结合了鸡尾酒疗法的临床益处和单一药物剂量使用的便利性，使它们成为开发中令人兴奋的领域。 针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的双特异性广泛中和抗体BAT2022，被证明能够结合所有主要的关注变体，包括一个不再被一个亲本抗体识别的受体结合域（RBD）突变体。 对于HIV，三特异性广泛中和抗体SAR441236和几个临床前分子通过针对病毒衣壳蛋白上的多个表位显示出前景。 防止抗性的多价靶向对于肿瘤相关抗原（TAA）的靶向也可能是临床上有用的。肿瘤细胞可以通过选择性剪接消除靶向的表位。人们推测，双特异性CAR-T细胞可以通过同时针对两个表位来防止肿瘤逃逸。 虽然进一步的机制研究将很重要，但这对于癌症免疫疗法是一个有趣的前景。虽然概念上不同，Spangler和同事证明了针对EGFR的三特异性靶向可以恢复对西妥昔单抗耐药的异种移植模型的疗效，这些模型在下游信号通路中有突变。 最有效的三特异性构建物实现了单独使用双特异性或单特异性构建物无法实现的受体下调水平。3.4.治疗应用和模式 迄今为止，大多数双特异性抗体已开发用于肿瘤学应用，并且随着cilta-cel的批准，首个基于双特异性抗体的细胞疗法已获批用于复发和难治性多发性骨髓瘤。 许多其他双特异性抗体目前正在早期临床试验中，用于血液癌症的治疗，包括ISB 1442和OriCAR-017，它们都处于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤的I期。 对于实体瘤的治疗，许多双特异性抗体针对HER2，HER2是一种受体酪氨酸激酶，涉及包括细胞增殖在内的多种细胞功能。在20-25%的乳腺癌患者中观察到HER2的高水平过表达。 通过结合临床单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗靶向不重叠的结构域IV和II，分别针对两个不同的HER2表位，以前已被证明可以显著改善治疗结果和预后。 HER2的重要性和双表位靶向的临床先例可能解释了管线中大量的抗HER2双特异性抗体，包括anbenitamab和zanidatamab，这是两个最先进的针对HER2的双特异性抗体。 其他杰出的肿瘤学靶标也通过双特异性抗体进行追求，包括通过REGN5093（-M114）和IMGN151分别针对间充质-上皮转化因子（MET）和叶酸受体α（FRα）。 在肿瘤学之外，临床候选药物SAR441236和BAT2022突显了双特异性抗体在传染病中的潜力。阻碍广泛实施针对急性感染的bnAbs的一个挑战是逃逸变体的出现，正如最近的SARS-CoV-2大流行所说明的那样。 针对单一表位的单克隆抗体只在突变逃逸变体发展并广泛传播之前有效，这使得既定的疗法无效。针对多个表位的bnAbs，如针对SARS-CoV-2的双特异性抗体BAT2022或针对HIV的三特异性抗体SAR441236，可以克服急性和慢性疾病中单突变逃逸变体的出现，允许持续使用和更持久的患者反应。 大多数临床双特异性抗体作为裸抗体发挥作用，以治疗病毒感染，通过相应的受体抑制或促进细胞信号传导，或者如TNB-738通过抑制酶活性。越来越多地，双特异性抗体被用于作为ADCs的一部分进行有效载荷输送，因为它们独特的作用机制促进了内化和溶酶体运输，如上所述。目前有六种双特异性ADC正在临床评估中，其中三种也在作为裸双特异性抗体进行研究。此外，双特异性抗体的高亲和力和选择性使其成为工程化高效T细胞招募者和CARs的有吸引力的选择。 在本节中，我们讨论了已在临床中进行测试或正在测试的双特异性抗体的结构、作用机制和活性，这些分子的数据是可用的。3.5.ALX-0651 Ablynx的ALX-0651，一种针对CXCR4的双特异性串联单域抗体，是第一个针对GPCRs的临床使用的生物制剂，并且据我们所知，是第一个进入临床的双特异性抗体（2011年）。虽然ALX-0651的单个单域抗体构建模块显示出中性拮抗剂活性，但双特异性ALX-0651不仅显示出更高的亲和力，而且还显示出针对CXCR4的反向激动剂活性。 临床前数据表明ALX-0651在阻断CXCR4介导的病毒进入以及诱导快速干细胞动员方面是有效的。尽管临床前数据支持开发，但由于缺乏对标准护理的优越性，ALX-0651已被终止。3.6.BI 1034020 BI 1034020是由Ablynx和勃林格殷格翰开发的一种双特异性、半衰期延长的串联单域抗体。这种双特异性抗体针对大脑中淀粉样蛋白β（Aβ）的两个独立表位，旨在用于阿尔茨海默病的治疗。BI 1034020的I期研究于2013年开始，但在发生与药物相关的严重不良事件后被终止。3.7.MEDI4276 MEDI4276是由Medimmune开发的一种针对HER2的抗体药物偶联物（ADC），于2015年进入临床。MEDI4276由一种基于曲妥珠单抗scFv的四价双特异性抗体组成，该抗体靶向HER2的域IV，并在mAb 39S的重链N端融合，后者靶向域II。这种双特异性抗体向HER2过表达的肿瘤细胞输送四个位点特异性结合的tubulysin有效载荷，在那里ADC被内化并运输到溶酶体以释放细胞毒素。与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合不同，MEDI4276可以交联受体，从而实现快速内化和通过将HER2从循环重定向到溶酶体降解，有效实现细胞质输送。异种移植肿瘤模型显示，MEDI4276对HER2低表达肿瘤以及对ado-trastuzumab emtansine耐药的肿瘤都具有高效性，从而满足了高度未满足的医疗需求。在I期剂量递增研究中，MEDI4276在HER2阳性乳腺癌和胃癌中显示出临床活性，但最终由于不利的毒性概况而被终止。3.8.西他卡苯自溶 Ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel），据我们所知，是迄今为止第一个也是唯一一个获批的基于双特异性抗体的治疗。cilta-cel最初由Legend Biotech开发为LCAR-B38M，是一种第二代自体CAR-T疗法，特点是具有两个单域抗体的双特异性外结构域，这些单域抗体针对B细胞成熟抗原（BCMA）的不同表位。双特异性靶向实现了比单特异性构建更高的亲和力结合和卓越的功效。基于CARTITUDE-1 Ib/II期研究（NCT03548207）的深度和持久反应以及可管理的安全性概况，cilta-cel在2022年获得批准。总体反应率高达97.9%，甚至高于初始I期研究（NCT03090659）观察到的87.8%。有趣的是，cilta-cel的批准仅在idecabtagene vicleucel（ide-cel）批准后的一年，ide-cel是一种具有单特异性BCMA靶向的类似CAR-T疗法。虽然应该谨慎比较各自的临床试验，但双特异性cilta-cel似乎在反应率和反应持续时间方面都优于单特异性的ide-cel。3.9.Zanidatamab和zanidatamab zovodotin Zanidatamab（ZW25）是一种由Zymeworks专有的Azymetric Fc平台衍生的双特异性抗体，它结合了一个针对HER2域IV的scFv和识别域II的Fab臂。Zanidatamab跨细胞膜结合两个HER2分子，引起细胞膜上受体的明显重组。除了快速内化和下调外，Fc结构域的聚集引起了强烈的补体依赖性细胞毒性（CDC），这在曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合中是观察不到的。双特异性HER2结合在体内异种移植模型中显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更优越的抗肿瘤活性。Zanidatamab在具有不同HER2表达水平的多种肿瘤患者中显示出安全性。目前正在进行多项临床试验，包括针对乳腺癌的II期试验(NCT04224272)和针对晚期胃食管腺癌的III期试验(NCT05152147)。Zanidatamab也在探索用于输送细胞毒性微管抑制剂。这种双特异性ADC，zanidatamab zovodotin(ZW49)，已被证明是免疫原性细胞死亡标志物的强诱导剂，并且对一系列HER2表达水平的乳腺癌和胃癌患者衍生的异种移植模型非常活跃。目前正在进行I期临床试验(NCT03821233)。3.10.MP0274 由Molecular Partners开发的MP0274通过DARPins实现双特异性HER2靶向，DARPins是可像串珠一样串联的替代框架。四价MP0274分子包含一个分别针对HER2域I和IV的DARPin，以及两个用于延长半衰期的人类血清白蛋白结合域。像基于IgG的抗HER2双特异性抗体一样，MP0274交联HER2受体，在各种HER2阳性细胞系和小鼠模型中显示出与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合相当的抗肿瘤活性。然而，MP0274可能通过稳定AKT调节的叉头转录因子FOX03a导致诱导凋亡，展现出独特的作用机制。在HER2阳性实体瘤患者的I期研究中，MP0274显示出良好的暴露和有利的安全性概况。一位先前接受过曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗的转移性乳腺癌患者对MP0274显示出持续反应，确立了临床概念验证。回顾性生物标志物分析揭示，这位患者是唯一一个携带HER2阳性、PI3K野生型遗传标志的患者，且在最高剂量水平，这表明在良好的MP0274暴露下，患者选择可能导致更高的反应率。然而，由于战略原因，MP0274的进一步临床开发已被停止。3.11.Anbenitamab和JSKN003 Alphamab Oncology基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗设计了一种双特异性HER2靶向抗体anbenitamab(KN026)。通过组合旋钮-入-孔和静电导向突变实现了相应HCs的异二聚体Fc配对。基于HER2相互作用残基的结构阐明，设计了一种可以与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗HC分别有效配对的通用LC。由安进公司开发的双特异性抗体anbenitamab显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更强的抗肿瘤活性，这一效果在不同HER2水平的多种肿瘤细胞系中均有体现，并且在小鼠模型中活性相当。初步特性分析表明，anbenitamab保留了其亲本单克隆抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），同时能够同时结合HER2的两个不同表位。anbenitamab于2018年进入临床试验，并在至少接受过一线治疗（包括曲妥珠单抗）的晚期转移性乳腺癌患者中显示出良好的安全性。 在第二项临床试验中，anbenitamab在HER2表达的晚期胃癌和胃食管结合部癌患者中表现出良好的耐受性。基于初步的积极活性，anbenitamab目前正在进行多项临床试验的评估，包括两项注册研究：作为HER2阳性晚期或转移性胃癌的二线治疗（NCT05427383），以及作为HER2阳性复发或转移性乳腺癌的一线治疗（NCT05838066），两者均与化疗联合使用。将anbenitamab与拓扑异构酶I抑制剂结合，得到了双特异性抗HER2抗体药物偶联物JSKN003，目前正在进行首次人体I期研究，针对晚期实体瘤（NCT05494918）。 3.12.额外的HER2靶向bpAbs 此外，MBS301、BCD-147、TQB2930和KM257是基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的四种额外的临床阶段抗HER2双特异性抗体。MBS301结合了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的去岩藻糖化半抗体，它们在工程CHO细胞系中分别生产，并通过体外使用结-洞突变异二聚体化。从Fc结构域中去除岩藻糖可以增强ADCC活性，结合双特异性靶向，可在不同HER2水平的肿瘤细胞系中以及在小鼠模型中产生强大的活性。目前正在进行一项I期临床研究（NCT03842085），评估MBS301用于治疗HER2阳性复发或转移性恶性实体瘤的效果。Biocad的BCD-147采用了一种不对称scFv-Fab格式，并已在健康志愿者中进行了I期研究（NCT03912441）。结构相似的TQB2930由泰国天晴药业开发，正在研究用于HER2阳性实体瘤的裸抗体（NCT05380882）以及作为抗体药物偶联物（TQB2102）在HER2阳性乳腺癌（NCT06115902）和胃癌中的应用。最后，轩竹生物制药正在开发不对称的通用LC双特异性抗体KM257，目前正在临床研究中，用于HER2阳性实体瘤（NCT05320874）以及作为抗体药物偶联物（KM501）在HER2阳性晚期实体瘤（NCT05804864）中的应用。 3.13.SAR441236 针对HIV的有效广谱中和抗体（bnAbs）的识别和开发由于病毒的高遗传多样性而面临挑战。大型和小分子单一疗法在很大程度上失败了，因为选择性压力增加了突变逃逸变体的机会。使用bnAbs组合的临床前和临床研究表明，靶向多个表位可以提高疗效。 SAR441236，由赛诺菲公司进行的I期临床开发（NCT03705169），由具有双重特异性的交叉双变量Ig样（CODV-Ig）臂与具有第三独特特异性的Fab臂配对，使其成为一种三特异性广谱中和抗体。临床前体内数据表明，三特异性广谱中和抗体在减少病毒载量和预防非人灵长类动物（NHP）类似的人类免疫缺陷病毒（SHIV）病毒挑战模型中的感染方面更为有效。3.14.GEN3009 Genmab结合其专有的DuoBody和HexaBody技术，设计了GEN3009，这是一种针对CD37的双特异性抗体，具有增强的Fc介导的六聚体化。这种双特异性抗体包含互补的Fc突变，这些突变引导体外控制的Fab臂交换反应中的异二聚体化，并通过E430G突变增强六聚体化。由于双表位靶向加上增强的六聚体化导致的Fc结构域密度的局部增加，与单一亲本单克隆抗体或组合相比，在B细胞淋巴瘤细胞系以及患者来源的慢性淋巴细胞白血病样本中均显示出优越的补体依赖性细胞毒性（CDC）。Fc结构域聚集进一步增加了ADCC和ADCP，导致在几种细胞系衍生的异种移植模型以及患者来源的非霍奇金淋巴瘤异种移植中产生强大的抗肿瘤活性。GEN3009已在复发或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中进行了首次人体试验（NCT04358458），但由于战略原因，最近停止了进一步的临床开发。3.15.REGN5093和REGN5093-M114 Regeneron的双特异性抗MET常见轻链抗体，REGN5093，作为抗体（NCT04077099）和作为抗体药物偶联物（NCT04982224）已进入临床。源自Regeneron专有的VelocImmune平台，REGN5093有效地抑制了配体独立的MET和HGF诱导的信号传导。DaSilva等人表明，REGN5093创造了具有2:2化学计量比的抗体-受体复合物，与单特异性抗体形成1:2复合物形成对比。这些更大的复合物可能导致REGN5093所见的MET降解，这是由于回收效率降低和bpAb：受体复合物的溶酶体流量增加所致。Regeneron进一步利用REGN5093的这一特性，通过在其上结合专有的细胞毒素美登素载荷来开发REGN5093-M114。该分子在MET依赖性和MET非依赖性肿瘤模型中均显示出疗效，进一步证明了双特异性抗体药物偶联物方法的效用。3.16.OriCAR-017 Oricell的双特异性GPRC5D靶向CAR-T细胞疗法，OriCAR-017，已进入临床，用于治疗复发和难治性多发性骨髓瘤（NCT05016778）。类似于cilta-cel，OriCAR-017 CAR包含串联的单域抗体，靶向GPRC5D上的两个不同表位。作者推测，双特异性靶向增加了他们的CAR-T细胞疗法的特异性和亲和力，从而提高了疗效。报告了有利的I期安全性和有效性数据，并支持OriCAR-017的进一步开发。3.17.SARS-CoV-2 中和双特异性抗体（bpAbs） MABS由SARS-CoV-2引起的全球大流行促使全球范围内的大量研究工作，多个研究小组展示了使用单域抗体（sdAbs）等抗体片段作为构建双特异性抗体（bpAbs）的基石的效用。 一些研究表明，双特异性抗体通过要求多个同时突变，大大减少了突变逃逸的发生率。与通常限于通过阻断RBD-ACE2界面来阻断的传统单价结合物不同，双特异性抗体的顺式结合显示了阻断和构象变化，而双特异性结合则在多聚体中进行了阻断和多聚体化。已进入临床的最先进的针对SARS-CoV-2的双特异性抗体BAT2022已完成了I期安全性和耐受性研究（NCT05518695）。BAT2022是一个对称的2+2 Fc含量分子，由一个sdAb分子连接到HC的C末端。BAT2022保持了其作为广谱中和抗体对抗多种SARS-CoV-2亚变体的有效性，展示了作为治疗性抗体的效用。多余的。3.18.ISB 1442 Ichnos Sciences的ISB 1442是一种基于专有的BEAT 2.0（基于TCR的双特异性抗体结合）平台的双特异性抗体，它与一个串联Fab臂上的两个不同的CD38表位具有高亲和力结合，并结合一个低亲和力的CD47 Fab臂以阻断吞噬细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）。低CD47亲和力旨在防止对红细胞的靶向毒性，同时在高亲和力双特异性CD38臂的引导下结合时实现强大的抗肿瘤活性。结合Fc突变以增强效应功能，ISB 1442不仅影响ADCP，还表现出ADCC和CDC。临床前数据表明，这种复杂的MoA可能比单一靶点药物具有更高的疗效和安全性。因此，ISB 1442目前正在进行一项针对复发/难治性多发性骨髓瘤患者的I/II期临床研究（NCT05427812）。3.19.TNB-738 Ancora Biotech的TNB-738是一种由Teneobio的专有转基因UniRat平台衍生的两个sdAbs组成的不对称抗CD38双特异性抗体，它们与不同的CD38表位具有高亲和力结合。TNB-738使用结-洞突变实现重链配对，一个完全沉默的IgG4 Fc以消除效应功能，以及在一个臂上使用惰性的kappa LC和CH1以提高可制造性。目前正在健康志愿者中进行I期剂量递增（NCT05215912），TNB-738通过酶抑制发挥作用。3.20.IMGN151 Immunogen的下一代FRα ADC已进入临床（NCT05527184），紧随其第一代FRα ADC mirvetuximab-soravtansine之后，该药物于2022年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的加速批准。IMGN151包含一个scFv臂与一个mirvetuximab Fab臂配对，每个臂都结合FRα的独特和不重叠的表位。IMGN151的双特异性靶向模式增强了FRα阳性细胞上的结合事件，从而在高、中、低FRα表达的细胞系中实现了优越的载荷传递。双特异性抗体结合增加的传递以及更有效的连接子-载荷可能允许IMGN151比mirvetuximab soravtansine治疗更广泛的患者群体。 4.结论和展望 从单特异性单克隆抗体的组合中演变而来，双特异性抗体已通过2022年FDA批准的首个基于双特异性抗体的疗法证明了其临床安全性和有效性。临床管线中的双特异性抗体基于多种格式，除了存在Fc结构域以增强稳定性和效应功能外，没有明确的趋势。最终，生物学决定了双特异性抗体的设计。与传统的单克隆抗体、双特异性抗体甚至针对不同表位的单克隆抗体组合相比，双特异性抗体提供了独特的作用机制，使它们成为多种适应症有吸引力的治疗选择。双特异性抗体结合的亲和力可以实现高度选择性的肿瘤靶向，如双特异性抗体ISB 1442的特性，这些特性还可以使T细胞引导者或CAR-T细胞等治疗方式受益，正如双特异性CAR-T疗法cilta-cel的临床成功所突出的那样。目前正在临床测试的大多数双特异性抗体已被证明可以影响TAA聚集以改善受体激动、效应功能和/或有效的内化和溶酶体运输。除了治疗性单克隆抗体外，这种作用机制特别适合改善向肿瘤的细胞毒性载荷传递，正如目前正在评估的六种ADC所说明的那样。或者，双特异性结合可能通过增强结合事件来改善载荷传递，正如对IMGN151的推测。除了高亲和力结合和受体聚集，双特异性抗体已被用于其他作用机制，如双通路抑制、多组分靶标的激活，或者如抗CD38双特异性抗体TNB-738的例子，锁定一个在酶学上不活跃的状态。在传染病领域，双特异性抗体有希望解锁具有增强持久反应、对多样化病毒景观更广泛有效，并且可能大大限制突变逃逸变体出现的广谱中和抗体。该领域正从双特异性抗体转向三特异性抗体甚至更高级的抗体，以应对一些最具挑战性的人类疾病，如HIV和SARS-CoV-2。随着进入临床的双特异性抗体数量的增加，双特异性抗体在靶向治疗中具有巨大的潜力。目前的双特异性抗体临床格局显示出对HER2靶向药物及其依赖于受体聚集的相关作用机制的强大集中。HER2的突出可能可以用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合疗法的临床先例来解释。然而，随着新技术使更复杂的结构更容易获得，我们预计双特异性抗体的靶标和适应症的数量将大幅增加。以前用传统单克隆抗体在临床上失败的靶标可能因双特异性抗体的独特作用机制而变得可获得，并且可能出现特别适用于双特异性抗体的新靶标。正如SAR441236和临床前研究所强调的，三特异性或更高价的结构可以扩展双特异性抗体的效果，甚至解锁新的作用机制。通过首个双特异性抗体治疗的批准得到验证，双特异性抗体的临床管线正在迅速扩展，并将激发对这个独特的抗体类别进行更多研究，以充分利用双特异性抗体在靶向治疗中的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：本章介绍了历史上和当代双特异性抗体的发展历程，以及当前蛋白工程界和制药行业推动此类分子应用于医学治疗的巨大热情。你将详细了解它们独特作用方式及其背后的原理。对各种双特异性抗体构型的详细介绍将帮助你判断它们在特定生物学场景下的适用性。双特异性抗体在生产和质控方面的挑战将激发你的兴趣，以运用所学知识设计新的解决方案，让这一前景广阔的疗法在生产和质控技术上得到改良。 1.前言 本质上来说，双特异性抗体（bsAbs）是一类具有针对两个不同表位或抗原的特异性的分子。即使仅从这个角度来看，在应用上，它也比必须生产和鉴定两个单特异性分子更有优势。在临床上有时面对配体冗余所驱动的疾病时，能够同时靶向两个不同表位或抗原的bsAbs就能体现其不可估量的价值。而且，在过去的三十年中，我们积累了丰富而扎实的知识贮备，意识到某些生物学效应只能通过具有双特异性的单个分子的物理连接来实现，而不是单特异性的双分子混合物。这使得这样的专性bsAbs非常受到重视，以致于在2019年有87个bsAbs正在进行临床研究，其中包括2个已经获批上市的bsAbs。这些独特的生物学作用可以是空间性的，bsAb的双臂分别结合在哪对于抗体的功能至关重要：典型的例子包括连接两种不同细胞类型或将酶与其底物连接的bsAbs。另外一类专性bsAbs是时间性的，双臂的结合依次进行，并且由于动力学或空间原因，一只臂与抗原的结合依赖于另一只臂与其抗原的结合。 如本章所述，bsAb通常是在一个分子中整合了完整的天然样IgG和/或其中的片段，以及通过linker连接排列，保留了抗原结合能力的抗体片段。尽管bsAb使用了与被整合抗体片段相同的氨基酸序列，理论上这些氨基酸链能够构建出与被整合片段相同的结构域，但是所有氨基酸被重新整合成一个全长IgG抗体时，它们的抗原结合和功能特性可能就会发生改变。不过，通过从抗体文库中筛选的方法，可以定向筛选出特性符合要求的抗体，例如高抗原亲和力, 高产量，以及良好的生理性质和特定的结合方式。正是由于这些优势，研究人员正在积极开发在抗体早期发现阶段对全长抗体进行筛选的策略。 2.双特异性抗体的历史 大约50年前，Linus Pauling领导的小组中的科学家Alfred Nisonoff得出了一个关于抗体分子结构的重要结论：每个抗体分子都由两个对靶抗原具有相同特异性的结合位点组成。诺贝尔奖获得者Rodney Porter使用木瓜蛋白酶将抗体切割成了两个Fab片段和一个Fc片段,Nisonoff继续了这项工作并使用了另一种蛋白酶，胃蛋白酶来进行抗体的蛋白水解切割，结果得到了一个二价F(ab)2片段和许多来源于Fc片段的多肽。他认为产生这种现象的原因是木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的切割位点分别位于重链二硫桥的两侧。之前人们认为两个Fab分别位于Fc片段的一端，而Nisonoff的发现改变了这个观点，他认为两个Fab片段都处于Fc片段的同一侧。随着对抗体结构认识的改变，很快便有人提出了人造bsAbs的想法：使用胃蛋白酶裂解，温和的还原和氧化两个具有不同特异性的F(ab)片段，于是Nisonoff和Rivers合成了一种双特异性的二价F(ab)2。他们运用同样的方法制备了针对小鼠免疫球蛋白（Ig）和铁蛋白的双特异性试剂，该试剂被用于通过电子显微镜观察小鼠淋巴细胞表面的Ig。 在接下来的20年中，Köhler和Milstein发明的杂交瘤技术被广泛使用并能高效的生产单克隆抗体。双特异性F(ab)2的产率也可以通过使用化学偶联剂（二巯基化物和硫醇激活剂）或硫醚键连接来提升。实际上，Milstein本人已经从杂交瘤的概念衍生出了“杂交-杂交瘤（hybrid hybridoma）”，设想了一种“四源杂交瘤（quadroma）”细胞，其中包含两种不同抗体的重链和轻链的编码基因能够组装并分泌一种bsAb（尽管它只是由两种重链和轻链混杂配对形成的产物之一）（图1）。 图1. 链错配问题  在一个细胞中表达4条不同的抗体链（图中分别用蓝色和绿色表示了分别对应不同抗体的链）时，通过排列组合可以预计产物是一种混有10种不同的潜在产物的混合物。多种抗体工程技术旨在让抗体链配对时倾向于形成所需的双特异性产物（图中心） 大约也是在那个时候，首次报道了bsAb可以通过重定向T细胞攻击肿瘤细胞来诱导有效的细胞毒性：一方面结合T细胞受体（TCR）以激活T细胞，另一方面结合淋巴瘤细胞系中表达的肿瘤相关抗原（TAA）Thy-1。在随后的几年中，有证据表明仅由化学偶联的F(ab)2片段组成的bsAb也能够介导T细胞活性重定向至肿瘤细胞。一方面，其功能不依赖于MHC；另一方面，诱导细胞裂解的极强效力这两个优势使得这种作用方式的bsAb至今都是临床发展的重点。 重组DNA技术的发展极大地影响了下一个十年bsAb的开发。1988年，单链可变片段（scFv）首次出现。它由抗体重链和轻链的可变区被一个柔性接头连接而成, 由此为多特异性抗体的设计开创了一个新时代。为了解决抗体各链随机结合的问题，现在可以将组成多个抗原结合位点/分子的序列放入一条多肽链中在大肠杆菌中表达，而且由于不存在糖基化的Fc片段，产率大幅提升。此外，有了重组DNA技术，我们还可以根据需求随意设计这些多特异性制品的效价，从而让它们能够满足更多的应用场景。但是，缺少Fc片段会导致抗体在体内半衰期短得多，必须通过在抗体上引入人血清白蛋白（HSA）或Fc融合的其它生物制品来弥补，来更好的发挥其生物学活性。因此，第一个公开发表的对称形式具有四价的双特异性分子，是一种将scFv与每个重链的C末端融合的单克隆抗体。此外值得注意的是，基于scFv的抗体容易聚集和稳定性较低的问题通常需要对最终产品进行重新优化。 1996年，Carter和同事们开创了另一种方法用于解决链错配问题（同时表达的重链和轻链随机配对，从而产生十种不同分子种类的混合物，图1)。Carter和同事们在观察到抗体重链二聚化是通过CH3结构域的二聚化（亲和力大约为10-15 nM）导致的之后，提出了“Knobs-into-Holes”工程设计的策略。该策略通过将抗体一条重链上一个侧链较小的氨基酸替换为一个侧链较大的氨基酸（“knob”），将另一条重链上一个侧链较大的氨基酸替换为一个侧链较小的氨基酸（“hole”），来诱导抗体的异二聚化，结果产生了超过95％的异二聚抗体产物(Fig. 7.2a)。之后，这种通过位阻效应制备不对称抗体的方法被不断优化，以进一步增加异二聚抗体的产率。此外，后续通过其他工程改造步骤，例如引入链间二硫键以及点突变，成功地改善了所得分子的热稳定性(Fig2b)。除了通过空间位阻的方法，抗体异二聚化还可以通过在异源重链的CH3结构域上引入带相反电荷的氨基酸(Fig2c)，或者同时运用空间位阻和静电排斥来实现(Fig2d)。为了实现更高的异二聚化效率，最近的方法引入了更广泛的突变，甚至通过使用天然存在于异二聚体分子中的异二聚化基序（motif），如BEAT body平台中使用的(Fig2e)。在21世纪的第一个十年中，科学家们提出了许多解决轻链错配的方法，例如使用共用轻链（common light chain）或具有物种特异性匹配性质的轻链；然而，直到2014年才出现了第一个可以促进同源的重-轻链选择性配对的正交互补平台。另一个有效的解决方案是使用CrossMab，这种异二聚体的每个臂上CH1和CL结构域的位置进行了互换。还有一种解决方案是用一对CH3结构域与两个Fab之一的CH1/CL的恒定区互换位置。 图2 使两个异源重链优先配对的工程方法  图中以卡通的形式显示了异源CH3结构域骨架，并在CH3结构域之间绘出了突变的氨基酸残基。(a),“Knobs-into-Holes”异二聚体 T366W + T366S/L368A/Y407V (PDB: 5DI8);(b),二硫键连接的“Knobs-into-Holes”异二聚体(PDB:5HY9);(c),通过引入带相反电荷的氨基酸形成的异二聚体 E356K/D399K + K392D/K409D(PDB: 5DK2);(d),位阻效应和电荷效应相结合的方法“EW-RVT,”包括 K360E/K409W + Q347R/D399V/F405T(PDB: 4X98);(e),基于BEAT body 异二聚体，基于TCR基序进行异二聚化(PDB: 6G1E)  在努力开发人工bsAbs的同时，还有一种古老得多的天然形成的一类双特异性抗体，具有开发成为治疗双特异性试剂的巨大潜力，其特殊的生物学性质引起了人们的关注。然而，在很长一段时间当中，人们并不清楚是什么样的结构生物学机制促使了它的产生。人们发现血清来源的IgG4抗体无法交联抗原并产生大型免疫复合物，而重组IgG4抗体能够很好地交联相同的抗原。此外，长期接触蜂毒素磷脂酶-A2（PLA2）的养蜂人血清中发现IgG4抗体水平升高，引起了人们对这些全长“单价”抗体的研究的兴趣。这些抗体可以阻断其他PLA2特异性抗体与PLA2结合：它们由两对重链-轻链组成，而其Fab臂发生了交换，导致每对重-轻链来自不同的抗体。在后来的研究中发现，Fab臂的交换是偶然地在翻译后发生的：首先大量互不相干的IgG4抗体阻碍了体内杂合抗体的形成。之后通过使用灵敏的实时FRET技术，科学家们发现Fab臂的交换可以在特定的氧化还原条件下在体内发生。通过总结这些现象，科学家们发明了当今构建bsAb最成功的技术之一，即“ DuoBody”技术平台。该技术平台在不同来源的IgG1半抗体的CH3结构域中引入突变，通过温和的还原和氧化反应进行受控的Fab臂交换（controlled Fab-arms exchange）。不同于在一个细胞中表达不同抗体链，利用duobody技术，我们甚至可以在细菌中共培养表达两种截然不同的半抗体并得到IgG4型的bsAbs。 综上所述，双特异性抗体的工程化，生产以及下游加工和质量控制方面的技术创新不仅导致如今出现了超过100种bsAb构型，而且还成功地将bsAb推动为当下基于抗体的疗法中，研究最火热、最具前景的化合物。在本章后面的小节中，我们将进一步介绍bsAb不同的生物学作用方式，不同的构型，并探讨其应用前景和局限性。 3.当今双特异性抗体的作用方式（mode of action，MOA） 从历史上看，某些只能通过用一个分子特异性结合两个靶点的抗体才能实现的生物学功能引起了科学界的广泛关注(图3)。表1列出了已经获批用于临床的治疗性抗体。除了3.1小节中图3a这种桥接不同细胞类型（例如T细胞重定向策略）的“反式”相互作用之外，bsAbs还能够桥接同一细胞上的两个受体（“顺式”相互作用）（3.2小节中图3b），以及靶向同一信号通路中的多个配体以克服它们在体内的冗余（3.3小节），或同时结合同一抗原的两个不同表位（3.4小节）。 图3.专性双特异性抗体的作用机制(a), bsAb 通过桥接效应细胞和靶细胞诱导细胞杀伤; (b) bsAb 结合同一细胞上的两个不同抗原诱导增殖、代谢激活或者凋亡; (c) bsAb 充当酶级联反应中的链接，使酶活化; (d) bsAb 作为载体介导载荷的运输 表1 获批用于临床的双特异性抗体 在某些情况下，激动性bsAbs可以增强细胞代谢和再生过程（图3b），或者可以串联某些酶级联反应（图3c和第3.5小节）。在某些特定的生物学场景中，我们还可以利用bsAb作为分子运输的载体。以此将载荷或者bsAb中的功能臂富集或逃离特定器官、组织或细胞区室，从而使载荷或者功能臂在这些区域发挥作用（图3d和3.6小节）。 3.1.桥接不同类型细胞的BsAb 这种方法主要是通过运用bsAb重定向T细胞，利用T细胞的细胞毒性以消除肿瘤细胞。bsAb充当T细胞与肿瘤细胞之间的物理连接，一条臂与T细胞结合，另一臂与肿瘤细胞结合。绝大多数以这种方式起作用的bsAb都选择与TCR复合物中的CD3ε结合，同时可以诱导T细胞活化而不依赖于TCR的抗原特异性以及MHC的限制，而且不需要辅助因子参与（例如CD4或CD8）。尽管此类药物在体外试验中展现出了令人鼓舞的疗效，但由于这些分子在体内诱导不受控制的细胞因子释放，以及难以生产等问题，限制了其在临床上的应用。直到blinatumomab（Blincyto®）惊人的临床效果披露后，人们才对T细胞重定向bsAb产生了浓厚兴趣，而因此，目前进行临床研究超过50％的bsAb都以T细胞重定向作为主要的作用方式。 Blinatumomab是一种由两个scFv组成，靶向CD19和CD3ε的bsAb。由于不包含Fc片段，因此它的分子量大小仅为55 kDa。其在体内的血清半衰期约为1小时，因此它的给药方式通常是使用便携式泵进行连续静脉输注。该药在非霍奇金淋巴瘤患者的治疗中已经展现出了疗效：它在复发/难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中的完全缓解率达到惊人的的43％，这使其在2014年获得美国监管部门的上市批准。 T细胞桥接抗体如何发挥作用？此类bsAb通过桥接T细胞和肿瘤细胞以形成免疫突触，从而使TCR活化并让T细胞释放颗粒酶和穿孔素，最终诱导靶细胞凋亡。由于blinatumomab的临床结果令人印象深刻，以至于好几种双特异性T细胞桥接抗体（BiTE）均使用了它的构型且都具有CD3结合片段，不同点是靶向的肿瘤相关抗原（TAA）不同。影响T细胞重定向bsAb效果的关键因素包括：肿瘤细胞表面靶抗原的表达水平，其在细胞膜上的流动性以及与抗原表位与靶细胞膜之间的距离。还有证据表明，与TAA的多价结合可以让T细胞更紧密的与靶细胞连接，从而提高杀伤效果（例如多价TandAb具有两个CD3结合位点和两个TAA结合位点，以此来提高T细胞桥接的效率）。另一方面，CD3特异性结合臂通常具有相对较低的亲和力（约200 nM），使得bsAb能够与CD3复合物发生多次连续接触，并引发一种称为“连续杀伤（serial killing）”的现象，从而使单个bsAb分子连接的T细胞可杀伤多个靶细胞。 此外，不含Fc片段的或含有不能结合效应细胞的Fc片段的T细胞桥接抗体，与具有功能性Fc片段的T细胞桥接抗体相比似乎更有优势。甚至在靶向CD3的双特异性抗体出现之前，科学家们就通过沉默OKT3（Muromonab，一种单特异性抗CD3抗体，在移植医学中用作为免疫抑制剂）Fc片段的效应功能提高了其安全性。通过阻止Fc片段与Fcγ受体结合，可以避免免疫细胞表面CD3不受控制地聚集。以这种方式修饰的抗体可显著降低细胞因子的释放。与blinatumomab相比，第一个获批的bsAb catumaxomab由小鼠和大鼠的重-轻链组成的异二聚体，并且靶向CD3和Ep-CAM，含有功能性Fc片段。由于catumaxomab的Fc片段能够结合除了肿瘤以外表达在肝脏中Kupffer细胞上的Fcγ受体导致的的靶点毒性（on-target/off-tumor toxicity），静脉注射后会引起患者出现严重不良事件，如强烈的局部细胞因子释放和T细胞介导的肝毒性。大多数（67％）靶向CD3的T细胞桥接bsAb被用于治疗血液系统恶性肿瘤，其靶标包括CD19、CD20、CD33、CD38和CD123（B细胞成熟抗原，BCMA）。T细胞桥接bsAbs在实体瘤中的应用进展相对缓慢，这是因为许多实体瘤抗原在健康组织中也以低水平表达，这可能导致毒副作用。其他影响该类bsAb在实体瘤中应用的因素还包括抗体和效应细胞难以渗透进入实体瘤组织，以及肿瘤的免疫抑制性微环境。目前约有14种T细胞桥接bsAb正在进行治疗实体瘤的临床试验，靶点包括Her2、EGFR、PSMA和Ep-CAM。 长期使用T细胞桥接抗体治疗可能会由于肿瘤抗原的丢失而出现耐药。一个典型的例子是ALL患者中CD19阴性白血病细胞的增殖。其它抑制T细胞活性的机制还包括调节性T细胞的抑制功能或免疫检查点分子（例如PD-1和PD-L1）的表达。不意外的是，对PD-1/PD-L1抑制可以增强T细胞桥接bsAb的治疗效果。因此，目前基于bsAb的疗法通过同时阻断PD-1/PD-L1轴以及其它免疫检查点CTLA-4、LAG-3或TIM-3来增强T细胞活性已经在进行早期临床研究。一些联合疗法令人鼓舞的早期数据更加支撑了这种观点：与ipilimumab单药治疗相比，联用ipilimumab（Yervoy®）（抗CTLA4）和nivolumab（Keytruda®）（抗PD-1）治疗可显著延长黑色素瘤患者的无进展生存期（PFS）。在双特异性药物的设计中，科学家们已经设想了用Fc沉默的bsAb分别以高亲和力PD-1结合臂和低亲和力CTLA-4结合臂来阻断肿瘤浸润淋巴细胞上的PD-1和CTLA-4，与此同时还能减少bsAb与CTLA-4阳性的外周血T细胞的结合。该设计旨在提高bsAb的安全性和耐受性。 在临床上，使用T细胞桥接bsAbs对抗癌症已经逐渐从激活的效应细胞扩展为使用其它合适的效应细胞类型。Vγ9Vδ2 T细胞是一类涉及免疫监视并且能与肿瘤产生的磷酸化抗原反应导致代谢失调的细胞。该细胞通过bsAb重定向到EGFR阳性肿瘤，并能够诱导结肠癌细胞死亡。另一类适合被桥接的是自然杀伤（NK）细胞。研究人员通过基于scFv构型的三特异性抗体靶向CD16a受体，并融合了IL-15和Her2特异性结合片段实现了NK细胞的桥接。TandAb AFM 13，一种通过接头连接四个抗体可变区片段的抗体，分别拥有两个CD30和CD16a结合位点，能够诱导NK细胞介导的CD30阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤。 除肿瘤领域外，T细胞重定向策略也可能被应用于传染病的治疗。靶向病毒的bsAbs已被证明可将细胞毒性T细胞重定向至已经被乙型肝炎病毒，巨细胞病毒和HIV-1感染的细胞。此类bsAb能够诱导杀伤被HIV感染的细胞并抑制HIV的离体复制。最近的研究有望成功地将bsAb用于再生医学：通过靶向递送CD34阳性的内皮祖细胞至CD41阳性的血小板，可在急性心肌梗死的小鼠模型中有效地修复心脏。通过靶向干细胞抗原1，bsAb可以将PBMC的一个亚群递送至损伤部位，再加上血小板上GPIIb/IIIa的活化，导致损伤部位的炎症细胞和纤维化明显减少，而毛细血管密度增加，心脏功能恢复。 3.2.桥接受体阻断信号通路 桥接受体的bsAb中最成功的例子当属靶向酪氨酸激酶受体家族的抗体。这可能是因为它们靶点组合的协同特性，但是在某些例子中也由于其专性的双特异性。令人惊讶的是，迄今为止，所有受体桥接bsAb在体外和体内试验中表现出的功能，都不能通过参考其亲本抗体的特性来预测。例如，有一个很好的靶向EGFR和Met的bsAb是通过在含有大量bsAb的文库中广泛筛选而来，并且是唯一一个不会在Met/EGFR阳性细胞诱导该通路激活的候选物。要知道，通常二价抗met抗体会引起met分子发生交联并诱导肿瘤发生。因此，这种靶向Met和抗EGFR结的不对称的双特异性抗体被用来阻断Met和EGFR诱导的信号传导。另一个例子是靶向Her2和Her3的单价双特异性抗体。通过与Her2高亲和力结合，可以使抗Her3 Fab在局部富集，从而可以阻止Her3与其配体HRG的结合并抑制两个受体的信号传导。 靶向受体的bsAb也可以表现出激动活性。有研究表明，成纤维细胞生长因子21（FGF21）代谢途径的激活可以有效缓解肥胖和糖尿病，但由于其毒副作用，无法直接靶向该分子。因此，bsAb BFKB8488A（Roche）通过靶向广泛表达的成纤维细胞生长因子受体1C和仅在肝脏、脂肪组织和胰腺中表达的β-klotho受体激活了该代谢途径。并且，毒副作用被有效地限制在同时表达两种靶点的组织中。 3.3.克服配体冗余 仅仅通过抑制支持癌细胞生长的细胞因子通常不足以阻止癌细胞的增殖，因为癌细胞增殖所涉及的信号传导途径依赖于激活这些通路冗余的配体。在抗血管新生方面，克服配体冗余作用方式的bsAb与单特异性药物相比具有一定优势。例如，一款靶向并抑制VEGF和δ样配体4（DLL-4）的DVD-Ig构型的bsAb目前正在进行治疗结肠癌患者的临床研究。研究人员开发了一款人源化IgG1 靶向VEGF和Ang2的CrossMab来治疗眼科疾病。在该药用于糖尿病相关性黄斑水肿患者之前，应该对其Fc区进行的额外工程改造，一方面避免与Fc受体的结合以减少二级免疫反应，另一方面提高药物的全身清除效率。 3.4.靶向同一抗原的两个不同表位: Biparatopic 双特异性抗体 Biparatopic bsAb靶向同一抗原的两个不同表位并可以充当交联剂，通常会导致抗原聚集。在这方面，它的活性可以与抗体的混合物相比。此类抗体的一个例子是抗Her2的bsAb ZW25。它极强的结合作用体现为更高的亲和力，能够更好地在细胞表面阻断Her2以抑制Her2介导的信号传导。它Fc区经过工程化改造后，能够更有效地发挥效应功能。在治疗晚期胃食管癌和乳腺癌患者的临床试验数据显示，该抗体比赫赛汀疗效更好。此外，以该抗体为基础，研究人员开发了一款抗体药物偶联物（ADC）ZW49。研究人员预计该药物能够介导更强烈的细胞内化，所以应该能够更有效的在胞内裂解毒素，从而获得更好的临床结果，目前，该药物正在开展临床试验。 3.5.酶模拟 典型的充当酶复合物共作用因子的bsAb的例子是emicizumab（Hemlibra®），它是目前获批上市的第二款bsAb。这种抗体通过以微摩尔级别的亲和力同时结合IXa和X因子，在A型血友病患者中模拟VIIIa因子（FVIII的活化形式，在A型血友病患者中缺失）。作为一种预防性治疗，这种bsAb可以有效地缓解A型血友病患者的出血，无论患者体内是否存在VIIIa因子抑制物。该bsAb是通过对40,000个bsAb（由200种靶向IXa因子的抗体和200种靶向X因子的抗体排列组合）的活性筛选而来。为了解决链错配问题，该bsAb由两条异源IgG4重链二聚体和一条共用轻链（common light chain）组成。在40,000个bsAb中大约有0.3%在筛选中表现出酶模拟活性。研究人员对最佳候选药物的轻链通过构架和CDR重组进行了优化。后续进一步的优化包括人源化以降低免疫原性，电荷优化以减少聚集问题，以及等电点优化以实现基于离子交换色谱的双特异性产物与副产物的分离。最终，该药物于2018年在美国和欧洲获批。 3.6.双特异性抗体介导的转运:背负式劫持 该概念涉及专性BsAb，其能够将分子转运进/出某些组织或细胞区室。其中一个开拓性的例子是，由抗体作为靶向部分和蓖麻毒素A组成的分子，毒素在该分子被细胞内化后会释放毒性。另一个由抗体和突变型假单胞菌毒素组成的药物正在临床开发中。 目前，科学家正在对利用bsAb作为“特洛伊木马”进行深入研究。因为它们可以穿过脑血屏障并将活性化合物递送到该区域。最常见的方式是，它们通过一个抗原结合臂与铁转运蛋白受体结合，从而让整个分子通过胞吞途径进入。有一个此类bsAb另一结合臂与ß-分泌酶1（BACE1）结合，能够在小鼠和猴子模型中显著抑制该酶的活性，从而减少脑和脑脊液中β-淀粉样蛋白斑块的数量。 核内体似乎也是一个可以作为bsAb转运功能的靶标。例如，bsAb一方面可以靶向埃博拉病毒糖蛋白胞外暴露的保守的抗原表位并以病毒作为载体，随之一起被内吞进核内体。病毒的糖蛋白被蛋白水解切割后，病毒与内体受体的结合位点暴露出来，该位点的结合是病毒从核内体进入细胞质所必需的。另一方面，bsAb通过靶向内体受体，阻断病毒与其结合，从而阻止病毒进入细胞质。通过这种机制，bsAb能够在体外中和几种已知的埃博拉病毒株并为小鼠提供抗病毒保护。另一款靶向次级内体蛋白（late-endosomal protein）CD63的bsAb能够提高靶向Her2的抗体-药物偶联物的递送效率并降低其的外周毒性。双特异性结合还可以通过介导与Fc或HSA的非共价融合，让不含Fc的抗原结合片段进入新生儿Fc受体（FcRn）循环途径，从而避免被溶酶体降解，在体内具有更长的血清半衰期。多种抗体运用这种设计并证实了其可行性：基于VHH的bsAbs vobarilizumab和ozoralizumab，它们分别靶向IL-6受体和肿瘤坏死因子并融合了能够结合HAS的片段，目前处于临床II期研究中。另一款基于VHH的，利用HAS延长半衰期的药物是靶向VWF蛋白（von Willebrand factor）的caplicizumab（Cablivi®）。FDA已经批准该药的用于治疗血栓性血小板减少性紫癜的患者。 4.双特异性抗体的构型 bsAb在完成单特异性抗体无法处理的任务中的成功引起了人们的兴趣。科学家希望推动bsAb用于更复杂的生物学场景。为了实现它们多样化的功能，有时需要不同的结合价位，有时甚至需要控制两个结合位点的空间位置。这促使蛋白质工程界设计出许多巧妙的解决方案来满足其多样化结构的需求。因此，目前已经有超过100种可用的，不同的bsAb构型 (图4)。 在IgG类的天然二价抗体中，两个抗原结合位点是相同的，并且重链和轻链的可变区都参与抗原结合。化学偶联以及共表达两对不同的重-轻链会导致混合产物的产生，从而造成链错配问题： 这会降低目标产物的产量，需要对各链做标签化标记以进行额外的纯化步骤，并需要对最终产物重新分析和质控。目前研究人员已经开发了多种技术来增加所需双特异性分子的产率。除了可以根据bsAb的基本结构将它们分类之外，还可以通过bsAb所应用的工程化方法对它们进行区分。 4.1.基于片段结构的双特异性抗体 单链可变片段（scFv），一种由连接子（linker）将重链和轻链的可变区连接在一起组成的多肽链。作为最小的抗体衍生结构，它保留了完整IgG抗体的抗原特异性，并且成为了如今构建多特异性抗体最常用的构型(图4A2)。我们可以在这种构型中通过选择合适长度的连接子来调整重链和轻链的空间排列，而缺少Fc片段则可以规避抗体的同二聚化(图4A)。特别是后一特性还让其适合在原核微生物或低等真核生物中表达，从而使它的生产变得廉价和简单。它们的模块化性质让我们可以按照意愿选择特异性结合的效价：目前，多效价靶向每个靶点的构型正在进行临床评估。与此同时，其模块化特性让我们能够调整结构域的排列，以找到最佳的组合形式，以此解决基于片段的bsAbs在溶解性和稳定性方面的潜在问题。 图4 bsAb构型的选择抗体各链标示: 红色, VL1; 蓝色, VH1; 黄色, VL2; 绿色, VH2; 黑色, CL; 白色, CH1; 灰色, CH2; 浅蓝, CH3. (A) 基于片段结构的构型: A1 F(ab)2, A2 T细胞桥接双特异性抗体(BiTE), A3 diabody, A4 dual affinity retargeting (DART),A5tandemdiabody(TandAb);(B)对称融合构型,B1dual-variabledomain-Ig (DVD-Ig),B2IgG-(scFv)2,B3(scFv)4-Fc,B4cross-overdualvariableIg(CODV-Ig);(C)对称构型, C1 Two-in-One Ab, C2 DutaMab, C3 mAb(粉色表示做了突变处理的CH3结构域); (D)不对称构型, D1 “Knobs-into-Holes”异二聚化的IgG, D2 通过电荷作用异二聚化的IgG, D3 通过位阻效应诱导、二硫键稳定异二聚化的IgG, D4 通过位阻效应诱导、点突变稳定异二聚化的IgG,D5SEED-body(条纹表示异二聚化的CH3); (E) 解决了轻链错配的不对称构型, E1 大鼠-小鼠 杂合IgG (带边框的洋红色,小鼠CL;带边框的粉色,小鼠CH1;洋红色,小鼠CH3;带边框的深灰色,大鼠CL;带边框的灰色,大鼠CH1;深灰色,大鼠CH3), E2 共用轻链异二聚化IgG, E3通过突变CH1/CL和VH1/VL结合界面异二聚化的IgG, E4 DuetMab, E5 CrossMab 相比之下，diabodies（图4 A3）包含两条链，每条链具有一个VH和VL结构域，并通过很短的（通常为5个氨基酸长度）linker连接。因为linker的长度比scFv中装配抗原结合位点所需的长度短得多，所以两条链在相反的方向上形成二聚体，当其在同一细胞中共表达时形成双特异性异二聚体分子。而有证据表明，两个结合位点位置的变化会影响抗体的有效应。例如DART构型的抗体（图4A4），由两个diabody组成。其中，两个diabody被一个额外的半胱氨酸键将抗体中靶细胞和效应细胞的结合位点限制在比其他基于linker设计的构型更近的距离，因而可以诱导更有效的靶细胞杀伤。但是，不含有Fc区会使此类分子无法进入FcRn循环途径，从而导致较短的血清半衰期。然而，我们可以通过在抗体中融合Fc片段或HSA结合片段来改善它们的药代动力学性质。 4.2.对称的双特异性抗体构型 既要保留Fc片段又要克服链错配问题的另一种方法是选择未修饰的IgG构型作为基本骨架，并为其加上第二种特异性。因此，这种构型通常都是以二价的形式靶向每种抗原（图4B, C）。通过融合组成的构型通常包括附加在重链C末端的scFv以及Fab片段，例如(scFv)2-Ig（图4B2）；这里Fab片段的可变区和恒定区可以用scFv取代，(scFv)4-Fc（图4B3）。但是，在DVD-Ig（dual-variable domain-Ig）的构型中（图4B1），靶向第二种抗原的特异性是通过在重链N端添加另一对重-轻链可变区实现的。此外，最近报道的CODV-Ig（cross-over dual variable Ig，图4B4）构型通过将两个可变区阵列附加到每个Fab片段的恒定区来给抗体添加第二种特异性，并通过优化了的linker将VH和VL相连，以确保其正确的空间位置。 另一类工程化方法旨在通过引入突变和选择而不是共价连接的方法来生产对称的bsAb，同时保留其分子结构和IgG分子的大小(图4C)。其中包括“Two-in-One antibody”（图4C1），其可变区的CDR被修饰为可以特异性识别两种不同的抗原；DutaMab，其重链和轻链的CDR可以分别结合一种不同的抗原（图4C2）；mAb 具有从文库而来的抗原结合性Fc，通过在CH3结构域突变残基赋予其抗原结合能力（图4C3）。 4.3.不对称的双特异性抗体构型 此类设计的双特异性抗体构型的原理是通过在共表达四个多肽链后，为异二聚体的两个异源抗体链之间创造优先配对的条件(图4D, E)。这种构型的bsAb除了基本保留了抗体的天然构型和大小，此外，它们的巨大优势是最大程度减少了免疫原性非天然抗体序列（例如标签和linker）的使用。为了实现异二聚化，第一种策略是基于点突变的空间位阻效应（图4D1）或电荷效应（图4D2），之后再优化突变了的Fc区以保持分子的稳定性(图4 D3, 4)。最近，旨在实现异源二聚化的方法采用了更广泛的突变，例如运用链交换技术改造结构域的SEEDbody：利用了IgG3和IgA CH3片段易于配对的特性，将其中类似的结构分别引入bsAb的两条重链中（图4D5）；BEAT构型：利用TCR（T-cell receptor）两条链异二聚化的特性，将介导TCR链异二聚化配对的残基引入到Fc区上(图2E) 。最近，出现了一种适用于IgG1骨架CH3结构域的方法是先表达两个半分子抗体，之后组装，也称为受控的Fab臂交换（controlled Fab-arms exchange）。 通过利用一个scFv作为抗原结合位点（图4D5）或使用多个物种的抗体结构域(图4E1)，解决了不对称构型中轻链错配的问题。后来研究人员通过让两个结合位点使用同样的轻链的方法也解决了这个问题(图4E2)。它为两个结合配偶体使用序列相同的轻链（图4E2）。但用这种方法构建的bsAb的局限性在于这种bsAb不能利用已经存在的单特异性抗体，因此需要一系列配套的噬菌体文库和转基因动物平台来支持其抗体发现过程。此外，通过修饰重链和轻链之间的结合界面也可以让某个Fab优先形成，避免轻链错配(图4E3)。还有一种促使轻链正确配对的策略是，通过去掉Fab片段恒定区之间的天然二硫键并人为引入另一条二硫键，称为DuetMab构型(图4E4)。在CrossMab中，轻链和Fd（VH-CH1）片段的位置在两个不对称半抗体中互换了位置（图4E5）。依赖于轻链结合抗原的bsAb的分离纯化步骤如下：在“κλ-body”构型中，采用了两个不同亚家族（κ和λ）的独特轻链。在进行亲和色谱分离时，使用诸如Kappa选择和Lambda Fab选择之类的载板来选择性捕获包含κ和λ两个轻链的不对称bsAb。此外，能够与bsAb两个Fab相结合的抗原蛋白如今也可以被用作色谱载板来特异性捕获bsAb。 实际上，对某些不对称bsAb的设计进行微调，是为了通过下游生产纯化达到所需均质终产物的最佳产量。此类方案根据目标产物与副产物的微小区别，例如基于与重组纯化蛋白A结合能力的差异、所带电荷的差异或分子量差异，可以分别通过离子交换色谱或凝胶过滤柱进行分离纯化。由于bsAb结构的复杂性，导致了其需要灵敏的分析工具监控并分离纯化正确配对的产物。bsAb的分析由一系列互补的方法组成。分析的第一步通常是基于液相色谱-质谱（LC-MS）的方法来测定抗体的分子量，以便快速分析bsAb各链是否正确配对；第二步包括疏水层析（HIC）分析，可基于目标产物和副产物疏水性的不同测定bsAb的纯度。 值得注意的是，目前大多数不对称构型的bsAb对每种抗原都只有一个单价结合位点，想要引入靶向抗原的多个结合点仍然是未来蛋白质工程面临的挑战：多价结合所获得的亲和力效应可能会挖掘出抗体的潜力，通过提高结合位点的数量，从而增强与表达抗原的靶细胞的相互作用强度。 5.展望 在了解了几类双特异性抗体的构型后，我们可以得出结论，未来大多数打算用于治疗的候选分子都倾向于含有Fc片段，主要是因为它带来的较长的体内血清半衰期。此外，之前被证明对单克隆抗体有益的所有基于Fc的修饰也都适用于bsAb：选择合适的Fc类型来延长半衰期；通过点突变或改变糖基化来增强次级免疫反应；或通过减少点突变造成空间位阻或减少糖基化使其难于结合FcγR分子。或者，如果不需要介导次级免疫反应，则可以使用IgG2或IgG4类的Fc片段。IgG4介导天然异源二聚化的特性似乎更适合用作bsAb的骨架。 尽管目前在临床试验中的分子最多具有两个结合位点，但在一些抗体构型中，多价靶向特定抗原似乎会更有利。未来的抗体工程化还可以利用天然的多价抗体分子，例如基于IgA的四价构型或基于IgM的十价构型。 6.总结 在本章中，我们了解了几十年来bsAb的发展历程，并学习了它们的多种构型以及作用方式。每种构型都在调整针对目标抗原的效价、靶向两种抗原时距离和浓度的物理化学参数等方面表现出独特的性质。而它们在理化性质，制造要求，生产后分析和配制以及体内药代动力学性质方面就更加差异化。但是，对bsAb的结构和功能同质性以及生物学效应的要求与经典的单特异性抗体是高度类似的，这对于其在人体和医疗上的应用至关重要。 Take Home Messages •根据生物学效应，BsAb可以充当两种单特异性抗体组合的混合物来发挥作用；也可以作为专性bsAb，将两种不同的抗原特异性组合在一起产生新的生物学效应。 •bsAb的专性作用要么是空间性的（两个抗原结合臂分别同时结合抗原），要么是时间性的（其中一条抗原结合臂与抗原的结合是实现另一臂结合活性的先决条件）。 •常用的bsAbs作用方式包括桥接不同细胞类型，桥接不同抗原，结合同一抗原的两个不同表位，靶向同一信号途径的两个抗原以及作为载体将携带的生物学功能递送至所需的器官和细胞室。 •bsAb的构型包括不含Fc片段的基于片段结构的构型；通过利用融合或突变方法添加第二种特异性的同源二聚化Fc的对称构型；以及通过空间位阻效应或者静电效应诱导两个异源Fc半分子结合的非对称构型。 •不对称构型通常通过点突变引入链配对基序，以诱导两个异二聚半抗体重链分子的优先配对。轻链错配的问题可以通过让两个不同的抗原结合位点共用序列相同的轻链；或者改造重-轻链结合界面，包括引入改造的二硫键；通过结构域交换或恒定区位置互换来解决。此外，对于具有κ和λ类轻链的抗体可以利用特异性结合κ和λ类轻链来进行分离纯化。 •抗原识别位点的效价在各种构型的抗体中是不同的，可以根据特定的生物学应用进行选择。目前的抗体工程技术甚至可以满足设计多价抗体的需求。 •使用IgG1、IgG2和IgG4不同骨架的bsAb构型可以调节不同的免疫效应功能。 下章预告：抗体偶联药物 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。