Imlifidase

摘要：A群链球菌（Strep A）是一种仅感染人类的细菌病原体，每年导致超过500,000名患者死亡，目前尚无获批的疫苗。A群链球菌具有高度多样性，但所有菌株均产生一种必需的、丰富的且保守的表面碳水化合物——A群碳水化合物，其中含有一个鼠李糖多糖（RhaPS）骨架。RhaPS是一种经过验证的通用疫苗候选物，可通过将天然碳水化合物与载体蛋白进行化学结合来制备糖结合物。我们改造了A群碳水化合物的生物合成途径，使其能够通过工业标准途径在大肠杆菌细胞内将RhaPS与选定的载体蛋白偶联，从而实现重组生产。通过核磁共振（NMR）光谱和质谱确认了所生产的重组糖结合疫苗的结构完整性。纯化的RhaPS糖结合物在小鼠和兔子中诱导产生了针对碳水化合物的特异性抗体，并且能够结合多种不同M型的A群链球菌菌株的表面，证实了重组生产的RhaPS糖结合物是一种有价值的疫苗候选物。 引言:链球菌（Streptococcus pyogenes），也称为A组链球菌（Strep A），与人类多种疾病有关，从每年超过5亿例的咽炎到危及生命的侵袭性感染，如链球菌中毒综合征和坏死性筋膜炎。它是三种感染后自身免疫性疾病的主要原因：肾小球肾炎、风湿热和风湿性心脏病。A组链球菌每年在全球导致超过50万人死亡，特别是在低收入国家。抗菌药物耐药性正在全球范围内出现，世界卫生组织已将A组链球菌疫苗列为疫苗优先事项。开发A组链球菌特异性疫苗的犹豫部分是由于疫苗成分可能间接引发自身免疫并发症，从而导致风湿性心脏病。此外，有效的A组链球菌疫苗理想情况下需要覆盖所有已知的150多种变异血清型（M型），并且成本低廉，以便在最需要的低资源国家使用。 所有A组链球菌血清型的表面都显示Lancefield A组碳水化合物（GAC），这种物质是保守的且具有免疫原性，因此是理想的疫苗候选物。GAC是一种肽聚糖锚定的表面结构，由聚鼠李糖主链和N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）侧链组成（图1）。 图 1 | 展示 GAC 生物合成途径（左侧）和修订的 GAC 生物合成途径（右侧）的示意图，修订的途径合成与 OTase 兼容的还原端糖。GAC 途径合成两种主要的细胞壁成分，(i) 未修饰的免疫原性重复单元（红色框）和 (ii) 最终的 GAC。我们的工程途径包括来自福氏志贺菌 1 型 O-抗原途径的基因 wbbPRQ。这些糖基转移酶引入了一个不同的末端基团，α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-Galp-(1→3)-D-GlcpNAc，该基团可以通过 GacCFG 延伸以产生含有免疫原性 →2-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-1→ 重复单元（红色框）的多鼠李糖主链。一旦脂质连接的产物通过 GacDE（ABC 转运蛋白）跨细胞膜转运，OTase PglB 识别还原端二糖，将糖链从脂质载体上切下，并将其转移到受体蛋白上的 OTase 序列上。这完成了第一个重组 A 群链球菌糖结合物疫苗候选物的合成。示意图由 Adobe Illustrator 制作。 GAC的生物合成分为两个独立的步骤：在细胞质中，GacBCFG在脂质前体Und-PP-GlcNAc上合成GAC聚鼠李糖主链，然后通过GacDE ABC转运体翻转到膜的另一侧。在细胞外，GlcNAc侧链通过GacL引入，并偶尔用甘油磷酸基团修饰（图1），然后通过一种未知的连接酶与肽聚糖连接。然而，具有免疫原性的GlcNAc侧链可能与其他A组链球菌成分结合，导致A组链球菌特有的复杂感染后自身免疫性疾病，如风湿热和风湿性心脏病，这些疾病每年估计导致超过25万人死亡。因此，开发A组链球菌疫苗的一个关键需求是排除任何可能引发与人体组织发生交叉反应的抗体的表位。 在A组链球菌中删除gacI基因会导致一种由α-(1→2)-和α-(1→3)-连接的残基组成的聚鼠李糖均聚物（RhaPS），这种均聚物缺乏GlcNAc侧链，针对这一表位产生的抗体不会与人体组织发生交叉反应。RhaPS存在于A组链球菌和与其密切相关的C组链球菌中，并已被验证为A组链球菌疫苗候选物。然而，直到现在，RhaPS疫苗候选物的生产要么使用复杂的化学偶联方法，要么化学合成最多两个重复单元。 针对细菌的糖结合疫苗是现代医学的成功案例之一，因为它们能够激活B细胞和（碳水化合物特异性）T细胞，从而产生持久的免疫反应。这导致全球细菌性脑膜炎和肺炎的发生率显著下降。历史上，糖结合疫苗是通过复杂的多步骤化学程序将细菌多糖共价连接到载体蛋白上生产的，这些程序成本高昂、繁琐，并且需要多次纯化步骤，可能导致批次间差异。此外，一些化学偶联方法，如还原胺化，可能会改变多糖表位，从而影响糖结合物的免疫原性。迄今为止，只有四种糖结合疫苗获得了完全许可，分别针对b型流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和伤寒沙门菌。在糖结合疫苗的开发中持续使用相同的载体蛋白（例如，白喉毒素的无毒突变体CRM197和灭活的破伤风类毒素TT）存在一些问题，包括对给定载体蛋白的预先存在的免疫力，这可能会抵消对使用相同载体的新糖结合疫苗的免疫反应。在儿童中观察到这种由载体诱导的表位抑制现象，与接受TT-Hib疫苗的儿童相比，接受CRM197-Hib糖结合疫苗的儿童表现出更强的免疫反应。 然而，通过细菌的糖基工程改造重组疫苗的糖结合疫苗设计即将发生变化，将细菌变成生产纯疫苗产品的微型工厂，以提供取之不尽、用之不竭且可再生的供应。这一过程被称为蛋白质糖链偶联技术（PGCT），提供重组生产定制糖结合物的低成本选择。PGCT的三个必要成分编码在细菌中：（i）候选糖链（通常是荚膜多糖或O抗原）的生物合成，（ii）含有能够特异性接收糖链的序列的候选载体蛋白，以及（iii）偶联寡糖转移酶（OTase）酶，例如首次发现的细菌OTase来自弯曲杆菌（CjPglB）。还报道了来自脑膜炎奈瑟菌（PglL）和最近来自鲍曼不动杆菌的两种OTase（PglL和PglS）。PGCT可以用于生产双重打击糖结合疫苗，其中糖链和载体蛋白来自同一种病原体，或者双重打击糖结合疫苗，其中糖链和载体蛋白来自不同的病原体，从而可能提供针对多种血清型或两种病原体的保护。然而，PGCT的一个缺点是OTase酶相对有限的糖链底物特异性。例如，CjPglB在转移缺乏还原端糖上的乙酰氨基修饰的糖链或两个糖与脂质载体通过β-(1→4)-连接的多糖时表现出较差的转移效率。尽管存在这些限制，现在已有许多疫苗候选物通过PGCT进行工程改造，包括改进现有的许可疫苗（例如肺炎链球菌），针对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的全新疫苗，以及由于生产成本低廉而针对兽医病原体的疫苗。目前，几种PGCT衍生的疫苗正在进行人体临床试验。所有先前报道的PGCT生产的疫苗候选物都是通过Wzx/Wzy依赖途径构建的。这些糖链是从含有4–6个糖的寡糖合成的，这些寡糖在细胞质中的脂质载体Und-PP上合成，并通过脂质双层转运到周质中，在那里它们被Wzy聚合酶延伸形成最终的多糖。 在本研究中，我们通过使用PGCT将RhaPS糖链与A组链球菌特异性和非A组链球菌载体蛋白偶联，展示了新型重组A组链球菌糖结合疫苗的生产。我们通过利用两种痢疾杆菌O抗原生物合成途径中的糖基转移酶，克服了OTase（CjPglB）还原端基特异性的限制，工程改造了两种具有不同还原端连接子的杂合RhaPS糖链：α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-GlcpNAc（痢疾杆菌福氏2a型，Shi2a）。我们证明这些修饰后的RhaPS具有CjPglB与载体蛋白偶联所需的二糖还原端基的立体化学。我们通过核磁共振（NMR）、质谱和免疫印迹法确认了重组构建的载体蛋白上RhaPS的结构完整性，并进行了初步免疫学研究，揭示这些重组合成的糖结合物能够产生针对A组链球菌的特异性抗体。我们的平台允许重组生产首个A组链球菌双重打击疫苗，并且通过其模块化系统可以轻松更换载体蛋白，以使用其他病原体特异性蛋白。 1.结果 1.1.将 OTase 兼容的还原端基连接子工程化到 StrepA 的 RhaPS 上 我们之前克隆了 Strep A RhaPS 所需的基因，并证明了其在大肠杆菌（E. coli）中的异源生产。RhaPS 是由内膜上的酶 GacB-G 合成的脂质连接的碳水化合物。在含有 O-抗原连接酶 waaL 基因的大肠杆菌菌株中生产 RhaPS，会导致其沉积在细胞表面，这可以作为生产外膜囊泡（OMV）疫苗的平台。天然 GAC 结构包含一个鼠李糖残基，其还原端通过 β-(1→4)-连接到 GlcNAc（图 1），我们推测这不会构成 CjPglB 的底物。所有尝试使用 CjPglB 构建天然 RhaPS 糖缀合物的尝试均未成功（数据未显示）。因此，我们试图修改 RhaPS 的还原端，以生成可作为 CjPglB 底物的结构。福氏志贺菌 1 型和宋内志贺菌 2a 的 O-多糖之前已被用于通过 PGCT 生成糖缀合物，并被验证为 CjPglB 的底物。这些结构已被表征，并相应地分配了基因/酶功能。由于两种志贺菌 O-抗原结构在其非还原端均含有两个鼠李糖单元，我们尝试创建结合了志贺菌重复单元与 GAC 的 RhaPS 结构的杂合糖，总体目标是生成可作为 CjPglB 底物的 RhaPS 糖（图 1）。因此，我们将 Strep A GAC 生物合成途径中的 gacB（图 1）替换为两个部分途径：（i）福氏志贺菌 1 基因 wbbP、wbbR 和 wbbQ，编码负责合成脂质连接的 α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-Galp(1→3)-α-D-GlcpNAc（此后称为 Shi1）（图 1）；（ii）宋内志贺菌 2a 酶 RfbF 和 RfbG，负责合成脂质连接的 α-L-Rhap(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-D-GlcpNAc（此后称为 Shi2a）。我们之前已证明，删除 gacB 会终止 RhaPS 的生产。我们现在评估了 Shi1 和 Shi2a 重复单元途径对这种 gacB 缺失的补充能力（图 2A）。将含有 Shi1 或 Shi2a 途径的质粒转化到大肠杆菌中，通过免疫印迹分析确定，恢复了 RhaPS 的生产（图 2A）。这表明志贺菌基因能够替代 gacB 在脂质连接 GAC 生物合成中的功能（图 1）。删除 wbbP 或 wbbQ 中的任何一个，都会导致 RhaPS 的产量为零或非常低，表明所有三个基因对于高效生产都是必需的（图 2B）。 图 2 | Western blot 和斑点印迹分析，研究大肠杆菌中重组 RhaPS 生产所需的最小基因簇要求。A. 大肠杆菌 rfaS 缺失细胞被转化以包含两个质粒，分别含有 Shi1/2a 基因簇片段、GacB 对照或空质粒（阴性对照），以及 RhaPS 基因簇（ΔB），过夜培养后，整个细胞裂解物经过 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析，使用商业化的抗 GAC 抗体。质粒标记如下：ΔB = gacACDEFG；B = gacB；Shi1 = wbbPQR；Shi2a = rfbFG；空质粒对照 = -。B. 大肠杆菌 rfaS 缺失细胞被转化以包含 RhaPS 基因簇和 Shi1 基因簇片段的不同组合，过夜培养后，使用 GAC 抗体进行斑点印迹分析。当与 ΔB RhaPS 蛋白共表达时，WbbPQR 蛋白合成 RhaPS。省略任何一个 Shi1 蛋白会导致 RhaPS 产量减少或无 RhaPS 生成。 培养基成分会影响糖和糖缀合物的生产。因此，我们探索了在一系列标准培养基中重组糖的生产。Shi1 和 Shi2a 构建的 RhaPS 在所有测试的培养基中均被生产出来（补充图 1A）。只有 Shi2a RhaPS 糖在 BHI 培养基中构建得较少。接下来，我们旨在确定 Shi1/Shi2a 工程化的 RhaPS 是否会被 CjPglB 识别为底物。将编码 RhaPS 生物合成基因和 Shi1 或 Shi2 重复单元途径的质粒转化到一个含有染色体、IPTG 诱导型 cjpglB 基因的大肠杆菌菌株中。选择了三种候选载体蛋白作为耦合目标：肺炎链球菌神经氨酸酶、NanA37、化脓性链球菌 IdeS54 和铜绿假单胞菌外毒素、ExoA39。每个受体蛋白在其潜在的 N 糖基化位点数量上有所不同。IdeS 和 NanA 构建物含有两个工程化的 N 糖基化序列，分别位于 N 端和 C 端，而 ExoA 含有两个天然存在的内部 N-糖基化位点和四个工程化的 N 端和 C 端位点（ExoA-10tag）。每种受体蛋白都与两种 RhaPS 连接子结合，并在多种培养基中进行测试，以确定糖缀合物生产的最佳条件（图 3）。受体蛋白通过 His 亲和色谱纯化，并使用针对蛋白的抗 His 抗体和针对糖的 GAC 抗体进行 Western 印迹分析（图 3；补充图 1B）。观察到所有三种蛋白载体都发生了糖基化（图 3；补充图 1B）。这表明这些杂合 RhaPS 生物合成途径生成的糖结构是 PglB 的底物。三种不同载体蛋白和途径的糖缀合物产量各有不同（图 3；补充图 1B）。在 SOB 和 BHI 培养基中，NanA 与 Shi1 途径结合时在两个位点上都发生了糖基化，而在 2YT 和 SSOB 培养基中观察到单一位点占据（图 3A）。阴性对照（LB 未加诱导剂（Un）、N-乙酰葡糖胺（NAG）以及缺乏 pglB 基因的菌株）显示出 NanA 的糖基化为零或极小，证实糖基化依赖于位于染色体上 pglB 基因上游的 Ptac 启动子的诱导以及丰富培养基的补充。IdeS 与 Shi2a 途径结合时在 2YT、BHI 和 SOB 培养基中主要发生单一位点糖基化，而在 SSOB 培养基中两个位点都部分被 RhaPS 糖基化（补充图 1B）。然而，与测试的其他受体蛋白-RhaPS 组合相比，IdeS-RhaPS 的糖蛋白产量定性较低。ExoA 在 SOB 培养基中显示出较高分子量的 RhaPS 装饰物种的条带模式，表明四个位点发生了糖基化（图 3B）。在 2YT、BHI 和 SSOB 培养基中，两个位点发生了糖基化。未糖基化和糖基化蛋白条带之间的带移估计反映了与未糖基化蛋白相比质量增加了 7–10 kDa，与天然 RhaPS 的预期分子量一致（图 3）。综合来看，这些结果表明，经过还原端修饰的 RhaPS 是 CjPglB 的可行底物，并且与当前用于在大肠杆菌中工程化糖缀合物疫苗的平台兼容。选择 Shi1 途径作为新技术的代表性模型，以促进糖缀合物疫苗的规模化生产、纯化和表征。 图 3 | 在不同培养基条件下，大肠杆菌中重组糖结合物生产的 Western blot 分析。大肠杆菌细胞（ΔwaaL，染色体整合了 OTase pglB 基因）被转化以包含 AtheShi1 基因簇、RhaPS 基因簇（ΔB）和 NanA 载体蛋白，以及 B Shi1、ΔB 和 ExoA-10 标签载体蛋白质粒。细胞在不同的生长条件下被检测糖结合物的生产。总细胞裂解物经过 SDS-PAGE 运行，并通过 His 和 GAC 抗体（分别为红色和绿色）进行分析。糖结合物的生产水平在不同的培养基条件下有所不同。未诱导的、-pglB 细胞缺乏染色体 pglB。箭头指示糖基化蛋白条带。 1.2.IdeS-RhaPS 和 NanA-RhaPS 糖缀合物的纯化 将糖基化蛋白纯化用于小鼠和兔子的免疫研究。首先，将 NanA-RhaPS 和 IdeS-RhaPS 的糖缀合物扩大到 2 L 培养基中，通过 IMAC 亲和色谱进行钴纯化。NanA-RhaPS 和 IdeS-RhaPS 分离物通过 SDS-PAGE 进行分析，并脱盐至无内毒素的 PBS 中。这些分离物中含有未糖基化的 NanA/IdeS 和 RhaPS 装饰蛋白的混合物，其中大部分是未糖基化的（补充图 2）。这些样本用于免疫研究，以评估 RhaPS 装饰蛋白的低产量是否足以触发（碳水化合物特异性）抗体，以及工程化的糖缀合物是否能够刺激持久的免疫力。分别将含有 NanA-RhaPS 和 IdeS-RhaPS 的亲和纯化分离物汇集，并通过尺寸排阻色谱法去除未糖基化的物质，以获得更大比例的 RhaPS-缀合蛋白。含有 NanA-RhaPS 糖缀合物的分离物比未糖基化的载体蛋白更早洗脱，并汇集用于第二次尺寸排阻色谱法（图 4A、B）。只有含有糖缀合物的分离物被汇集，通过 SDS-PAGE 分析判断，大部分未糖基化的载体蛋白被去除（图 4A、B）。IdeS-RhaPS 的纯化方案也经过优化，分离出具有一个和两个糖基化位点的糖缀合物，并去除多余的未糖基化蛋白（补充图 3）。浓缩的 NanA-RhaPS 分离物随后用于兔子免疫研究。纯化糖缀合物的总产量为：NanA-RhaPS 高：1 mg/4 L；NanA-RhaPS 低：10 mg/4 L；IdeS-RhaPS 高：0.8 mg/4 L；IdeS-RhaPS 低：9 mg/4 L。我们对糖缀合物进行了 TFA 水解，随后通过 HPAEC-PAD 对纯化的 NanA-RhaPS 糖缀合物样本中的鼠李糖进行定量。分析表明，1.8 mg/mL 的 NanA-RhaPS（50 µM）样本中含有 0.3 mg/mL 的鼠李糖（单糖）。根据质谱数据，我们估计每个糖链含有 36 个鼠李糖单元，平均 RhaPS 糖链质量为 5.9 kDa，对应 50 µM 浓度。这些结果表明，用于免疫研究的纯化 NanA-RhaPS 样本中，NanA 载体蛋白与 RhaPS 糖链的摩尔比为 1:1。 图 4 | 使用色谱法、核磁共振（NMR）和质谱法对糖结合物产品进行生化分析。A 经 NTA 柱纯化的 NanA-RhaPS 通过两轮尺寸排阻色谱法纯化，以分离高分子量的糖基化 NanA-RhaPS 物种。B 第二轮的各分段通过 SDS-PAGE 分析，揭示了 NanA-RhaPS 糖结合物和游离蛋白物种的顺序洗脱。蓝色框内的分段被汇集用于免疫研究。C 核磁共振分析证实，糖结合物疫苗候选物携带了具有 [→2-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-1→]n 结构的天然主链重复单元。工程糖结合物的重叠 1H,13C-HSQC（黑色）和 1H,13C-HMBC（红色）核磁共振谱的选定区域。Rhamnan 多糖结构的重复单元以 SNFG 格式给出。D 来自 NanA 蛋白的胰蛋白酶肽的 HCD 谱。前体离子 [M+3H]3+ m/z 1428.63096 的单同位素质荷比对应于肽 AQGGDQNATGGEQPLANETQLSGESSTLTDTEK，Δ 质量为 949Da，对应于 HexNAc-Hex-(dHex)4。从 MS/MS 谱中分配的 b 离子和 y 离子列表在此图中显示。总结的糖基化特征表明观察到 NanA 和 IdeS 的位点特异性糖基化。我们观察到两种蛋白的 N 端附近的糖基化位点最多可携带 36 个 Rha 残基。对于 NanA 蛋白，第二个糖基化位点大多被检测到，携带 30 到 40 个 Rha 残基。IdeS 蛋白的 C 端糖基化位点表现出多样的糖链异质性，携带 9 到 41 个 Rha 残基。 1.3.NMR 光谱确认了多聚鼠李糖重复单元的结构 为了确保在大肠杆菌中异源产生的 GAC 的准确复制，我们通过质谱和 NMR 分析对工程化糖缀合物进行了结构表征。通过 GC-MS 对糖缀合物进行的糖组成分析显示鼠李糖是主要的糖成分。鼠李糖衍生物在保留时间 11.77 分钟处洗脱，其 MS 裂解模式显示出 m/z 204 和 m/z 217 的离子，这些是单糖的特征。随后，我们进一步通过 NMR 光谱进行分析。一方面，多糖中糖残基的¹H 和¹³C NMR 化学位移，以及另一方面多肽或蛋白质中氨基酸的化学位移，在许多情况下光谱重叠相对有限。因此，可以识别出预期来自糖残基的交叉峰。在糖残基的端基原子的共振区域，识别出两个交叉峰，分别为 δH/δC 5.20/101.70 和 δH/δC 4.97/102.82，与重复单元中含有两个糖残基的鼠李糖多糖一致。此外，在 δH 4.2–3.5 和 δC 79–70 的光谱区域观察到八个交叉峰，这些峰来自两个糖环的质子和碳。由于蛋白质的交叉峰存在，无法从¹H,¹³C-HSQC 谱中明确识别鼠李糖残基的外环甲基基团的 NMR 共振。然而，在¹H,¹³C-HMBC NMR 谱中观察到 δH 1.34 和 δC 70.04 和 72.94，以及 δH 1.29 和 δC 70.10 和 72.40 之间的相关性，即与鼠李糖残基中甲基基团的质子和糖的吡喃环形式的碳原子一致；因此，可以从¹H,¹³C-HSQC NMR 谱中识别 C6 的 NMR 化学位移。此外，¹H,¹³C-HMBC NMR 谱还揭示了端基质子和糖苷氧基化碳（~78 ppm）之间的相关性，以及端基碳和糖苷氧基化碳上的质子之间的相关性。¹H,¹³C-HSQC 谱中未分配的 NMR 化学位移数据以及¹H,¹³C-HMBC NMR 谱中来自端基原子的数据被输入到 CASPER 程序中，同时输入两个 L-鼠李糖吡喃糖残基，但未定义端基构型或任何连接位置。自动结构解析的结果揭示了 →2-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-1→ 作为重复单元结构。在这种类型的分析中，排名第一的结构方案被归一化为单位值，δRel = 1.0，在“归一化相对排名”列表中，如果要将排名第一的结构选为正确的结构，则需要排名第一的结构与排名第二的结构之间至少有约 20% 的差异（即 δRel = 1.2）。排名第二的结构显示出 δRel = 2.2，即远高于区分结构替代方案所需的差异。因此，二维 NMR 光谱实验与 CASPER 程序分析相结合揭示了一个二糖重复单元，其鼠李糖残基的连接方式交替，与 GAC 的多糖骨架的已报道结构相同，并且与西方印迹分析一致。 1.4.通过质谱法确定 RhaPS 的缀合  已有几种天然 GAC 样本被分离和表征了其近似总质量。我们着手研究重组产生的 RhaPS 糖缀合物是否具有天然大小。纯化的 NanA-RhaPS 和 IdeS-RhaPS 糖缀合物被用于质谱分析，以确定缀合位点和糖链质量。质谱方法可用于确定糖缀合物疫苗候选物的糖质量（以及多糖中的重复单元数量），如 Ravenscroft 等人所示。在 SEC-MALS 实验中确定的 A 群链球菌 RhaPS 的近似平均质量为 7.2 kDa。考虑到我们的大肠杆菌系统产生了除 GacB 酶之外的所有 RhaPS 生物合成所需的蛋白质，我们假设每个 N-糖基化位点上的糖链的平均重复单元数量应与天然合成的糖质量相当。这种长度调节遵循 ABC 转运蛋白途径，因此与许多其他研究人员开发的许多生物合成的 O-多糖缀合物相比，其糖链长度更为明确，后者的糖链长度分布在较大的分子量范围内。经过蛋白酶解后，NanA-RhaPS 和 IdeS-RhaPS 通过 LC-MS/MS 进行分析。我们采用了一种基于高场非对称波形离子迁移谱（FAIMS）的无偏、基于 MS 的方法，使用不同的补偿电压（CV）进行分级，以增加修饰肽段的检测。数据通过 Byonic 搜索，使用限制在天冬酰胺上的通配符设置，以识别修饰肽段。正如预期的那样，识别出的修饰肽段显示出 146.0579 Da 的 Δmass 单元，表明存在连续的脱氧己糖（鼠李糖）。这些糖链修饰的质量与理论质量以及 Shi1 还原端基糖一致。有趣的是，我们在 NanA 和 IdeS 两个样本中观察到，在鼠李糖的较高重复单元中，糖肽的质量额外增加了 56 Da。这些识别肽段的 MS/MS 谱表明它们是糖肽，因为糖链裂解和 146.0579 Da 的重复模式。在所有测试的 FAIMS 电压中，–35 V/–40 V 的结果是识别出独特的糖肽的比率最高。我们识别出 32 和 29 个独特的糖肽，分别对应于 NanA 和 IdeS。我们的数据表明，这两种糖缀合物最多携带 37 个鼠李糖残基，总质量最多达到 5.8 kDa。在相同的条件下，我们还识别出对应于 NanA 蛋白质序列的糖基化 C 末端肽段。在 IdeS 的情况下，预期的糖肽被检测为 NQTNGGDQNATGGHHHHHHHHHH 或 TLSTGQDSWNQTNGGDQNATGGHHHHHHHHHH。根据 Δmass 和糖链片段，我们的数据表明，来自 NanA 蛋白的肽段携带 30 到 40 个鼠李糖残基，而 IdeS C 末端糖肽携带 9 到 41 个鼠李糖残基。我们识别出 22 和 23 个独特的 C 末端糖肽，分别对应于 NanA 和 IdeS。我们还检测到 11 个独特的糖肽，其质量在预期糖链质量的 1 Da 质量容差范围内。总之，此处应用的 FAIMS 辅助开放式搜索糖肽分析明确揭示了两种载体蛋白被预期的（Rha）nGal-GlcNAc 糖部分修饰，从而证实了 Shi1 途径构建了一个还原端连接链，可以进一步扩展以产生类似天然的 RhaPS 糖链。 1.5.评估 RhaPS 糖缀合物的免疫原性 我们对三种不同的疫苗候选物（NanA、NanA-RhaPS 和 IdeS-RhaPS）进行了小鼠免疫研究（n=10）。我们的糖缀合物免疫研究表明，这些疫苗候选物在小鼠体内耐受性良好，以 0、14 和 28 天为间隔给药三次。免疫后（第 70 天），血清被分析以检测免疫原特异性抗体（图 5A、B）。所有三种候选物 NanA、NanA-RhaPS 和 IdeS-RhaPS 在 ELISA 测定中均触发了显著高于安慰剂疫苗水平的抗体。鉴于载体蛋白 IdeS 是一种 A 群链球菌特异性蛋白，我们测试了 IdeS-RhaPS 是否也触发了针对 IdeS 的特异性抗体，这些抗体能够中和酶的蛋白酶活性。第 70 天采血的所有稀释度均显示，IdeS 的蛋白酶活性被中和了 >70%（图 5C），并且超过了之前 IdeS 免疫的阳性对照样本的中和能力。这些数据表明，IdeS-RhaPS 可能是一种双重靶向的疫苗候选物，既能靶向 A 群链球菌表面的碳水化合物，也能靶向分泌的蛋白酶 IdeS。 图 5 | 免疫后小鼠抗体效价和细胞因子水平评估研究。A, B 小鼠免疫研究（n=10）（70 天）。小鼠血清在免疫后被检测 IgG 抗体，免疫剂包括低 RhaPS 含量的 NanA-RhaPS、NanA 单独使用以及低 RhaPS 含量的 IdeS RhaPS。使用基于 ELISA 的检测方法评估小鼠血清中针对疫苗候选物的特异性抗体，结果显示所有免疫小鼠的 IgG 水平均升高。Y 轴：450 nm。统计分析采用方差分析（ANOVA），随后进行 Dunn 检验。*p<0.01；**P<0.001；***P<0.0001；ns - 无显著差异。C IdeS-RhaPS 免疫研究的小鼠血清（n =10）在 IdeS 中和试验中进行了测试。测试了从 1:6 到 1:180 的一系列稀释液，中和活性以与非血清对照相比的百分比显示。表示 D35 的重复数据。虚线，阳性对照血清；实线，阴性对照血清。D, E 免疫小鼠的脾细胞在用 NanA-RhaPS 重新刺激后被检测 IL-17A 和 IFN-γ 水平。统计分析采用方差分析（ANOVA），随后进行 Bonferroni 检验。*P<0.05；**P<0.001；****P<0.0001。 除了抗体分析外，我们还确定了这些缀合物是否能够诱导 B 细胞激活所必需的免疫细胞反应。我们测量了从免疫小鼠分离并重新刺激的脾细胞中的两个 T 细胞激活标志物（IFN-γ 和 IL-17A）。数据显示，在用相应免疫原刺激时，与 Mock（PBS）对照组相比，用 NanA、NanA-RhaPS 和 IdeS-RhaPS 免疫的小鼠体内显著触发了 IL-17A（图 5D、E）。此外，与 Mock 对照组相比，接受 NanA 或 NanA-RhaPS 的所有动物体内 IFN-γ 标志物显著更高（图 5E）。IdeS-RhaPS 免疫并未导致与 Mock 对照组相比 IFN-γ 水平升高。因此，在用 NanA-RhaPS 和 NanA 免疫的动物的脾细胞中，两种测试标志物均有所增加。相反，IdeS-RhaPS 源细胞仅在 IL-17A 细胞因子介质中显示出增加水平，表明 IL-17A 介导的免疫反应在免疫后可能发挥作用（图 5D、E）。 接下来，我们研究了纯度更高的糖缀合物（含有较少未缀合的载体蛋白）是否能够触发针对 RhaPS 的特异性免疫反应。三只兔子接受了免疫，并在第 35 天收集了免疫后血清。通过 ELISA 测试终端血清以检测抗 NanA-RhaPS 反应。所有三次免疫后采血均为阳性，而三次免疫前采血均未检测到重组产生的 RhaPS（补充图 7A）。通过进行 ELISA 分析，用 NanA-RhaPS 抗原包被的板被抗 NanA-RhaPS 血清识别，与免疫前血清相比（补充图 7B），也证实了这一点。最后，我们测试了在外膜上产生 RhaPS 的大肠杆菌细菌。当结合到产生 RhaPS 的细菌时，仅 NanA-RhaPS 血清检测到明显的碳水化合物模式，而在缺乏 RhaPS 基因簇的阴性对照菌株中则没有（补充图 7C），证实了 NanA-RhaPS 触发了针对 RhaPS 的特异性抗体。然后，我们使用定制的 ELISA 在没有任何载体蛋白的情况下测试血清，以脂质连接的提取 RhaPS（LL-RhaPS）作为目标抗原（补充图 8A–C）。ELISA 数据显示，来自一只代表性兔子（兔子 #1）的抗血清，无论是在免疫前还是免疫后用 NanA-RhaPS，都能识别脂质连接的 RhaPS。为了标准化效价，我们使用了商业化的抗 A 群碳水化合物抗体。根据生成的标准曲线（补充图 8B），我们分析了三只兔子在免疫前后的抗 RhaPS 效价。免疫后效价显著升高（补充图 8C）。 为了确定产生的 IgG 抗体是否能够识别所有 A 群链球菌表面的天然抗原，我们用免疫兔子血清进行了流式细胞术实验。用来自 NanA-RhaPS 免疫兔子的血清对各种 A 群链球菌 M 型和表达 GAC 的 S. dysgalactiae subsp. equisimilis（SDSE）进行检测，并与免疫前血清进行比较。所有测试的 A 群链球菌菌株均显示出与抗 NanA-RhaPS 免疫血清的结合。抗体检测到的细胞数量以及流式细胞术直方图揭示了 NanA-RhaPS 触发的抗体能够识别测试菌株，包括最近报道的主导 M1UK 系列的 M154486、最近用于人体挑战研究的 M75 血清型和 M89（图 6）。总体而言，这些结果与之前使用化学缀合的 RhaPS 背骨的报告一致。 图 6 | 代表性的抗体沉积直方图，显示 A 群链球菌 M 血清型和表达 GAC 基因簇的无乳链球菌亚种马链球菌（SDSE）菌株（Stg485 和 Stg652）。除 M2（1:100）外，所有菌株均用兔抗血清（1:1000）染色，分别来自免疫前（红色阴影）和免疫后（NanA RhaPS；蓝色阴影）接种组。顶部的数字显示了免疫前血清（红色）和 NanA RhaPS 免疫血清（蓝色）的几何平均荧光强度（gMFI），用于显示的直方图。 2.讨论 尽管 A 群链球菌感染在全球范围内具有重要意义，并且抗生素耐药性呈上升趋势，但目前尚无获许可的 A 群链球菌疫苗。细菌多糖是重要的疫苗抗原，但要有效，它们必须与载体蛋白缀合。这种糖缀合物疫苗展示了高效的抗原呈递能力，并能够发展出具有显著高亲和力抗体反应的强效记忆 B 细胞，这在最需要 A 群链球菌疫苗的幼儿中尤为重要。Lancefield GAC 是一种保守的、丰富的、免疫原性的表面结构，已被证明是一种优秀的糖缀合物疫苗候选物。然而，存在担忧的是，GlcNAc 侧链可能会引发不希望的免疫并发症。因此，我们重组生产了缺乏侧链的 GAC 背骨结构 RhaPS，它由聚鼠李糖均聚物组成，具有免疫原性的 →2-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-1→ 二糖重复单元，作为潜在 A 群链球菌疫苗的糖基成分。我们之前已经证明，表达 RhaPS 的大肠杆菌外膜囊泡（OMVs）在小鼠感染模型中是强抗原，并产生了针对所有测试的 A 群链球菌血清型的特异性杀菌抗体。然而，OMVs 的显著局限性在于它们可能是异源的，并且难以制造。同样，最近有报道称 A 群链球菌糖缀合物疫苗通过将 GAC 与金纳米颗粒、anAc-PADRE 脂质核心和截短的链球菌溶素 O 使用点击化学进行缀合，但这些方法的规模化、非天然氨基酸掺入和生产成本是主要考虑因素。 PGCT 是一种有吸引力的潜在低成本技术平台，可用于开发针对 A 群链球菌的定制糖缀合物疫苗，但由于当前 OTases 无法识别 A 群链球菌糖基结构而导致其未被测试。在本研究中，我们通过工程化 OTase 兼容的二糖结构克服了还原端基特异性限制，从而能够将 RhaPS 与来自不同物种的一系列载体蛋白缀合。我们通过结合 A 群链球菌途径与两种特征明确的痢疾杆菌碳水化合物途径，工程化了杂合糖基结构。对于本文中使用的还原端连接物，福氏痢疾杆菌 1 型的结构为 α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-GlcpNAc，宋内痢疾杆菌 2a 的结构为 α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-D-GlcpNAc。与 GAC 类似，糖基组装在膜的细胞质侧进行，发生在 Und-PP 上。然而，与 GAC 不同的是，重复单元通过 Wzx 翻转酶翻转到周质中，并通过 O-抗原聚合酶 Wzy 在周质中聚合。我们将相应的酶与 GacC-G 配对，以在相应的痢疾杆菌还原端基团上建立免疫优势的 GAC 重复单元。这些包括 S. pneumoniae 神经氨酸酶 NanA-RhaPS 的双重疫苗、灭活蛋白酶 IdeS-RhaPS 的双重疫苗以及已建立的类毒素载体 ExoA-RhaPS。我们证明了 PGCT 可以适应多种载体蛋白和糖基组合，这是开发糖缀合物疫苗以避免过度使用载体蛋白并避免潜在载体诱导的表位抑制的重要考虑因素。 我们研究的另一个新颖之处是首次合成了一个肽聚糖锚定的表面糖基（GAC/RhaPS），它在细胞质中构建其整个长度，然后通过 ABC 转运蛋白依赖途径转移，因此不依赖于在周质中进行重复单元组装，然后才能成功地通过 PGCT 转移到载体蛋白上。这增加了越来越多的多样化细菌糖基列表，如荚膜多糖 、O-抗原和糖蛋白，这些糖基可以作为基于 PGCT 的糖缀合物疫苗的糖基成分。 用重组 NanA-RhaPS 疫苗候选物进行的免疫研究表明，它们能够触发针对载体蛋白和 RhaPS 碳水化合物的抗体。与仅用 NanA 免疫的动物相比，用 NanA-RhaPS 免疫的小鼠体内 IFN-γ 和 IL-17A 细胞因子介质水平增加（图 5D、E）。我们推测，这些糖缀合物免疫动物中细胞因子介质的增加是由碳水化合物识别的 Th 辅助细胞驱动的，表明对 RhaPS 部分的适应性免疫反应，为这些重组糖缀合物疫苗候选物刺激蛋白质和糖基免疫反应的能力提供了有价值的信息。在针对 B 群链球菌 III 型糖缀合物疫苗的研究中，也得出了类似的观察结果和结论。所有测试的 S. pyogenes 血清型和产生 GAC 的 S. dysgalactiae subsp. equisimilis 菌株均被针对重组 NanA-RhaPS 产生的抗体检测到。用 IdeS-RhaPS 免疫的小鼠在 IgG 切割测定中显示出针对 IdeS 的功能性中和抗体。这些缀合物制剂中的游离蛋白含量可能解释了这种功能性，进一步对高纯度缀合物的分析将确定是否真正从 IdeS/RhaPS 产生了功能性载体抗体。顺序 SEC 纯化成功地显著提高了缀合物的纯度。然而，进一步的研究应专注于提高大肠杆菌细胞内的糖基化效率，以简化生产并提高产量。 总之，我们证明了糖工程为利用 PGCT 构建几种有前景的 A 群链球菌糖缀合物疫苗提供了新的机会。将 RhaPS 与多种蛋白质载体缀合证实了还原端连接基团策略的成功，这种策略可以更广泛地应用于其他重组糖缀合物疫苗的构建。我们目前还在利用相关链球菌病原体，这些病原体通过含有 GacB 同源酶的相关途径合成各自的表面碳水化合物。我们的平台技术应该允许类似地修改这些途径，类似于本报告中修改 A 群链球菌糖基的解决方案，将它们转化为 OTase 酶和 PGCT 糖缀合物生产的兼容底物。 3.方法 3.1.培养基和生长条件 大肠杆菌菌株在LB琼脂和LB肉汤、超级最佳肉汤（SOB：20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，2.4 g/L硫酸镁，0.186 g/L氯化钾，0.5 g/L氯化钠）、咸味超级最佳肉汤（SSOB：20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，2.4 g/L硫酸镁，0.186 g/L氯化钾，10 g/L氯化钠）、脑心浸液（BHI）肉汤和2倍酵母-胰蛋白胨（16 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，5 g/L氯化钠）中培养，温度为37°C或28°C，具体视情况而定。根据需要添加抗生素，浓度如下：氨苄青霉素100 µg/mL；红霉素150 µg/mL；链霉素40–80 µg/mL；卡那霉素50 µg/mL。 3.2.质粒构建 克隆。Shi1（pHD0677）和Shi2（pHD0768）是从合成基因（IDT）克隆到克隆质粒中，再通过XbaI和NcoI位点亚克隆到pBAD24载体（pHD0131）中。IdeS（失活）（pHD0769）是从合成基因块中克隆，并通过限制性克隆（InFusion，Takara）插入到XbaI和EcoRI线性化的空质粒pEXT21（pHD0788）中。IdeS片段的5′端包含信号肽。通过PCR和NcoI及XbaI消化，使用列出的引物和pHD0677作为DNA模板，获得Shi1衍生物质粒pHD0678-680。所有构建物均通过DNA桑格测序（邓迪大学DSTT测序设施）和/或全质粒测序（Plasmidsaurus）进行验证。ExoA通过EcoRI和BamHI位点克隆到pEXT21载体中，引物如下所示。 3.3.引物 pHD0678_679_fwd: CCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCG WbbP_XbaI_rev: CGACTCTAGATTAATCAGGAATCCCTAGTATTTTTAATAACTTTAC WbbR_XbaI_rev: CGACTCTAGATTACATTTTAAGACCATCTTTTATTCCTTTTAAATATAAATGC pHD0678_679_fwd: ATTCCATGGATGAACAAGTACTGCATCCTTGTGC pHD0678_679_fwd: CATGGGGTCAGGTGGGAC pHD0890_fwd: CTAGCGCCGCCGATCAG pHD0890_rev: GAGGATCCTCAGTGGTGGTGG 3.4.小规模糖缀合物表达和纯化 糖缀合物测试表达在rfaS细胞中进行。转化细胞在LB培养基中37°C过夜培养，用0.1 mM IPTG和0.2%阿拉伯糖诱导。含有pglB基因（cedA::pglB）的E. coli MAGIC细胞，其pglB基因在IPTG诱导型启动子下，通过电转化或化学转化在含有卡那霉素（50 µg/mL）的LB培养基中进行转化，并用10–100 ng的感兴趣质粒（表1）进行转化，然后在LB琼脂上用相应的选择抗生素卡那霉素（K，50 µg/mL）、氨苄青霉素（A，100 µg/mL）、链霉素（S，80 µg/mL）和红霉素（E，150 µg/mL）进行选择，即KASE。从平板上取1到5个菌落，在含有所需抗生素的LB培养基中37°C过夜培养。第二天早上，将培养物稀释1:100到新鲜的10 mL指定培养基中，加入0.2%（w/v）L阿拉伯糖（Sigma）和1 mM甘油（Sigma），在30 mL封闭试管中培养。在OD600达到0.5时，通过添加1 mM IPTG（用于pEXT21载体和染色体整合的pglB）促进诱导蛋白的表达。然后将培养物在28°C下再培养16小时，随后通过离心（5300 × g，4°C，15分钟）收获细胞。对于His纯化，将沉淀物重悬于1 mL裂解缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 8.0）中。使用BeadBug氧化锆裂解管（Sigma）在FastPrep均质器（MP Biomedicals）中裂解细胞，并通过离心去除不溶性物质。随后，通过Ni-NTA亲和层析（树脂）从细胞裂解液中纯化组氨酸标记蛋白，并在50 mM Tris HCl pH 8，300 mM NaCl，300 mM咪唑中洗脱。通过SDS-PAGE、Western blot和ELISA（如下所述）验证糖缀合物的产生。 3.5.大规模糖缀合物生产和纯化 为了进行下游分析，包括免疫研究、NMR和质谱分析，IdeS-RhaPS和NanA-RhaPS的生产被放大。菌株在含有KASE的LB培养基中37°C过夜培养，然后以1:100的比例稀释到预热的SOB或THY培养基中，含有相同的抗生素。当OD600达到约0.6时，将细胞转移到28°C，并用诱导混合物诱导，含有0.1 mM IPTG、0.2%阿拉伯糖、1 mM GlcNAc和10%甘油。在28°C下培养16–18小时后，通过离心（5000 × g，30分钟，4°C）收获培养物，将沉淀物重悬于含有蛋白酶抑制剂、溶菌酶、10 mM咪唑和2 mM TCEP的PBS缓冲液中。使用恒定细胞破碎器对细胞进行破碎。经过三次30kpsi的处理后，将样品进行离心（30k × g，30分钟，4°C），并将上清液结合到5 mL HPI MAC/NTA柱上，用Co2+充电。用含有15 mM咪唑和0.2 mM TCEP的PBS缓冲液洗涤结合的蛋白，并用含有500 mM咪唑和0.2 mM TCEP的PBS缓冲液洗脱。从NTA柱洗脱的分数通过SDS-PAGE检查，含有糖缀合物的分数通过离心（10kDa MWCO浓缩器）浓缩，并注入Superdex 75 16/600柱中，用无内毒素的PBS平衡。通过SDS-PAGE分析峰值分数，并用10kDa MWCO浓缩器浓缩至5 mg/mL。将游离载体蛋白和糖缀合物的混合物汇集并浓缩，用于小鼠免疫研究。 用于兔免疫研究的样品通过额外的Superdex 75 16/600纯化步骤进行处理。通过SDS-PAGE（考马斯亮蓝染色）判断，将仅含有糖基化蛋白而不含游离载体蛋白的峰值分数汇集。蛋白样品在25%甘油中快速冷冻，直至免疫。 为了进行NMR分析，通过高效液相色谱（HPLC）去除盐。将75 µL到5 mL（25%甘油中3.5–5 mg/mL）的糖缀合物样品注入，并通过C4柱（Perkin Elmer Epic C4柱或Phenomenex Jupiter 10 u C4 300Å 250×10 mm 10微米）进行处理。使用溶剂A（H2O加0.1%（v/v）TFA）和溶剂B（乙腈0.1%（v/v）TFA）以3 mL/min的速度应用溶剂梯度，起始条件为95%A和5%B。线性梯度逐渐增加到90%B。通过OD220识别含有蛋白样品的分数，通过SDS-PAGE分析进行确认，汇集并冷冻干燥。3.6.糖缀合物含量分析 通过NanoDrop和HPLC分析确定纯化糖缀合物的浓度。简而言之，将纯化的糖缀合物稀释至1.8 mg/mL，按照报道的程序进行TFA水解，然后通过HPAEC-PAD定量纯化的NanA-RhaPS糖缀合物样品中的鼠李糖。通过计算确定的值，计算蛋白与糖链的摩尔比。3.7.通过SDS-PAGE和Western blotting分析糖缀合物 His下拉和OD600匹配的周质提取物与LDS样品缓冲液混合，在95°C下变性10分钟，然后在4–12%双-三凝胶中用MOPS或MES缓冲液（Invitrogen，美国）分离。然后将凝胶电转印到硝酸纤维素膜上，该膜用PBS-T（PBS中含0.1% Tween-20）洗涤，并在4°C下摇动过夜，用兔抗GAC抗体（Abcam ab21034）以1:5000稀释，用小鼠抗His单克隆抗体（Thermo Fisher Scientific或Abcam ab216773，山羊pAb对兔IgG）以1:5000稀释，检测RhaPS和His标记的载体蛋白。或者，通过ab117504（小鼠mAb对His标记）检测His标记蛋白。用PBS-T洗涤三次后，在室温下用山羊抗兔IRDye 800CW和山羊抗小鼠IgG IRDye 680（LI-COR Biosciences）以1:10,000稀释液孵育30分钟。经过三次最终洗涤后，通过Odyssey CLx LI-COR检测系统（LI-COR Biosciences）在700和800 nm两个通道中检测荧光信号。 3.8.点样法 大肠杆菌细胞在5 mL指定培养基中培养，培养基中添加了适当的抗生素和0.2%（w/v）L-阿拉伯糖，在37°C下以180 rpm振荡过夜。将培养物归一化至OD600 = 5，通过离心（6000 × g，10分钟）沉淀，用无菌PBS洗涤三次。将2.5 µL的细胞悬浮液点在硝酸纤维素膜上，晾干30分钟。用PBST洗涤膜，并用抗GAC抗体（abcam9191）以1:5000的稀释度孵育45分钟。用PBST洗涤膜三次，然后在PBST中用山羊抗兔IRDye 800CW（LI-COR Biosciences）抗体以1:10000的稀释度孵育30分钟。荧光信号通过Odyssey LI-COR检测系统（LI-COR Biosciences）检测。3.9.核磁共振波谱 核磁共振波谱在Bruker AVANCE III 700 MHz波谱仪上记录，该波谱仪配备了5 mm TCI Z梯度低温探头（1H/13C/15N）。将10 mg的糖缀合物IdeS-RhaPS溶解在0.6 mL的D2O中，使用5 mm外径的NMR管在298 K下分析。化学位移以ppm为单位报告，使用D2O中的外部钠3-三甲基硅基-（2,2,3,3-2H4）-丙酸（TSP，δH 0.00 ppm）和D2O中的外部1,4-二氧六环（δC 67.40 ppm）作为参考。2D NMR实验，如1H,13C-HSQC和1H,13C-HMBC，其长程耦合的延迟时间为12.5 Hz，使用Bruker脉冲序列和TopSpin 3.2软件进行数据采集，TopSpin 4.1.3用于数据处理和分析。3.10.质谱分析 纯化的NanA-RhaPS和IdeS-RhaPS蛋白分别浓缩至3.1 mg/mL和3.5 mg/mL。将30微克的每种糖蛋白标准品悬浮在200 mM HEPES pH 8、40 mM Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）和40 mM氯乙酸胺（CAA）中，在95°C下处理5分钟，以还原和烷基化半胱氨酸残基。在胰蛋白酶消化之前，样品经过乙酸乙酯沉淀。将蛋白沉淀溶解在50 mM TEAB缓冲液中，胰蛋白酶以1:50（酶:底物）的比例加入。在37°C下孵育过夜后，将得到的糖肽/肽混合物在真空浓缩器中干燥，无需额外加热。对于胰凝乳蛋白酶，样品在25°C下孵育4小时。3.11.反相液相色谱-串联质谱 所有样品均悬浮在含有0.1%甲酸的水中。样品通过Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000系统分离，并与Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 480（配备FAIMS Pro装置）连接，使用仪器控制软件版本3.3。将样品加载到PepMap C-18捕获柱（0.075 mm×50 mm，3μm粒径，100 Å孔径）上，使用缓冲液A（0.1%甲酸，2%乙腈）以20 μL/min的流速加载5分钟，然后在300 nL/min的流速下通过15 cm×75μm的C18柱（柱材料：ReproSil C18，1.9μm）分离。对于nLC-MS/MS方法，每个实验的总时长为60分钟。通过改变缓冲液的组成，从3%缓冲液B（0.1%甲酸，80%乙腈）增加到30% B，历时23分钟，然后从30% B增加到45% B，历时3分钟，最后在30秒内迅速增加到98% B。将组成保持在98% B 3分钟，然后在30秒内降低到2% B，最后在3% B下保持20.5分钟。所有数据均在正离子模式下使用数据依赖采集模式收集。FAIMS分离使用以下设置：内外电极温度为100°C（除非另有说明）；静态FAIMS分析使用CV值为-20、-30、-35、-40和-50。在所有情况下，每次分析注入400 ng肽。离子源相对于地电位保持在2200 V，离子传输管温度保持在275°C。在350-2000的质荷比（m/z）范围内收集前体离子（MS1）的调查扫描，分辨率为60,000，归一化AGC目标为250%，最大注入时间为60 ms，RF透镜为50%，数据以轮廓模式采集。对于肽的同位素分布，启用单同位素质子选择（MIPS），选择z=2-8的前体进行数据依赖的MS/MS扫描，循环时间为3秒（除非另有说明），强度阈值为4.0e3，动态排除设置为40秒，前体单同位素周围设置±10 ppm的窗口。此外，启用MS/MS扫描的前体拟合，阈值为70%，在2 Da窗口内。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库提交给ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD037039。3.12.数据分析-肽和糖肽鉴定 使用Byonic v4.3.4（Protein Metrics Inc.）对原始数据文件进行批量处理，使用补充数据1中列出的蛋白质组数据库。对于所有搜索，设置半胰蛋白酶（慢速）特异性，并允许最多两次未切割事件。将羧基甲基化设置为半胱氨酸的固定修饰，而甲硫氨酸的氧化和蛋白质N端乙酰化作为可变修饰。允许最大前体质量容差为10 ppm，而HCD片段的质量容差设置为最多20 ppm。启用100至10,000 Da质量范围内的所有肽的通配符搜索，限制在天冬氨酸。使用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的切割特异性对每种蛋白样本进行搜索，设置蛋白质鉴定的最大假发现率（FDR）为1.0%。NanA和IdeS蛋白中鉴定的糖肽的HCD MS/MS光谱在补充数据2中举例说明。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库提交给ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD037039。手动检查鉴定的修饰肽，只有严格遵循蛋白酶切割特异性的肽才被考虑用于验证和定量。对于位点特异性相对定量，使用Skyline计算鉴定峰的提取离子色谱图。每个含有PTM位点的肽分别进行归一化，使其所有蛋白质形式的面积总和为100%。使用FragPipe计算平台（v18）验证肽序列覆盖率，使用MSFragger（v3.5）和Philosopher（v4.4.0）。使用MSFragger搜索引擎对肽进行鉴定，使用.raw文件。使用补充数据3中列出的蛋白质组数据库进行鉴定。使用默认功能将反转和污染蛋白序列作为诱饵添加到原始数据库中。酶特异性设置为“严格胰蛋白酶”或“胰凝乳蛋白酶”。允许最多两次未切割。同位素误差设置为0/1/2/3。肽长度设置为7至50，肽质量设置为500至5000 Da。将甲硫氨酸的氧化和蛋白质N端的乙酰化设置为可变修饰。将半胱氨酸的羧基甲基化设置为固定修饰。每个肽的可变修饰数量最多设置为3。3.13.通过气相色谱-质谱法分析单糖组成 将0.56 µg的IdeS-RhaPS糖缀合物与2纳摩尔的肌醇作为内标混合，分成三份，进行甲醇解、三甲基硅烷化和单糖组成分析，如前所述。TMS衍生化的样品通过GC-MS（安捷伦科技，7890B气相色谱系统，配备5977A MSD和安捷伦HP-5ms气相色谱柱，30m×0.25mm，膜厚0.25µm）分析。 3.14.伦理审批 小鼠实验获得了邓迪大学动物福利和伦理使用委员会的批准，并按照英国内政部批准的项目许可证 [PPL PEA2606D2] 进行。涉及兔子的实验与德国大卫生物技术公司合作进行。 3.15.小鼠和兔子免疫研究 小鼠模型：5 至 6 周龄的雌性 C57BL/6J 小鼠购自英国查尔斯河实验室。动物在免疫前适应环境 10 天。小鼠通过皮下注射 NanA-RhaPS（n=10）、NanA（n=10）或 IdeS-RhaPS（n=10）进行免疫。免疫原包含非糖基化载体蛋白和糖缀合物。在第 14 天和第 28 天进行了相同的加强注射。动物在第 70 天通过二氧化碳窒息安乐死，并通过心脏穿刺采血。安慰剂免疫小鼠（n=10）用于基线测量。所有组均以 1:1 的比例接受西格玛佐剂系统与免疫原。兔子模型：3 只新西兰白兔接受了 NanA-RhaPS 糖蛋白的三次等量剂量免疫（10 µL 的 3.5 mg/mL，含有 3 µg 的 RhaPS 和 35 µg 的 NanA，稀释在琥珀酸盐缓冲液中，并用 Adju-phos® [Invivogen] 佐剂）。免疫（每次注射每剂量 250 µL）在第 0 天、第 14 天和第 28 天进行，第 35 天进行终末采血以获取血清。第 0 天进行 PBS 注射。动物通过二氧化碳窒息安乐死，并通过心脏穿刺采血。所有免疫工作均由大卫生物技术公司进行。 4.酶联免疫吸附测定（ELISA） 多糖特异性 IgG 通过在 Nunc Maxisorp 96 孔板上涂覆 1 µg/孔的纯化 NanA-RhaPS 或 IdeS-RhaPS 重组蛋白（在无内毒素的 PBS 中）进行测量，板在 4 °C 下孵育过夜。第二天，板在加入小鼠或兔子抗血清 50 µL/孔（1:1000 稀释）之前进行洗涤，并在室温下孵育 1 小时。未结合的抗体通过用 ELISA 洗涤缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 PBS）洗涤板而去除。结合的抗体通过使用 50 µL/孔的 1:1000 的抗小鼠 IgG HRP（西格玛-奥德里奇）进行探测，并在室温下孵育 1 小时；使用 75 µL/孔的四甲基联苯胺底物（西格玛-奥德里奇）进行 HRP 检测，反应通过加入 75 µL/孔的 1 M H₂SO₄终止，并在 450 nm 处读取吸光度。 4.1.使用兔子血清的免疫印迹分析 从 NanA-RhaPS 免疫的兔子中获得的抗血清用于通过大肠杆菌细胞或链球菌斑点印迹和 Western 印迹分析进行结合测试。在大肠杆菌细胞的外膜上表达 Streptococcus mutans 和 A 群链球菌 RhaPS 的基因簇的过夜培养物被点样到硝酸纤维素膜上，干燥后用 5% 脱脂奶粉在 Tris 缓冲盐水、0.1% Tween® 20（TBS-T）中封闭。兔子血清在 TBS-T 中稀释 1:500。膜在室温下用兔子血清孵育 1 小时。然后膜用 TBS-T 洗涤三次，并使用荧光标记的 IRDye 抗兔子二抗进行两种印迹分析，ab216773（Abcam）稀释 1:5000。孵育 1 小时后，膜按上述方法洗涤，并使用 LICOR 仪器成像。 4.2.流式细胞术 通过流式细胞术分析对 A 群链球菌（GAS）表面的抗体结合进行分析，如文献 9 中所述。简而言之，过夜培养的 A 群链球菌细胞或 S. dysgalactiae subsp. equisimilis（SDSE）分离株表达 G 群碳水化合物（SDSE_GGC）基因簇或 SDSE 分离株替换 GGC 基因簇为功能性 A 群碳水化合物簇（SDSE_GAC）的细胞在第二天稀释 1:10。细胞用 PBS（流式缓冲液）中的 0.3% BSA 洗涤至 OD₆₀₀ 0.4。用人类 IgG（西格玛，英国）封闭细菌细胞上的非特异性结合位点 1 小时，然后用流式缓冲液再次洗涤，再与兔子免疫血清（1:1000 稀释）孵育过夜。洗涤后，细胞用检测抗体（Alexa fluor 488-偶联山羊抗兔子 IgG；赛默飞世尔，英国）重悬；用 4% PFA 固定细胞，然后通过流式细胞术（BD 生物科学）分析。共获取 20,000 个事件，使用 FlowJo 软件版本 10.6.2 分析直方图。 4.3.从大肠杆菌中制备脂质连接的（LL-）RhaPS 培养 1 升含有质粒 pHD0136 和 pHD01399 的大肠杆菌菌株至 OD₆₀₀ 0.5 的光学密度。细胞通过离心在 4000 × g 下收集 10 分钟，然后在 20 mL 缓冲的蔗糖（10 mM HEPES，pH 7.4，含 20% 蔗糖）中重悬。细胞悬浮液在冰上冷却 5 分钟，通过快速加入等体积的球形体缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.4，20 mM EDTA 和 300 µg/mL 溶菌酶）生成球形体，并在冰上孵育过夜。球形体通过离心在 4000 × g 下收集 10 分钟，重悬于 20 mL 含钙和镁的 HBSS（Gibco）中，并在冰上孵育 30 分钟。然后通过在冰上超声处理（使用 ½ 英寸探头，50% 振幅，四个周期，每次 15 秒开，30 秒关）使球形体破裂。细胞碎片通过离心在 20,000 × g 下收集 10 分钟，上清液转移至超速离心管。膜通过超速离心在 35,000 rpm（Type 50.2 Ti Rotor，~111,000 × g）下收集 30 分钟，温度为 4 °C。膜沉淀在 5 mL 含 0.5% SDS 和 200 µg/mL 蛋白酶 K 的 HBSS 中重悬，然后在 56 °C 下孵育 60 分钟。通过在 95 °C 下加热 10 分钟使残留的蛋白酶 K 失活，LL-RhaPS 样品储存于 -20 °C。 4.4.LL-RhaPS ELISA 对于 LL-RhaPS ELISA，LL-RhaPS 和大肠杆菌 pHD01399 的相应 LPS 样品在 PBS 中稀释 1:100，取 50 µL 液体转移至 96 孔 Maxisorp 板（Nunc）的孔中。板在 4 °C 下孵育过夜，然后用 3% BSA 在 PBS 中的 0.02% Tween 封闭，每孔 200 µL，在室温下孵育 1 小时。用 TBST 洗涤孔三次，然后用 100 µL/孔的抗血清或商业抗 GAC（Abcam）在封闭缓冲液中以各种浓度孵育 1 小时，温度为室温。用 TBST 再次洗涤三次后，孔用 1:10,000 稀释的 HRP-偶联山羊抗兔子 IgG 孵育 1 小时，温度为室温。用 PBST 洗涤板三次，然后用 50 µL/孔的 TMB 孵育，直到抗 GAC 标准显色。通过加入 50 µL/孔的 1 M H₂SO₄终止反应，并在 OD₄₅₀ 处测量吸光度。商业抗 GAC 抗体被赋予了 12,000 的任意效价，允许通过与标准曲线比较来确定血清样品的相对效价。 4.5.IdeS 中和试验 采用文献 64 中先前发表的方法进行 ELISA。Maxisorp 96 孔 ELISA 板（Nunc）用山羊抗人 Fab（西格玛）1/20,000 稀释液在 4 °C 下孵育过夜。10 ng 重组 IdeS 在 37 °C 下与血清稀释液预孵育 1 小时，然后加入 100 ng 人 IgG（西格玛）在测定稀释液（AD：1% BSA PBS-T 0.3% Tween-20）中，再在 37 °C 下孵育 3 小时。ELISA 板在加入测定样品 1 小时前用 AD 封闭 1 小时，然后加入测定样品 1 小时，接着用 1/20,000 稀释的山羊抗人 Fc-HRP（西格玛）孵育。所有步骤均在 37 °C 下进行，并用 PBS-T（0.05% Tween-20）洗涤三次。板用 100 µL TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，赛默飞世尔科学）在室温下孵育 15 分钟，然后加入 100 µL 1 M 硫酸终止反应。板在 SoftMax Pro 板式读取器上读取 450 nm 处的吸光度。信号与无血清测定条件、非免疫正常小鼠血清（NMS）和阳性对照血清进行比较。 4.6.细胞因子测定 根据 Moffitt 等人的协议，从小鼠脾细胞中测定由糖缀合物疫苗刺激的细胞因子介质。简而言之，新分离的小鼠脾脏用含有谷氨酰胺（Gibco）、10% FBS（Gibco）和 100 µ/mL 青霉素-链霉素（赛默飞世尔）的 RPMI 培养基冲洗。收获的细胞通过 40 µm 细胞筛过滤，并用 5 mL RPMI 培养基洗涤，通过在 300 × g 下离心 10 分钟收集细胞。向沉淀中加入 1 mL RBS 裂解缓冲液（BioLegend），然后孵育 1–2 分钟。向细胞中加入 10 mL RPMI 培养基，然后在 300 × g 下离心 10 分钟。将得到的沉淀重悬于 1 mL RPMI 培养基中，计数并调整至 7.5×10⁶ 个/mL。向 96 孔板的指定孔中加入 200 µL 细胞（1×10⁶ 个/mL），加入 50 µL 50 µg/mL 的重组蛋白（NanA-RhaPS），在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 3 天。细胞通过离心（400 × g，10 分钟）收集，用于进一步分析细胞因子介质 IFN-γ 和 IL-17A（赛默飞世尔）的 ELISA 分析。所有步骤均在室温下进行。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

Lund, Sweden, 7 January 2025. Hansa Biopharma AB, “Hansa" or the "Company” (Nasdaq Stockholm: HNSA), today announced that management will attend the 43rd Annual J.P. Morgan Healthcare Conference. If you are interested in a meeting, please contact Hansa Biopharma at ir@hansabiopharma.com. The Company has achieved several key milestones in the last 12-months across its three key therapeutic areas: Autoimmune, Gene Therapy and Transplantation. In Autoimmune, the company announced positive data from the 15-HMedIdeS-09 Phase 2 trial in Guillain Barre Syndrome (GBS) and indirect treatment comparison to the International Guillain-Barré Syndrome Outcome Study (IGOS) demonstrating the potential of imlifidase, the Company’s first-generation IgG cleaving molecule, to address a significant unmet need in GBS. Additionally, the GOOD-IDES-02 (Phase 3 trial in anti-GBM) completed enrolment and positive results from the NICE-01 Phase 1 trial and additional 12-month analysis for HNSA-5487, the Company’s second-generation IgG cleaving molecule, demonstrated rapid and robust IgG reduction and redosing potential. In Gene Therapy, the Company initiated two trials with gene therapy partners: SRP-9001-104 Phase 1b trial in Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) with Sarepta Therapeutics, Inc. (Nasdaq: SRPT) and GNT-018-IDES Phase 2 trial in Crigler-Najjar Syndrome with Genethon. In both trials, imlifidase is being evaluated as a pre-treatment to gene therapy in patients with anti-AAV antibodies. In Transplantation, randomization of the ConfIdeS (pivotal US Phase 3 trial in kidney transplantation) trial was completed. The Company had four consecutive quarters of strong IDEFIRIX (imlifidase) sales across Europe with Q3 2024 being the highest ever quarterly IDEFIRIX sales performance (69.5 MSEK/$6.4M), underscoring the important role that IDEFIRIX can play in desensitization in kidney transplantation. In 2025, the Company has several key milestones: Data read out of the pivotal US Phase 3 ConfIdeS trial for imlifidase and submission of a Biologics License Application (BLA) to the US Food and Drug Administration (FDA) in 2H 2025 Data read out of Sarepta Therapeutics’ Phase 1b trial SRP-9001-104 in DMD (2H 2025) Data read out of the GOOD-IDES-02 Phase 3 trial in anti-GBM HNSA-5487 development pathway alignment with regulatory agencies in neuro-autoimmune diseases (1H 2025) with an initial focus in myasthenia gravis (MG) Hansa is developing novel immunomodulating biologic therapies based on its proprietary, first in class IgG cleaving platform and is focused on IgG-driven immune mediated diseases. The Company has two IgG cleaving compounds including imlifidase, a first generation, first in class, single dose therapy with proven efficacy and safety and HNSA-5487, a second-generation IgG cleaving molecule with redosing potential. Imlifidase is conditionally approved in the EU for desensitization in kidney transplantation, with late-stage trials in autoimmune diseases where IgG is a driver of disease, and as a pre-treatment to gene therapy in patients with anti-AAV antibodies. --- ENDS --- Contacts for more information: Evan Ballantyne, Chief Financial Officer ir@hansabiopharma.com Stephanie Kenney, VP Global Corporate Affairs media@hansabiopharma.com Notes to editors About Imlifidase Imlifidase is a unique antibody-cleaving enzyme originating from Streptococcus pyogenes that specifically targets IgG and inhibits IgG-mediated immune response.1 It has a rapid onset of action, cleaving IgG-antibodies and inhibiting their activity within hours after administration. Imlifidase is conditionally approved in Europe and is marketed under the trade name IDEFIRIX® for the desensitization treatment of highly sensitized adult kidney transplant patients with a positive crossmatch against an available deceased donor.1 Full product information can be accessed via the initial Summary of Product Characteristics found here. About HNSA-5487 HNSA-5487 is Hansa Biopharma’s second-generation IgG-cleaving enzyme with the potential to prolong the IgG-low window and redosing potential. In the NICE-01 Phase 1b trial, HNSA-5487 demonstrated rapid and highly robust reduction of IgG levels by more than 95 percent within a few hours post treatment. In a 12-month follow up analysis IgG levels returned to normal range six months after initial dosing. This confirms that HNSA-5487 mirrors the extremely high efficacy of imlifidase, the Company’s first-generation IgG-cleaving enzyme, in reducing total IgG levels. No serious adverse events were observed and as previously communicated HNSA-5487 is safe and well tolerated. About Hansa and Kidney Transplantation Kidney disease can progress to kidney failure or End-Stage Renal Disease (ESRD), identified when a patient’s kidney function is less than 15%.2 ESRD poses a significant health burden, affecting nearly 2.5 million patients worldwide.2 A kidney transplant is the treatment of choice for suitable patients with ESRD because it offers improved survival and quality of life benefits, and is cost savings compared to long-term dialysis. There are approximately 170,000 kidney patients in the U.S. and Europe waiting for a new kidney.3 Highly sensitized kidney transplant patients have pre-formed antibodies called donor specific antibodies (DSAs) with a broad reactivity against human leukocyte antigens (HLAs), which can cause tissue damage and potentially transplant rejection.4 The presence of DSAs means that highly sensitized patients tend to have limited or no access to transplant, as finding a compatible donor organ can be particularly challenging.5,6 The complexity of their immunological profile means that highly sensitized patients spend longer time than average on transplant waiting lists, with evidence showing that this longer time waiting for a suitable donor relates to an increased mortality risk.7,8 Across the U.S. and Europe, highly sensitized patients comprise around 10-15% of the total of patients on transplant waiting lists.9,10 Imlifidase is a promising new strategy for desensitization of transplant patients with donor-specific anti-HLA (Human Leukocyte Antigens) antibodies (DSAs).11 Highly sensitized patients have high levels of these preformed antibodies that can bind to the donor organ and damage the transplant.4 Once they are inactivated with imlifidase, there is a window of opportunity for the transplant to take place. By the time the body starts to synthesize new IgG, the patient will be receiving post-transplant immunosuppressive therapy to reduce the risk of organ rejection. The efficacy and safety of imlifidase as a pre-transplant treatment to reduce donor-specific IgG was studied in four Phase 2 open-label, single-arm, six-month clinical trials.10-13 Hansa is collecting further clinical evidence and will submit additional efficacy and safety data based on one observational follow-up study and one post authorization efficacy study (PAES). About Hansa and Autoimmune Diseases Autoimmune diseases form a group of serious diseases caused by the immune system attacking the body. In many autoimmune diseases the immune system mistakenly recognizes the body’s own proteins, as foreign and mounts an immune response, creating antibodies to attack the body’s own cells and tissues.14-16 Pathogenic IgG can contribute to a broad spectrum of autoimmune diseases. Hansa Biopharma is exploring how imlifidase and HNSA-5487 may be able to prevent or slow the progression of these diseases and their debilitating, life-threatening symptoms. Imlifidase is currently being studied in the following autoimmune diseases: anti-glomerular basement membrane (anti-GBM) disease and Guillain-Barré Syndrome (GBS). HNSA-5487 is moving quickly into the clinical phase focusing on patients with myasthenia gravis (MG) and potentially other neuro-autoimmune diseases. About Hansa and Gene Therapy Imlifidase is currently being evaluated as a pre-treatment to gene therapy in areas of high unmet need. Many gene therapies are based on the use of Adeno Associated Viruses (AAV) vectors.17-19 In some patients the immune system carries antibodies that counteract the gene therapy treatment preventing its success.18-24 Pre-treatment with imlifidase prior to AAV-based gene therapy treatment has the potential to inactivate antibodies and thereby enable gene therapy in patients with pre-existing antibodies to AAV-based gene therapies.23 It is estimated that anti-AAV antibodies on average prevent 1 in 3 people from benefiting from gene therapy treatments.18-21 About Hansa Biopharma Hansa Biopharma is a pioneering commercial-stage biopharmaceutical company on a mission to develop and commercialize innovative, lifesaving and life-altering treatments for patients with rare immunological conditions. The Company has a rich and expanding research and development program based on its proprietary IgG-cleaving enzyme technology platform, to address serious unmet medical needs in autoimmune diseases, gene therapy and transplantation. The Company’s portfolio includes imlifidase, a first-in-class immunoglobulin G (IgG) antibody-cleaving enzyme therapy, which has been shown to enable kidney transplantation in highly sensitized patients and HNSA-5487, a second-generation IgG cleaving molecule with redosing potential. Hansa Biopharma is based in Lund, Sweden, and has operations in Europe and the U.S. The Company is listed on Nasdaq Stockholm under the ticker HNSA. Find out more at www.hansabiopharma.com and follow us on LinkedIn. ©2025 Hansa Biopharma AB. Hansa Biopharma, the beacon logo, IDEFIRIX, and IDEFIRIX flower logo are trademarks of Hansa Biopharma AB, Lund, Sweden. All rights reserved. References