Imlifidase

敬请光临 北京朝阳悠唐皇冠假日酒店 2024年7月26-27日（周五、周六） 文末扫码免费参会（名额有限先到先得） RHINOBIO ·展位信息· RHINOBIO ·参展产品· RhinoBio目前有较为成熟的九个产品系列，均为生物制药研发和生产过程中必备的工具试剂。 一 内毒素检测 01) 重组C因子内毒素检测试剂盒，货号：RAF-01/RAF-02 Rhinogen® 重组C因子内毒素测定试剂盒是一种不依赖于动物源性成分，灵敏度高、特异性高、可稳定且持续提供的替代鲎试剂的内毒素测定试剂，具有如下特性： 终点荧光测定，与其他定量LAL方法相当； 液体试剂易于使用； 灵敏度范围0.005-5EU/ml； 内毒素特异性，无G因子旁路干扰； 消除了对动物源试剂的依赖，符合3R的替代原则； 重组表达生产，产品批间一致性良好； 不依赖动物源性成分，提供更高的供应安全性； 本试剂盒可替代传统鲎试剂用于人用和动物用注射药物（如化学药品、放射性药物、抗生素类、生物制品等）及医疗器械（如透析液、植入式器械等）的原辅材料、中间产品、放行产品的内毒素检测。 数据展示 02) 重组鲎试剂内毒素检测试剂盒，货号：RAF-03 Rhinogen® 重组鲎试剂(Recombinant Cascade Reagent，rCR)采用基因重组技术表达鲎血细胞中的C因子(Factor C)、B因子(Factor B)和凝固酶原(Proclotting enzyme)，具有以下特点： 与动态显色法内毒素检测试剂操作流程一致，检测设备相同，分析方法一样； 检测方便，单步复溶； 在96孔板中检测，操作方便，且高通量； 灵敏度范围为0.005~5EU/ml； 内毒素特异性，无G因子旁路干扰，避免结果出现假阳性； 消除了对动物源试剂的依赖，且符合3R的替代原则，提供更高的供应安全性； 重组表达生产，产品批间一致性良好。 二 蛋白结构表征 01) PNGase F(Glycerol-free)，货号: QPF-001 Rhinogen® PNGase F (Glycerol-free)是一种高度纯化和非常稳定的内切糖苷酶，具有稳定性高、比活性高等特点。适用于蛋白质组学及糖生物学研究中糖蛋白上N-连寡糖链的有效释放。 高纯度：没有污染蛋白酶/其它糖苷酶，纯度≥95％； 高稳定性：每批产品都经过严格的质量控制，以实现产品批间稳定性； 高比活性：有效和完全的释放N-连聚糖； 与下游HPLC、质谱兼容：不含甘油，酶切体系与HPLC及质谱工作流程环境兼容。 数据展示 除了上述的重组PNGase F糖苷酶，我们还可以提供固定化 PNGase F，用于样品中N-聚糖的释放。 Rhinogen® Immobilized PNGase F，Microspin，货号QPF-101。以琼脂糖为基架，提供了预填充固定化的PNGase F的柱子，可在柱内直接酶切，酶切产物可用离心的方法收集。 另外我们还推出了新品: Rhinogen® Quick™ PNGase F-Plus，货号：QPF-019。试剂盒中除了PNGase F外，还提供Quick™反应增强剂，并配有还原和非还原两款反应缓冲液，可缩短酶切时间至60min以内，且兼容LC和LC/MS。 02) IdeS protease，货号：QIP-001 Rhinogen® IdeS protease是一种高度纯化和非常稳定的重组蛋白酶，具有稳定性高、比活性高等特点，适用于重组抗体药物的结构表征分析。 高比活性：有效切割抗体下铰链，获得F(ab')2和Fc片段； 广泛的底物特异性：除对人IgG1~4、猴、羊、兔IgG有酶切活力外，还对小鼠IgG2a、IgG3具有特异性切割活性； 无动物源性：重组生产，无外源性的病毒污染，生产过程不使用任何动物源原料； 高稳定性：每批产品都经过严格的质量控制，以实现产品批间稳定性。 数据展示 除了上述的重组IdeS抗体特异性蛋白酶，我们还可以提供固定化IdeS： Rhinogen® Immobilized IdeS，Microspin，货号QIP-101。 以琼脂糖为基架，提供了预填充固定化的IdeS的柱子，可在柱内直接酶切，酶切产物可用离心的方法收集。 Rhinogen® Immobolized IdeS Cut-Pure Kit，Microspin，货号QIP-102。试剂盒中有两个离心柱，可分别用于酶切和纯化F(ab')2 和Fc/2。 03) O-糖蛋白酶，货号：QPF-008&QPF-013 O-糖蛋白酶是一组种类不断增加、高度特异性的内切蛋白酶，可识别并切割糖肽/糖蛋白上，与O-糖基化丝氨酸或苏氨酸相邻的肽键。对O-糖蛋白酶酶切产生的糖肽进行MS分析，可获得有关蛋白序列中O-糖基化位点和每个糖基化位点上连接的O-糖链结构的重要信息。 三 生物学活性检测 01) Cell Titer Turbo 2.0 Luminescent Cell Viability Assay，货号：RA-GL11 Rhinogen® CellTiter Turbo 2.0 Luminescent Cell Viability Assay适用于生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖、细胞毒性试验等。其检测灵敏度高、线性范围宽，可兼容少量样品检测以及大量样品的高通量筛选。 方便快速：试剂盒中提供的检测试剂为即用型，读数稳定，检测速度快，完成检测仅需约10分钟； 灵敏度高：能够检测最低10nmol的ATP； 线性范围宽：96孔板中，在50个至25,000个细胞范围内有良好的线性关系，但不同细胞的检测数量上限会有不同； 高通量：可兼容少量样品检测以及大量样品的高通量筛选。 数据展示 02) Bio-Bright™ One-Step萤火虫荧光素酶分析试剂盒，货号：RA-GL07 Rhinogen® Bio-Bright™ One-Step萤火虫荧光素酶分析试剂盒主要适用于萤火虫荧光素酶报告基因系统，具有操作简便、试剂稳定、灵敏度高等特点。 方便：将冻干粉底物与缓冲液简单混合即可使用，检测步骤简单； 快速：检测2-15min内完成； 稳定性好：室温（22-25℃）下本产品的信号半衰期为30分钟； 高灵敏度：能够检测最低10-20mol的荧光素酶。 数据展示 四 支原体检测 01) MycoAlarm™ 支原体检测试剂盒，货号：RA-MT01 Rhinogen® MycoAlarm™ 支原体检测试剂盒采用生化方法进行支原体检测，提供一种快速、灵敏的样品检测方法。 操作简单：仅需20min即可检测细胞培养中是否有支原体污染； 特异性高：不会受到细菌、真菌、酵母的干扰； 发光值高：可以兼容多种发光读数计或者多功能酶标仪； 使用方便：3种组分，增加阳性对照，便于使用； 阳性对照采用重组表达支原体来源特异性酶，避免实验室被阳性支原体污染的可能。 数据展示 02) Myco-Visal™ 一步法快速支原体检测试剂盒，货号：RA-MT03 Rhinogen® Myco-Visal™ 一步法快速支原体检测试剂盒是针对细胞培养物支原体污染的快速检测试剂，使用简单便捷，只需吸取1μl细胞培养液上清加入反应体系中，65℃孵育1小时，肉眼观察即可判定结果。 操作简单：仅需60min即可检测细胞培养中是否有支原体污染； 特异性高：不会受到细菌、真菌、酵母的干扰； 检测灵敏度高：能检测至少500cfu的支原体； 污染性低：反应是在管内进行，反应后无需开盖进行检测，降低污染风险。 结果判断： 65℃反应 60min后，立刻取出反应管，在光线良好的环境中观察（建议以白纸或白色背景），通过反应管溶液颜色的变化，即可判断检测结果。如果溶液为天蓝色，则说明有支原体污染——阳性。如果为紫色，则说明没有支原体污染——阴性。 结果判断展示图 <👆点击图片查看活动详情> 更多精彩福利 FOLLOW US 关注我们 FREE参会 FREE试用 联系我们 👩💻订购热线 📫邮箱：sales@rhinobio.com 📞电话：18912791908 🧑🔬技术支持 📫邮箱：techserv@rhinobio.com📞电话：18662424289

摘要：使用腺相关病毒（AAV）载体的基因转移在过去十年中取得了巨大进展，并成功治愈了血友病A和B等严重疾病。然而，对AAV衣壳抗原或转基因产物的免疫反应仍在阻碍这一进展。旨在减弱T细胞反应的免疫抑制在一些患者中显示出成功，但在其他人中失败，特别是在接受了非常高AAV载体剂量的患者中。尽管最初认为AAV载体只引起低于系统性症状阈值的边缘先天反应，但最近的试验表明，补体激活可能导致严重的不良事件。背根神经节毒性也被发现是高载体剂量的并发症，同样严重的肝毒性也是如此。大多数严重并发症发生在接受非常高载体剂量的患者中，这表明应该探索使用更高效的AAV载体以允许剂量减少或反复给予较小剂量，后者结合抗体或B细胞耗竭措施。 1.  引言 基于腺相关病毒（AAV）载体的基因转移技术在减轻症状甚至治愈由单基因缺陷引起的疾病方面取得了进展，例如Leber先天性黑蒙症，这是一种先天性失明，或由于凝血因子9基因功能丧失突变引起的血友病B。尽管AAV载体的免疫原性较差，并且在小鼠、狗和非人灵长类动物中能持续多年，但接受大剂量注射的人类会针对AAV衣壳或甚至转基因产物产生T细胞和B细胞反应。T细胞可能导致转导细胞的排斥，而B细胞如果产生AAV中和抗体，则会阻止载体的再次成功应用。更糟糕的是，如果抗体中和了可溶性转基因产物，它们可能会干扰传统的蛋白质疗法。通过在基因转移期间或之后给予的免疫抑制剂，部分可以预防针对AAV载体转导细胞的免疫介导排斥。免疫抑制药物改善了AAV介导的基因转移的疗效，但有些患者没有反应，仍然排斥AAV转导的细胞，而其他人不需要药物，但仍然接受治疗，因为目前还无法预测哪些患者会产生破坏性的免疫反应。尽管在过去二十年中，我们对AAV自然感染或不同血清型AAV载体介导的基因转移在不同剂量下应用于不同器官时的先天和适应性免疫反应有了更好的理解，但一些基本问题仍然没有答案。本文综述了AAV引起的不同类型的免疫反应，以及它们如何转化为缺乏疗效甚至更糟的毒性（图1）。 图1：AAV载体的免疫反应和毒性。图表显示了注射AAV载体时引发的不同类型的免疫反应。毒性在下方被下划线标出，并列在可能促成不良事件的免疫反应成分旁边。图表中使用了以下缩写：CpG，未甲基化的CpG基序；C1和C3，补体因子1或3；DCs，树突状细胞；DRG，背根神经节，dsRNA，双链RNA；MAC，膜攻击复合物；MHC，主要组织相容性复合体；NK细胞，自然杀伤细胞，TMA，血栓性微血管病，？- 仍有待更详细的测试。 2.  AAV和AAV载体的基本生物学 AAV是依赖病毒，自然感染灵长类和其他物种，在辅助病毒如腺病毒的帮助下可以复制。作为一个属，它们对静止和分裂的宿主细胞具有广泛的范围，尽管不同血清型的AAV或AAV载体具有更有限的嗜性；例如，在人类中，AAV1载体对肌肉有很高的嗜性，而AAV2载体容易感染肺和脑细胞。嗜性可能因物种而异：AAV8载体比人类更有效地感染小鼠肝细胞。AAV感染无症状，病毒在个体一生中持续存在。然而，AAV具有免疫原性，因为它们刺激可检测的B细胞和T细胞反应。由于长期适应性免疫的诱导依赖于需要通过炎症信号驱动的先前成熟来呈现抗原的细胞，AAV感染必须能够触发先天免疫反应，在自然感染中，这些反应可能部分由辅助病毒驱动。AAV携带一个单链DNA基因组，有两个开放阅读框架（ORF），编码调节蛋白以及衣壳抗原。基因组两侧有反转末端重复（ITR）序列。在AAV载体中，两个ORF被删除，并替换为治疗蛋白或RNA的表达载体；在病毒生产过程中，删除的序列以及来自辅助病毒的必要序列以转录方式提供。注射后，AAV载体的衣壳抗原存在于接种物中，但与转基因产物不同，它们不是由转导细胞积极产生的。这反过来限制了衣壳抗原向免疫系统呈现的持续时间，直到蛋白质被降解，根据临床试验结果，这可能需要几个月。 3.  免疫学101：与AAV及其载体相关的知识 3.1.  先天反应 病毒或病毒载体在其抗原或基因组中携带病原体相关分子模式（PAMP），这些在哺乳动物中不存在，因此被所谓的病原体识别受体（PRR）识别为威胁，PRR位于细胞表面、内体内部或细胞质中。某些类型的PRR表达，如Toll样受体（TLR），通常具有细胞类型特异性；例如，巨噬细胞表达TLR2但不表达树突状细胞，而TLR3的表达模式正好相反。PAMP与PRR结合启动一个信号级联反应，最终激活转录因子，如核因子κB（NF-kB）、激活蛋白1（AP-1）、干扰素调节因子（IRF）-3和-7。这启动了炎症介质的产生，如细胞因子和趋化因子，树突状细胞成熟为专业的抗原呈递细胞，激活其他先天免疫系统的细胞，如自然杀伤细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。病毒也可以通过启动通常由内质网（ER）应激触发的未折叠蛋白反应来引发炎症反应。例如，表达凝血因子VIII的AAV载体由于该蛋白的过度表达而触发ER应激反应；ER应激又可能促进针对AAV或FVIII特异性免疫反应的激活。在大多数情况下，先天免疫反应是非抗原特异性的，它们的激活是短暂的，它们缺乏“记忆”，因此第二次暴露于同一病原体会引发非常相似的反应。 补体系统是先天免疫系统的一部分，但在某些方面依赖于适应性免疫系统的效应分子，它为抵抗病毒提供了关键的防御机制。它可以直接杀死或中和病毒，它可以聚集病毒，促进白细胞的吞噬作用，并且与病毒特异性抗体协同杀死感染细胞，从而阻止新病毒后代的产生。有三条途径可以通过几个步骤激活补体形成所谓的膜攻击复合物（MAC）。在经典途径中，抗原-抗体复合物激活C1复合物，然后分别将C2和C4分裂成a和b。C4b和C2b形成一个名为C3转化酶的复合物，它将C3分裂成a和b；后者与C4bC2b复合物一起消化C5成a和b。C5b与C6、C7、C8和C9结合形成MAC。在凝集素途径中，病毒碳水化合物与甘露糖结合凝集素（MBL）/纤维胶凝集素-甘露糖相关丝氨酸蛋白酶1（MASP）复合物结合，激活C1复合物。一些病毒激活替代补体途径。这条途径在低水平持续转化C3为C3a和C3b。通常，补体抑制因子H和I使C3b失活，防止途径完全激活。一些病毒与C3b结合导致补体因子B分裂成a和b。Bb与C3结合形成替代C3转化酶，可以裂解C3成a和b，从而实现补体的完全激活。激活的补体引发炎症反应，作为中性粒细胞的强大吸引剂，触发凝血途径，损伤内皮细胞并激活血小板，这可能导致微血管损伤和血栓形成。AAV载体与补体因子C3结合，但正如AAV8载体所示，也提高了补体抑制因子H和I；因此，人们认为AAV载体不会直接激活替代补体途径。 3.2.  适应性免疫反应 抗原特异性适应性免疫反应比先天反应出现得更慢，根据抗原负荷、抗原暴露部位和炎症反应的强度，可能需要一到几周的时间才能在血液中检测到。B细胞识别可溶性或表面结合抗原上的线性或构象表位。初始B细胞首先分化成短暂存活的浆细胞，主要产生未经过亲和力成熟的IgM抗体。在滤泡T辅助细胞的帮助下，抗原暴露的B细胞然后形成生发中心，在那里它们经历类别转换和亲和力成熟，随后分化为长期存活的浆细胞和记忆B细胞。长期存活的浆细胞归巢到淋巴组织和骨髓，后者为它们提供了一个可以存活数十年的生态位。记忆B细胞主要留在淋巴结或脾脏。在再次遇到它们的抗原时，它们要么增殖并经历额外的亲和力成熟，要么承担效应功能并开始分泌抗体。记忆抗体反应通常比初次反应更快出现，峰值反应更高更持久，抗体对它们的认知抗原的亲和力也增加了。它们对T细胞帮助的依赖性也较小，T细胞帮助基本上是用来诱导初次成熟的抗体反应。 T细胞通过细胞内降解病毒蛋白产生的小肽激活。肽与MHC分子结合，然后被运输到细胞表面，与MHC类I分子结合的肽被CD8+ T细胞识别，而与MHC类II分子结合的肽触发CD4+ T细胞反应。MHC类I分子存在于大多数细胞上，而MHC类II分子仅由免疫系统的细胞如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞表达。激活后的CD4+ T细胞根据炎症反应的类型和T细胞受体（TcR）信号的强度分化为不同的亚群，即Th1细胞，它们促进CD8+ T细胞反应，Th2细胞，它们推动B细胞激活，Th17细胞，它们诱导强烈的炎症反应并激活中性粒细胞，Th22细胞，在保护皮肤免受感染方面发挥作用，以及调节性T细胞（Tregs），它们抑制效应T细胞反应，对维持对自身抗原的耐受至关重要。 原始CD8+ T细胞的激活通常需要来自CD4+ T细胞和成熟的树突状细胞的帮助，这些细胞呈现MHC类I肽复合物以及如CD80或CD86等共刺激因子，这些因子与T细胞上的CD28结合。原始CD8+ T细胞可以通过直接感染的树突状细胞激活，或者对于那些无法感染这些关键抗原呈递细胞的病毒，通过一种称为交叉呈递的过程来激活。CD8+ T细胞对抗原极其敏感，仅有2-4个MHC类I肽复合物就可以触发反应。激活后，CD8+ T细胞将其代谢转向糖酵解能量产生。这种转变对于产生完全功能的效应T细胞至关重要，因为它支持T细胞的快速增殖，并为分裂的细胞和效应分子提供构建块。激活后，CD8+ T细胞迁移到感染组织，在那里它们释放抗病毒细胞因子，如干扰素（IFN）-γ，或通过释放穿孔素和颗粒酶B裂解表达抗原的细胞。一旦表达抗原的细胞被清除，大多数激活的CD8+ T细胞就会经历凋亡，剩余的细胞分化为不同亚群的记忆细胞：效应记忆细胞循环，它们仍然部分激活，并且可以立即开始效应功能而无需进一步增殖；中央记忆细胞归巢到淋巴结，它们是“休息的细胞”，在遇到它们的抗原后增殖，然后成为效应细胞。组织驻留记忆细胞可以在几乎所有组织中找到；它们通过在遇到它们的认知抗原时立即承担效应功能，提供快速的局部保护。在病毒载量保持高水平的慢性感染期间，会导致所谓的T细胞耗竭：T细胞上调其表面的共抑制分子，改变其代谢从糖酵解能量产生转向脂肪酸氧化，经历不可逆的表观遗传变化，失去功能，并最终死亡。病毒持续感染，要么进入潜伏期，要么仅以非常低的水平存在，不会导致T细胞耗竭，但可能导致免疫系统过度反应。记忆CD8+ T细胞的召回比初次反应的激活要求不那么严格。记忆CD8+ T细胞可以在没有共刺激因子的情况下由抗原呈递激活，不再需要T细胞帮助。然而，记忆CD8+ T细胞激活的抗原阈值略高于原始T细胞。 4.  AAV载体的免疫反应和毒性 免疫反应和相关的不良事件与AAV载体剂量直接相关，并部分与应用方式有关。低至中等剂量，如用于眼部疾病矫正或使用优化的转基因产物治疗血友病B的注射剂量，通常未能诱导可检测的T细胞反应，尽管它们可能刺激AAV衣壳特异性抗体反应。给予免疫特惠部位如大脑或免疫抑制微环境如肝脏的AAV载体不太可能引发强烈反应，而系统性给予或给予肌肉的载体则相反。尚未证明但有可能的是，年龄也可能起作用，因为老年人的先天和适应性免疫系统功能下降。先天反应如补体激活在AAV基因转移后可能导致显著毒性，但大多数不良事件与适应性反应有关。针对转基因产物的T细胞和B细胞反应已有报道，但适应性免疫系统更常见的是对AAV衣壳的抗原反应。尽管大多数人类，除了非常年幼的儿童外，可能对AAV衣壳抗原具有免疫记忆，但目前尚不清楚这些细胞的召回是否是AAV基因转移时遇到问题的根本原因，或者高载体剂量的初次反应是否应受责备。需要获得这些知识，因为它影响哪种免疫抑制方案可以减弱AAV特异性免疫反应并允许持续的转基因产物表达。正在探索的许多药物，如雷帕霉素，一种mTOR抑制剂，将阻断适应性免疫系统原始细胞的刺激，而不影响召回反应。同样，通过修改AAV载体的PAMPs减少炎症信号可能会减少初次反应，但对记忆细胞的重新激活影响有限。 4.1.  先天反应 与其他病毒相比，AAV或基于AAV的载体只引起适度的炎症反应，这可以通过TLR9与载体基因组中未甲基化的CpG序列结合触发，通过衣壳蛋白中的PAMP与TLR2结合，以及可能通过双链RNA，这可能与黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）相互作用，MDA5是RIG-I样受体家族的一个螺旋酶，作为细胞质PRR。TLR2和TLR9由单核细胞和巨噬细胞表达。骨髓树突状细胞对TLR2呈阳性，而浆细胞样树突状细胞，是I型IFN的丰富来源，对TLR9呈阳性。MDA5广泛表达。通过AAV的PAMPs阻断先天PRR激活减弱了初次而不是二次免疫反应。最常用的方法是从AAV载体的基因组中去除富含CpG的序列。动物研究表明，减少载体的CpG基序减弱了CD8+ T细胞反应，而没有改变B细胞反应。ITRs非常富含CpG序列，不能修改，以至于完全耗尽AAV载体基因组的CpG可能不可行。由AAV载体触发的适度先天免疫反应可能足以推动适应性免疫反应，但到目前为止，它们并没有与其他病毒载体（如腺病毒载体）在临床试验中直接和早期引起的毒性联系起来。这样的载体，即使是作为疫苗以适度剂量使用，也会在8-24小时内在许多患者中引起1-3级系统反应，而用于基因治疗的高剂量已导致由于先天免疫系统的超激活而导致死亡。然而，随着越来越高剂量的AAV载体进入临床试验，先天免疫反应可能会加入到可以引起基因转移受者严重不良事件的免疫反应列表中。 4.2.  补体反应 在一些年轻患者中，高剂量的AAV（等于或高于5 x 10^13 vg/kg）已导致血栓性微血管病（TMA），伴有溶血性贫血、血小板计数低和溶血性尿毒症综合征（HUS），导致肾脏损伤，即使在给予类固醇的情况下也是如此。用于脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的AAV载体在超过1400名个体中进行了矫正，导致4个月至4岁女孩中出现9例TMA病例。在杜氏肌营养不良症（DMD）治疗试验中，注射表达小型肌营养不良蛋白的AAV9载体在15名7-12岁男性接受者中有4例出现TMA。在所有病例中，症状在基因转移后6-12天开始。大多数患者通过血浆置换、类固醇、血液透析、血小板输血和eculizumab（一种补体抑制剂）成功治疗。尽管如此，SMA和DMD治疗组各有一名患者因TMA并发症死亡。原发性TMA是由影响补体调节的遗传性或获得性缺陷引起的。继发性TMA是由其他病理条件如恶性肿瘤、药物、感染、自身免疫等引起的补体激活引起的。可以诱导继发性TMA的感染包括流感病毒、SARS-CoV-2或B19病毒，后者是一种与AAV有关的细小病毒。 AAV基因转移后的TMA与补体的病理激活有关。一些病毒如SARS-CoV-2携带可以激活补体凝集素途径的基序。这条途径不太可能涉及AAV基因转移后的TMA。补体激活的经典途径需要AAV载体与抗体结合。在AAV基因转移后，不仅可以通过传统的未切换的B细胞，还可以通过B1和边缘区（MZ）B细胞非常快速地在3到4天内诱导IgM反应，由于IgM是补体的有效激活剂，这些早期抗体可以结合AAV并启动TMA。这将要求在抗体产生时AAV颗粒仍然可以在血液或间质液中被获取。使用生物发光AAV颗粒的动物研究表明，AAV被细胞非常迅速地吸收，一旦病毒穿透细胞膜，它就免于抗体的屏蔽，这使得补体激活途径在TMA患者中的可行性受到质疑。或者，补体激活的经典途径可能被预先存在的AAV结合抗体触发；尽管大多数AAV基因转移试验只招募没有可检测到的AAV中和抗体的接受者，但这并不一定排除低水平的结合抗体或甚至自然发生的IgM的存在，这些抗体可以与AAV载体低亲和力结合。应该重新考虑替代补体途径的激活。如上所述，已知AAV与C3结合，同时上调补体抑制因子I和H可能不足以阻止高载体剂量激活途径。然而，TMA的发病时间学，最早在基因转移后第6天被检测到，反驳了AAV载体通过替代补体途径激活的说法。 4.3.  B细胞反应 AAV特异性B细胞反应可以由自然感染引起，或者可以被AAV基因转移刺激或召回。但是，考虑到AAV诱导的抗体对补体激活和TMA的潜在贡献，这种免疫反应不会伤害患者，但通过中和载体，阻止它们传递有效载荷，从而排除了成功的AAV介导的基因转移。已经尝试过改变载体衣壳以避免其中和，尽管成功有限，因为许多抗体结合的领域对转导至关重要。空的AAV颗粒被用作抗体诱饵，但这种方法可能会增加T细胞反应的诱导。血浆置换，包括选择性去除AAV特异性抗体的方法，已在具有预先存在的中和抗体的动物中允许成功的AAV转导。通过使用Imlifidase（IdeS），一种链球菌半胱氨酸蛋白酶，能够将IgG裂解成F(ab’)2片段和Fc，获得了类似的结果。 对分泌型转基因产物的中和抗体的诱导可能非常有害，因为这些抗体可能使传统的蛋白质治疗复杂化。这种反应的刺激似乎取决于载体应用的途径。肝转移AAV载体表达因子VIII或IX，这是用于矫正血友病的途径，到目前为止还没有导致转基因产品中和抗体的形成，这可能部分反映了Tregs的抑制作用，长期存在的蛋白质治疗随着时间的推移导致耐受性，以及仔细选择患者排除那些有抑制物形成史的人。相比之下，至少在动物中，肌肉注射表达F.IX的AAV载体导致抑制物的形成。 动物研究表明，通过例如雷帕霉素和依布替尼的免疫抑制治疗，可以阻断或至少减弱对转基因产物的初次抗体反应。然而，免疫抑制将需要长时间的，甚至是基因转移接受者的寿命，考虑到药物对感染敏感性的影响，可能不是一个可行的选择。 4.4.  T细胞反应 在用于矫正血友病B的早期基因治疗试验中，AAV载体接受者最初产生的F.IX水平足以减轻他们的症状，但大约4周后发展为亚临床性转氨酶升高，伴随着循环中的AAV特异性T细胞增加和转基因产物表达丧失。T细胞进一步被鉴定为属于CD8+ T细胞亚群，人们认为它们反映了先前自然感染引起的T细胞的记忆反应。随后的试验在基因转移后仔细监测患者的病情，并用类固醇治疗肝酶的增加，这消除了T细胞反应并允许持续的F.IX表达。在需要通过静脉注射大量AAV载体的神经肌肉疾病的试验中，一些患者的肝毒性更为严重。大约三分之一的Onasemnogene abeparvovec接受者，这是一种FDA批准的用于SMA治疗的AAV9载体疗法，表现出与主要由CD8+ T细胞组成的炎症反应相关的肝损伤。到目前为止，所有患者在类固醇治疗后都已康复。 尽管CD8+ T细胞是系统性AAV基因转移引起肝损伤最可能的原因，但效应细胞来自记忆细胞库的假设应该重新审视。在大多数血友病患者中，反应出现得非常慢，这更符合初次而非二次T细胞反应的特征。此外，在大多数AAV患者中，T细胞的激活可以通过在基因转移时或转氨酶升高时给予的泼尼松阻止。对其他抗原的研究表明，类固醇通过影响T细胞转换为糖酵解能量产生的作用；这阻止了原始CD8+ T细胞和具有低亲和力而非高亲和力受体的记忆CD8+ T细胞的激活。考虑到AAV基因转移接受者中的CD8+ T细胞反应是由来自输入病毒颗粒的衣壳蛋白的有限量的抗原驱动的，这些病毒颗粒在几周至几个月内缓慢降解，很难想象肝脏毒性是由针对仅与MHC类I分子低亲和力结合的表位的T细胞引起的。 4.5.  免疫反应在AAV基因转移引起的其他不良事件中的潜在作用 4.5.1.  致命性肝毒性 在一项针对X连锁肌管肌病的治疗试验中，四名患有预先存在的肝病的患者在接受AAV基因转移几周后死亡。患者对免疫抑制药物没有反应，他们的肝脏没有细胞浸润的证据，这导致结论是直接的载体或转基因产物毒性而不是T细胞引起了致命性肝损伤。我想指出，即使是在肝脏的门脉和周围门脉区域的微小T细胞反应，也可能损害肝脏循环，这在预先存在肝病的患者中可能变得致命。任何需要非常高剂量载体的AAV基因转移试验都应该仔细监测血液中的AAV衣壳特异性T细胞，以帮助分析潜在的严重不良事件，而这样的数据在XLMTM试验中并不可用。 4.5.2.  背根神经节（DGR）毒性 在非人灵长类动物中的研究表明，通过鞘内、脑室内、小脑延髓池内以及在较小程度上通过静脉转移大量AAV载体可能会引起DGR毒性，而免疫抑制并不能减轻这种毒性。大多数动物保持无症状，但在安乐死时显示出中枢和周围神经系统的组织学病变，伴有轴突退行性变、神经元细胞损伤以及B细胞和T细胞浸润。随后的研究表明，通过转移micro (mi)RNA138可以阻断非人灵长类动物的DGR毒性，这减少了神经元中的转基因表达，表明是转基因产物的直接毒性而不是免疫机制介导了这一不良事件。 在临床试验中也观察到DRG毒性。在一个试验中，两名家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者和突变在编码超氧化物歧化酶1（SOD1）的基因中，通过单次鞘内注射编码针对SOD1的microRNA的AAV载体进行治疗。一名患者在接受基因转移当天用泼尼松治疗，治疗后约4周显示出循环中的AAV衣壳特异性T细胞增加，并同时发展出神经症状，根据MRI扫描与DRG毒性一致。第二名患者接受了更积极的免疫抑制方案；他的T细胞反应较低，出现较晚，没有发展出神经症状，他的MRI没有异常。 在另一个试验中，两名接受免疫抑制的患者接受了通过静脉注射表达生存运动神经元1的rhAAV10载体治疗SMA 2型，再次一名患者发展为DRG毒性。目前尚不清楚，在人类中适应性免疫反应，如AAV特异性CD8+ T细胞，是否促成了DRG。 4.6.  心肌炎在DMD患者中 如上所述，炎症环境对于触发适应性免疫反应至关重要，而在AAV基因转移中，这是由AAV载体中或上的PAMPs触发的。一些疾病，如DMD，其特征是肌肉浸润的白细胞对肌肉纤维退化反应，增加了促炎细胞因子的分泌，这可能加剧免疫介导的不良事件。如果加剧的炎症影响心肌，这是特别令人担忧的。事实上，在辉瑞的一个Ib期试验中，2名DMD患者在接受了表达小型肌营养不良蛋白的AAV9载体后观察到心肌炎；其中一名患者死亡（https://pharmaphorum.com/news/myocarditis-case-mars-sareptadmd-gene-therapy-readout/）。在Sarepta Therapeutics使用AAVrh74载体进行的第二个小型肌营养不良蛋白1试验中，20名患者中有1名也发展为心肌炎（https://investorrelations.sarepta.com/news-releases/news-releasedetails/sarepta-therapeutics-investigational-gene-therapy-srp-9001），通过类固醇治疗得到解决。尽管AAV载体诱导的心肌炎的病因尚未完全理解，但似乎DMD患者受损肌肉组织中的炎症环境有利于诱导对AAV载体转基因产物的免疫反应，或者AAV载体诱导的额外炎症反应促进了对肌肉细胞的自身反应性T细胞反应。 5.  结论 免疫系统介导的毒性继续挑战AAV载体成功基因转移，特别是当需要高剂量来纠正目标遗传疾病时。免疫抑制，可以进一步优化，已成功用于减弱一些AAV载体诱导的免疫反应，但在其他情况下失败了。更令人担忧的是，最近描述的一些严重甚至致命的不良事件，如TMA、暴发性肝毒性或心肌炎。TMA是由过度的补体激活引起的，但目前尚不清楚这一途径在AAV基因转移中是如何激活的，以及影响补体系统的遗传变异是否起作用。在系统转移非常高剂量的AAV载体时，T细胞介导的严重肝毒性是可以预期的，观察到预先存在肝病的患者死亡可能有不同的病因，仍有待更详细地调查。 避免对非常高剂量的AAV载体转移的免疫介导毒性没有简单的途径；我们的免疫系统经过漫长的进化，将病毒视为威胁，并相应地通过清除它们及其感染的细胞来做出反应。每场战争都会造成附带损害，免疫系统对病毒或AAV载体进行的战斗也不例外。在这个阶段，我们的重点可能必须从使用过高剂量的AAV载体转移。我们的努力应该集中在开发能够更有效地转导细胞、实现更高转基因产物表达或提供更高活性转基因的载体上；这两种方法都可以实现剂量节约。同时，该领域应该探索选择性阻断B细胞对AAV基因转移反应的免疫抑制方案。通过抑制B细胞激活或从循环中去除这类抗体来预防基因转移后AAV中和抗体的诱导，将允许重复使用较低剂量的AAV载体，以替代目前使用的冲击疗法。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。