MTBVAC (Biofabri)

摘要：由结核分枝杆菌（MTB）引起的结核病（TB）是一种普遍的全球性传染病，也是全球主要的死亡原因之一。目前，唯一可用的预防结核病的疫苗是卡介苗（BCG）。然而，BCG在成人中的效力有限。近一个世纪以来，开发有效的结核病疫苗的努力一直在进行中。在这篇综述中，我们审视了结核病疫苗研究中目前存在的障碍，并强调了理解MTB与宿主之间相互作用机制的重要性，以便为研究提供新的途径，为新型疫苗的开发奠定坚实的基础。我们还评估了各种结核病疫苗候选物，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗，以及新兴的mRNA疫苗和基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗，这些疫苗目前处于临床前阶段或临床试验中。此外，我们还讨论了开发不同类型的结核病疫苗所面临的挑战和机遇，并概述了结核病疫苗研究的未来方向，旨在加快有效疫苗的开发。这篇全面的综述提供了新型结核病疫苗领域所取得进展的总结。 1.引言 结核病（TB）是一种古老且在全球广泛分布的疾病，是细菌感染导致的死亡的主要原因。在17-18世纪的欧洲，结核病被称为“白色瘟疫”，几乎有100%的欧洲人感染，其中25%死于这种疾病。1882年，德国微生物学家罗伯特·科赫（Robert Koch）破译了结核分枝杆菌（MTB）作为导致TB的病因，从而开启了结核病预防、诊断和治疗的新篇章。随着抗结核药物的不断发展以及卫生和生活条件的改善，结核病的发病率和死亡率显著下降。然而，自20世纪90年代以来，由于耐药MTB菌株的出现、免疫抑制剂的使用、药物成瘾、贫困和人口流动等因素，全球结核病疫情恶化。结核病已成为最主要的重新出现的传染病和严重的全球健康问题，尤其是在发展中国家。 尽管抗结核药物有效，但根除结核病仍面临许多挑战。2022年10月27日，世界卫生组织（WHO）全球结核病报告显示，全球约有四分之一的人口感染了MTB。2021年，全球估算的新发结核病例数为1060万，比2020年增加了4.5%，结核病死亡人数为160万，比2020年增加了6.7%。中国是结核病负担较重的国家之一，估算的结核病例数仅次于印度和印度尼西亚，占全球结核病发病率的7.4%。2015年，WHO推出了“终结结核病战略”，这是一个雄心勃勃的全面计划，为2020-2035年期间设定了宏伟目标。这些目标包括到2035年将结核病发病率比2015年显著降低90%，结核病相关死亡率显著降低95%。 疫苗接种是预防和管理结核病最经济有效的方法，是实现WHO 2035年全球终结结核病战略的关键途径。在这方面最成功的措施之一是卡介苗（BCG）疫苗，自其诞生以来已在全球广泛使用140年。尽管BCG对婴儿和幼儿的重症结核病（如播散性结核病和脑膜炎型结核病）提供了显著的保护，但其对成人肺结核（PTB）的保护作用有限，效果不一，对MTB引起的原发性或潜伏性结核病感染无有效保护。目前，全球约有四分之一的人口存在潜伏性结核病感染（LTBI），无临床症状，约90%的LTBI患者不会发展为结核病。然而，这种潜伏状态是活动性结核病的潜在来源，也是结核病根除的主要障碍。因此，迫切需要开发更有效的结核病疫苗，以预防和控制由MTB引起的潜伏性和活动性感染。 随着免疫学和分子生物学的快速发展，一些新疫苗已进入临床试验阶段，并显示出一定的安全性和保护效果。然而，设计理想的结核病疫苗仍面临许多挑战，如MTB的致病机制不明确、筛选特定抗原的困难、缺乏理想的佐剂以及动物模型的限制。本文综述了MTB-宿主相互作用的免疫机制和当前新结核病疫苗研究的临床试验现状。还讨论了结核病疫苗研究面临的挑战和未来发展的方向，为未来结核病疫苗的发展提供新视角。 2.对MTB的感染和免疫 MTB的主要传播途径是通过空气飞沫，通过呼吸进入人体，并开始感染肺泡巨噬细胞。以前的研究表明，大约5%的感染个体可以完全清除体内的MTB，大约5-10%的个体会发展为活动性结核病，近90%的感染个体保持在LTBI状态。这表明，在MTB感染后，只有一小部分个体的免疫系统能够有效识别、监测和清除MTB，而绝大多数个体处于LTBI状态。因此，MTB与其宿主之间的相互作用极其复杂，结核病的发生、发展和结局不仅与MTB的毒力有关，而且与结核病患者的免疫力密切相关。遗传差异导致结核病患者的某些免疫缺陷或异常，影响身体抵抗MTB感染的能力。MTB感染后，会诱导一系列免疫反应，主要包括先天免疫（也称为非特异性免疫）和适应性免疫（也称为特异性免疫）（图1）。在本文中，我们将重点关注MTB诱导的先天和适应性免疫反应，并为新结核病疫苗研究提供新的见解。 图1. 由MTB诱导的先天和适应性免疫反应。MTB通过呼吸道进入肺泡后，首先被肺泡巨噬细胞、未成熟的树突状细胞（iDCs）和自然杀伤（NK）细胞等驻留免疫细胞识别。iDCs捕获MTB后，从感染部位迁移到淋巴结，细菌诱导它们分化为表达增强抗原呈递和MHC能力的成熟树突状细胞（mDCs）。在CD28-CD80和CD40-CD40L的协助下，树突状细胞上的MHC I和MHC II分子识别并激活CD4+和CD8+ T淋巴细胞。CD4+ T淋巴细胞根据微环境中的细胞因子分化为Th1、Th2或Th17亚群，有助于控制MTB感染。Th1和Th2免疫相互制衡并维持免疫稳态。CD8+ T淋巴细胞进一步分化为产生颗粒酶、穿孔素、Fas-FasL、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等分子的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），以激活巨噬细胞并清除细菌。根据先天和适应性免疫反应之间的相互作用以及MTB的毒力，感染可能导致恢复、潜伏性结核病感染（LTBI）或活动性结核病（ATB）。 2.1. MTB诱导的先天免疫反应 先天免疫反应在针对MTB的非特异性防御中起着至关重要的作用，它负责启动针对MTB的特异性适应性免疫反应。因此，先天免疫是MTB的第一道防线，至关重要。先天免疫系统是进化形成的，负责先天免疫的防御功能，包括屏障、细胞和分子成分。为了抵抗MTB入侵，宿主的先天免疫系统依赖于粘膜屏障等组织屏障、物理和化学屏障。同时，包括巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞（DCs）、自然杀伤T（NKT）细胞和γδT细胞在内的各种先天免疫系统组分，有助于产生免疫反应以对抗结核病感染。此外，宿主通过细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL-12）、白介素-1β（IL-1β）、MIP-1α/CCL3、趋化因子、补体分子、抗菌肽、溶菌酶和β防御素等免疫分子，发挥其抗结核免疫反应和免疫调节功能。 巨噬细胞通过其强大的吞噬和杀菌能力，在针对MTB的保护性免疫反应中发挥关键作用。巨噬细胞具有通过特定的模式识别受体（PRRs），如C型凝集素受体（CLRs）、Toll样受体（TLRs）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）样螺旋酶受体（RLRs）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLRs），检测MTB展示的病原体相关分子模式（PAMPs）的能力。随后，在识别MTB后，巨噬细胞采用包括自噬、吞噬作用、凋亡、产生活性氧（ROS）和炎症体激活等一系列机制，从系统中清除MTB。PAMPs与PRRs之间的相互作用诱导巨噬细胞表达各种炎症细胞因子，包括干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL-12）、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α/CCL3）。这些细胞因子招募中性粒细胞、T淋巴细胞和单核细胞至感染部位，围绕感染细胞形成肉芽肿以限制细菌传播。 从结构上看，肉芽肿是围绕感染部位的巨噬细胞和其他免疫细胞（包括中性粒细胞、树突状细胞（DCs）和自然杀伤（NK）细胞）紧密组织的聚集体。DCs在抗结核感染中发挥关键作用，因为它们是最有效的抗原呈递细胞（APCs）。DCs不仅向初始T细胞呈递结核病抗原，还连接先天免疫和适应性免疫。根据DC细胞的发育阶段，它们可以分为未成熟DCs（iDCs）和成熟DCs（mDCs）。iDCs没有分泌细胞因子的能力，但它们具有很强的抗原摄取能力。在抗原摄取后，它们逐渐迁移到淋巴结，并向效应T细胞呈递抗原，从而启动适应性免疫反应。mDCs具有产生细胞因子和刺激T细胞分化的能力，从而激活T细胞介导的适应性免疫反应。 此外，自然杀伤（NK）细胞和中性粒细胞也通过产生非特异性细胞因子和趋化因子参与了对结核分枝杆菌感染的早期先天免疫反应。在机体感染MTB后，NK细胞可以迅速响应。NK细胞不受MHC和抗体的限制，能够通过产生含有穿孔素、颗粒素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，直接杀死细胞内外的MTB。NK细胞可以通过分泌如干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子，介导CD8+ T效应细胞的反应。IFN-γ是NK细胞分泌的主要细胞因子，可以通过促进单核细胞和巨噬细胞中MHC类分子的表达，增强抗原呈递细胞（APCs）的抗原呈递能力，从而在MTB被识别后的肉芽肿阶段参与控制MTB感染。MTB被识别后，中性粒细胞迅速到达感染部位，然后激活并分泌大量趋化因子，包括白介素（ILs）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素诱导的T细胞α趋化因子（I-TAC）、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）、单核细胞趋化蛋白（MCP）、干扰素-γ诱导蛋白-10（IP-10/CXCL10）和干扰素-γ诱导的单核因子（MIG, CXCL9）。这些趋化因子可以有选择地招募免疫细胞，包括Th1 T细胞、Th17 T细胞、中性粒细胞、树突状细胞（DCs）和NK细胞到感染部位。此外，中性粒细胞分泌的趋化因子可以进一步增强类似细胞的招募。 2.2.MTB诱导的适应性免疫反应 在MTB抗原的刺激下，抗原特异性T/B淋巴细胞经历自我激活、增殖和分化成效应细胞，产生一系列生物学杀菌效应。根据参与免疫反应的细胞类型和机制的不同，适应性免疫反应可分为两种类型：B细胞介导的体液免疫反应和T细胞介导的细胞免疫反应。 2.2.1. CD4+ T细胞及其分化和平衡 CD4+ T细胞在宿主对MTB感染的反应中至关重要。最初，原始的CD4+ T淋巴细胞（Th0细胞）缺乏效应T细胞功能，仅产生少量的IL-2，同时无法产生干扰素（IFN-γ）、IL-4或IL-5。树突状细胞（DC细胞）摄取MTB抗原，主要通过MHC II呈递给Th0细胞。在不同细胞因子的调节下，激活的Th0细胞分化成不同类型的辅助T细胞，包括Th1、Th2、Th17、调节性T细胞（Treg细胞）等（图2）。DC细胞分泌的IL-12和IFN-γ能够诱导Th0细胞分化为Th1细胞，而在IL-2和IL-4的微环境中，Th0细胞分化为Th2细胞。Th1和Th2细胞都是效应T淋巴细胞，在宿主抵抗MTB感染中发挥重要作用。在MTB感染期间，Th1细胞主要释放关键效应分子，如IFN-γ、IL-2和TNF-α，这些分子在激活巨噬细胞系统以有效控制和消除MTB中发挥至关重要的作用。这些机制涉及自噬、活性氧和氮中间体的使用、抗菌肽、启动下游抗菌途径和溶酶体酶来对抗感染。尽管Th1在细胞内病原体感染中起主要作用，但Th2在抗击MTB感染中的作用也很重要。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等细胞因子，协助B细胞的激活和增殖，并参与体液免疫的调节。Th1和Th2细胞通过它们分泌的细胞因子相互调节，它们处于动态平衡状态，在维持免疫反应的平衡中发挥重要作用（图2）。Th1和Th2细胞之间的不平衡也被认为是结核病的一个重要原因。结核病不是由于缺乏有效的Th1反应，而是由于Th2反应的过度转移，Th2细胞因子抑制了Th1细胞因子的作用。 图2. MTB感染中CD4+ T细胞亚群的相互作用和平衡。抗原呈递细胞（APCs），如巨噬细胞，通过MHC II分子将MTB抗原肽呈递给初始T细胞（Th0细胞），诱导T细胞根据细胞因子微环境分化成不同亚型。在巨噬细胞分泌的IL-12和IFN-γ的刺激下，Th0细胞激活STAT4和T-bet，分化成Th1亚型，并释放如IFN-γ和TNF-α等细胞因子来对抗MTB感染。同样，巨噬细胞也可以通过分泌不同的细胞因子，包括IL-2和IL-4、IL-6、IL-23和TGF-β，以及IL-10和TGF-β，促进Th0细胞分化成Th2、Th17和Treg亚型。Th1、Th2、Th17和Treg亚型之间的相互作用是复杂和平衡的，它们协同工作，发挥免疫反应并维持宿主对MTB感染的防御。 同样，在IL-6、IL-21、IL-23和TGF-β等细胞因子的作用下，Th0细胞可以分化成Th17细胞。Th17细胞是最近在人体中发现的一种新的CD4+效应T细胞亚群。这些细胞表现出分泌各种效应细胞因子的能力，包括IL-17、IL-17F、IL-21和IL-22。通过产生这些细胞因子，Th17细胞促进中性粒细胞和IFN-γ阳性CD4+ T细胞招募到感染部位，随后在抗击MTB感染中发挥关键作用。有趣的是，Th17细胞的招募功能并非始终持续。如果其活性过强，Th1和Th2细胞通过分泌如IFN-γ和IL-4等细胞因子，抵消Th17细胞的效应，从而维持免疫反应的动态平衡（图2）。 Th0细胞可以响应IL-10和TGF-β分化成Treg细胞，除了分化成Th1、Th2和Th17细胞外。无论是体外还是体内，Treg细胞都表现出免疫抑制功能，其特征是高度表达Foxp3、CD45RO、CTLA-4、CCR4、mTGF-β、GITR和CD62L，以及低表达CD45RA和CD127（IL-7R），以及在激活时呈现记忆样表型。以前的研究表明，老年结核病患者中Treg细胞频率更高，IFN-γ阳性T细胞频率更低，Treg细胞的扩张与MTB负荷密切相关。人类队列研究报告了健康个体中Treg细胞的频率最低，其次是LTBI患者，ATB患者中的频率最高。CD4+CD25highFoxP3+细胞的增加与LTBI和TB队列中观察到的Th1反应损伤和体外微生物杀伤活性降低有关。 有趣的是，Treg和Th17细胞也具有相互抑制和平衡的关系。TGF-β可以在Th0细胞中诱导Foxp3或RORγT的表达，IL-6的表达在决定Th0细胞是否向Treg或Th17细胞分化方面起着关键作用（图2）。在IL-6存在的情况下，平衡倾向于Th17分化，而在其缺失的情况下，Treg细胞的分化占主导。FoxP3抑制RORγT的功能，先前的研究发现CD4+CD25+Foxp3+CD39+ Treg细胞在抑制致病性Th17细胞中发挥作用。此外，最近的研究表明，Treg细胞可以通过表达共抑制分子T细胞Ig和ITIM域（TIGIT）来抑制促炎性Th1和Th17细胞。 2.2.2. CD8+ T细胞和B细胞 尽管CD4+ T细胞在控制MTB感染中的关键作用已经确立，但CD8+ T细胞和B细胞的作用也越来越被认识到。在吞噬MTB后，树突状细胞通过MHC I类分子向CD8+ T细胞呈递抗原，激活它们成为细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。CTLs可以通过释放穿孔素和颗粒素裂解失去免疫活性的巨噬细胞。因此，MTB失去了保护，并可以被激活的巨噬细胞和NK细胞清除。此外，激活的CTLs可以分泌如IFN-γ等细胞因子，刺激单核细胞和巨噬细胞产生活性氧（ROS）和活性氮中间体（RNIs），引起直接的细胞毒性。 T淋巴细胞在介导适应性免疫以清除MTB中发挥关键作用。然而，最近的研究表明，体液免疫在预防MTB感染中的重要性也得到了揭示。可以肯定的是，体液免疫在获得性免疫反应中起着重要作用。它涉及产生针对入侵病原体或疫苗抗原的抗原特异性抗体。在结核病的情况下，研究表明B细胞和体液免疫确实可以调节免疫反应。这表明B细胞和抗体的产生可能在免疫防御结核病感染中发挥作用。激活的B细胞可以通过产生IL-10来调节炎症反应，并通过产生IL-12、IFN-γ和TNF-α来刺激Th1反应。此外，B细胞可以通过产生抗体介导细胞毒性。 3.结核病疫苗的临床管线  对MTB的遗传系统、蛋白质组学和免疫机制的科学理解的进步，加速了更安全、更有效的新型结核病疫苗的开发。结核病的理想疫苗策略应包括三个组成部分：预防暴露后的原发性感染和疾病，预防潜伏感染的重新激活，以及作为标准结核病治疗的免疫治疗辅助以促进患者恢复。目前正在进行临床试验的新结核病疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗、重组BCG疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗和DNA疫苗。灭活疫苗主要用于结核病治疗；减毒活疫苗针对新生儿的初次免疫或预防青少年和成人的结核病；亚单位疫苗主要用于MTB的暴露前后预防；而病毒载体疫苗旨在增强BCG的免疫效果。本综述提供了目前正在临床管线中开发的19种候选结核病疫苗的发展进展和面临的障碍的概述（图3）。 图3. 结核病疫苗临床管线。当前管线提供了正在进行临床开发的疫苗候选物的数据，而临床前开发候选物的信息尚未收集。缩写：RIBSP，生物安全问题研究所；SRII，Smorodintsev流感研究所；NIAID，国家过敏和传染病研究所；NIH，国立卫生研究院；SSI，Statens血清研究所；IAVI，国际艾滋病疫苗倡议；ICMR，印度医学研究理事会；CADILA，Cadila制药有限公司；DHMC，达特茅斯希区柯克医疗中心；SIIPL，印度血清研究所私人有限公司；VPM，疫苗项目管理有限公司；Gates MRI，比尔和梅琳达·盖茨医学研究所；GSK，葛兰素史克。 3.1. 灭活结核病疫苗 灭活疫苗使用整个或片段化、裂解形式的MTB来诱导对多种MTB抗原的免疫反应。灭活疫苗长期以来一直用于结核病的预防和治疗。这些疫苗诱导Th1细胞介导的和体液免疫反应，防御细胞外MTB感染，并已显示出在控制结核病方面的良好免疫治疗效果。灭活疫苗的缺点包括免疫时间短、免疫期短和需要多剂量。然而，灭活疫苗在稳定性、安全性和生产方面具有优势，使它们成为一种快速发展的疫苗类型。目前正在进行临床试验的灭活疫苗包括MIP、RUTI、Vaccae和DAR-901（表1）。 3.1.1. MIP 印度产牛型结核菌（MIP）是一种非致病性、生长迅速的非结核分枝杆菌（NTM）。MIP最初被广泛用作麻风病的免疫调节剂，后来发现它能够预防小鼠和豚鼠的结核病。此外，MIP在结核病复治患者中被证明是安全的，并且可以通过TLR-4信号通路激活NF-KB，诱导感染MTB的巨噬细胞分泌促炎细胞因子和一氧化氮（NO）。在印度坎普尔（Ghatampur）进行的一项临床试验评估了MIP（印度产牛型结核菌）在约28,948名居住在272个村庄的农村人群中的保护效果。结果显示，与安慰剂组相比，接种组的肺结核发病率显著降低。这种降低在接种后10-13年观察到，统计分析显示p值为0.002，卡方值为11.604。此外，据报道，同时接受MIP和DOTS治疗的结核病患者在痰液清除方面恢复更快，与仅接受DOTS治疗的患者相比。这表明在治疗方案中加入MIP增强了DOTS在结核病患者中的治疗效果。由印度科学与技术部和印度Cadila制药有限公司赞助的III期随机、双盲、安慰剂对照、多中心临床试验（NCT00265226）评估了MIP在印度II类结核病患者中的治疗效力和安全性。观察到MIP治疗患者和安慰剂治疗患者在两周后的痰涂片转化率没有显著差异，分别为53.35%和48.72%。然而，在四周治疗后，MIP组（67.1%）的痰培养转化率显著高于安慰剂组（57%），表明MIP具有清除细菌的能力。尽管MIP组的局部反应明显高于安慰剂组，但它们很快自行解决并消失。这些结果表明MIP具有良好的安全性，并且有潜力在结核病患者中清除MTB。 3.1.2. RUTI疫苗 RUTI疫苗是一种设计用来对抗结核病感染的治疗性疫苗。Archivel Farma S.L.（西班牙巴塞罗那）和Parexel（美国加州格兰岱尔）之间的合作努力开发了一种疫苗，该疫苗结合了纯化和脂质体的MTB杆菌细胞片段。这些杆菌在应激条件下培养，以模拟肉芽肿内部的环境，从而诱导产生通常对免疫系统隐藏的潜伏特异性抗原。这种疫苗可以提供对复制和非复制细菌的强大和有效的免疫反应。涉及小鼠、豚鼠、山羊和小型猪的实验模型已经证明了RUTI在短暂化疗后控制LTBI的效力。基于这些令人满意的结果，2007年在健康志愿者中进行了一项随机、双盲、安慰剂对照的I期临床试验（NCT00546273），以评估四个剂量（5微克、25微克、100微克和200微克）的RUTI的安全性和免疫原性。试验确认，不同剂量的RUTI疫苗只会导致志愿者注射部位的抽搐症状，两个人（2/16）经历了无菌性肉芽肿性炎症，可能与RUTI疫苗产品中使用的非活性化合物有关。此外，这项临床试验证明了RUTI疫苗可以在志愿者中诱发特异性的体液和细胞介导的免疫反应。作为评估RUTI疫苗的首次临床试验，这项I期试验的结果为RUTI疫苗的后续临床试验提供了基础。在发布这项I期临床试验结果的同年（2010年），在南非三个地区启动了RUTI疫苗的II期临床试验（NCT01136161），以评估三个RUTI剂量（5微克、25微克和50微克）在HIV阳性（n = 47）和阴性（n = 48）LTBI个体中的安全性、耐受性和免疫原性。2014年，II期临床试验的结果发布，展示了接受RUTI疫苗的个体不良反应的发现。RUTI接受者最常见的不良反应与局部注射部位反应有关。这些包括红斑（91/92）、无菌性脓肿（6/6）、硬化（94/92）、肿胀（74/83）、局部结节（46/25）、局部疼痛（66/75）、溃疡（20/11）、鼻咽炎（20/5）和头痛（17/22）。值得注意的是，这些反应大多数性质温和，并且参与者能够很好地耐受。此外，结果表明，接受5微克或25微克RUTI的HIV阴性患者在第二次接种后显示出良好的免疫反应，并在免疫反应强度上略有增加，而HIV阳性患者在第一次接种25微克或50微克RUTI后显示出类似的多抗原免疫反应轮廓，第二次接种后未观察到免疫反应的显著增加。这些结果表明，RUTI疫苗诱发的免疫反应在HIV阴性和阳性人群中不同，可能由于HIV阳性个体中CD4+ T淋巴细胞受损。 尽管上述两项临床试验的结果已经证明了RUTI疫苗的可接受的耐受性和安全性，以及诱发体液和细胞介导的免疫反应，但需要更多的大规模临床试验来验证疫苗的效力。目前，两项IIb期临床试验（NCT04919239和NCT05455112）正在招募志愿者，以评估RUTI作为结核病化疗辅助的有效性，以及RUTI免疫疗法在结核病患者中的有效性和安全性与标准治疗相比较。此外，从已经发布的临床试验数据来看，接受志愿者的RUTI疫苗剂量与不良事件的频率之间似乎存在相关性。我们认为，在未来的RUTI临床试验中，主要考虑之一将是如何改进疫苗以减少志愿者的不良反应，并确定疫苗的适当剂量范围。 3.1.3. 疫苗用结核菌 疫苗用结核菌（M. vaccae）是一种对人类病原性低的快速生长环境分枝杆菌。它最初由Boenickse R和Juhasz E从牛的乳腺中分离出来。M. vaccae包含许多与免疫调节特性共享的分枝杆菌抗原。这些共享的分枝杆菌抗原可以通过诱导Th-1型免疫反应来帮助宿主防御MTB感染，从而在结核病治疗中发挥作用。 尽管如此，早期研究主要集中在热杀死的M. vaccae在抗结核化疗中的辅助免疫治疗作用上，但结果表现出异质性。1995年，在尼日利亚北部城市卡诺进行的一项临床试验评估了M. vaccae免疫疗法在治疗PTB中的疗效，显示在接受M. vaccae免疫疗法的患者中，与仅接受安慰剂（单独化疗）的患者相比，在抗结核药物治疗3周时的痰液转化率显著更高（73%对19%，p = 0.00001）。这些发现表明M. vaccae免疫疗法在注射后的第一周和第二周有益处。两年后，另一项临床试验显示，M. vaccae免疫疗法显著提高了难治性结核病患者的治疗成功率（77%对52%，p < 0.02）。这些临床试验结果表明，M. vaccae免疫疗法在结核病治疗中具有一定的辅助作用；然而，一些临床试验得出了相反的结论。1999年，《柳叶刀》上发表的一项临床试验评估了M. vaccae在标准短期抗结核化疗中的作用，发现M. vaccae免疫疗法并没有显著减少结核病患者的痰液转化时间，表明M. vaccae免疫疗法在标准抗结核化疗中没有提供任何益处。同样，临床试验评估了在标准抗结核化疗中加入单剂量SRL172（杀死的M. vaccae）免疫疗法对HIV感染结核病患者（n = 760）死亡率的影响，结果显示单剂量SRL172疗法安全且耐受良好，但作为标准抗结核治疗的辅助免疫疗法，并没有显著影响成人PTB患者的存活率或微生物学结果。为了解决上述临床试验结果的异质性问题，陈怡黄等人在2017年进行了一项荟萃分析，包括了13项临床试验的数据。这项研究的结果显示，与安慰剂组相比，接受M. vaccae免疫疗法的TB患者在1-2个月和6个月时痰涂片阴性率显著更高。此外，在这些ATB患者中，在1或2个月时更有可能观察到痰培养阴性的结果。这些来自荟萃分析的发现表明，M. vaccae免疫疗法有望成为PTB的有效治疗。 上述临床试验表明，热杀死的M. vaccae制剂有潜力作为抗结核化疗的辅助治疗手段，最近的临床试验也验证了M. vaccae疫苗预防结核病的能力。在芬兰和赞比亚对HIV感染成人进行的I期和II期临床试验中，之前接种过卡介苗的受试者显示，全灭活M. vaccae具有良好的安全性和免疫原性，并发现M. vaccae可以预防HIV阳性人群中的结核病。此外，在坦桑尼亚进行的一项双盲、安慰剂对照的III期临床试验中，显示M. vaccae作为预防疫苗使用时，既安全又耐受良好。此外，该疫苗对结核病感染具有显著的保护效果。这些发现突出了M. vaccae作为预防结核病措施的潜力。 令人兴奋的是，中国北京的国家食品药品监督管理总局与中国人民解放军总医院第八医学中心合作，改进了Mycobacterium vaccae，并将其命名为VaccaeTM。VaccaeTM最初由安徽智飞龙科马生物制药有限公司生产（现由安徽智飞生物制品有限公司，中国合肥提供），以其增强免疫力、刺激吞噬作用、双向调节免疫反应和最小化病理损害的能力而闻名。在中国广西进行了一项III期临床试验（NCT01979900），包括10000名15-65岁的结核菌素皮肤试验（TST）阳性患者，TST结果大于15毫米，以评估VaccaeTM预防LTBI患者结核病的效力和安全性，其结果尚未公布。VaccaeTM已获得中国食品药品监督管理局（CFDA）批准（批准号：S20010003）作为结核病辅助治疗。此外，VaccaeTM是世界卫生组织推荐的唯一用于结核病免疫治疗的疫苗。VaccaeTM疫苗在接种后也在极少数人中引起局部皮疹、硬化或发热等问题。 3.1.4.DAR-901 DAR-901是一种源自M. vaccae的灭活全细胞疫苗，代表了SRL172的一种新颖且可扩展的制造工艺。DAR-901在临床前研究中作为卡介苗增强剂显示出效力，有效预防结核病，因此是进一步临床开发的有希望的候选疫苗。DAR-901疫苗已知能诱导Th1免疫反应，并加快和加强针对结构和生长相关抗原的特异性免疫，从而减少MTB负担并缓解肺部病理损害。在美国进行的一项I期临床试验（NCT02063555）中，评估了该疫苗在不同剂量（0.1毫克、0.3毫克和1毫克）下对之前接种过卡介苗的成人，无论是否感染HIV的安全性、耐受性和免疫原性。试验表明，疫苗在所有三个剂量水平上都耐受良好，诱导了针对MTB抗原的细胞和体液免疫反应，并且没有严重的不良事件。在坦桑尼亚进行的另一项II期临床试验（NCT02712424）中，评估了该疫苗在减少之前接种过卡介苗的青少年结核病感染风险方面的效力。结果表明，1毫克DAR-901的三剂系列被认为是安全且耐受良好的。然而，它在预防初始或持续性IGRA转化方面并未表现出效力。有趣的是，转化为IGRA的DAR-901接受者对ESAT-6的免疫反应增强。因此，由于预防疾病可能需要与抵御感染不同的免疫反应，因此有必要进行DAR-901预防结核病的临床试验。 3.2.减毒结核病疫苗 通过去除MTB中的一些毒力基因来制备具有基因缺陷的减毒结核病疫苗，使其失去致病性，显著表达多种抗原，激活不同类型的T细胞，并增强免疫原性。它可以作为预防疫苗使用，并替代新生儿卡介苗接种。与其他疫苗相比，其优点是能够激活复杂多样的免疫反应，具有更广泛的抗原表位范围，诱导与自然感染类似的免疫反应，从而产生长期保护。然而，减毒疫苗也有一些缺点，如潜在的恢复毒力风险和免疫复合物的并发症。MTBVAC和BCG（重新接种）目前是正在进行临床试验的减毒结核病疫苗（表1）。 3.2.1.MTBVAC MTBVAC是一种基于phoP-fadD26基因缺陷减毒MTB菌株的新型结核病活疫苗。PhoP和fadD26基因被敲除，以灭活包括ESAT-6在内的各种毒力因子的表达，并在MTB细胞膜合成中发挥作用。该疫苗主要针对新生儿作为卡介苗接种的替代品，以及青少年和成人以增强免疫力。迄今为止，MTBVAC是第一个进入临床试验的减毒结核病活疫苗，并显示出与卡介苗相当的安全性。2013年，在瑞士对HIV阴性志愿者进行了一项I期双盲、随机、对照、剂量递增试验，以评估MTBVAC与卡介苗的安全性和免疫原性（NCT02013245）。结果显示，在三个剂量组中MTBVAC的安全性与卡介苗相当（第一组接受5 × 103 CFUs MTBVAC，第二组接受5 × 104 CFUs MTBVAC，第三组接受5 × 105 CFUs MTBVAC），并且在接种疫苗后没有触发严重的不良事件。此外，为了评估MTBVAC在结核病流行区的成人和新生儿中的安全性和免疫原性，一项Ib期随机、双盲、剂量递增临床试验在南非高结核病负担地区进行（NCT02729571）。结果显示，两组的不良事件的频率、严重程度和类型相似，并且没有与疫苗相关的严重不良事件。此外，试验观察到Th1型CD4细胞对MTBVAC有剂量依赖性反应，MTBVAC的峰值反应（即在第70天）在2.5 × 105 CFUs剂量组中高于卡介苗疫苗，并且MTBVAC的反应在第360天高于卡介苗。低剂量组（2.5 ×103CFUs）的Th1型CD4细胞对MTBVAC的反应显著低于卡介苗或高剂量MTBVAC在第70天和第360天的反应。上述免疫原性结果表明，高剂量MTBVAC诱导了强烈的免疫反应，在未来的研究报告中，可能考虑省略MTBVAC的低剂量组。 目前，南非正在进行两项MTBVAC的临床试验，即NCT02933281和NCT03536117，研究MTBVAC的不同方面。NCT02933281专注于评估MTBVAC在有无LTBI的成人中的安全性和免疫原性的四剂（5 × 103、5 × 104、5 × 105和5 × 106 CFUs）疫苗接种。另一方面，NCT03536117旨在评估MTBVAC在新生儿中的三剂（2.5 × 104、2.5 × 105和2.5 × 106 CFUs）疫苗接种的安全性和免疫原性。然而，这些试验的结果尚未披露。此外，一项MTBVAC的随机、双盲、对照III期临床试验（NCT04975178）正在撒哈拉以南非洲的结核病流行区进行，以评估其在有无HIV暴露的新生儿中的效力、安全性和免疫原性，目前正在招募参与者。 3.2.2. BCG重新接种（Gates MRI-TBV01-201） 如前所述，卡介苗接种为婴儿提供了益处，但对其他人群则不然。近年来，比尔和梅琳达·盖茨医学研究所（Gates MRI）、Aeras和赛诺菲巴斯德进行了临床试验，重新利用现有的卡介苗在青少年和儿童中。2015年，在南非开普敦进行了一项随机、安慰剂对照、部分盲法Ib期临床试验（NCT02378207），研究健康、未感染HIV和MTB、之前接种过卡介苗的青少年参与者重新接种卡介苗的安全性和免疫原性。该临床试验于2020年发表在EClinicalMedicine上，显示重新接种卡介苗具有可接受的安全性，并诱导了强健的、多功能的BCG特异性CD4+ T细胞。此外，在南非开普敦对健康青少年进行了一项随机、安慰剂对照、部分盲法II期临床试验（NCT02075203），以评估重新接种卡介苗预防MTB感染的效力。结果表明，重新接种卡介苗具有免疫原性，并降低了持续QFT转化的比率，效力为45.4%（p = 0.03）。然而，该研究还发现，尽管重新接种卡介苗没有引起严重的不良事件，但轻度至中度的注射部位反应在重新接种卡介苗中比H4:IC31疫苗更常见。 因此，卡介苗重新接种的安全性已成为日益受到关注的话题。2022年，在npj Vaccines杂志发表的一篇文章调查了卡介苗注射部位脓肿和局部淋巴结病变的发生率及风险因素。结果显示，在1387名接种卡介苗的参与者中，有3%出现了注射部位脓肿，其中大多数（34/41，83%）无需治疗即可自行恢复。此外，接种卡介苗重新接种的参与者中，注射部位脓肿的发生率更高（OR 3.6，95% CI 1.7–7.5）。此外，在1387名接种卡介苗的参与者中，有48人（3%）观察到局部淋巴结病变。有趣的是，在重新接种卡介苗的个体中，这些病变的发生率更高（比值比（OR）2.1，95%置信区间（CI）1.1–3.9）。值得注意的是，初始卡介苗接种和重新接种相关的不良事件的频率和类型在不同地理区域有所不同。为了解决这种变异性并阐明卡介苗重新接种的安全性，进行了一项全面的系统综述。该综述包括了22项研究，包括随机试验（n = 8）、病例系列或报告（n = 6）、病例对照研究（n = 4）和观察性研究（n = 4）。研究结果表明，卡介苗重新接种后轻度局部和全身反应的发生率略有增加；然而，在接种疫苗的免疫能力正常的个体中没有严重不良事件。基于上述临床试验和研究获得的数据，2019年，盖茨MRI进行了一项随机、观察者盲法、安慰剂对照的IIb期研究（NCT04152161），以评估卡介苗重新接种在预防南非健康儿童和青少年持续MTB感染方面的有效性、安全性和免疫原性。该临床试验旨在招募年龄在10至18岁之间的1820名儿童和青少年志愿者。志愿者将被随机分配到两个组，并接受单一剂量的0.1 mL卡介苗SSI或生理盐水，两者都通过上臂三角肌区域皮内注射。这项临床试验的结果尚未公布。 3.3.重组卡介苗疫苗 卡介苗对成人的保护效力差异很大，但其他新疫苗的保护效力仍无法超越现有的卡介苗。因此，对现有卡介苗进行合理的重组和修改是结核病疫苗研究的一个方向。到目前为止，卡介苗的修改研究越来越多地受益于现代分子生物学的研究方法和结果，即通过将外源目标基因插入现有细菌或病毒中，使它们作为载体来构建重组卡介苗（rBCG）疫苗。已经开发了几种类型的rBCG，它们在动物模型和人类中的保护效果和体液及细胞免疫反应已经得到了评估。目前，有三种rBCG已经进入临床试验（VPM1002、rBCG30和AERAS-422），其中rBCG30和AERAS-422由于效力和安全问题已经停止（表1）。 VPM1002是通过用单核细胞增生李斯特菌的listeriolysin O（LLO）编码基因替换脲酶C基因而创建的rBCG疫苗。这种替换导致LLO的分泌，促进抗原和DNA进入宿主细胞的细胞质中。结果，VPM1002显著增强了抗原特异性CD4+ T和CD8+ T细胞的产生。此外，已发现它诱导自噬、激活炎症体并促进细胞凋亡。已经证明VPM1002可以有效诱导Th1和Th17类型的免疫反应。此外，在对小鼠、免疫缺陷小鼠、豚鼠、家兔和非人灵长类动物进行测试时，与卡介苗相比，VPM1002显示出更高的效率和安全性。此外，该疫苗已被用于免疫疗法治疗非肌层浸润性膀胱癌，作为卡介苗的替代品。 在德国进行了一项随机对照剂量递增的I期临床试验，以评估VPM1002在男性人类志愿者中的安全性和免疫原性（NCT00749034）。结果显示，VPM1002诱导了特异性和剂量依赖性的免疫反应，在最高剂量（5 × 105 CFUs）下安全且耐受良好。随后在南非高负担环境中进行了一项II期临床试验（NCT01479972），以评估VPM1002和卡介苗在未接触HIV且未接种卡介苗的新生儿中的安全性和免疫原性。结果表明，VPM1002在新生儿中单剂量后安全、免疫原性和免疫耐受性良好。由VPM1002诱导的CD4+和CD8+ T细胞反应与卡介苗诱导的反应相当。为了进一步评估VPM1002与卡介苗在接触HIV和未接触HIV的新生儿中的安全性和免疫原性，一项双盲、随机、对照的IIb期临床试验（NCT02391415）在南非四个医疗中心的416名新生儿上进行。结果显示，VPM1002在接触HIV和未接触HIV的新生儿中都是安全的。尽管两种疫苗都具有免疫原性，但VPM1002产生的免疫反应低于卡介苗。 上述临床试验的一个限制是样本量小，使得两种疫苗引起的免疫反应的统计比较难以建立。在两项最近的III期临床试验（NCT03152903和NCT04351685）中，尚未招募志愿者，样本量已分别增加到2000和6940名参与者。这些临床试验旨在评估VPM1002在预防已成功治疗结核病的个体中结核病复发的有效性和安全性，以及在预防新生儿结核病感染方面的有效性和安全性。 3.4.亚单位结核病疫苗 亚单位结核病疫苗由从MTB中分离和纯化的免疫活性成分组成，如蛋白质、肽、氨基酸和糖。这些疫苗具有高效、安全和低成本的优势。然而，它们有限的抗原数量导致激活广泛免疫的能力较弱，免疫原性持续时间较短，记忆免疫能力较低。因此，亚单位疫苗需要佐剂来诱导免疫保护或免疫疗法，增强其免疫原性，并确保靶向递送。它们通常用作卡介苗初次接种后的增强疫苗，以增强卡介苗介导的保护或延长保护持续时间。目前正在进行六种亚单位结核病疫苗的临床试验，包括M72/AS01E、GamTBvac、H56: IC31 (AERAS-456)、H4: IC31 (AERAS-404)、ID93+GLA-SE和AEC/BC02，以评估它们对MTB感染或结核病的能力（表1）。 3.4.1.M72/AS01E M72/AS01E是由英国葛兰素史克（GSK）公司开发的亚单位候选结核病疫苗，由免疫原性高的MTB蛋白Mtb39A和Mtb32A以及佐剂AS01E组成。M72/AS01E亚单位疫苗已显示在诱导免疫反应方面的效力，其特征是激活产生γ-干扰素的CD4+ T细胞和抗体产生；然而，其确切的作用机制仍不清楚。为了更好地理解M72/AS01E疫苗的免疫保护机制，必须进行进一步的基础研究。 这种疫苗旨在预防结核病，其在激活T细胞和抗体产生方面的成功使其成为未来结核病预防工作的有希望的候选疫苗。为了评估其安全性、免疫原性和保护效力，已经进行了一些临床试验。在肯尼亚、南非和赞比亚进行了一项随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验（NCT01755598），包括3575名18-50岁的成年人，他们生活在结核病高发国家。该试验旨在评估两剂M72/AS01E与安慰剂相比对预防肺结核的保护效果。结果显示，该疫苗安全有效，疫苗相关的不良反应轻微，成人MTB感染的保护效力为54%。三年的随访表明，M72/AS01E疫苗接种至少提供了三年的免疫保护，以防止潜伏感染发展为活动性结核病病例。然而，在36个月的随访后，最终的保护效力被发现为49.7%（图4）。此外，在结核病流行地区进行了一项双盲、随机、对照的II期临床试验（NCT00950612），以评估M72/AS01E在健康的HIV阴性青少年中的安全性和免疫原性。研究结果表明，M72/AS01E疫苗表现出可接受的临床安全性和反应原性概况。此外，这种疫苗接种方法引发了强大且持久的CD4+和CD8+ T细胞反应，以及NK细胞中CD4+ T细胞依赖的干扰素-γ（IFN-γ）反应。这些效应在MTB感染的个体和居住在结核病流行地区的未感染健康青少年中都有观察到。这些试验表明M72/AS01E在青少年和成人中具有良好的安全性和免疫原性。目前，南非正在进行一项随机、安慰剂对照的III期临床试验（NCT04556981），以评估M72/AS01E在正在接受病毒抑制和抗逆转录病毒治疗的HIV阳性受试者中的安全性和免疫原性。 图4. M72/AS01E亚单位疫苗对无HIV感染个体中确诊的肺结核病例的效力。该分析在效力队列中使用了协议中规定的未调整的Cox回归模型。本图所使用的数据来源于之前的研究。版权所有 © 2019 马萨诸塞州医学会。 3.4.2. GamTBvac GamTBvac是一种结核病亚单位候选疫苗，由改性的葡聚糖结合域的Ag85a和MTB的ESAT6-CFP10抗原组成，以及CpG寡核苷酸佐剂和葡聚糖。Ag85a是MTB分泌的乙酰转移酶85复合体的蛋白质组分，ESAT6-CFP10是两种MTB蛋白质的融合。这两种抗原都与来自肠膜明串珠菌的葡聚糖结合域（DBD）融合，使它们能够与葡聚糖结合。DBD融合通过促进它们被APCs摄取和呈递，提高了抗原的稳定性和免疫原性。CpG寡核苷酸是免疫刺激剂，激活Toll样受体9（TLR9）信号，这是先天免疫反应的关键组成部分。这些寡核苷酸固定在DEAE-葡聚糖核心上，由修饰过的500 kDa DEAE-葡聚糖组成，附有二乙基氨基乙基多阳离子，以增强抗原递送并促进TLR9信号。这些佐剂的加入增强了对抗原的免疫反应，从而提高了疫苗的效力。GamTBvac疫苗的免疫原性和保护效力在小鼠和豚鼠结核病模型中使用GamTBvac-prime/boost和BCG-prime/GamTBvac-boost方案进行了评估。结果显示，GamTBvac疫苗表现出强大的免疫原性，并在两种模型中对MTB H37Rv菌株的气溶胶和静脉挑战都展示了极佳的保护。2017年进行了一项I期临床试验（NCT03255278），以评估GamTBvac疫苗的安全性和免疫原性。这项研究包括之前接种过卡介苗的健康志愿者，采用五组的比较安慰剂对照设计，包括两组安全性评估（安全性和便携式研究组；安慰剂安全性研究组）和三个免疫原性评估组，剂量逐渐增加（0.25剂量组、0.5剂量组和1剂量组）。两年后的结果表明，该疫苗候选物具有可接受的安全性概况，0.5剂量疫苗组（含有12.5微克DBD-Ag85a、12.5微克DBD-ESAT6-CFP10、75微克CpG（ODN 2216）、250微克DEAE-葡聚糖500 kDa和5毫克葡聚糖500 kDa）展示了最高的免疫原性，通过IFN-γ体内IGRA反应和IgG ELISA分析显著增加。随后，进行了一项双盲、随机、多中心、安慰剂对照的II期临床试验（NCT03878004），以评估GamTBvac在180名未感染MTB、接种过卡介苗的健康志愿者中的安全性和免疫原性。结果证实了在I期试验中展示的可接受的安全性概况，并表明该疫苗诱导了高水平的抗原特异性IFN-γ、Th1细胞因子和IgG抗体。在前面提到的I期和II期临床试验的有希望的结果基础上，2021年进行了一项III期临床试验（NCT04975737）。这项多中心试验采用了双盲、随机设计，疫苗与安慰剂的比例为1:1。该试验的目的是评估GamTBvac疫苗在预防18-45岁未感染HIV的个体中的肺结核方面的安全性和效力。这项临床试验目前正在招募志愿者，其结果将决定该疫苗是否有潜力用于结核病预防。 3.4.3. H56:IC31 H56:IC31是一种由Valneva Austria GmBH生产的亚单位疫苗，由三种MTB抗原（Ag85B、ESAT-6和Rv2660c）和IC31佐剂组成。研究表明，在小鼠或NHP模型中感染LTBI或ATB后接触H56:IC31可以防止MTB的重新激活，并与接受佐剂或卡介苗的对照组相比显著减少细菌负荷。H56:IC31的安全性和免疫原性已在四项临床试验（NCT01967134、NCT02378207、NCT02503839和NCT01865487）中进行了评估。最初的I期临床试验（NCT01967134）在南非进行，旨在评估H56:IC31疫苗在HIV阴性成年人中的安全性和免疫原性，无论他们是否患有LTBI。该试验的发现表明，该疫苗安全可接种。此外，它成功刺激了抗原特异性IgG抗体的产生，并触发了表达Th1细胞因子的CD4+ T细胞的发展。这些免疫反应观察到在接种疫苗后持续了最多210天。一项Ib期随机安慰剂对照试验（NCT02378207）在南非进行，以评估H56:IC31在健康、接种过卡介苗、HIV阴性青少年中的安全性和免疫原性。该疫苗的整体安全性和耐受性良好，没有发生严重的疫苗相关不良事件。H56:IC31诱导了良好的CD4+ T细胞反应和血清IgG。另一项I/IIa期临床试验（NCT01865487）在南非进行，评估了疫苗的最佳剂量和对感染和未感染MTB的成年人的影响。结果显示，无论剂量（5、15、50微克H56/500纳摩尔IC31）、接种次数或MTB感染如何，免疫原性都是可接受的。两次或三次注射最低剂量的H56:IC31（5微克H56/500纳摩尔IC31）在感染和未感染MTB的成年人中诱导了持久的抗原特异性CD4+ T细胞反应。在另一项随机、开放标签的I/II期临床试验（NCT02503839）中，主要评估了H56:IC31在肺结核和肺外结核患者中的安全性和免疫原性，以及H56:IC31和环氧合酶-2抑制剂（依托考昔）联合应用的情况。结果显示，H56:IC31诱导了抗原特异性T细胞的强烈扩增和更高的血清转化比例。值得注意的是，依托考昔的联合应用不仅未能增强免疫反应，而且还减少了H56:IC31诱导的T细胞反应。这些数据表明，在接种疫苗的个体中，H56:IC31的给药是可行且耐受良好的，展示了进一步临床开发的有希望的安全性概况。这些临床试验还表明，H56:IC31疫苗在不同程度LTBI感染的人群中展示了出色的免疫原性。 目前正在进行的IIb期双盲、随机、安慰剂对照试验（NCT03512249）旨在进一步评估H56:IC31在减少HIV阴性成年人结核病复发方面的安全性和有效性。该试验计划招募900名参与者，但尚未招募志愿者。 3.4.4. H4:IC31 (AERAS-404) H4:IC31疫苗，也称为AERAS-404，是由SSI、赛诺菲巴斯德、Valneva和Aeras共同开发的，由重组融合蛋白Ag85B-TB10.4（H4）和IC31佐剂组成。临床前研究表明，H4:IC31可以为动物提供对肺结核的保护。此外，在人体研究中，该疫苗已被证明可以刺激抗原特异性CD4+ T细胞，导致分泌重要的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-2。在瑞士（NCT02420444）、南非（NCT02109874）、瑞典（NCT02066428）和芬兰（NCT02074956）的HIV阴性、卡介苗未接种的成年人以及南非的HIV未感染、HIV未暴露、卡介苗初种的婴儿（NCT01861730）中进行了几项评估H4:IC31安全性和免疫原性的I期临床试验。这些临床试验产生了类似的结果，表明H4:IC31在人类中是安全的，并诱导产生IFN-γ和多功能CD4+ Th1反应。2020年，在南非开普敦进行了一项Ib期随机临床试验（NCT02378207）。该试验的目的是评估三种不同的疫苗方案：H4:IC31、H56:IC31和卡介苗重新接种的安全性和免疫反应。这项研究涉及481名未感染MTB的青少年。结果显示，H4:IC31和H56:IC31疫苗均诱导了针对Ag85B的CD4+ T细胞介导的细胞免疫反应和H4和H56抗原特异性IgG抗体，但未检测到抗原特异性CD8+ T细胞反应。此外，在2014年，进行了一项随机、安慰剂对照、部分盲法的II期临床试验（NCT02075203），以评估H4:IC31和卡介苗重新接种在预防HIV阴性、QFT-GIT阴性、之前接种过卡介苗的西开普地区青少年的MTB感染方面的安全性、免疫原性和效果。结果显示，H4:IC31疫苗和卡介苗疫苗组之间严重不良事件的发生率没有临床上的显著差异[88]。H4:IC31疫苗和卡介苗都被发现具有免疫原性。然而，QuantiFERON-TB Gold In-tube检测（QFT）的转化率在H4:IC31疫苗接种者（30.5%）中低于卡介苗接种者（45.4%）。 3.4.5.ID93+GLA-SE (QTP101) 由美国传染病研究中心开发的ID93+GLA-SE疫苗由三种与MTB毒力相关的抗原（Rv2608、Rv3619、Rv3620）、一种与潜伏相关的抗原（Rv1813）和GLA-SE佐剂组成。ID93+GLA-SE可以刺激CD4+ T细胞分泌高水平的Th1细胞因子，从而在接种和未接种卡介苗的小鼠和豚鼠中产生保护性的抗结核效果。在美国进行了一项I期随机、双盲、剂量递增的临床试验（NCT01599897），以评估健康成年人中两剂ID93抗原单独或与两剂GLA-SE佐剂联合使用的安全性和免疫原性。结果显示，所有剂量的单独ID93和ID93+GLA-SE均可接受安全性，并且ID93与佐剂GLA-SE联合使用可诱导强烈的抗体和CD4+ T细胞免疫反应。随后在南非进行了一项I期随机、对照、安慰剂对照、剂量递增的试验（NCT01927159），以评估其在HIV阴性、接种过卡介苗的健康成年人中的安全性和免疫原性。结果显示，在所有抗原和佐剂剂量水平上均表现出良好的安全性。此外，接种ID93+GLA-SE疫苗诱导了高水平和持久的抗原特异性CD4+ T细胞和IgG反应。此外，一项在南非开普敦完成的IIa期随机、双盲、安慰剂对照的临床试验（NCT02465216），旨在评估ID93+GLA-SE在完成治疗后的HIV未感染成人结核病患者中的安全性和免疫原性。结果显示，ID93+GLA-SE诱导了强烈和持久的抗体反应和抗原特异性、多功能CD4+T细胞反应，与安慰剂组相比，两剂2微克ID93 + 5微克GLA-SE剂量诱导的抗原特异性IgG和CD4+ T细胞反应水平显著更高，反应持续6个月。未观察到与疫苗相关的严重不良事件。目前正在韩国进行一项IIa期随机、双盲、安慰剂对照试验（NCT03806686），以评估接种过卡介苗的健康医疗工作者中ID93+GLA-SE疫苗的安全性、免疫原性和效力。该研究尚未招募志愿者。这些临床试验评估了不同人群中ID93+GLA-SE的安全性和免疫原性，所有试验均显示出良好的安全性和免疫原性，为进一步的临床试验提供了有力的证据。然而，这些试验的样本量小限制了统计差异的准确估计。 3.4.6. AEC/BC02 AEC/BC02是一种重组亚单位结核病疫苗，包含两个主要成分：MTB Ag85b和一个名为ESAT6-CFP10的融合蛋白。它与一种名为BC02的CpG和基于铝的佐剂系统结合使用。该疫苗由中国北京国家食品药品监督管理总局开发，并由安徽智飞龙科马生物制药有限公司（中国合肥）生产。在BALB/c小鼠模型中对AEC/BC02疫苗的免疫原性和效力进行了初步评估，表明AEC/BC02可以诱导强烈的细胞免疫反应，在小鼠中产生高频率的抗原特异性干扰素-γ分泌T细胞。此外，在豚鼠预防模型中，AEC/BC02未能预防MTB感染，但诱导Koch现象的风险较低。然而，在豚鼠潜伏感染模型中，AEC/BC02有效控制了结核分枝杆菌的重新激活，并减少了肺部和脾脏中的细菌负荷。这些结果表明，AEC/BC02可能预防潜伏感染的重新激活，并可能作为治疗性疫苗。随后的一项研究验证了AEC/BC02疫苗对小鼠MTB潜伏感染的治疗效应，并发现AEC/BC02疫苗免疫疗法显著减少了小鼠肺部和脾脏中的细菌负荷，这可能与AEC/BC02诱导的抗原特异性IFN-γ和IL-2细胞免疫反应有关。这些临床前研究表明，AEC/BC02疫苗在预防和治疗LTBI方面具有巨大潜力。因此，2017年进行了一项I期临床试验（NCT03026972），由中国安徽智飞龙科马生物制药有限公司赞助，评估AEC/BC02疫苗的安全性。该研究旨在招募四组参与者：第一组包括25名结核病-PPD阴性和IGRA阴性志愿者，他们将接受安慰剂、低剂量佐剂或低剂量疫苗的干预；第二和第三组每组30名结核病-PPD阴性和IGRA阴性，他们将接受安慰剂、高剂量佐剂或高剂量疫苗的干预；第四组由50名结核病-PPD阳性和IGRA阳性的参与者组成，他们将接受安慰剂、低剂量佐剂、高剂量佐剂、低剂量疫苗或高剂量疫苗的干预。此外，2020年1月在中国湖北进行了一项Ib期、单中心、单剂量、安慰剂对照的临床试验（NCT04239313），评估健康成年人中AEC/BC02疫苗的安全性和免疫原性。与NCT03026972不同，NCT04239313招募了结核病-PPD阴性和IGRA阴性的参与者，主要评估低剂量疫苗和低剂量佐剂的安全性。这两项临床试验已完成参与者招募，但结果尚未发布。 2022年3月，在中国湖南启动了一项II期双盲、随机、对照临床试验（NCT05284812），以评估AEC/BC02疫苗在18岁及以上LTBI个体中的安全性、耐受性和免疫原性。该研究计划招募200名受试者，主要结果指标是肌肉注射后的不良事件数量，次要结果指标是抗原特异性总IgG抗体水平和抗原特异性干扰素-γ水平的变化。该试验目前正在招募志愿者。 3.5. 基于病毒载体的结核病疫苗 基于病毒载体的结核病疫苗是一种将MTB的保护性抗原转移到相对安全的病毒载体中，以实现有效且持久的免疫保护的疫苗。基于病毒载体的结核病疫苗具有高安全性、易于制造和低成本的优势，并且可以携带较大的基因片段。然而，也存在一些缺点，如毒力恢复和外源基因表达不稳定。用于开发结核病疫苗的常见病毒载体包括改良的天花病毒安卡拉株（MVA）、流感病毒、血凝病毒、腺病毒Ad5和Ad35、仙台病毒和猴腺病毒。目前正在进行临床试验的基于病毒载体的结核病疫苗包括MVA85A、ChAdOx1.85A、TB/FLU-01L、TB/FLU-04L和AdHu5Ag85A（表1）。 3.5.1. MVA85A MVA85A疫苗是由Aeras和牛津大学开发的一种活性病毒载体疫苗，使用天花病毒安卡拉株作为载体表达MTB抗原85A并诱导T细胞免疫反应。临床前研究表明，MVA85A可以在动物模型中刺激细胞和体液免疫反应，并对小鼠、豚鼠、牛和猕猴的结核病提供免疫保护。2007年，在南非开普敦进行了一项I期临床试验（NCT00460590），以评估健康志愿者中MVA85A的安全性和免疫原性。结果显示，该疫苗耐受性良好，并诱导了持久、强烈和抗原特异性的CD4+ T细胞反应。临床试验还评估了MVA85A在儿童和婴儿中的安全性、免疫原性和效力。儿童是结核病增强疫苗的目标人群，但他们通常有较高的寄生虫负担。2014年，进行了一项II期临床试验（NCT00679159），以评估MVA85A在南非接种过卡介苗的健康儿童和婴儿中的安全性和免疫原性。七年后，该试验的结果发表，并表明MVA85A疫苗在婴儿中安全并产生了强烈、多能、持久的CD4和CD8 T细胞反应。不幸的是，这项临床试验没有揭示儿童中MVA85A疫苗的安全性和免疫原性。2009年，一项随机、安慰剂对照的IIb期临床试验（NCT00953927）评估了在2794名之前接种过卡介苗且未感染HIV的新生儿中MVA85A的安全性和免疫原性。结果于2013年发表在《柳叶刀》上，显示尽管接受MVA85A的婴儿比安慰剂组（89%对45%）有更高的轻度不良事件发生率，但两组之间在系统性和严重不良事件的发生上没有显著差异。此外，该疫苗对结核病的效力为17.3%（95% CI，从-31.9%到48.2%），对结核感染的效力为-3.8%（95% CI，从-28.1%到15.9%）。 MVA85A对婴儿结核病或感染的缺乏效力与之前的动物研究不一致，可能归因于婴儿免疫系统建立不完全，导致对MVA85A的有效免疫反应能力不足。由于感染HIV的新生儿被禁止接种卡介苗，因此需要一种新的结核病疫苗来预防HIV感染的新生儿中的结核病，并避免与卡介苗接种相关的潜在风险。2018年，在南非进行了一项II期双盲、随机、对照试验（NCT01650389），评估了HIV暴露的新生儿中MVA85A疫苗的安全性和免疫原性。结果显示，该疫苗安全，并诱导了早期适度的抗原特异性免疫反应。然而，该试验没有评估MVA85A疫苗对HIV暴露的新生儿中结核病的保护效力，因此无法与NCT00953927临床试验的结果进行比较。这些有希望的结果支持评估MVA85A在预防婴儿结核病中的效力。 3.5.2.ChAdOx1.85A ChAdOx1.85A是一种表达MTB抗原Ag85A的基于猴腺病毒载体的结核病疫苗。在一项临床前研究中，研究人员使用小鼠模型评估了ChAdOx1.85A的免疫原性和保护效果。ChAdOx1.85A的鼻内给药在小鼠中诱导了显著更高水平的IFN-γ和TNF-α分泌来自CD4+和CD8+ T淋巴细胞。然而，与阴性对照相比，单独ChAdOx1.85A免疫并没有显著减少小鼠器官中的MTB负荷。先前接种卡介苗后再接种ChAdOx1.85A和AMVA85A增强了免疫保护。在另一项动物实验中，接种ChAdOx1.85A单独的小鼠肺部的CFU与未接种疫苗的组相比没有显著减少。接种卡介苗的小鼠肺部CFU减少了（p = 0.0059），并且从随后的ChAdOx1.85A免疫中没有显著获益。此外，BCG-ChAdOx1.85A-MVA85A初免-增强方案与对照组相比进一步提高了保护效果。来自动物实验的数据表明，与单独卡介苗或ChAdOx1.85A相比，BCG-ChAdOx1.85A-MVA85A初免-增强方案在小鼠中提供了更大的保护。基于这些结果，大多数ChAdOx1.85A疫苗的临床试验都使用了BCG-ChAdOx1.85A-MVA85A初免-增强方案。实际上，一项标识为NCT01829490的I期临床试验在英国进行，以评估健康成年人中ChAdOx1.85A疫苗的安全性和免疫原性，无论是否进行MVA85A增强，在接种疫苗后。结果显示，不良反应大多是轻度到中度的，疫苗是安全的[104]。MVA85A增强增强了ChAdOx1.85A疫苗诱导的Ag85A特异性ELISpot和细胞内细胞因子CD4+和CD8+ T细胞反应。2018年，在乌干达进行了一项IIa期随机开放标签试验（NCT03681860），评估不同剂量的ChAdOx1.85A疫苗（5 × 10^9 vp和2.5 × 10^10 vp）在不同年龄组（成人和青少年）中的安全性和免疫原性，并评估BCG-ChAdOx1.85A-MVA85A初免-增强方案在增强保护效力方面的优势。通过主要结果指标的不良事件和对Ag85A的T细胞反应来评估该临床试验的安全性和免疫原性。志愿者招募已经完成，但结果尚未公布。 3.5.3.TB/FLU-01L和TB/FLU-04L TB/FLU-01L是一种减毒流感病毒株Flu NS106，表达MTB抗原ESAT-6。与此同时，TB/FLU-04L是一种表达MTB抗原ESAT-6和Ag85A的截断NS1蛋白的改良流感病毒载体。这两种疫苗是由哈萨克斯坦的生物安全问题研究所（RIBSP）和俄罗斯的Smorodintsev流感研究所（SRII）共同开发的。目前，正在进行多项临床试验，以评估TB/FLU-01L和TB/FLU-04L疫苗的安全性和免疫原性。2017年，在哈萨克斯坦进行了一项随机I期临床试验（NCT03017378），评估36名接种过卡介苗的18-50岁成年人中TB/FLU-01L结核病疫苗的两剂（第1天和第21天）方案的安全性和免疫原性。然而，这项研究的结果尚未报告。 Kira Stosman及其同事的另一项研究在动物模型中评估了TB/FLU-04L疫苗的安全性，并在急性毒性测试中未发现致命影响。在行为、临床症状、食物和水的摄入、体温和体重等重要功能上未观察到病理变化，并且在6.5 log10 TCID50和7.5 log10 TCID50的疫苗中报告的代谢和造血指标也未产生显著影响。这些发现在另一项临床前研究中得到了进一步验证。此外，最近的一项研究在小鼠模型中调查了TB/FLU-04L疫苗的保护效力，并表明单独接种TB/FLU-04L可以诱导与卡介苗相当的保护，并显著增强“卡介苗初免—TB/FLU-04L增强”方案中卡介苗的保护效果。 作为新开发的基于病毒载体的结核病疫苗，TB/FLU-04L在临床前研究中表现出色。2015年，一项I期、随机、双盲、安慰剂对照试验（NCT02501421）调查了在接种过卡介苗的健康成年人中接种两剂TB/FLU-04L（第1天和第21天）的安全性和免疫原性。该试验已完成志愿者招募，但结果尚未公布。 3.5.4.AdHu5Ag85A（前称Ad5Ag85A） AdHu5Ag85A，之前称为Ad5Ag85A，是一种基于重组人类5型腺病毒（AdHu5）的结核病疫苗，设计用于表达MTB的Ag85A抗原。这种重组腺病毒构建物经过E1和E3基因的删除，并包含MCMV启动子（跨越核苷酸1724-2251）、tPA信号序列（跨越核苷酸1573-1676）、MTB Ag85A基因序列（跨越核苷酸685-1572）和SV聚腺苷酸信号（跨越核苷酸483-641）。AdHu5Ag85A的递送可以通过肌肉注射或气雾吸入进行。在小鼠、豚鼠、山羊和牛的PTB模型中进行的研究表明，AdHu5Ag85A作为卡介苗初免后的增强剂或独立疫苗，都显示出效力。然而，AdHu5Ag85A疫苗提供的保护程度取决于免疫途径。2014年，进行了一项调查以评估AdHu5Ag85A疫苗的免疫原性，并检查腺病毒增强剂量和接种途径对其免疫原性的影响。结果显示，通过皮内递送2 × 109感染单位的方案在所有测试方案中产生了最坚定和有力的反应。 这些临床前研究支持AdHu5Ag85A疫苗在人类应用中的进一步临床研究。早在2013年，就进行了一项I期临床试验，评估了在健康成年人中接种AdHu5Ag85A的安全性和免疫原性，这些成年人要么是卡介苗未接种者，要么之前接种过卡介苗。试验结果表明，AdHu5Ag85A通过肌肉注射在人类中是安全的，并且之前接种过卡介苗的志愿者中，AdHu5Ag85A增强疫苗显著促进了多功能CD4+和CD8+ T细胞免疫。两年后，另一项I期临床试验（NCT02337270）在加拿大接种过卡介苗的健康成年人中进行，以评估AdHu5Ag85A的安全性和免疫原性。直到2022年才公布试验结果，显示无论使用低剂量或高剂量的气雾途径免疫或肌肉注射，AdHu5Ag85A疫苗都显示出良好的安全性和耐受性。特别是气雾途径免疫，尤其是低剂量免疫，在呼吸道组织驻留记忆的CD4+和CD8+ T细胞的多功能性上显著诱导。 3.6.结核病DNA疫苗 结核病DNA疫苗是一种创新的疫苗类型，它利用MTB的一小段DNA在宿主生物体中触发免疫反应。为了递送MTB DNA片段，使用含有特定MTB抗原基因的质粒。一旦质粒被引入宿主生物体，DNA片段就被受体细胞同化，并且合成抗原。经过处理后，目标抗原形成抗原肽，与宿主细胞的MHC I类和MHC II类分子结合，并呈现给宿主的免疫识别系统，诱导产生特定的体液和细胞免疫反应，以预防或治疗相应疾病。 作为第三代疫苗，DNA疫苗与第一代（减毒活疫苗、灭活疫苗）和第二代（亚单位疫苗）疫苗相比，具有几个优势：其生产过程廉价、快速、可扩展，研发（研究与开发）快速且灵活，并且在室温下相对稳定，并且可以诱导持久的体液和细胞免疫反应。然而，在应用DNA疫苗时可能需要克服一些障碍：（1）DNA疫苗易于降解，利用率低；（2）不同的生物屏障可以阻碍DNA疫苗到达目标；（3）在人类细胞核中的低表达可能导致DNA疫苗的免疫原性低；（4）它可以诱导身体产生抗DNA IgG，可能引发自身免疫疾病；（5）DNA疫苗的最大风险是外源DNA对人细胞核中DNA的干扰。 进入临床试验的唯一基于DNA的治疗性结核病疫苗GX-70因安全问题而终止（表1）。GX-70 DNA疫苗是由来自MTB的四种抗原质粒以及重组Flt3配体组成的疫苗。延世大学进行了一项开放标签、剂量递增的I期临床试验（NCT03159975），评估GX-70在高风险PTB患者中的耐受性、安全性和免疫原性，这些患者经历了治疗失败或复发。在这个试验中，参与者被分为三组，通过电穿孔到三角肌，每四周接受不同剂量的GX-70疫苗（0.26毫克、1毫克和4毫克），总共接种五次。试验的主要结果指标是确定最大耐受剂量。次要结果指标包括评估IFN-γ反应（由结核病抗原刺激）和监测每毫升皮克克的Flt3L（Flt3配体）浓度。 4.新型结核病疫苗研究的挑战与展望  结核病疫苗的开发目前正处于关键时期，众多学者致力于新型疫苗的探索。尽管出现了许多新的疫苗候选物，但大多数仍处于早期开发阶段，一些已经进行了动物实验。目前，全球只有19种结核病疫苗进入临床试验阶段，这些疫苗的效力仍需进一步评估。然而，开发一种普遍有效的结核病疫苗仍然面临重大挑战。 4.1. 结核病疫苗临床试验的不可持续性 COVID-19的全球爆发显著加快了COVID-19疫苗的开发速度，仅在一年内，全球就有超过10种COVID-19疫苗获得紧急使用批准，创造了疫苗研究历史上的显著里程碑。然而，与这种快速发展形成鲜明对比的是，结核病疫苗的开发过程通常需要10-15年，许多疫苗在后期阶段失败。目前，只有三种结核病疫苗处于I期和IIa期临床试验阶段（GX-70因安全问题已停止），在这一研究领域留下了巨大的空白。这引起了真正的担忧，即如果目前处于IIb期和III期试验阶段的疫苗，如M72/AS01E疫苗，没有显示出显著的效力，那么在新型结核病疫苗领域可能会有有限的“计划B”选项。因此，世界可能需要多种新疫苗来应对全球结核病的严重负担。即使候选疫苗在III期试验中显示出有希望的保护效力，它们也不应该被视为进一步研究的终点。相反，我们需要更深入地了解MTB与宿主之间的相互作用机制，加强临床前和早期临床研究的规划，并培养更多的候选疫苗种子，因为这些对于结核病疫苗的成功开发至关重要。 4.2. 选择适当的免疫原性抗原表位是结核病疫苗研究的重点和挑战 被宿主的巨噬细胞和树突状细胞等APCs吞噬后，MTB不能直接呈现给适应性免疫细胞以触发适应性免疫反应。相反，它在APCs内被降解成数千个肽片段，并通过MHC分子呈现给CD4+和CD8+ T细胞。目前，结核病疫苗的抗原表位筛选正处于瓶颈阶段。应该为表位预测选择哪些MTB抗原？如何选择最具免疫原性的抗原表位？是否需要结合多种抗原表位，如HTL、CTL和B细胞表位？如何确定这三种细胞表位的排列顺序和比例？哪种抗原能获得更好的免疫原性？这些是抗原表位选择中需要解决的紧迫问题。近年来，随着生物信息学和免疫信息学技术的快速发展，从在动物实验中已证明具有良好免疫原性和保护效率的MTB抗原中预测HTL、CTL和B细胞表位已成为可能，成本低廉。 此外，在预测、筛选和鉴定表位时，必须考虑MTB抗原在不同阶段的表达特征。以前的研究表明，与结核病患者相比，LTBI个体对更多潜伏抗原表现出更强的IFN-γ反应。因此，基于这一发现，可以对LTBI人群进行进一步研究，以验证对某些潜伏抗原的强烈T细胞反应及其与结核病潜伏期的关系。因此，在候选抗原的选择中，根据疫苗的目标人群，如健康个体、LTBI人群或ATB患者，有必要选择在MTB潜伏和增殖阶段表达的抗原。 4.3. 缺乏针对孕妇的结核病疫苗临床试验 女性中结核病的最大风险与生育年龄相吻合，每年有超过20万名孕妇受到ATB的影响。美国孕妇LTBI的患病率为4.2%，在印度的HIV阴性女性中为19%至34%，在南非的HIV阳性女性中高达49%。以前的研究发现，孕妇和产后妇女患结核病的风险比一般人群更高，孕期结核病对母亲和胎儿的健康和生命构成威胁。这些数据表明，孕妇是ATB和LTBI的高风险人群。然而，遗憾的是，目前处于临床研究阶段的19种结核病疫苗针对各种人群，包括婴儿、儿童、青少年、成人和老年人，但不包括孕妇。系统地将孕妇排除在结核病疫苗临床试验的目标人群之外主要是基于对孕妇的“保护”观念。然而，随着对孕期研究伦理态度的演变，逐渐认识到以保护为名排除孕妇实际上使她们面临更高的结核病风险。相比之下，其他传染病疫苗的临床试验已经将孕妇作为目标人群，如戊型肝炎、HIV和百日咳。 4.4. 结核病疫苗临床试验评估终点的争议 确定标准化的终点评估标准是临床试验中评估结核病疫苗的另一个关键问题。目前，缺乏明确标准来定义终点事件导致结核病疫苗评估标准的差异。在评估LTBI时，常用的两种方法是干扰素-γ释放试验（IGRAs）和结核菌素皮肤试验（TSTs）。尽管TST结果可能受到卡介苗接种和非结核分枝杆菌（NTM）感染的影响，但其操作简单且成本低廉，因此在发展中国家，特别是在极度贫困的国家得到了广泛采用。IGRAs则利用不受卡介苗接种或NTM感染影响的抗原（ESAT-6和CFP-10）。然而，IGRAs操作更复杂，成本更高，使其更适合在发达国家实施。因此，在发展中国家进行的结核病疫苗临床试验可能倾向于使用TST作为LTBI评估方法，而发达国家可能更倾向于使用IGRAs。此外，随着技术的进步，TST和IGRAs都引入了新的方法和技术，如Diaskintest、C-Tb皮肤试验、EC-Test、T-SPOT.TB、QFT-GIT、QFT-Plus和LIAISON QFT-Plus。这些不同的方法在LTBI的敏感性、特异性和诊断性能上存在差异。因此，选择哪种方法用于LTBI评估将直接影响疫苗保护的评估值。 4.5. 疫苗佐剂或递送系统的选择对结核病疫苗的免疫原性和保护效力至关重要 佐剂可以通过作为免疫刺激剂增强对抗原的免疫反应。它们还可以作为载体将抗原递送到适当的免疫细胞，从而提高体内免疫保护。理想的佐剂可以减少疫苗接种的频率，降低每剂疫苗的抗原剂量，改善免疫反应的质量，促进交叉免疫，并在某些情况下增强最终疫苗配方的稳定性。在过去的七十年中，包括氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾在内的铝盐在疫苗配方中证明了其安全记录。这些佐剂最初在20世纪30年代、40年代和50年代与白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎疫苗一起使用，因为科学调查揭示了它们增强免疫系统对这些免疫接种的反应的能力。系统回顾与荟萃分析综合分析了含铝的白喉、破伤风和百日咳（DTP）疫苗免疫后的不良事件，并发现没有充分的证据将疫苗中铝盐的使用与重大或持久的不良事件联系起来。 随着随后的进步，新的佐剂被设计出来，以精确针对身体免疫反应的不同方面，从而加强和延长疾病保护。目前，临床阶段结核病疫苗中的佐剂包括TLR-9激动剂CpG-ODN1a、脂质体配方和乳液（如AS01、CAF01和GLA-SE）以及其他佐剂如IC31。 4.5.1. 脂质体和乳液 脂质体和乳液目前被用作许多候选结核病亚单位疫苗的递送载体，如M72/AS01E、ID93+GLA-SE和H1:CAF01。这些佐剂通过疏水相互作用自发自组装成颗粒，携带各种疫苗或佐剂配方，可以通过淋巴引流或被APCs吞噬靶向淋巴结，激活先天和适应性免疫反应。此外，这些佐剂具有促进疫苗抗原缓慢释放的能力，它们的囊泡结构作为保护性储库，防止抗原降解。此外，带负电荷的脂质体（阳离子脂质体）的配方允许它们聚集并与带正电荷的抗原结合，进一步增强这种储库效应。然而，脂质体和乳液配方经常表现出与局部反应原性相关的相关性，这强调了在它们能够用于人类应用之前需要进行修改以提高安全性。 M72/AS01E疫苗，被认为是非常有前景的亚单位疫苗，在肌肉注射以乳液形式给药时，在无HIV感染但有LTBI的个体中显示出54%的效力。AS01被认为通过迅速诱导位于引流淋巴结的NK细胞和CD8+ T细胞产生IFN-γ，从而促进强烈的细胞Th1反应，这一理论得到了人类疫苗试验中观察到的稳健的Th1和IFN-γ反应的支持。ID93/GLA-SE疫苗利用了一种在水包油乳液（GLA-SE）中的葡萄糖基脂质佐剂，它作为TLR4激动剂。GLA-SE的佐剂作用依赖于其递送载体，最近的研究表明，单独的GLA引起的IgG2反应类似于单独的水包油乳液，而两者的结合则促进了Th1反应。另一方面，CAF01是由合成的两亲性脂质DDA和TDB组成的脂质体配方。DDA能够自组装成囊泡，TDB则嵌入DDA双层中以稳定脂质体。TDB通过激活Mincle受体发挥强大的免疫刺激作用。一旦Mincle被识别，它与Fc受体共同γ链（FcRγ）相互作用，通过Syk启动细胞内信号传导。这一信号级联导致CARD9依赖的NF-κB激活和下游促炎细胞因子的产生。此外，CAF01通过Mincle依赖的IL-1产生诱导Th1/Th17极化，随后是MyD88信号传导。在H1:CAF01疫苗的临床前试验中，已经证明CAF01佐剂显著增强了IFN-γ的产生，并引发了依赖于Th17的记忆，从而无论在感染前后，都对MTB产生了保护。 4.5.2. TLR-9激动剂CpG-ODN1a和IC31佐剂 TLR-9激动剂CpG-ODN1a和IC31是临床试验中评估的另外两种结核病疫苗佐剂。目前正在进行I/II期临床试验的GamTBvac，利用了鼠李糖偶联物和CpG佐剂，以及一个包含鼠李糖结合域的抗原融合蛋白。鼠李糖有着悠久的医学使用历史，并被FDA归类为“普遍认为安全”（GRAS）。在佐剂环境中，鼠李糖有潜力通过与Langerin、DC-SIGN家族受体和甘露糖受体的相互作用来诱导炎症反应，从而可能激活先天免疫。疫苗的另一个组成部分IC31，由抗菌肽KLKL5KLK（KLK）和TLR9激动剂ODN1a组成。假设ODN1a与TLR9结合，启动TLR9/MyD88依赖途径，并增强APCs产生IL-12。KLK本身具有免疫刺激特性，并且有效地针对细胞内TLRs。 4.5.3. 结核病亚单位疫苗佐剂或递送系统的可能未来应用 如前所述，已经在结核病疫苗的临床前研究中评估了多种新型佐剂和递送载体，如Advax™（三角刺槐糖颗粒）、PLGA、枯草杆菌孢子、壳聚糖及其衍生物、PolyI:C、环状二核苷酸、右旋糖酐、免疫刺激复合物（ISCOMs）、Lipokel（PamCys2和3NTA）、纳米乳液和结合HBHA蛋白的巴西棕榈蜡纳米颗粒。这些佐剂可以广泛地分为三组：纳米或微粒、来自植物或微生物衍生物的佐剂，以及基于递送系统的佐剂。特别值得注意的是Advax™，这是一种独特的植物衍生多糖，制成三角刺槐糖颗粒，已证明能够增强对各种疾病的免疫反应。Advax™表现出高安全性、最小的炎症反应，并诱导包括Th1、Th2、Th17 CD4+亚型以及记忆CD8 T细胞在内的广泛T细胞反应。 重要的是要考虑佐剂的选择起着重要作用，因为不同类型的佐剂激活的先天免疫反应不同，这可能会影响抗原呈递和随后的疫苗反应。因此，了解佐剂的作用机制对于确定不同疫苗最合适的佐剂至关重要。此外，佐剂的实际应用面临几个挑战。免疫刺激剂可能引起不良反应，包括自身免疫疾病，以及免疫反应。此外，由于高免疫耐受性、稳定性差和复杂的制造工艺，许多佐剂在临床开发中失败。 4.6. 结核病疫苗研究中动物模型的选择 动物模型对于理解MTB的体液和细胞免疫反应以及评估候选结核病疫苗的安全性、免疫原性和保护效力至关重要。新的结核病疫苗需要在进行人体临床试验之前，通过动物模型建立其安全性、免疫原性和保护效力。 目前，结核病疫苗研究中采用了多种动物模型，包括小鼠、豚鼠、家兔和非人灵长类动物（NHPs）。小鼠具有成本低、有效性和可得性等优点，包括纯系、杂系和转基因品系。它们是最广泛使用的小动物模型，用于初步筛选结核病疫苗候选物和评估其效力。虽然小鼠对MTB感染的免疫反应与人类相似，但在观察疫苗相关的病理损害方面存在局限性。 豚鼠通常用于评估皮肤反应性、新的结核病疫苗候选物和耐多药MTB的传播能力。它们通过呼吸道对MTB感染高度敏感，并显示出类似于人类的组织病理学特征，包括特征性的干酪性肉芽肿。此外，豚鼠可用于进一步筛选皮肤试验抗原和评估之前在小鼠模型中测试的有前景的疫苗。对豚鼠肺部感染MTB形成的病理损伤进行了广泛研究，为豚鼠PTB研究提供了基础。然而，豚鼠的维护成本较高，免疫学试剂的可用性限制了它们在临床环境中的使用。 家兔模型则广泛用于筛选和评估结核病的潜在疫苗候选物。家兔在MTB感染后发展出与人类相似的肉芽肿、液化和空洞。它们已被用于评估卡介苗、牛结核病疫苗、M. microti和亚单位疫苗等疫苗的效力。此外，家兔模型有助于理解由MTB H37Rv感染引起的空洞形成的致病因素和机制。然而，家兔模型的使用受到成本高、缺乏相关的免疫学试剂、遗传操作和伦理考虑的限制，使其不适合长期存活研究。 NHPs自然对MTB感染敏感，在结核病疫苗和药物开发中有着悠久的使用历史。NHPs，如猴子，与人类有着最密切的进化关系，它们的病理和疾病状态与人类非常相似。猴子感染后会发生广泛的干酪性坏死、液化和空洞形成，以及包含类似于人类肺肉芽肿的巨细胞的肉芽肿。然而，NHPs的使用受到伦理问题、高成本、耗时、显著的个体间变异性、新药批准的不必要性以及空间需求的限制。它们通常用于在临床试验前评估结核病疫苗的安全性、免疫原性和保护效力。 每种动物模型都有其优势和局限性，选择取决于特定的研究目标、可用性、伦理考虑和资源。结合多种动物模型可以更全面地了解结核病疫苗的反应。总之，由于成本低、有效且不同品系可获得，小鼠通常用于初步筛选和评估结核病疫苗候选物。豚鼠提供与人类结核病病理相似之处，对皮试反应和耐多药结核病研究有用，尽管它们的维护和试剂可用性可能具有挑战性。家兔表现出与人类相似的病理变化，被用于疫苗评估和理解空洞化机制。尽管存在伦理和资源考虑，但在临床试验前，NHPs（如猴子）因与人类病理高度相似而被用于安全性、免疫原性和保护效力评估。 通过利用这些不同的动物模型，研究人员可以深入了解结核病疫苗的安全性、免疫原性和保护效力，为在人体临床试验中进一步开发和测试潜在候选物奠定基础。 4.7. 深度学习赋能结核病疫苗研究 深度学习技术在疫苗开发中扮演着越来越重要的角色。疫苗研究中的一个挑战是快速准确地识别具有潜在治疗效果的分子，这是传统实验方法需要大量时间和资源才能实现的任务。通过分析和处理大量的生物数据，并将这些数据与对MTB、细胞和人类免疫系统的深入了解相结合，深度学习技术可以帮助识别具有潜在治疗效果的MTB抗原或表位候选物。具体来说，在结核病疫苗开发领域，深度学习技术可以应用于以下领域：结核病诊断的临床试验纳入标准、MTB蛋白质结构预测、表位预测和筛选、疫苗接种时机的优化和预测，以及免疫谱分析。 4.7.1. 结核病诊断的临床试验纳入标准 临床试验结果异质性的一个原因是缺乏标准化的疾病状态诊断标准和方法。深度学习技术的兴起可能为这一挑战提供了一个有希望的解决方案。深度学习技术可以用于自动和快速检测和诊断结核病病例，针对各种临床生物标志物。这些技术可以应用于自动分析和识别微生物学和成像特征，如在结核病痰液和血液样本中发现的，以及遗传和免疫因子数据。例如，2023年发表在《Insights Imaging》上的一项横断面研究开发了一个深度神经网络（DNN）算法来检测结核病患者的X光结果，区分活动性PTB和非结核性分枝杆菌性肺病（NTM-LD）。该研究表明，基于曲线下面积（AUC）的DNN模型在检测结核病和分枝杆菌性肺病方面表现出稳定的性能。此外，包括决策树、随机森林、支持向量机、贝叶斯方法、逻辑回归和层次聚类在内的各种深度学习算法已应用于LTBI和ATB的区分和诊断，显著提高了诊断效率。 4.7.2. MTB蛋白质结构预测 深度学习模型在生物学中的突破性贡献可以归因于AlphaFold解决了“蛋白质折叠问题”，这被认为是生物学中一个基本且长期存在的挑战。深度学习在结构预测和蛋白质折叠解析方面取得了显著进展，现在通常用于抗体生成，以绕过实验步骤。蛋白质结构预测和免疫原设计在疫苗开发中起着至关重要的作用，几十年来，获得蛋白质结构的唯一手段是通过实验方法。然而，最近的深度学习方法已经能够从氨基酸序列预测结构，实现与实验方法相当的准确性。MTB编码超过4000种蛋白质，如果这些蛋白质结构和蛋白质折叠的挑战能够利用深度学习进行预测，将大大加快MTB基于肽的疫苗的开发，通过识别可以被MHC分子有效识别和呈递的表位。 4.7.3. MTB表位的预测和筛选 深度学习算法在疫苗表位的预测和筛选中发现了广泛的应用。例如，共识方法、NN-align-2.3（netMHCII-2.3）、NN-align-2.2（netMHCII-2.2）、SMM-align（netMHCII-1.1）、Sturniolo、NetMHCIIpan-3.1、NetMHCIIpan-3.2、NetMHCIIpan-4.0和NetMHCIIpan-4.1等算法在预测HTL表位方面取得了显著的成功。同样，存在许多成熟的深度学习算法用于预测CTL表位，包括NetMHCcons、人工神经网络（ANN）、PickPocket、共识、稳定矩阵方法（SMM）、NetMHCstabpan、epiTCR、SMMPMBEC、AttnTAP、NetMHCpan、Comblib_Sidney2008等。丰富的文献支持这些深度学习算法在预测疫苗表位方面的高准确性，从而提高疫苗设计和效力。在以前的研究中，我们利用深度学习算法从IEDB数据库筛选潜在的MTB HTL、CTL和B细胞表位，成功构建了如MP3RT、ACP、PP19128R和HP13138PB等新型结核病疫苗，并在进一步的体外实验后。总之，深度学习技术在疫苗表位的预测和筛选方面具有巨大的潜力，并且由于其适应性和可扩展性，预计将成为未来疫苗设计和优化的重要工具。 4.7.4. 疫苗接种时机的预测和优化 深度学习技术可以用于预测和优化疫苗接种的时机和剂量，确定最佳时间和剂量。这方面的具体应用包括以下几个方面： 病原体感染和免疫状态监测：病原体感染后，人体启动对病原体的免疫反应，这些反应的时机和强度通常受到感染方式和剂量等各种因素的影响。疫苗接种的时机和剂量选择很大程度上取决于患者的免疫状态。因此，监测患者的免疫状态对于确定疫苗接种的时机和剂量至关重要。深度学习技术可以应用于监测患者的免疫状态和病原体感染，为优化疫苗接种时机提供准确的预测和建议。例如，医学研究人员可以利用深度学习技术对各种诊断数据进行全面分析，包括病原体检测和免疫学评估，预测免疫系统反应的时机和强度，从而确定疫苗接种的最佳时机。 T细胞表位免疫原性预测：深度学习技术可以应用于准确分析T细胞免疫反应的复杂性，并预测未来免疫反应的强度和时机。以结核病疫苗为例，结核病的特点是慢性感染。MTB感染后，在宿主体内长期存在，并在适当的时候触发免疫反应。因此，预测MTB潜在抗原表位的免疫原性是构建理想疫苗的关键方面。深度学习技术可以从多个角度进行T细胞表位免疫原性预测，包括基于深度神经网络的模型，如DeepImmuno-CNN、DeepImmuno-GAN、DeepNetBim和DeepHLApan。这些模型可以根据潜在的免疫因素预测未来T细胞反应的免疫原性，从而提出更合理的疫苗接种时机和策略。 疫苗剂量选择：利用深度学习技术分析和预测患者的免疫状态，可以帮助医生就疫苗剂量和接种做出更好的决策。深度学习可以考虑患者体重、年龄和疾病状况等因素，预测最佳疫苗剂量，从而确定最佳的疫苗接种时机和策略。 需要注意的是，深度学习技术在疫苗接种时机预测和优化方面仍处于发展阶段，需要大规模数据和验证来支持其应用。此外，疫苗接种时机的决策过程通常涉及多个因素的综合考虑，包括个体免疫状态、疫苗安全性和疫苗供应。因此，在实际应用中，深度学习技术的结果应与临床判断相结合，共同确定最佳疫苗接种时机。 4.7.5. 免疫谱分析 免疫谱数据的增长与深度学习的发展相一致，这使我们能够仅从测序数据中预测免疫反应特征或疾病结果。有趣的是，在不断增长的免疫谱数据基础上训练的深度学习模型能够预测免疫疗法中的治疗效果和感染状态。因此，如果能够将结核病疫苗临床试验中获得的大量数据进行全球性的汇总和整合，形成特定于结核病疫苗的免疫谱数据，并基于这些数据训练深度学习模型，就有望解决当前结核病疫苗评估中标准有限和显著异质性的挑战。 4.8. 结核病mRNA疫苗 mRNA疫苗是一种结合分子生物学与免疫学的技术。这项技术与基因疗法密切相关。通过表达系统将编码抗原的外源mRNA引入细胞，合成的抗原可以在体内引发免疫反应（图5A）。mRNA疫苗具有其他疫苗所不具备的特定优势。首先，mRNA理论上可以满足编码和表达各种蛋白质的所有遗传信息要求。通过mRNA序列的修改，可以优化疫苗的发育效率，使其比其他类型的疫苗修改更为方便。其次，尽管编码的抗原不同，但大多数mRNA疫苗的生产和纯化过程非常相似，这使得保留甚至标准化这些过程成为可能，以利于其他类似mRNA疫苗的开发。此外，体外转录的使用使mRNA疫苗的生产更加容易。然而，mRNA也面临着mRNA不稳定、过度免疫原性和缺乏有效的mRNA递送系统的挑战。mRNA疫苗可以与佐剂结合使用，以增强对抗原的免疫反应。佐剂的添加可以增强免疫原性，提高抗体滴度，改变抗体类型，并增强迟发型超敏反应。由于mRNA疫苗的不稳定性，mRNA疫苗的引入需要一些载体的辅助。因此，科学家们已经开发了基于脂质的递送、基于聚合物的递送、基于肽的递送、类病毒复制粒子递送和阳离子纳米乳液递送等。此外，裸mRNA疫苗也可以直接注射到细胞中。到目前为止，已经深入研究了各种形式的递送载体和修饰mRNA，以测试它们的治疗效果，特别是在COVID-19流行期间。mRNA疫苗的大规模生产趋向于产业化。大规模生产的规模依赖于转化科学，这对于加速生产速度至关重要。在体外，转化技术可以快速选择制剂和结构，在临床前和临床研究中。 图 5. 展示了mRNA结核病疫苗和基于VLP的结核病疫苗的生成。在(A)中，获取编码MTB目标蛋白的DNA，并将其转录成mRNA。然后，将mRNA装载到脂质纳米颗粒和其他载体中，以创建用于肌肉注射的结核病mRNA疫苗。当这些mRNA疫苗注入人体时，旁观者细胞中的核糖体协助翻译目标蛋白。旁观者细胞吞噬产生的蛋白，激活先天和适应性免疫反应以消除MTB。在(B)中，将病毒的衣壳蛋白克隆到表达载体中。然后，修改表达载体以包含MTB蛋白，如ESAT-6或CFP-10。结果得到的表达载体包含衣壳蛋白和MTB蛋白。将其转化或转染到表达系统中以产生蛋白质。最后，MTB蛋白组装成VLPs，形成基于VLP的结核病疫苗。 2004年的一项研究首次证明，使用体外合成的RNA，表达结核分枝杆菌MPT83抗原的DNA或mRNA疫苗可以在小鼠中诱导特定的体液和T细胞免疫反应，并可以诱导抗原特异性的细胞介导和体液免疫反应。然而，它们的保护效力并不优于卡介苗。这项研究的结果表明，mRNA疫苗实现了特定免疫反应的启动。RNA免疫观察到的短暂表达可能会最小化DNA疫苗接种中提出的许多安全问题。然而，RNA免疫似乎会导致短期保护性免疫。因此，这种方法可以是一个重要的工具，通过结合体内增强免疫反应的有效策略和不同载体，开发更安全、更有效的结核病疫苗。 2022年，一项研究提出了一个假定的mRNA疫苗MT.P495，该疫苗针对结核分枝杆菌的磷酸盐结合蛋白PstS1。这项研究使用了几个针对MTB的磷酸盐结合蛋白PstS1的生物信息学工具，并且已经在计算上测试了其引发免疫反应和安全性的能力，预测了该抗原中存在的几种T细胞和B细胞表位及其在宿主体内产生免疫反应的能力。PstS1蛋白是一种免疫优势蛋白，TLR-2激动剂，无机磷酸盐摄取脂蛋白，存在于MTB细胞膜表面，并且作为粘附分子通过甘露糖受体（MR）促进与巨噬细胞的结合。因此，这个mRNA疫苗模型作为一个模型，已经准备好由实验者和工业界进行体内测试。所有上述结果表明，所提出的mRNA疫苗候选物MT.P495可能会引发强烈的免疫反应，特别是针对MTB。为了将来开发可行的MTB疫苗，这种模型化的mRNA是一个很好的疫苗模型，可以立即用于实验室测试，包括体外和体内研究。 目前，在国家卫生研究院的资助下，国际艾滋病疫苗倡议（IAVI）正在与Moderna合作，探索使用mRNA疫苗技术开发结核病疫苗的潜力。IAVI/Moderna mRNA结核病疫苗构建正在进行临床前评估。 4.9. 基于病毒样颗粒（VLP）的结核病疫苗 病毒样颗粒（VLPs）指的是由于病毒衣壳、核心或包膜蛋白的表达而自我组装成的颗粒，甚至包括从多层病毒制备的单层颗粒。基于VLP的疫苗是一类具有病毒结构但不具有病毒复制能力的疫苗。与减毒疫苗和病毒载体疫苗相比，它们被认为更安全（图5B）。基于VLP的疫苗具有几个优势：(1) 由于它们与原生病毒非常相似，因此具有高度的免疫原性。这意味着它们可以刺激包括体液（抗体介导的）和细胞免疫反应在内的强烈免疫反应。免疫系统将VLP识别为外来入侵者，并进行防御，产生抗体和记忆T细胞，提供持久的保护。(2) 由于不含可能引起感染的病毒遗传物质，基于VLP的疫苗被认为是安全的。它们不能在宿主内复制，因此不会引起它们模拟的疾病。这种安全性消除了实际感染的风险，同时仍然引发强烈的免疫反应。(3) 基于VLP的疫苗已被证明具有良好的稳定性，并且可以使用已建立的生物制造工艺进行生产。它们可以大规模生产，使它们可能适用于大规模疫苗接种活动。然而，基于VLP的疫苗的发展也遇到了各种障碍，包括与稳定性、下游处理复杂性、对环境条件的敏感性和高生产成本有关的问题。 目前，已有基于VLP的疫苗获得批准，用于预防人类三种不同的病毒感染，即乙型肝炎病毒（HBV）、戊型肝炎（HEV）和人乳头瘤病毒（HPV）。有趣的是，有多达九种基于VLP的疫苗专门获得批准用于预防HBV，包括乙型肝炎疫苗（HEPLISAV-B®）、Recombivax HB、Heberbiovac HB、Euvax B、GenVac B、Hepavax-Gene和GenHevac B。 随着VLP技术在开发各种疾病疫苗方面的不断进步，它现在进入了结核病疫苗开发领域。目前，有四种基于VLP的结核病疫苗，即LV20 VLPs、HBc-ESAT-6 (HE6)、ESATVLPs和HBc-VLP-CFP-10，正在进行临床前开发。 5.结论  结核病是最致命的传染病之一，由于HIV共感染和耐药菌株的出现，其预防和控制面临着前所未有的挑战。疫苗接种是通过减少活动性结核病的发病率来应对这一挑战的最经济有效和高效的方法。然而，唯一的结核病疫苗卡介苗的保护效力不足，迫切需要开发新型结核病疫苗。目前，有19种新型结核病疫苗处于不同的临床试验阶段，包括4种处于I期（AdHu5Ag85A、GX-70、TB/FLU-01L和TB/FLU-04L）、3种处于IIa期（ID93+GLA-SE、AEC/BC02和ChAdOx1.85A）、5种处于IIb期（RUTI、DAR-901、H56:IC31、H4:IC31和MVA85A）以及5种处于III期（MIP、SRL172、MTBVAC、VPM1002和M72/AS01E）。尽管新型结核病疫苗的研究取得了进展，但仍存在几个挑战，包括结核病疫苗临床试验的可持续性差、抗原表位选择困难、孕妇被排除在现有的结核病疫苗试验之外、评估结核病疫苗临床试验终点的争议、疫苗佐剂和递送系统选择有限，以及缺乏合适的动物模型来评估结核病疫苗，特别是基于表位的疫苗。此外，新技术的应用为结核病疫苗研究提供了新的方向，如mRNA疫苗和疫苗研究中的深度学习的使用。 尽管结核病疫苗开发领域面临众多挑战，包括经济、政策和社会制约因素，但必须认识到新型结核病疫苗的开发是一项促进人类福祉的公共卫生事业。政府和国际组织应提供有力支持，并积极促进这一领域的国际合作与交流。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。