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Janus激酶通过传递来自50多种细胞因子的信号在免疫反应中发挥关键作用，使其成为自身免疫性疾病的有吸引力的治疗靶点。但目前可用的JAK抑制剂伴随着一些不良反应，这是由于它们对细胞因子信号的抑制缺乏选择性。因此，下一代抑制剂需要在保持疗效的同时避免不良事件的发生。在JAK家族成员中，JAK3只调控γc细胞因子的窄谱，成为一个潜在的理想靶点。图1 JAK1和JAK3在γc细胞因子受体上的协同信号通路在非受体酪氨酸激酶的Janus激酶家族中，有四种亚型，JAK1, JAK2, JAK3和TYK2(酪氨酸激酶2)，通过JAK/STAT途径发出信号。JAK1、JAK2和TYK2普遍表达，而JAK3主要在淋巴组织中表达，是淋巴细胞发育的选择性调节因子，在免疫系统中发挥功能，使JAK3成为治疗自身免疫性疾病的一个有吸引力的靶点。JAK3只选择性地与一种细胞因子受体亚基结合，称为共同γ-亚基或γc链。如图1所示，JAK3协同JAK1参与了由6种细胞因子(白介素2、4、5、7、15和21)启动的信号传导，这些细胞因子在免疫稳态中很重要。JAK3在自身免疫性疾病中的关键作用的一个例子是x-连锁严重联合免疫缺陷症(X-SCID)。JAK3或γc细胞因子突变可导致X-SCID，这是一种紧急儿科疾病，可导致严重感染和腹泻，需要立即进行造血干细胞移植(HSCT)或基因治疗。JAK3抑制剂的发现过程和结构特征JAK3和其他JAK成员之间氨基酸序列的一个差异是ATP结合袋内存在半胱氨酸残基，而其他三种亚型中的半胱氨酸残基被丝氨酸残基所取代，这为设计高选择性JAK3抑制剂提供了结构生物学基础。2000年，阿斯利康Brown等人首次报道了JAK3选择性抑制剂的发现过程，首先使用酶联免疫吸附试验(ELISA)对>20万个化合物进行高通量筛选，测试化合物的浓度为10μM。合成了一系列2-氨基乙基酮(AEKs)化合物，其中包括最有效的化合物1(图2)(JAK3 IC5080nM，[ATP] = 2µM)，但是在实验条件下发现化合物1可以分解，此前也有报道AEKs可以通过逆向迈克尔加成反应反应裂解。在制备和评价了更稳定的AEKs后，发现其JAK3活性较低，这是因为，JAK3活性是由于AEKs在ELISA实验条件下分解，产生高活性的萘基乙烯酮，乙烯酮可能与JAK3蛋白形成共价相互作用。当发现最有效的化合物1在实验条件下的分解半衰期为36分钟，并且可能的分解产物为2时，证实了这一点(图2)。随后对化合物2测试，它的JAK3 IC50也为80nM ([ATP] = 2µM)，这表明分解产物实际上是活性抑制剂。图2 化合物1（AEK）通过逆向迈克尔加成反应分解得到乙烯酮此后的JAK3选择性抑制剂都保留了乙烯酮片段，所不同的是，不饱和烯酮片段上加入氰基就成为可逆抑制，氰基的引入使得Cα氢的酸性增强（图3B），产物的不稳定性增加，半胱氨酸的不可逆加成变为可逆加成。可逆共价抑制剂的亲电弹头多为氰基、酮羰基等可逆亲核加成反应受体，其与靶标共价结合的可逆性，使得可逆共价抑制剂的药代动力学特征介于不可逆共价抑制剂和非共价抑制剂之间。可逆共价抑制剂具有抑制作用时间长、有效浓度低、降低脱靶毒性的优点。图3 半胱氨酸残基与亲电弹头共价键形成机制(A)不可逆(B)可逆图4是一些代表性的JAK3抑制剂，其中红色虚线标注的氰基和不饱和烯酮片段可以和Cys909的巯基发生共价结合作用。Ritlecitinib是JAK3的一种不可逆抑制剂，根据截止时间2023年3月份，智慧芽数据库搜索Ritlecitinib关键词得到的信息，针对类风湿性关节炎的单药和联合用药的二期临床均已失败，溃疡性结肠炎适应症处于三期临床，克罗恩氏病处于二期临床，辉瑞计划在2023年对I型糖尿病进行II期临床试验(NCT05743244)，这也是目前临床进展最快的JAK3选择性抑制剂。ritlecitinib的抑制活性也是通过与JAK3中的Cys909残基的相互作用介导的，共价结合作用提高了化合物对JAK3的选择性。Ritlecitinib抑制JAK3，IC50为33.1 nM，对JAK1、JAK2和TYK2无活性（IC50>10 000 nM）。Ritlecitinib还抑制Th1和Th17，通过抑制IFNγ的产生（IC50=48 nM）和IL-17的产生（IC50=269 nM）来实现。JAK抑制剂治疗IBD是通过阻断免疫细胞的通讯来实现，2018年5月，FDA批准tofacitinib用于治疗中重度UC。Tofacitinib是一种口服小分子抑制剂，可抑制JAK1和JAK3，阻断下游的JAK/STAT信号通路，从而调节DNA转录。选择性JAK1抑制剂itacitinib在aGVHD患者中表现出良好的疗效，但是因副作用，已经终止了几个适应症如胰腺癌、斑块性银屑病、类风湿性关节炎。选择性JAK3抑制剂能否降低广泛抑制细胞因子带来的副作用，至少从ritlecitinib的一期临床数据得到了验证。研究中也没有发生主要不良心脏事件（MACE）、死亡、机会性感染。图4 代表性的JAK3共价抑制剂靶点JAK3现状通过查询“智慧芽新药情报库”，现阶段该靶点（含多靶点）共有近45个品种分布于“临床前-临床各阶段”，开发的适应症近69个且临床试验重点指向自免疾病（尤其是类风湿性关节炎、肠炎），临床试验重点分布于临床I期（单靶点），相关专利数量＞3800件（靶点综合）。图5 JAK3研发机构热点分析名称最高阶段适应证公司Ritlecitinib三期溃疡性结肠炎；克罗恩氏病PfizerR348二期终止移植物抗宿主病；干燥性角膜结膜炎Rigel PharmaceuticalsCT 340二期瘙痒；银屑病；特应性皮炎Creabilis SAOST-122二期溃疡性结肠炎；结肠直肠癌OncostellaeTD-5202一期炎症性肠病Theravance Biopharma表1 临床阶段的JAK3抑制剂总结来自细胞实验的结果反复证明，在JAK1/JAK3异二聚对之外，单独抑制JAK3是取消γc链细胞因子的下游信号所必需的。JAK3共价抑制剂在人全血和小鼠肝脏微粒体中也表现出稳定性。这种稳定性使得一些化合物在口服给药后在体内炎症模型中显示出疗效。表1中列出目前临床上主要的JAK3选择性抑制剂。辉瑞开发的Ritlecitinib目前进展最快，虽然针对RA的临床已经失败，但是在溃疡性结肠炎方面的临床还在进展中，并且新增了I型糖尿病二期临床的探索。然而，困难依旧存在。Rigel公司的R348针对眼科疾病的尝试宣告失败。Creabilis SA公司的CT 340在二期临床也是无进展的状态。Theravance公司的化合物TD-5202早在2020年就进入临床，但在第28届联合欧洲胃肠病学会议上，报告了一些一期临床的不良反应，现阶段仍在一期。今年2月份，Theravance公司宣布暂停吸入JAK抑制剂开发，并裁员17%。这也给TD-5202的未来蒙上一层阴影。OST-122对JAK3和TYK2都能产生抑制作用，目前二期正常进展当中。去年9月，美国和日本监管机构批准TYK2抑制剂deucravacitinib用于治疗中重度斑块型银屑病。Bristol Myers Squibb的这个口服药物也是TYK2信号通路的第一个上市的选择性抑制剂。Deucravacitinib的成功上市再一次验证了JAK/STAT通路的成药性。这个成功的通路已经研究了30年，针对这一通路中JAK激酶的每一个亚型的功能研究也越来越深入，上市的药物也从早期的pan抑制剂发展到针对两个亚型或某一个亚型的高选择性抑制剂。JAK3高选择性的抑制剂能否如TYK2抑制剂这般成功上市也有待时间的检验。参考文献：1.Stefan A. Laufer,et al, Recent Developments in JAK3 Inhibition: Isoform Selectivity by Covalent Targeting of Cys909.http://dx.doi.org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.bmcl.2017.07.079.2.Glynn Addison,et al, Current Status in the Discovery of Covalent Janus Kinase 3 (JAK3)  Inhibitors.Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2019, 19, 1531-1543.3.Hans-Günter Zerwes,et al, Selective inhibitors of the Janus Kinase Jak3 – are they effective?http://dx.doi.org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.bmcl.2014.08.046.4.智慧芽新药情报库.