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▎药明康德内容团队编辑免疫检查点抑制剂的应用标志着癌症治疗领域的一次革命性变革，为多种癌症疗法开辟了新的路径。这些抑制剂最初主要作为单药疗法应用，然而，随着研究的深入和治疗经验的积累，现在越来越多的患者开始接受基于免疫检查点抑制的联合疗法。这种联合疗法不仅涉及不同免疫检查点抑制剂的结合，还包括将其与传统治疗方法如化疗和放疗，以及新兴的免疫治疗手段相结合。这样的多模式治疗策略旨在通过协同作用提高临床疗效，以更全面地针对肿瘤。近期，《自然》杂志的子刊Nature Reviews Immunology发表了一篇综述文章，深入探讨了免疫检查点抑制剂与其他治疗手段结合应用的作用机制、相关生物标志物的发展，以及从临床试验中获得的见解。在今天的文章中，药明康德的内容团队将向读者介绍这篇文章的精华部分，深入解析这些研究成果对未来癌症治疗策略的影响。免疫疗法组合治疗策略的研究进展免疫检查点抑制剂作为一种革命性的免疫疗法药物，通过阻断免疫系统中的关键通路，增强机体对癌细胞的攻击能力。这类药物主要针对CTLA-4、PD-1和PD-L1等关键性免疫检查点分子，通过激活患者的免疫反应来有效抗击癌症。现有药物在多种疾病阶段和适应症中已获批准使用，且动物模型和早期临床试验揭示了多种免疫治疗方法的潜在效果。尽管如此，新的治疗突破仍在积极探索中。目前正在测试的药物组合不仅包括已获批准的免疫检查点抑制剂，还有针对肿瘤微环境（TME）的药物、传统的化/放疗和新一代免疫检查点抑制剂等其他治疗手段。同时，包括实验性免疫治疗药物在内的组合疗法也正在进行临床试验。在癌症组合疗法的研究中，理解不同药物组合背后的作用机制，并预先考虑生物标志物的重要性不言而喻。因此，目前研究的重点是确定哪些生物标志物对治疗反应具有预测价值，并开发科学合理的药物组合策略，以进一步提升这些治疗方法的整体疗效。图片来源：123RF免疫疗法+化疗组合化疗长期以来一直是许多恶性肿瘤的主要全身性治疗方法，它的主要优势在于能迅速减少肿瘤体积，缓解肿瘤负担，以及减轻免疫抑制。将化疗与免疫治疗相结合具有潜在优势，如诱导免疫原性细胞死亡、激活适应性免疫反应、调节TME等。化疗可能使肿瘤微环境对肿瘤浸润淋巴细胞的抑制减少，进而增强免疫治疗的有效性。目前已有多种化疗和免疫检查点阻断疗法的组合获得了监管批准，然而，这些组合治疗方案中的化疗药物的确切剂量和治疗顺序还需进一步的研究和优化。免疫疗法+放疗组合放疗会引起大量DNA损伤，导致突变、死亡和新抗原的产生。尽管放疗主要作用于局部区域，但罕见的辐射诱导的远后效应表明放疗也可能诱发抗癌免疫反应。放疗通过诱导MHC I类分子表达、增强肿瘤抗原呈递、引起免疫原性细胞死亡、下调CD47“别吃我”信号和产生活性氧等机制来增加肿瘤的免疫原性。临床前模型已经表明放疗和免疫检查点抑制剂之间的协同作用，这种策略现已应用于临床：在化疗和放疗后接受PD-L1阻断剂度伐利尤单抗的治疗方案已被批准用于III期非小细胞肺癌。辐射诱导的DNA损伤还可能激活STING途径，这对于I型干扰素依赖的抗肿瘤免疫至关重要。然而，放疗也被证明对免疫系统有不利影响，比如免疫细胞可能被辐射杀死，此外辐射还可能导致形成免疫抑制性TME，增加髓系来源抑制细胞和调节性T细胞的数量。最近，为了优化对免疫检查点疗法的抗肿瘤反应，正在评估仅照射肿瘤的一部分或使用不同剂量辐射的策略。新一代免疫检查点抑制剂疗法组合目前研究的重点在于新一代免疫检查点抑制剂中的relatlimab和针对TIGIT的抗体。Relatlimab是一种靶向LAG-3的抗体药物，已被批准用于治疗晚期黑色素瘤。LAG3是一种抑制T细胞活性并促进Treg细胞发育的免疫抑制受体，能够与多种涉及T细胞抑制的配体结合，与PD-1抑制剂联合使用具有协同效果。临床试验结果表明，relatlimab和PD-1抑制剂的组合在无进展生存期（PFS）方面显著优于PD-1抑制剂单药治疗。TIGIT是一种与T细胞抑制和耗竭相关的检查点分子。在多项临床试验中，针对TIGIT的单克隆抗体tiragolumab和针对PD-L1的阿替利珠单抗的双重阻断未能达到预期的治疗效果。在接受免疫检查点阻断治疗的晚期黑色素瘤患者中，高TIGIT:CD226比例与不良临床结果相关，可能是值得进一步探索的生物标志物。此外，还有其他针对TIGIT的药物的免疫检查点组合试验正在进行中，涵盖各种适应症。另一种潜在的关键生物标志物是TIM3，它广泛表达在多种免疫细胞中，具有调节先天和适应性免疫的作用。在实体瘤的患者队列中，它被识别为整体生存期不良的预后生物标志物。TIM3的具体功能和预后意义仍不清楚，可能取决于其在不同细胞类型上的动态表达和免疫环境。最近的研究表明，阻断TIM3和PD-1的单克隆抗体组合显示出初步的抗肿瘤活性。免疫细胞的位置也可以影响TME中靶向阻断反应，通过ImmunoPET进行分子成像可能有助于检测特定肿瘤标志物和/或免疫细胞群体。结合刺激先天免疫细胞的治疗策略癌症会导致先天免疫细胞功能失调，因此克服抑制免疫细胞活性的消极信号和提供激活信号成为研究重点。巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和肥大细胞等先天免疫细胞通过模式识别受体（PRRs）对危险信号和病原体做出反应，临床上正在测试针对PRRs的几个药物家族，其中包括STING激动剂。目前，已有几项STING激动剂的临床试验正在进行中，包括全身给药或直接注射进肿瘤，并与针对PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂联合使用。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）有两种极化状态，其中“M1极化”具有抗肿瘤效果，而“M2极化”具有免疫抑制功能。TLR9激动剂可以诱导TAMs的M1极化，并使T细胞趋向于记忆表型。然而，TLR9激动剂作为单药治疗的效果有限。最近的研究显示，TLR9激动剂与针对PD-1免疫检查点阻断的联合治疗在抗PD-1耐药的转移性黑色素瘤患者中取得了一定的疗效。此外，还有其他处于临床试验阶段的TLR激动剂与PD-1抑制剂联用时也显示出针对晚期实体瘤的潜在疗效。结合溶瘤病毒的治疗策略使用病毒诱导先天和适应性免疫反应并直接杀死癌细胞的策略已被广泛评估。其中包括T-VEC，这是目前获得监管批准用于癌症定向治疗的溶瘤病毒，它通过引起直接的肿瘤细胞溶解来释放肿瘤来源的抗原，并被设计用来表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），促进树突状细胞成熟和肿瘤抗原反应性T细胞的发展。然而，3期临床试验显示，使用T-VEC和帕博利珠单抗联合治疗的患者在PFS或总生存期方面没有显著改善。目前尚不清楚，对于抗PD-1方案耐药的患者群体来说，这种联合治疗方案是否优于单独使用帕博利珠单抗。当前，多项试验正在研究溶瘤病毒作为单药治疗或与针对PD-1的免疫检查点治疗联合使用的可能性。其中，RP1溶瘤病毒与纳武利尤单抗联合使用在对抗PD-1耐药的黑色素瘤患者中显示出36%的总体缓解率（ORR），在未经治疗的非黑色素瘤皮肤癌患者中，报告了33%的ORR。此外，RP2和RP3溶瘤病毒以及T3011溶瘤病毒作为单药治疗或者与靶向PD-1的药物联合使用的方案也在临床研究中。与基于细胞因子的疗法组成的联合治疗策略细胞因子作为抗癌疗法的应用已经广泛地进行了研究，包括IFNα和重组IL-2等。然而，IL-2与Treg上的高亲和力IL-2Rα亚单位结合可能导致TME对抗癌免疫反应不利。因此，当前有多项临床试验在测试“下一代”IL-2制剂以及其他多种细胞因子。这些细胞因子与放疗、化疗或免疫治疗联合应用的临床效果也正在积极研究中。此外，p38 MAPK途径在调控促肿瘤细胞因子的产生方面起着关键作用，并且与免疫治疗的反应不足相关。ARRY-614是一种针对p38的小分子抑制剂，它正在与PD-1抑制剂联合用于治疗多种实体恶性肿瘤，初步结果显示了其潜在的治疗效果。同时，合成趋化因子和趋化因子受体阻断剂的应用也正在测试中，这些药物有助于降低Treg细胞的丰度并促进效应细胞在肿瘤微环境中的聚集。一些药物还正在与免疫检查点阻断、病毒载体和细胞疗法结合使用，以增强免疫治疗的整体效果。图片来源：123RF结合过继性细胞疗法和T细胞接合器的治疗策略过继性细胞治疗提供了一种新的策略来激发抗肿瘤反应。其中，使用体外扩增的自体癌症反应性肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是当前研究的重点。研究显示，TIL细胞疗法与免疫检查点疗法的结合在多个适应症中显示出潜在的治疗效果，并且目前正在进行进一步的研究以探索其与其他免疫治疗药物的联合应用。CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中已取得批准使用，但其在实体瘤中的应用仍面临挑战。结合免疫检查点抑制剂可能有助于改善CAR-T细胞在实体瘤微环境中的功能。尽管如此，一项针对神经母细胞瘤患者的临床试验发现，CAR-T细胞与PD-1检查点抑制剂的联合治疗在抗肿瘤效果上表现一般，且未显著影响CAR-T细胞的扩增、持久性或循环细胞因子水平。目前，CAR-T与免疫检查点抑制剂的联合应用正在血液恶性肿瘤和实体瘤中进行研究。使用T细胞接合器是另一种促进免疫细胞迁移到肿瘤部位并激活它们的策略。例如，在临床试验中，Tebentafusp（一种获批的T细胞接合器）与研究者选择的疗法相比显示了6个月的总生存期益处，这一效果与gp100的表达水平无关。gp100作为肿瘤生物标志物的预测效用不足，这可能与肿瘤间和肿瘤内异质性有关。目前，T细胞接合器与免疫检查点抑制剂的联合治疗方案正在不同适应症中进行评估。结合抗癌疫苗的治疗策略在肿瘤特异性T细胞反应和免疫活跃的“热”肿瘤环境中，免疫检查点阻断治疗展现出显著的疗效。其中，癌症疫苗在促进T细胞反应和增强其对肿瘤的浸润过程中扮演着关键角色。目前的临床研究表明，基于树突状细胞的疫苗具有较强的效果，而基于mRNA的疫苗也显示出了相当的潜力。不过，关于mRNA疫苗的最佳配方和治疗顺序，当前研究还未得出定论。一些早期研究结果提示，先施行癌症疫苗，再进行免疫检查点阻断治疗可能更为有效。然而最近公布的数据显示，在PD-1阻断后接种个体化mRNA疫苗，，在针对黑色素瘤患者的2期试验中显示出改善PFS的效果。关于疫苗的最佳施用顺序及其他疫苗平台（如DNA疫苗）的选用，仍存在一定的不确定性。新抗原作为个体化癌症治疗靶点的重要性需要更深入的研究与验证。随着疫苗平台的改良和免疫分析技术的精细化，预计疫苗的治疗效果将进一步得到提升，并推动新抗原预测技术的发展，从而为癌症免疫治疗提供更强有力的支持。结合抗血管生成方案的治疗策略异常的血管生成是癌症的一个标志性特征，与免疫逃逸和免疫抑制密切相关。通过正常化异常的肿瘤血管结构，可以有效改善肿瘤微环境。抗血管生成药物可以调节TME并减少免疫抑制细胞，进而发挥治疗作用。特别是，血管内皮生长因子受体（VEGFR）抑制剂与免疫检查点抑制剂的联合使用，在多种肿瘤类型中展示了潜在的临床效益，这一策略已在多项临床试验中得到验证。在肾细胞癌患者中，检查点抑制剂与抗血管生成药物的联合疗法在一个单臂试验中显示了58%的总体缓解率。研究表明，该疗法对于肿瘤相关免疫细胞上表达PD-L1水平大于或等于1%的患者更为有效。3期临床试验验证了这些发现，并确立了新的治疗标准。目前，多项研究正在探索PD-1抑制剂与抗血管生成药物联合疗法在不同癌症类型中的治疗效果。然而，尚无稳定且可靠的生物标志物可以预测对VEGFR靶向疗法的反应，也没有常规使用的预测性生物标志物。一些临床试验正在探索使用生物标志物对患者进行筛选，以提高治疗效果。图片来源：123RF结合小分子靶向疗法的治疗策略迄今为止，基于常见体细胞突变的预测性生物标志物是最常用且稳健的工具，这些突变可通过肿瘤的分子检测或循环肿瘤DNA的分析来识别。在黑色素瘤患者中，尽管BRAF和MEK激酶抑制剂联合疗法显示出较高的总体缓解率，但其治疗复杂性及潜在的副作用同样引发了关注。此外，结合免疫检查点阻断治疗与靶向治疗的策略已经得到了临床前研究的支持，但仍需要进一步的研究来确定其安全性和有效性。未来展望当前，研究人员正在积极探索多种生物标志物，例如循环肿瘤DNA以及全面的TME分析，以深入了解药物的作用机制并为患者分层及数据收集提供支持。为了有效运用这些复杂技术，必须将创新的数据科学分析方法与生物信息学辅助的临床数据分析进行整合。通过这种综合方法，我们可以更深入地了解药物在特定患者背景下的活性，进而发现更加有效的药物组合方案。展望未来，肿瘤治疗策略将更多地依据肿瘤生物学特性和免疫状态来定制。通过对肿瘤进行深入的分子、表型和空间特征分析，我们可以确定最适合的治疗方法。个体化的治疗策略将从不断扩展的免疫治疗选项中进行选择，可能包括双重甚至三重免疫检查点阻断、疫苗、化疗、放疗、细胞治疗，或是临床试验中的新型干预措施。虽然目前所描述的生物标志物技术尚未标准化，但从已有研究中获得的洞察将指导生物标志物技术平台的改进，并提供关键的干预调控节点。尽管在免疫肿瘤学领域，药物剂量和给药时间安排仍具挑战性，但随着越来越多的成功治疗案例和对肿瘤的深入分析，我们能够通过必要的调整，从而将免疫治疗的优势扩展到更广泛的患者群体。大家都在看▲欲了解更多前沿技术在生物医药产业中的应用，请长按扫描上方二维码，即可访问“药明直播间”，观看相关话题的直播讨论与精彩回放参考资料：[1] Butterfield, Lisa H, and Yana G Najjar. “Immunotherapy combination approaches: mechanisms, biomarkers and clinical observations.” Nature reviews. Immunology, 10.1038/s41577-023-00973-8. 6 Dec. 2023, doi:10.1038/s41577-023-00973-8免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。分享，点赞，在看，聚焦全球生物医药健康创新

摘要患者对信使核糖核酸(mRNA)疫苗表现出良好的耐受性，编码分子的选择是灵活多样的。这些疫苗可以被设计成表达包含多个表位的全长抗原，而不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制，相对容易控制，并且可以快速批量生产。美国食品药品监督管理局(FDA)于2021年批准了辉瑞和BioNTech生产的首个基于mRNA的新型冠状病毒病(COVID-19)疫苗，引发了mRNA疫苗研发热潮。基于上述特点和mRNA疫苗的发展，尤其是近五年来，mRNA肿瘤疫苗已成为研究热点，发展迅速。本文从抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用、不同给药途径和临床前评价等方面对mRNA肿瘤疫苗的研究进展进行了分析，以反映mRNA肿瘤疫苗的发展趋势和面临的挑战。关键词：mRNA，癌症疫苗，肿瘤相关抗原，新抗原，mRNA递送载体，佐剂，给药途径。1.mRNA疫苗和mRNA癌症疫苗1961年，Brenner等人首次发现mRNA，它是基因作为蛋白质表达所必需的关键中间分子，含有与氨基酸(蛋白质的基本单位)相对应的密码子信息。1990年，Wolff等人首次证明，通过肌肉注射编码相应蛋白的纯RNA，可以在小鼠体内有效表达特定蛋白[如氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶(Luc)]；具体来说，βgLucβgAn RNA的蛋白表达以剂量依赖性和时间依赖性的方式发生；这项工作还提出了mRNA疫苗的概念。2020年，美国食品和药物管理局(FDA)紧急批准了Pfizer--BioNTech/BNT162b2和Moderna/mRNA-1273生产的两种基于mRNA的疫苗，用于预防2019年冠状病毒病(COVID - 19)。2021年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了Pfizer-BioNTech(上市名称为Comirnaty)生产的首个COVID-19疫苗，激发了mRNA疫苗的研发热情，并对mRNA癌症疫苗的突破产生了期待。迄今为止，研究人员已将mRNA用作疫苗平台[例如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、冠状病毒、病毒抗原(狂犬病病毒糖蛋白、寨卡病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的蛋白质)，细菌病原体(结核分枝杆菌)和癌症]和蛋白质替代平台(例如factor IX、卵泡抑素、鸟氨酸经甲氨基甲酰基酶和促红细胞生成素)，用于疾病的预防和治疗。mRNA疫苗具有许多共同特征。与质粒脱氧核糖核酸(DNA)和病毒载体存在因基因插入和/或感染而导致突变的风险不同，mRNA进入细胞质后可直接翻译成蛋白质；因此，mRNA疫苗是非整合的、非传染性的、耐受性良好的。mRNA也在细胞中短暂表达，允许重复接种。mRNA转录物中编码单位的选择是灵活多样的，允许编码抗原和免疫调节分子来诱导和调节适应性和先天免疫应答，并且含有多个表位的编码全长抗原可以由MHC Ⅰ类(MHC-Ⅰ)和Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子呈现，而不受MHC限制。体外转录(IVT) mRNA的生产不需要细胞，防止了蛋白质或病毒的污染，并允许快速、经济和容易的大规模生产。mRNA癌症疫苗利用编码肿瘤抗原或免疫调节分子的mRNA递送相应的蛋白，结合相关的递送载体和佐剂，诱导抗肿瘤应答。图1显示了mRNA癌症疫苗的发展时间表。抗肿瘤T细胞是介导这些疫苗治疗效果的主要预期效应细胞，图2总结了抗肿瘤T细胞产生和作用的机制。RNA在疫苗位点被DCs摄取，翻译并加工成抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物并呈递到细胞表面。活化的DCs到达引流淋巴结，呈递的抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物与淋巴结内分化簇8 (CD8)+/CD4+ T细胞(第一信号)表面的T细胞受体(TCR)结合，导致T细胞活化和增殖，共刺激信号分子[如CD80/CD86, OX40配体(OX40L)]与受体(如CD28, OX40)在T细胞(第二信号)和细胞因子[如干扰素(IFN) I，白细胞介素12 (IL-12)， IL-1]与T细胞上的细胞因子受体结合(第三信号)。此外，CD4+ T细胞分泌的IL-2可促进CD8+ T细胞扩增。活化的T细胞在趋化因子[如CC -趋化因子受体7，CC -趋化因子配体(CCL) 5，CXC -趋化因子配体9/10]的作用下向肿瘤组织迁移并浸润，最大限度地发挥其分泌的效应器[如IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、穿孔素、颗粒酶]的抗肿瘤作用。内源性抗原主要通过MHC-Ⅰ分子呈递激活细胞毒性CD8+ T细胞，外源性抗原主要通过MHC-Ⅱ分子呈递激活辅助CD4+ T细胞。细胞毒CD8+ T细胞通常对靶细胞具有很强的直接杀伤作用，这些细胞是癌症疫苗预期诱导的主要效应细胞。2.mRNA癌症疫苗在临床前和临床研究中的进展疫苗的核心作用是提供能被人体免疫细胞识别的抗原，从而引发免疫反应。抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用以及给药途径是疫苗设计中需要考虑的关键因素。表1总结了这些因素的进展在临床前和临床设置。表2总结了2016年至2021年期间使用基于mRNA的癌症疫苗的临床试验。2.1.选定抗原或靶标2.1.1.肿瘤相关抗原研制肿瘤疫苗的第一步是抗原的选择，抗原应具有较高的肿瘤特异性，并能诱导强而可控的抗肿瘤T细胞反应。肿瘤抗原根据其组织分布、表达水平和中枢耐受状态可分为TAAs和TSAs。TAAs在肿瘤中普遍过表达，在正常组织中也有表达，肿瘤特异性弱，中枢耐受性强，免疫原性弱，主要包括组织分化抗原和癌胚抗原。TAAs的中枢免疫耐受是利用这些抗原开发癌症疫苗的主要挑战。使用多个(如2-6个)共享TAAs的组合已成为临床开发靶向mRNA癌症疫苗的趋势。所选择的TAAs通常在相关肿瘤中广泛表达，当与不同的载体或佐剂结合时，可以诱导抗肿瘤免疫反应。2009年，Weide等人对鱼精蛋白(RNActive®)保护mRNA癌症疫苗进行了1/2期临床研究，采用GM-CSF作为佐剂，编码6种TAAs (Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-A1、MAGE-A3和生存素)。这种疫苗是皮内注射。该疫苗显著降低了免疫抑制细胞(如外周血中的Foxp3+/CD4+调节性T细胞(Tregs)和骨髓抑制细胞)，并增加了一部分患者的特异性T细胞。1例接受治疗的患者完全缓解，未发生大于Ⅱ级的不良反应(NCTO0204607)。2011年，Fotin-Mleczek等人对编码卵白蛋白(OVA)/PSMA/STEAP和PSMA的蛋白蛋白复合物mRNA癌症疫苗进行了临床前研究。结果表明，双组分mRNA肿瘤疫苗可通过TLR7诱导自佐剂作用，平衡适应性免疫反应，并具有持续的抗肿瘤作用(NCT00831467,NCT00923312)。2014年，Fotin-Mleczek 等人研究表明，蛋白复合OVA -编码mRNA的癌症疫苗与临床前放疗联合使用具有较强的协同抗肿瘤作用。编码4-5种前列腺特异性抗原[如CV9103 (NCT00831467)和CV9104 (NCT01817738)]或5-6种黑色素瘤和非小细胞肺癌TAAs[如CV9201 (NCT00923312)和CV9202 (NCT03164772)]的蛋白复合物肿瘤疫苗正在临床试验中。BN111是一种mRNA癌症候选疫苗，编码4种TAAs (NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE)的固定组合，这些TAAs在黑色素瘤中普遍存在，并作为RNA -脂质复合物制剂(Lipo - MERIT)递送。BNT111单独或联合免疫检查点PD-1抑制剂可诱导不可切除黑色素瘤患者持续和强抗原特异性CD4+ / CD8+ T细胞反应和客观反应。超过5%的患者发生了相关不良事件，大多数不良反应为1-2级(NCT02410733)。基于这些结果，BNT111已获得FDA快速通道指定用于临床转化治疗晚期黑色素瘤(NCT04526899)。Lipo-MERIT mRNA癌症疫苗编码3个针对OC的TAAs (NCT04163094)， 5个针对PC的TAAs[如BNT112 (NCT04382898)]，或针对HNSCC和HNC的共享癌症抗原的固定组合[BNT113 (NCT04534205)]，目前正在临床试验中。AML和骨髓瘤mRNA肿瘤疫苗的临床翻译也呈现出从单一TAA的应用[如WT1 (NCTO0834002、NCT00965224、NCTO1291420)]到多个TAA的联合应用[如WT1、PRAME、CMV pp65、癌睾丸抗原7、MAGE-A3 (NCTO1734304、NCT02405338、NCT01995708)]的趋势。研究发现，在43%的化疗后缓解的AML患者中，经WT1 mRNA电穿孔的DCs可预防或延迟复发(NCT00965224)，改善的总生存率(OS)率或临床反应与诱导WT1特异性CD8+ T细胞反应(NCTO0965224, NCTO1291420)相关。TLR7 /8成熟DCs转染编码WT1、PRAME和CMV pp65的RNA可防止在完全缓解的AML患者亚群中复发(NCTO1734304)。mRNA肿瘤疫苗也在朝着个体化和精确化方向发展，初步趋势是从应用自体肿瘤[如AML (NCT00514189-已终止)、前列腺癌(NCT01197625)、NCT01278940、NCT008464562、NCT00961844-已终止]或肿瘤干细胞[如OC (NCT01334047-已终止)]衍生mRNA向采用个体化TAA 面板 (NCT01334047、NCT02709616、NCT02808364、NCT02808416)发展。负载完整肿瘤mRNA的DCs可以诱导针对肿瘤内广泛抗原的T细胞反应，甚至是患者独有的抗原(NCT01278940)。研究发现，用癌症干细胞衍生mRNA转染的树突状细胞可诱导患者产生免疫应答，并显示出有希望的初步安全性结果(NCT00846456)。含有3-13种不同TAA mRNA的个性化TAA面板脉冲DCs与良好的OS相关，并且治疗的患者没有出现Ⅲ/Ⅳ级不良事件(NCT02709616, NCT02808364, NCT02808416)。来源于自体肿瘤细胞或肿瘤干细胞的mRNA包含肿瘤细胞中的所有蛋白。这个策略简单可行，但其靶向性和有效性有待提高，同时也要考虑安全性。图1 mRNA癌症疫苗发展的时间轴。缩写：CART，电荷改变可释放转运体；CLAN，阳离子脂质辅助纳米颗粒；DCs,树突状细胞；DOTAP/DP7-C，1,2-二醇-3-三甲基丙烷氯/胆固醇改性阳离子肽DP7；LCP NPs，脂质/钙/磷酸（LCP）纳米颗粒；LPC，阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物；LNPs，脂质纳米颗粒；Mann,甘露聚糖；PGCP NPs，聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）/G0-C14/神经酰胺聚（乙二醇）（PEG）(PGCP) NPs；PSA，前列腺特异性抗原；ssPAlmE-PALA，脂质纳米颗粒和a-螺旋阳离子肽“KALA”；triMN-LPR，阳离子脂质体(L)-一种阳离子聚合物(P)-mRNA (R)，称为脂多聚体（LPR），通过A-D-甘露聚糖苷（triMN）的三天线功能化。2.1.2.肿瘤特异性抗原TSAs通常是由肿瘤细胞基因组中的非同义突变形成的肿瘤新抗原；这些抗原在正常细胞中不表达，具有很强的肿瘤特异性和免疫原性，中枢耐受性较弱。TSAs与抗肿瘤免疫反应之间的相关性已在多项研究中得到证实。对来自癌症基因组图谱的18个实体肿瘤数据中的数千个RNA序列的分析显示，每个肿瘤中新抗原的数量与T细胞细胞毒性活性相关基因的表达呈正相关。对来自癌症基因组图谱的515例患者的6个位点的RNA-seq数据分析表明，高水平的免疫原性突变表位与患者生存率的提高有关。具有高水平免疫原性突变的肿瘤具有更高水平的CD8A、PD-1和CTLA4。对619例结-直肠癌样本的全外显子序列分析表明，肿瘤中高水平的新抗原与肿瘤浸润淋巴细胞的增加和生存率的提高相关。在子宫内膜癌中也证实了新抗原水平与肿瘤浸润淋巴细胞数量之间的关系。此外，发现具有高水平新抗原的肿瘤比具有低水平新抗原的肿瘤具有明显的同质性。突变负荷大于每百万碱基10个体细胞突变的肿瘤(相当于表达基因中150个非同义突变)更容易形成免疫原性新抗原，而突变负荷小于每百万碱基1个体细胞突变的肿瘤不太可能形成免疫原性新抗原。大多数肿瘤的突变负荷为每百万碱基1-10个体细胞突变，通常可以形成T细胞识别的新抗原。Rajasagi等人利用全外显子测序和HLA -肽预测结合算法(即NetMHCpan)分析了13种不同肿瘤(2488个样本)的预测突变HLA-结合肽，结果表明每个肿瘤都可以产生数万到数千个新抗原，这表明新抗原在大多数肿瘤中是常见的。图2 mRNA癌症疫苗的作用机制图mRNA癌症疫苗的流行趋势是向个体化和精密度发展，旨在开发使用多种(20种)新抗原的mRNA癌症疫苗[如，IVAC MUTANOME (NCTO2035956)、IVAC_W_brel_uID和IVAC_W_brel_uID/IVAC_M_uID (NCT02316457)、RO7198457(NCT03289962、NCT04161755、NCT03815058、NCT04486378)、mRNA-4157 (NCT03313778、NCT03897881)、NCI4650/mRNA4650 (NCT03480152)、NCT03468244、NCT03908671]。2015年，Kreiter等人通过外显子组测序和MHC-Ⅱ表位预测结合算法分析了小鼠肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞系B16F10、结肠癌细胞系CT26和乳腺癌细胞系4T1)中的突变肽，并制备了编码这些突变肽的RNA疫苗，在临床前评估它们的抗肿瘤作用。多新表位RNA在体内有效诱导T细胞应答，抑制小鼠肿瘤的生长和转移，大部分免疫原性突变体被CD4+ T细胞识别；即使RNA只编码一个新表位(如B16-M30)，也能诱导更强的T细胞反应，并控制小鼠B16F10黑色素瘤的生长。Zhang等人对DOTAP/DP7-C脂质体进行了临床前研究，DOTAP/DP7-C脂质体作为载体和佐剂，装载了编码小鼠LLC细胞系LL2 (DOTAP/DP7-C/LL2)五种肿瘤新抗原的mRNA。DOTAP/DP7-C/LL2显著抑制原位和皮下LL2肿瘤的生长，刺激抗原特异性淋巴细胞反应。2017年，Sahin 等人发现基于RNA的多重新表位疫苗可诱导黑色素瘤患者的抗原特异性多克隆T细胞免疫反应；选择的新表位中有60%具有免疫原性，这些新表位诱导的主要T细胞反应是CD4+ T细胞反应，肿瘤转移明显减少，约75%的患者无进展生存期为27个月(NCT02035956)。2020年，Cafri等人发现编码20种新抗原的NCI4650/mRNA-4650可在胃肠道肿瘤患者中诱导新抗原特异性T细胞反应；选择的新抗原中有21%是免疫原性的，来自患者的新抗原特异性T细胞中有59%是CD4+ T细胞(NCT03480152)。虽然mRNA的制备是快速和经济的(良好生产规范级RNA可在3周内制备)，但肿瘤新抗原的筛选和鉴定可能需要很长时间和昂贵，并且在疫苗制备过程中患者的病情可能发生变化，导致研究人员错过了患者的最佳治疗机会。基于高通量和生物信息学技术对基因深度测序和大数据集蛋白质组学分析的参数，治疗性肿瘤新抗原肽疫苗、RNA疫苗和融合DC -肿瘤细胞疫苗的制备时间分别约为160天、114天、103(89-160)天和10天。新抗原的筛选和鉴定速度直接影响mRNA新抗原疫苗的临床疗效，是mRNA新抗原疫苗面临的一大挑战。同时，肿瘤新抗原预测的准确性有待提高。表1 mRNA癌症疫苗在临床前和临床设置的概述2.1.3.免疫调节分子与肿瘤抑制基因编码CD70、CD40配体和组成活性TLR4的mRNA(命名为TriMix, NCT03788083)；编码人OX40L、IL-23和IL-36γ的mRNA(命名为mRNA-2752, NCT02872025，NCTO3739931)；和编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA(命名为SAR441000/BNT131、NCT03871348)是编码免疫调节分子的三种具有代表性的mRNA癌症疫苗，这类疫苗还包括编码TLR7/8激动剂和RIG-1激动剂的mRNA疫苗(CV8102/ RNA佐剂®、NCT03291002、NCT03203005)；mRNA编码OX40L [mRNA-2416 (NCT03323398)]；mRNA编码IL-12[MEDI1191 (NCT03946800)， BNT151 (NCT04455620)]；mRNA编码IL-12和IL-7 (BNT152, BNT153，NCT04710043)；和编码BisCCL2/5i的mRNA。一些研究表明，编码免疫调节分子(如TriMix，mRNA-2752，BNT131和mRNA编码BisCCL2/5i)和肿瘤抑制基因(如PTEN或p53编码mRNA)的mRNA癌症疫苗作为单一疗法也具有抗肿瘤作用，通常与多种肿瘤抗原(如MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶、gp100、生存素、hTERT和新抗原)和免疫检查点抑制剂(如抗PD-1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合用作辅助治疗。2012年，Van Lint等人发现，结节内注射TriMix和TAA(如TRP2/WT1/P1A) mRNA可诱导DCs成熟并原位启动抗原特异性T细胞。与不加佐剂的荧光素酶(FLuc) mRNA脉冲DCs相比，TriMix显著降低了DCs中FLuc的表达，且LPS、单磷酰脂质A、聚(I:C)诱导的降低作用更强；而TriMix可以产生免疫刺激环境来改善T细胞反应，优于LPS。2016年Bialkowski等人发现HPV16-E7-TriMix mRNA可诱导CD8+ T淋巴细胞向肿瘤粘膜迁移，控制肿瘤生长。当与顺铂联合使用时，HPV16-E7-TriMix mRNA通过下调髓源性抑制细胞(MDSCs)和Tregs的数量来抵抗免疫抑制微环境，导致生殖道肿瘤完全消退。在多种小鼠肿瘤模型中，瘤内注射TriMix已被肿瘤浸润的树突状细胞吸收，然后呈交给肿瘤引流淋巴结的T细胞，诱导抗肿瘤T细胞反应和抗肿瘤作用。2013年和2016年，Wilgenhof等人发现，与TriMix共电孔的DCs和编码四种与HLA Ⅱ靶向信号(DCLAMP)(命名为TriMixDC-MEL)相关的黑色素瘤相关抗原(MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶或gp100)之一的mRNA，在预处理的晚期黑色素瘤患者中具有良好的耐受性，并在两名患者(NCT01066390)中引起完全缓解和部分缓解。TriMixDC-MEL联合免疫检查点抑制剂(ipilimumab)在预先治疗的晚期黑色素瘤患者(NCTO1302496)中耐受并诱导高度持久的肿瘤反应。2020年，De Keersmaecker等人研究表明，在相当一部分晚期黑色素瘤患者中，TriMixDC-MEL和ipilimumab联合使用可诱导有效的CD8+ T细胞反应，并与患者的临床反应相关(NCTO1302496)。2019年Hewitt发现，在瘤内注射包裹在LNPs中的编码IL- 23、IL-36γ和OX40L的三联体mRNA，可以激活并招募多种免疫细胞(例如DCs和T细胞)进入肿瘤，从而诱导依赖于Batf3的交叉呈递DCs和细胞毒性CD8+ T细胞的持久抗肿瘤免疫。该疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用，在体内抗免疫检查点抑制剂模型中具有强大的抗肿瘤作用。2021年，Hotz等人发现BNT131联合抗PD -1抗体可显著提高荷瘤小鼠(如B16和MC38荷瘤小鼠)的生存率。2021年，Wang等人发现编码BisCCL2/5i LNPs的mRNA与编码PD-1配体抑制剂LNPs的mRNA联合可显著延长荷瘤(如原发性肝癌、结直肠癌和胰腺癌的肝转移)小鼠的生存期，且BisCCL2/5i可促进这些肿瘤对PD-1配体抑制剂的敏感性。表2 2016-2021年期间关于mRNA癌症疫苗的临床试验一些临床前研究表明，使用编码肿瘤抑制基因(如PTEN和p53)的mRNA治疗肿瘤是可行的。2018年，Islam等人研究发现，负载抑癌基因PTEN编码mRNA的聚脂包被多聚脂杂交NPs(如mRNA- pgcp NPs)可在体外和体内有效转染PTEN基因缺失的前列腺癌细胞，并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶Akt通路促进癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长。2021年，Lin等人发现肿瘤抑制基因PTEN编码mRNA NPs可诱导PTEN突变的黑色素瘤细胞和PTEN缺失的前列腺癌细胞自噬和死亡。PTEN-mRNA NPs上调免疫抑制TME中的CD8+ T细胞和促炎细胞因子(如IL-12、TNF-α和IFN-γ)，下调Tregs和MDSCs，并与抗PD -1抗体联合对这些肿瘤产生有效的抗肿瘤作用。2019年，Kong 等人研究发现肿瘤抑制基因p53-编码mRNA NPs可促进p53缺失型肝细胞和NSCLC细胞对哺乳动物雷帕霉素抑制剂靶点(依维莫司)的敏感性，且p53-mRNA NPs与依维莫司联用在体外和体内肝癌和NSCLC模型中具有显著的协同抗肿瘤作用。编码p53和肿瘤抗原(如生存素、hTERT、新抗原)的mRNA癌症疫苗目前正处于临床试验阶段(NCTO0978913、NCT02316457)。2.1.4. mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的联合研究肿瘤发展过程中对TAAs的中枢免疫耐受和外周免疫耐受(如免疫检查点通路，TME)是癌症疫苗面临的两大挑战。两者都会影响癌症疫苗的效力和持续时间。为了靶向中枢免疫耐受，多个TAAs或多个TSAs的组合是mRNA癌症疫苗发展的主要趋势。为了靶向外周免疫耐受，将mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用是mRNA癌症疫苗应用的另一个主要趋势。2018年，Liu等人对负载MUCI mRNA的LCP NPs联合抗-CTLA-4抗体治疗TNBC进行了临床前评估，结果表明LCP-mRNA NPs作为单一疗法或联合治疗的一部分(LCP-mRNA NPs + 抗-CTLA-4)可显著抑制肿瘤生长，且联合治疗的抑制效果明显强于LCP-mRNA NP单疗法。Wang等人研究表明，同时装载编码黑色素瘤相关抗原TRP2的mRNA和靶向PD-L1的小干扰RNA的LCP NPs可以在体外和体内有效地将mRNA传递到DCs中，并促进DCs的成熟。靶向PD-L1的小干扰RNA下调DCs中PD-L1的表达，增强抗肿瘤免疫和抗肿瘤作用，疫苗有效抑制肿瘤生长。2019年，Verbeke等人研究表明，单独使用Galsomes mRNA的体内抗肿瘤作用不明显，这种治疗可以增加免疫微环境中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、不变性NKT (iNKT)、NK和M1肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的数量；这些作者还发现，治疗对PD-1/PD-L1通路的负调控可能会限制其抗肿瘤作用。与单独接种疫苗相比，结合OVA mRNA Galsomes和抗PD-L1抗体显著增加脾脏iNKT细胞数量，降低脾脏DC细胞上PD-L1水平和脾脏增生iNKT细胞上PD-1水平，显著提高抗肿瘤效果。此外，Oberli等人表明，含有编码单一肿瘤抗原(例如gp100或TRP2)的mRNA的lnp和使用这两种抗原的序贯治疗在体内均具有显著的抗肿瘤作用；但两种方法的抗肿瘤作用无显著性差异。2.2.抗原或目标的表达2.2.1. mRNA分子的药效学用于制备疫苗的mRNA主要包括常规的非复制mRNA和病毒衍生的自扩增mRNA。mRNA的IVT是制备分子的主要技术，利用噬菌体RNA聚合酶(如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)和含有目标抗原序列的线性化DNA模板。非复制性IVT mRNA的基本结构包括一个编码目标蛋白的开放阅读框(ORF)、一个位于5'和3'非翻译区(UTRs)两侧的7-methylgaunosine 5'帽和一个3' poly(A) 尾。5'帽和3'poly(A)可以在IVT过程中添加，也可以在初始IVT后酶促添加。自我扩增的mRNA包含两个ORFs，一个编码目标抗原序列，另一个编码病毒复制机制，从而实现持久的细胞内RNA扩增。一种由编码CEA的甲病毒复制子组成的mRNA疫苗(称为AVX701)正在临床试验中(NCTO0529984, NCTO1890213)。与蛋白质或肽疫苗不同，mRNA癌症疫苗产生效果的第一步是编码蛋白的序列信息可以翻译成功能蛋白。影响翻译过程的因素包括正调节因素、负调节因素和双向调节因素。正调控因子总结如下:①5′帽及其修饰物[如抗反向帽类似物CleanCap]可招募真核翻译起始因子4E，促进核糖体识别和翻译起始，消除mRNA序列中的游离磷酸基团，显著增强mRNA的稳定性。②poly(A)序列及其修饰(如长度’)可以减缓RNA外切酶的降解过程，从而增加稳定性，延长体内半衰期，提高mRNA的翻译效率。③UTR优化[例如，由a-珠蛋白和β-珠蛋白衍生的3' UTR序列，AU和GU-富集序列；3' UTR中的稳定元素；5' UTR中的GCC-(A/G)- CCAUGG，短而松散的5' UTR135]和ORF的密码子优化(如尿苷的缺失，G:C含量的富集，同义频繁密码子，具有较高转移RNA丰度的密码子)可以提高mRNA的稳定性和蛋白质翻译。表达载体中的表位通过不同的序列和信号肽(例如，内核/溶酶体信号分选片段和跨膜-细胞质结构域)连接，以增加IVT，提高抗原在细胞内加工和呈递的靶向性。④核苷修饰[如假尿嘧啶(Ψ)、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基胞苷(5meC)和n -乙酰胞苷修饰转录后RNA]和纯化IVT-mRNA(如Mg2+31、温度、高压液相色谱和快速蛋白液相色谱)以减少双链RNA的污染，可以降低分子的先天免疫激活，增加蛋白质翻译。与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA (5meC, Ψ)可显著促进小鼠FLuc的表达。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用明显强于LCP(未修饰mRNA)。负调控因素包括:①细胞外RNases酶能快速降解裸mRNA。②IVT产生的双链RNA杂质可以结合细胞质中的模式识别受体(PRRs)[如RIG - Ⅰ，黑色素瘤分化相关蛋白5 (一种RIG -Ⅰ受体)，蛋白激酶RNA激活(也称为真核翻译起始因子2 alpha激酶2)，2'-5'-寡腺苷酸合成酶]和内体(如TLR3)来激活特定途径[如RIG -Ⅰ /MAD5→线粒体抗病毒信号蛋白→IFN Ⅰ，(IFN Ⅰ→)蛋白激酶RNA激活→真核翻译起始因子2alpha， (IFN Ⅰ→)2′5′-寡聚腺苷酸合成酶→核糖核酸酶L, TLR3→含有Toll/IL-1受体结构域的适配器诱导IFN-β→IFN Ⅰ]，可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解。双向调节因子包括未修饰的单链RNA作为病原体相关分子模式(PAMP)，它可以结合内体中的PRRs[如TLR7, TLR8]来激活特定途径(TLR8→髓样分化因子88→促炎细胞因子；TLR7→骨髓分化因子88→干扰素调节因子7→IFN Ⅰ)。一方面，mRNA可以激活先天免疫反应(DC成熟和激活)，进而激活适应性免疫反应(T和B细胞免疫反应);另一方面，过早和过度激活IFN Ⅰ可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解，促进DC和T细胞凋亡。过度强烈的炎症反应也会引起毒副作用。在T细胞中，Ⅰ型IFN受体信号的激活先于TCR信号的激活，可作为促进免疫应答的真正第三信号。Udhayakumar等人表明，与含有未修饰mRNA的RALA mRNA纳米复合物相比，含有Ψ-和 5meC-修饰mRNA的mRNA纳米复合物诱导了有效的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，并且具有优越的疗效，修饰的(5meC，Ψ) mRNA纳米复合物通过抑制IFN-β活化显著降低了Ⅰ型IFNs对CTLs的抑制作用，并有效诱导了CTLs。相比之下，Oberli等人表明，未修饰mRNA LNP疫苗在外周血中诱导的CD8 T细胞应答(7.8%)比核苷修饰mRNA (5meC，Ψ) LNP疫苗(1.0%)强得多，并表明Ⅰ型干扰素是保护性CD8 T细胞应答所必需的。这些相互矛盾的结果可能与双向调节因素有关。2.2.2.疫苗抗原表达方法根据抗原的表达，疫苗可分为多肽或蛋白质疫苗、细胞疫苗(如肿瘤细胞疫苗、DC疫苗和工程细胞疫苗)、核酸疫苗(如DNA和RNA疫苗)和病毒载体疫苗。肽或蛋白疫苗是广泛使用的疫苗类型。抗原肽的序列定义明确，易于控制。肽疫苗包括短肽疫苗和长肽疫苗。短肽疫苗有一些缺点，包括蛋白质水解导致抗原降解和免疫反应持续时间较短，短肽可以结合许多核细胞表面的MHC Ⅰ分子，这些核细胞作为非专业抗原呈递细胞APCs)，通常不含共刺激信号，导致抗原耐受和T细胞功能障碍。长肽疫苗通常含有20-30个氨基酸，可激活CD4+和CD8+ T细胞。蛋白质疫苗也能诱导T细胞反应；然而，长肽通常比蛋白质更有效地被APCs内化和加工。长肽疫苗的缺点包括对酶降解的敏感性、快速清除和注射部位吸收不足。细胞疫苗主要包括癌细胞疫苗和DC疫苗。癌细胞疫苗是用自体或异体灭活的全细胞及其衍生物(如细胞裂解物、DC融合衍生物、表达TSAs或免疫增强因子的修饰全细胞和肿瘤衍生mRNAs)，它们通常包含细胞的所有抗原，在疫苗设计和生产之前不需要费力地鉴定，从而导致相对快速的制备和某些个性化特征。然而，使用癌细胞的方法不能准确地测定和控制相应的肿瘤抗原，质量控制困难，而且癌细胞往往含有较少的特异性抗原，导致免疫原性较弱和潜在的致癌性。DCs是最有效的APCs，在连接先天和适应性免疫反应中起着核心作用。DC疫苗一般使用自体DC作为载体来表达和呈递抗原。1996年，Boczkowski等人证明了使用肿瘤来源的mRNA癌细胞脉冲DCs的可行性。2017年之前，在大约24项临床试验中，mRNA癌症疫苗使用DCs作为载体。然而，DC疫苗的制备工艺复杂，生产昂贵，质量控制困难。此外，患者必须具有相对正常的免疫功能，没有化疗或其他治疗引起的骨髓抑制，并提供大量功能性DCs，导致可用疫苗数量有限。核酸疫苗是用编码抗原的核酸(如DNA、RNA)制备的。mRNA疫苗的特点已在本文第1部分进行了描述。与mRNA相比，DNA必须进入细胞核才能翻译成相应的抗原，这有插入突变引起的潜在风险，可能比mRNA更不安全。总的来说，核酸对降解敏感，不稳定，半衰期短，导致裸核酸被APCs吸收的效率较低。新的载体和给药途径。用于提高核酸的吸收和呈递效率(下文讨论)。有限的研究表明mRNA癌症疫苗与肽或蛋白癌症疫苗相比具有抗肿瘤优势。用体外合成的鸡OVA RNA脉冲的DCs比用OVA肽脉冲的DCs在体外刺激OVA特异性的初级CTL反应更有效。在原位治疗性肿瘤模型中，DOTAP/DP-C/mRNA编码5种新抗原在诱导脾脏产生活化T细胞(CD3+ CD8+ IFN-γ+)方面明显强于DOTAP/DP-C/突变肽。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用显著强于LCP (TRP2肽/CpG)。编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs提高MC38-S荷瘤小鼠存活率的能力明显强于相应的蛋白处理。肽抗原通常只含有一个表位，而mRNAs编码的全长抗原含有多个表位，可以诱导T细胞靶向这些表位，产生更强的抗肿瘤作用。病毒载体疫苗是利用病毒作为表达或呈递抗原的载体制备的。目前，被广泛研究的病毒载体包括痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。出于安全考虑，采用复制缺陷病毒或减毒病毒。痘病毒可包含多个基因，复制和转录仅限于细胞质，插入突变的风险较低，表达产物可呈现MHC Ⅰ和Ⅱ。非禽类痘病毒可以诱导宿主产生免疫反应，从而使其只能使用一种或最多两种疫苗。重组鸟痘病毒可以多次接种，其病毒外壳蛋白不能在哺乳动物细胞中产生，并且病毒不能诱导宿主产生免疫反应来中和病毒。重组腺病毒载体易于设计，作为疫苗和基因治疗药物的载体已显示出实用性；然而，它们的免疫原性会影响疫苗的效果。疱疹病毒有广泛的宿主范围；可感染神经细胞、外周血单核细胞和DCs；并且具有复制周期短、容量大、安全性相对较好的特点。此外，其他载体，如细菌和酵母，在临床前研究中显示出作为疫苗载体的潜力。总的来说，免疫原性、致癌性、传染性、包装能力有限和病毒载体生产困难是广泛应用的挑战。2.3.mRNA癌症疫苗的载体开发具有良好的安全性、靶向性、稳定性、自佐剂效应、负载能力和通用性的mRNA递送载体，能够高效、持续地递送和呈递抗原，激活APCs，是mRNA肿瘤疫苗领域的一个基本方向。mRNA肿瘤疫苗在临床前采用的载体如表3所示。mRNA癌症疫苗中使用的主要载体之一是脂质体及其衍生物。1995年，Conry等人显示了编码人CEA复合物的脂质体mRNA的体液免疫原性，首次在临床前研究中证实了mRNA癌症疫苗的概念验证。甘露糖可以与DCs表面表达的甘露糖受体结合，利用靶向DCs的载体促进mRNA的高效传递和转染。2011年，Perche等人研究表明，携带mRNA的Man11-LPR100转染DCs的效率是无糖LPR100的4倍，并且在体内具有更好的抗肿瘤作用。由于甘露糖与其受体之间的结合力较弱，增加载体表面甘露糖的密度可能是提高甘露糖修饰LPR递送效率的有效途径。2018年，Le Moignic 等人研究表明，与单甘油三酯- LPR相比，三甘油三酯- LPR可以更有效地诱导抗原转染，通过在注射部位诱导局部炎症反应，将更多的DCs招募到引流淋巴结，并更有效地诱导抗原特异性免疫反应。2018年，Wang 等人利用甘糖醇偶联物(MPn-CHs)制备了DCs靶向脂质体(MPn-LPs)作为mRNA载体，结果表明MP1000-LPs负载mRNA (MP1000-LPX)具有良好的转染效率，MP1000-LPX主要通过增强DCs上甘糖受体(如CD206)的表达来增强mRNA的表达。2020年，Son等人研究表明，采用多糖包被二氧化硅纳米颗粒制备的Mann -capsules可以通过Dectin-2或TLR-4激活骨髓源性树突状细胞(BMDC)，且Mann -capsules促进BMDC分化和成熟的能力明显强于PEI或脂质体；此外，PEI和脂质体具有高毒性。LNPs似乎是一种很有前途的mRNA癌症疫苗载体。LNPs的成分主要包括可电离脂质，促进mRNA的自组装和内体释放；磷脂，支持脂质双层结构；胆固醇，一种稳定剂；脂质锚定聚乙二醇，延长配方的半衰期。还考虑了筛选和鉴定这些媒介的高通量技术。2017年，Oberli 等人构建并优化了LNP库，发现含有编码肿瘤抗原的mRNAs(如gp100和TRP2)与LNPs作为佐剂结合，可有效诱导抗原特异性CD8+ T细胞，抑制肿瘤生长，延长小鼠OS。2018年，McKinlay等人对基于两亲性CARTs的mRNA载体库进行了高通量筛选研究，结果表明，与单一CART或脂质体 2000相比，双CART可将体外淋巴细胞mRNA转染效率提高9倍；体外mRNA转染效率为80%，小鼠淋巴细胞mRNA转染效率为1.5%。2019年，Miao等人建立了一种高通量的可电离类脂质构建技术，可在一天内合成数千种脂质制剂，并使用DCs(如HeLa细胞、BMDCs或骨髓源性巨噬细胞)高通量评估LNPs的转染效率。结果表明，mRNA LNPs通过干扰素基因通路的胞内刺激物诱导APC成熟，增强抗肿瘤作用。2021年，Meng等人发现含有CpG核心的VLVPs可以促进DC成熟和抗原呈递、抗原特异性CD8+ T细胞在淋巴器官中的增殖和肿瘤中的T细胞浸润，并减少免疫抑制细胞(如肿瘤相关骨髓源性抑制细胞和表达精氨酸酶1的抑制性DCs)。以LNPs为载体的mRNA癌症疫苗[如编码新抗原的mRNA-4157 (NCTO3313778、NCTO3897881)和编码突变蛋白的V941 (NCT03948763)]目前正处于临床试验阶段。多阳离子肽鱼精蛋白和DCs是mRNA癌症疫苗中采用的另外两种主要载体。鱼精蛋白和DCs的特点及其作为mRNA癌症疫苗载体的研究进展分别见第2.1.1节和2.2.2节。鱼精蛋白可以保护mRNA不被血清RNA酶降解，促进mRNA的传递。此外，鱼精蛋白可与脂质体联合使用(例如，阳离子脂质体-鱼精蛋白，LPC和VLVP)。2000年，Hoerr等人发现脂质体包裹的浓缩RNA-肽复合物可诱导抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，裸RNA和蛋白蛋白保护的RNA在体内均可诱导特异性免疫反应，而受保护的RNA在体外稳定时间较长。Mai等人的研究表明，携带细胞角蛋白19编码mRNA的LPC经鼻递送可诱导小鼠APC成熟和强烈的细胞免疫反应，并降低肿瘤的生长。载体对疫苗的效力有关键影响。Phua等人表明，在没有NP载体的情况下，鼻内接种裸mRNA不能诱导抗肿瘤免疫反应。然而，临床前和临床研究都在综合考虑所选靶点、佐剂和递送方法的基础上证明了裸mRNA的可行性和有效性。发现FLT3可增强结内裸RNA的抗肿瘤作用。结内HPV16-E7-TriMix裸mRNA和瘤内TriMix裸mRNA均可诱导有效的抗肿瘤T细胞反应。结节内裸mRNA多重新表位疫苗诱导有效的抗原特异性T细胞免疫应答(NCT02035956)。2.4.佐剂在mRNA癌症疫苗的临床前研究中开发的一类主要佐剂[如LPS73, poly(I:C), Td, CpG]是PAMPs，它通过PAMP-PRR途径激活DCs，然后调节先天和适应性免疫反应。作为一种强效的回忆抗原，Td可通过CCL3106促进DC迁移，提高抗肿瘤作用。LPS辅助处理进一步提高了CD8+ T细胞水平和LNP mRNA诱导细胞的抗肿瘤活性。mRNA- CART联合CpG的体内抗肿瘤作用明显强于mRNA-CART和裸mRNA与CpG的联合，也强于mRNA-CART与TLR7配体或CD80 /86 mRNA的联合。大多数新型载体(如脂质样材料C1、DOTAP/ DP7-C、Mann-capsule、LNPs)兼具载体和佐剂的特性，其中一些载体具有佐剂的功能，类似于PAMPs。Mann -capsule通过Dectin-2或TLR-4激活BMDCs，葡聚糖-capsule通过CD206、CD209或巨噬细胞诱导的C型凝集素激活BMDCs。DP7-C、DOTAP和mRNA分别通过TLR2、TLR4和TLR7激活DCs。DOTAP/DP7C诱导DC成熟和抗原呈递的能力明显强于DOTAP、poly(I:C)和CpG。Cl或C1 mRNA可通过TLR4依赖的核因子κB信号通路促进BMDC活化，C1- OVA mRNA的体内抗肿瘤作用是TLR4依赖的CpG，因为VLVP中含有的佐剂，可以提高疫苗的效果，阻止PD-1在T细胞中的表达。然而，这些类PAMP佐剂可能影响mRNAs的翻译效率和降解，并具有潜在的毒性，如2.2.1节所述。开发既不影响mRNA翻译效率，又能积极调节多种先天和适应性免疫反应，促炎作用相对温和，毒性较低的新型佐剂已成为重要方向。TAA mRNA的免疫原性可以通过GM-CSF mRNA的共递送而增强。FLT3配体可促进浆细胞样DCs、经典DCs和NK细胞的扩增；诱导T辅助1型微环境；增强肿瘤内T细胞浸润及裸RNA的抗肿瘤作用。mRNA LNPs可通过刺激干扰素基因依赖性激活Ⅰ型IFN，诱导APC成熟，限制全身细胞因子表达，增强抗肿瘤作用。用于mRNA Galsomes的佐剂α-GC可通过DCs呈递激活iNKT细胞。活化的iNKT细胞可与DCs发生双向正调节作用，可正向调节NK细胞和免疫抑制细胞(如MDSCs和M1 TAMs)，不影响mRNA翻译效率，促进直接和间接的抗肿瘤作用。编码免疫共刺激分子的mRNA可用作佐剂(见2.1.3节)。TriMix (NCT01066390, NCTO1302496)；mRNA-2752 (NCT02872025)；mRNA编码人OX40L (mRNA-2416, NCT03323398)；编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA (BNT131，NCTO3871348)；编码IL-12的mRNA (MEDI1191，NCT03946800)；和mRNA编码的TLR7 /8激动剂和RIG-1-兴奋剂(RNA佐剂®)，NCT03291002，NCT03203005]正在临床试验中作为辅助治疗与免疫检查点抑制剂联合使用。表3 在临床前环境中用于mRNA癌症疫苗的递送系统概述2.5.给药途径给药途径直接影响疫苗的效力，mRNA癌症疫苗通常采用的给药途径包括静脉注射、皮内、皮下、肌肉注射、结内和肿瘤内给药。静脉注射允许更大的疫苗量和直接将疫苗输送到淋巴器官，但也有更大的系统性毒性风险。皮下注射疫苗的真皮含有APCs(如，DCs和巨噬细胞)以及血管和淋巴血管，但主要由致密结缔组织组成，导致通过皮内途径给药时疫苗量很小。皮内给药也可导致注射部位的不良反应(例如，肿胀、疼痛、红斑和瘙痒)。皮下注射疫苗的皮下区域含有比真皮更少的APCs；然而，它主要由脂肪组织的松散网络组成，允许通过皮下途径注射更大的注射量，从而引起更少的局部副作用(如疼痛)。肌肉注射疫苗的肌肉含有致密的血液网络，可以帮助招募和再循环不同类型的免疫细胞(如，浸润性APCs)到注射部位。肌内给药比皮内给药的注射量大，局部副作用也比皮内和皮下给药轻。结内注射疫苗的淋巴结含有多个APCs，结内给药具有较高的递送效率，允许小剂量的疫苗，但涉及复杂的程瘤内给药主要用于编码免疫共刺激分子的mRNA疫苗(例如TriMix, CV8102, mRNA-2752, mRNA-2416, BNT131和MEDI1191)作为免疫辅助治疗，也允许小剂量的疫苗，涉及复杂的程序。准确预测特定疫苗的最佳给药途径是困难的，建议通过直接比较研究来选择疫苗的最佳给药途径。结内注射的Luc-RNA在体内的转染效率优于皮内或皮下注射。经静脉注射OVA RNA复合DOTAP-DOPE诱导的CTLs杀伤作用优于皮内或皮下注射(静脉注射＞皮内注射＞皮下注射)。结内递送OVA mRNA联合TriMix诱导的抗原特异性T细胞的体内细胞毒性明显强于皮内递送疫苗。皮内接种E7 mRNA单糖化-LPR诱导的抗原特异性T细胞应答明显强于皮下接种。通过CART有效地将mRNA传递到APCs中(次要淋巴细胞APCs优先通过静脉注射靶向，而局部APCs通过皮下注射靶向)。肿瘤内三次给药的编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs的抗肿瘤作用显著优于同种药物的皮内或皮下给药；然而，在同一剂量下，通过这些途径的抗肿瘤效果没有显著差异，这表明对肿瘤疫苗的给药效果也与给药频率有关。鼻黏膜富含APCs和免疫细胞，临床前研究表明经鼻内注射的mRNA癌疫苗初步有效。鼻内接种mRNA纳米颗粒和鼻内递送LPC mRNA均可诱导抗肿瘤免疫应答。3.mRNA癌症疫苗的挑战和趋势迄今为止，已有数百种癌症疫苗进行了临床评估，美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种治疗性癌症疫苗[卡介苗 (TheraCys®)，一种牛分支杆菌减毒活株，用于治疗非肌肉浸润性膀胱癌；Sipuleucel-T (Provenge®)，一种用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的DC疫苗；以及用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤性疱疹病毒疫苗(talimogene laherparepvec, T-VEC) (Imlygic®)和两种预防性癌症疫苗(HPV疫苗和乙型肝炎病毒疫苗)。影响mRNA肿瘤疫苗研制的因素主要包括分子本身的内在因素和外部因素[如对肿瘤抗原的中枢耐受性(见第2.1.1节)、肿瘤和HLA的异质性以及肿瘤免疫微环境]。这些因素深刻地影响了mRNA癌症疫苗的发展。从内在因素来看，研究人员通过改进mRNA的结构和序列，改进mRNA的制备和纯化技术(见第2.2.1节)，开发新的传递载体(见第2.3节)，在一定程度上提高了mRNA癌症疫苗的有效性。肿瘤异质性的本质是肿瘤细胞的基因组异质性，导致抗原异质性，这是影响抗肿瘤T细胞反应产生的关键因素，也是开发个性化癌症疫苗的主要原因。HLA异质性主要是指个体间HLA分子类型的不同，导致个体间这些分子对肿瘤抗原的结合区域或结合亲和力存在差异，从而影响抗肿瘤T细胞反应的产生和强度。HLA异质性是由HLA等位基因在不同民族和地区人群中的多态性引起的。HLA Ⅰ等位基因包括9-11个常见超型，其覆盖率为90%。HLA-A loci (HLA-A等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101和A*2402)占HLA-Ⅰ等位基因的60%，HLA-B loci (HLA-B等位基因：B*0702、B*0801、B*2705、B*3501和B*5701)占这些等位基因的35%以上。TME由免疫细胞、间充质细胞以及多种细胞因子和组织因子组成，在肿瘤发生和免疫逃逸中起重要作用。大质量内的间质压力可减少大分子(如抗体)和效应细胞(如T细胞)的扩散。大多数实体瘤也缺乏T细胞共刺激分子。TME通常含有免疫抑制细胞，包括CD4+Tregs, MDSCs，抑制性CD8+T细胞，M2 TAMs和调节性NK/NKT细胞。这些免疫抑制细胞和TME中的肿瘤细胞可以释放大量可溶性的免疫抑制因子，包括转化生长因子β、IL-10、PD-L1、吲哚胺2,3-双加氧酶和血管内皮生长因子等，进入微环境。考虑到肿瘤和HLA的异质性，肿瘤新抗原疫苗的开发在理论上比TAA定向疫苗具有更强的特异性抗肿瘤作用和更弱的毒副作用，一直是癌症疫苗研究的主要热点(见2.1.2节)。鉴于肿瘤免疫微环境，开发基于免疫的联合疗法(例如，与佐剂或免疫检查点抑制剂联合)已成为癌症疫苗应用的一个关键趋势(见第2.1.4和2.4节)。4.讨论产品的临床前评价是进入临床转化的前提，合理的评价可以提高预测临床结果的可靠性。临床前评价所采用的参数、技术和方法是疫苗质量标准的重要组成部分。疫苗的临床前评价应充分阐明疫苗的作用和机制，而mRNA肿瘤疫苗临床前评价的重点是确定抗原特异性T细胞反应的产生(如T细胞的数量和活化)和效果(如T细胞的杀伤作用和抗原亲和力)。一般来说，在临床前评估中，定量的体外和体内试验用于评估mRNA癌症疫苗的效果和机制。根据目前对抗原特异性T细胞免疫应答的认识，评价参数主要包括①鉴定疫苗的理化特性；②mRNA转染APC的效率(如结合与摄取、内化与转运、表达与分布)；③APCs的分化、成熟和抗原提呈；④疫苗免疫刺激；⑤细胞免疫原性(如CTL的产生、增殖和靶细胞杀伤)；⑥体液免疫原性；⑦抗肿瘤作用及相关机制；⑧初步毒性（如细胞毒性、内脏毒性和溶血）。诸如颗粒大小、电荷、对mRNA的结合能力和负载率、稳定性(如时间、温度和血清稳定性)、聚乙二醇化和硬度等因素可影响抗原递送(如淋巴引流)。Son等人研究表明，尺寸为~220 nm的Mann-capsules具有良好的变形能力，通过50 nm孔膜后的回复率约为30%。与基于蛋白质或肽的疫苗不同，mRNA疫苗开发的第一步是确保mRNA序列中编码的信息能够有效地翻译成相应的蛋白质或肽。mRNA的体外和体内转染效率是mRNA疫苗临床前评价的重要参数，提高mRNA的转染效率是提高mRNA疫苗药效学的关键途径。然而，APCs的体外转染效率可能存在差异，DOTAP/ DP7 - 增加了绿色荧光蛋白mRNA在APCs(包括293T、JAWSII、DC2.4和BMDCs)中的体外转染效率分别为84.87±3.21%、12.23±1.35%、28.49±2.46%和14.51±2.35%。为了验证mRNA在体外和体内的转染效率，我们以多种APCs作为体外转染模型，在体内检测不同器官的多种APCs的mRNA转染效率。增强绿色荧光蛋白(FLuc)是实验中常用的转染蛋白。染料标记的mRNA或疫苗载体已广泛用于转染研究。共聚焦显微镜和流式细胞术常用于评估细胞内微转染(如递送、摄取和翻译)，共聚焦显微镜可更直观、准确地评估mRNA的翻译效率，交互式视频信息系统可用于评估全身或局部大转染(如分布、淋巴引流)。用于体内抗肿瘤活性评价的肿瘤模型主要包括治疗性或预防性皮下、原位和肺转移肿瘤模型，所建立的体内肿瘤模型应准确模拟人体病理。Bialkowski等人的研究表明TC-1肿瘤的TME可因肿瘤接种部位(即皮下、肺部和生殖道)的不同而有显著差异，这直接影响了E7-TriMix mRNA疫苗的抗肿瘤效果。在选择用于临床前评估的细胞或动物模型时，物种特异性是需要考虑的重要因素。为了获得更准确的评价信息，可以建立人源化动物模型。通过静脉注射人外周血单个核细胞(HLA-A2型)的CD34+造血干细胞建立的人源化小鼠，进入免疫缺陷NOD/ shi-scid IL-2Rγnull小鼠或C57BL/6小鼠，建立体内肿瘤模型(如结果表明，转染修饰的人CD133 mRNA的DCs处理人源化小鼠模型的中位生存期大于60天，转染修饰的小鼠CD133 mRNA的DCs处理同源小鼠肿瘤模型的中位生存期为38天。肿瘤疫苗理论上具有抗肿瘤复发和转移的作用，可以建立多种体内肿瘤模型进行评价，阐明这些疫苗在预防或治疗肿瘤转移或复发方面的优势。有效的抗肿瘤反应需要多个免疫细胞的协同作用，而不是单个细胞的作用。目前，大多数肿瘤疫苗的重点是诱导CD8+T细胞，但CD4+T细胞等免疫细胞在诱导和维持免疫记忆、增强CTLs的肿瘤杀伤作用中也发挥着重要作用。采用NKT配体(如α-GC)作为佐剂的mRNA Galsomes通过iNKT细胞诱导抗肿瘤作用。在含有CD4+和CD8+T细胞的培养系统中转染CD133 mRNA的DCs比仅含有CD4+或CD8+T细胞的培养系统中的DCs更有效地激活T细胞并杀死肿瘤靶细胞。也有人担心mRNA癌症疫苗的安全性和副作用。修饰后的mRNA可与血清蛋白结合形成血管闭塞，具有潜在的毒性。DOTAP/DP7-C mRNA具有良好的血清稳定性和较低的细胞毒性；然而，Lipo2000和PEI25K具有很强的细胞毒性。最后，我们期待mRNA癌症疫苗的成功临床转化。参考资料：He Q, Gao H, Tan D, Zhang H, Wang JZ. mRNA cancer vaccines: Advances, trends and challenges. Acta Pharm Sin B. 2022 Jul;12(7):2969-2989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.03.011. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35345451; PMCID: PMC8942458.