Seasonal influenza virus vaccine quadrivalent(Sanofi Pasteur SA)

中文摘要目前公认的预防流感的最佳方法为疫苗接种。近年来，采用动物细胞大规模培养技术生产病毒性疫苗所凸显的安全性、经济性和时效性优势日益显著，将是未来流感疫苗工业化生产的发展趋势。如何利用动物细胞大规模培养的关键技术去提高流感病毒的产量，则是加强这些优势的关键所在。此文综述了流感疫苗及其生产方式、动物细胞大规模培养生产流感疫苗涉及的关键技术以及动物细胞大规模培养中影响病毒扩增效率的因素等方面的研究进展。正文流感病毒可引起季节性流感，甚至有可能引起大流行暴发，每年造成300~500万严重病例、30~60万死亡以及巨大的经济损失。目前公认的预防流感的最佳方法为疫苗接种。根据全球流感疫苗行动计划所设定的最终免疫计划，全球每年的流感疫苗需求量为107.8亿剂左右（以70%的世界人口和2剂免疫计算）。而根据WHO数据显示，2019年季节性流感疫苗和大流行流感疫苗的全球产能分别为14.8亿剂和83.1亿剂，仅为需求量的13.7%和77.1%。由此可见，目前流感疫苗的产能是不足的，亟待开发新颖且高效的流感疫苗生产方式。相较于传统的鸡胚生产工艺，利用动物细胞大规模培养技术生产流感疫苗来提高产能成为了近几年来流感疫苗工艺开发的重要关注点。如何利用动物细胞大规模培养的关键技术去提高流感病毒的产量，是建立高效、经济的流感病毒生产工艺的关键所在。1流感疫苗及其生产方式1.1流感疫苗目前上市的人用季节性流感疫苗多为三价或四价，包含甲型H1亚型、甲型H3亚型和1种乙型流感病毒（三价）或2种乙型流感病毒（四价）。季节性流感疫苗候选病毒株每年由WHO分别对南北半球做出推荐，并将分离得到的毒株下发至生产商进行生产。目前已在不同国家或地区获得生产许可并上市的人用流感疫苗有全病毒或裂解型灭活疫苗（如法国Sanofi Pasteur 公司的Vaxigrip®和Fluzone®、澳大利亚Seqirus公司的Flucelvax®和韩国SK chemicals公司的SKYCellflu® ）、减毒活疫苗（美国Medlmmune公司的FluMist®）和重组蛋白疫苗（法国Sanofi Pasteur公司的Flublok®），其中灭活疫苗为主要产品。此外，很多新型的流感疫苗制备技术如病毒样颗粒、病毒载体、核酸疫苗生产技术也在近些年得到了发展，已有部分成果进入了临床试验阶段。1.2流感疫苗生产方式流感疫苗目前仍主要采用鸡胚工艺生产，已有超70年的历史。尽管此技术已广泛采用自动化生产，但整体生产能力的提升以及全球范围内产量和质量的均一性仍受到严重限制，因为该技术存在许多缺点：需要鸡胚的充足供应，对大规模生产形成了挑战；鸡胚个体差异大，导致了病毒产量和免疫效果存在批次差异性；鸡胚原料容易存在外源病原体；部分人群对鸡胚蛋白过敏；容易与流行分离株的抗原错配。为了克服鸡胚工艺的诸多缺陷，动物细胞作为生产基质成为了新关注点。与鸡胚工艺相比，基于动物细胞培养工艺生产的流感病毒生长更佳且与原始病毒株的抗原匹配度更高，克服了部分人群对鸡蛋成分过敏的问题，过程可控且易于标准化，易于放大且生产不依赖原料供应，不仅可以提升季节性流感疫苗的生产效率和有效性，更有利于应对潜在的流感大流行暴发，可在短时间内快速生产大流行流感疫苗。因此，WHO、美国FDA等组织和多国政府鼓励采用动物细胞培养技术来取代传统的鸡胚工艺生产流感疫苗。目前上市的灭活流感疫苗中，鸡胚疫苗市场份额占到85%~90%，而采用动物细胞培养法生产的仅为10%~15%，说明后者的市场开发潜力巨大。1.3动物细胞大规模培养技术在流感疫苗生产领域的应用连续细胞系的出现使得采用生物反应器大规模生产病毒疫苗成为可能。目前，可用于连续培养的永生或转化细胞系如Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney，MDCK）、Vero、HEK293等细胞系已被应用于流感疫苗生产工艺中。针对不同细胞，可将生产工艺分为贴壁培养工艺和悬浮培养工艺。贴壁细胞培养工艺是使贴壁细胞在贴壁基质（滚瓶、方瓶或微载体等）的支持下生长至指定细胞密度后再进行病毒感染，感染前通常会辅以换液步骤。而悬浮细胞培养工艺的规模更容易放大，但不容易更换培养液，因此病毒感染前一般不进行换液。目前全球已上市的基于细胞培养技术生产的流感疫苗大多采用贴壁细胞培养法，且生产规模已相当可观。近年来，一些研究者开始将动物细胞无血清悬浮培养技术引入流感疫苗生产。悬浮培养的优点在于能够轻松放大到万升级别反应器生产体积；培养过程易于控制，培养条件（pH、温度、CO2等）可维持稳定均一，有利于保证产品产量和质量的一致性；操作简便，污染风险小。目前已开发出多种应用于流感疫苗生产的悬浮细胞系，如设计细胞系AGE1.CR和PER.C6细胞系，又如对流感病毒易感的MDCK 33016-PF、MDCK SUS2、PBG.PK2.1、EB66等细胞系。但是，目前在无血清的培养条件下，细胞悬浮培养法成本高且生产率低，生产的流感病毒滴度与鸡胚工艺相比并无优势。因此，开发快速高效的无血清悬浮培养工艺对流感疫苗制备产业来说意义重大。2动物细胞大规模培养生产流感病毒的关键技术2.1种毒株构建与制备基于动物细胞培养技术生产流感疫苗使用的病毒株需满足以下几点要求：（1）与流行株匹配。流感病毒高频率的变异和鸡胚生产工艺引起的疫苗株和流行株的错配，会降低流感疫苗的保护性。为了避免此问题，可采用合成和反向遗传技术构建种毒株。（2）具有高感染能力和扩增能力。前一点要求种毒株中感染性病毒颗粒数比例要高，以减小大规模生产中的病毒接种量，同时在多轮感染复制后仍产生较低水平的缺陷病毒颗粒。后一点则要求制备的种毒株能在短时间内感染复制并获得较高滴度，保证生产效率。病毒驯化、生产工艺优化以及病毒株的合成及筛选等技术手段均可以提高这两方面性能。2.2细胞系的选择和驯化流感疫苗的制备过程中，细胞系的选择会影响病毒产率、生物反应器配置以及纯化目标等多个生产工艺属性。利用代谢组学、RNA测序分析、基因编辑等新兴的分子生物学工具可定制具有高生长速率和高产率的细胞系（如PER.C6和CAP细胞）。应用于高效流感疫苗生产的细胞系应达到以下几点标准：高生长速率、高活率、易于放大、较低的代谢副产物生成速率以及绝对的安全性。表1展示了不同细胞系在批式培养工艺下的流感病毒生产结果比较，可发现MDCK细胞是公认的最适于流感病毒扩增的细胞基质之一，目前经批准上市的动物细胞基质流感疫苗多采用MDCK细胞。在细胞安全性这一标准中，连续细胞系可能会表现出成瘤性和致瘤性。近年来，越来越多针对细胞安全性的研究正在逐步消除人们对于成瘤性和致瘤性的担忧。首先，可通过限制细胞传代次数和剔除潜在的致癌基因片段来减少成瘤风险；其次，纯化技术的发展使得最终每剂产品中存在完整MDCK细胞的概率非常低（10-35~10-25）；另外，实验和风险模型都已证明动物细胞是安全的细胞基质，细胞提取物并不具有致瘤性，而成瘤性也仅出现于免疫缺陷裸鼠中。2.3培养基的开发为了达到生产工艺、产品安全性和经济性等方面的要求，选择适用于流感疫苗生产的培养基至关重要。血清和其他动物来源的成分如水解物、动物源蛋白等仍然普遍应用于流感疫苗的生产工艺中，但培养基的开发正朝着无血清、化学成分确定的方向发展。用于流感疫苗生产的培养基通常根据细胞系的性能和流感病毒的特性进行开发和优化，从而平衡细胞密度最大化、病毒产量最大化和质量最优化等几个目标之间的关系。此外，已有研究证明了培养基组分对细胞致瘤性也产生影响，而美国Medlmmune公司开发的Taubs+MediV SF103无血清培养基则不会使MDCK细胞转化为致瘤细胞。流感病毒感染细胞后导致细胞代谢发生根本性的改变，因此近年来以病毒复制期的细胞代谢为研究对象，针对性地设计并开发特异性维持培养基的研究日益增多。总而言之，用于流感疫苗生产的细胞培养基开发既要考虑细胞生长的要求，同时也需兼顾流感病毒扩增的要求。2.4生物反应器大规模培养由于病毒疫苗在结构及功能上的复杂性，细胞培养方式的选择和培养过程的参数控制会对产品的效价（如蛋白产量、病毒滴度）和质量（如病毒感染性、蛋白糖基化和其他转录后修饰）产生重大影响。动物细胞在生物反应器中的培养可分为批式培养、流加培养和灌注培养。针对不同的工艺目标，应选择不同的培养方式。批式培养操作简单，污染风险低，但随着培养后期营养物质的耗竭和代谢副产物的累积，最终产量受到影响；灌注培养占地面积小，单次运行产率高，灵活性好且产品质量更加稳定。但是灌注培养由于收获液体积庞大，往往给下游纯化带来挑战。对于培养操作参数的优化和控制，本质上基于物理学、化学和生物学原理，这些参数可以采用在线或离线方式进行监测和控制。美国FDA推出了过程分析技术计划，旨在通过实时监测原材料、工艺中涉及的物料以及工艺关键质量属性来设计、分析并控制生产工艺，以确保工艺的可靠性和最终产品的质量。而近年来介电谱技术、在线成像技术、质谱检测分析技术等的发展实现了对过程参数和细胞生理状态的实时监控。2.5病毒纯化经过多年发展，目前应用于工业规模的流感病毒下游纯化技术通常有密度梯度离心、过滤和层析方法。国外疫苗生产企业如法国Sanofi Pasteur公司、英国GSK公司和瑞士Novartis公司均曾采用上述方法纯化流感全病毒。近年来，基于过滤原理的超滤、微滤和切向流过滤等方法应用日渐广泛，可实现流感病毒的多倍数浓缩。针对此类方法，必须谨慎选择膜孔径和操作条件，使病毒的收率最大化。基于层析原理的纯化方法有离子交换色谱、体积排阻色谱、疏水色谱和亲和色谱等。此外，在实际应用中还可将多个操作单元（超速离心、超滤或过滤和柱层析）结合起来构建下游纯化工艺。目前针对动物细胞培养的流感病毒下游纯化工艺已有诸多研究，各种纯化方法或多或少地显示出了局限性，如难以实现大规模纯化、宿主细胞蛋白或DNA去除不完全、纯化材料的潜在毒性以及高昂的价格等。由此可见，设计开发新的流感病毒下游纯化技术，以克服以上局限性，获得回收率高、杂质去除效果好且经济的纯化工艺，仍任重道远。3动物细胞大规模培养中影响病毒扩增效率的因素流感病毒在细胞内的扩增效率可以用单细胞病毒产率（cell-specific virus yield，CSVY）来衡量，提高病毒滴度可通过提高细胞密度和CSVY实现。然而，当细胞密度上升时，往往会出现CSVY下降的现象，即细胞密度效应，是基于动物细胞培养技术的病毒疫苗生产中亟待解决的问题。3.1反应器控制相关操作条件反应器的控制条件主要包含pH和温度。对于采用动物细胞培养的流感病毒生产工艺，pH的选择不仅要满足细胞自身的正常代谢运作，还要满足病毒维持自身的生理特性要求（稳定性、感染活性、抗原性等）。有研究发现pH6.8~7.8时贴壁MDCK细胞产毒能力最佳，pH小于7.0时流感病毒血凝素滴度开始下降，pH大于7.6时病毒血凝素滴度比pH7.0~7.4低23%~29%；研究还进一步发现维持合适的产毒期pH值会改变细胞的周期分布和凋亡，且会影响胞内抗病毒蛋白的表达量，最终影响病毒的增殖效率。和pH一样，培养过程中的温度控制也需要同时考虑细胞和病毒的共同需求。对于细胞而言，温度最直接的影响是改变代谢速率，影响细胞对营养物质的消耗和利用，从而影响病毒产量。降温操作（降温至低于细胞最适生长温度）已应用于病毒批式培养生产工艺中，用于减少细胞自我分裂增殖过于活跃造成的营养消耗和代谢副产物累积，提高病毒产量。此外，有研究发现调节产毒期温度可以改变病毒颗粒的结构从而改变其抗原性，降温生产获得的病毒可在小鼠体内获得更高水平的中和抗体滴度。另有研究发现，温度还与病毒颗粒在培养液中的稳定性有关，当温度较高（＞35 ℃）时，培养液中的病毒产量在培养后期可能下降。3.2病毒感染复制相关过程参数病毒感染复数（multiplicity of infection，MOI）指感染时病毒颗粒数与细胞数的比值。病毒以扩散的形式在培养液中运动，提高MOI可增大病毒碰撞细胞并吸附进入其中的几率，但MOI过高则容易导致细胞产生高比例无感染性的干扰缺陷病毒颗粒，降低病毒产量；降低MOI可以减少大规模生产中的种毒液制备体积，但是MOI过低又会导致病毒颗粒在进入细胞之前便已降解或失活。有研究考察了 MOI对贴壁MDCK细胞扩增流感病毒的影响，发现MOI会影响病毒释放速率和产量。感染时间指的是病毒感染细胞时的细胞生长时间，感染时间决定了感染时的细胞密度和细胞生理状态，从而影响病毒的扩增效率。对于病毒培养液的收获时间而言，病毒在达到最大滴度后，其感染力以及颗粒总数可能会再次下降，而胞外宿主DNA和蛋白水平则会由于细胞裂解而显著增加，因此，必须结合产量要求和下游纯化要求来明确病毒收获时间。对于流感病毒而言，其表面的血凝素只有水解后才能活化，病毒因此才具备感染性。动物细胞中通常并不具备此类水解酶，因此需要在培养过程中额外添加。胰蛋白酶是最常用选择之一。Iskandar等研究了胰蛋白酶的来源（猪源、牛源、真菌源、重组类）和浓度对细胞生长和产毒的影响，结果发现使用猪源和牛源胰蛋白酶不仅可获得更高的细胞活率，且在最优化的浓度条件下可获得最高的病毒产量。3.3营养限制和代谢副产物累积如前文所述，细胞内的病毒扩增与细胞自身的代谢水平密切相关，需要合理利用培养基中的营养物并减缓代谢副产物的生成，以实现高效的病毒扩增。葡萄糖和谷氨酰胺是病毒RNA和蛋白合成必需的能量物质来源。研究证明，病毒感染后葡萄糖的代谢速率会发生改变，但会因宿主细胞系的不同而上升或下降。谷氨酰胺在流感病毒感染MDCK和HEK293细胞后也发生了显著的变化。对于蛋白质合成的必要物质氨基酸来说，Sidorenko和Reichl揭示了胞内游离的氨基酸池在高密度培养中有可能成为病毒复制的瓶颈。脂质类是合成细胞膜以及病毒囊膜的主要原料，还可以阻断宿主细胞的天然免疫应答，以确保病毒的大规模扩增。Tian等采用代谢组学的方法分析了流感病毒在早期感染中的宿主细胞代谢情况，发现其中一部分代谢物与脂类代谢途径相关。培养过程中的代谢副产物对产毒期细胞的生理状态和流感病毒的扩增有着显著的影响，研究发现超过20 mmol/L的乳酸与1~5 mmol/L的氨会对细胞生长产生负面影响。4展望随着全球流感的不断出现和流行，控制和预防流感病毒的快速传播取决于能否获得有效且安全的流感疫苗。动物细胞大规模培养技术在流感疫苗产品的生产中日益广泛，可更好地预防全球及区域性突发的流感病毒流行和暴发。认识培养环境和工艺操作条件等如何影响细胞生长代谢和病毒扩增，是基于动物细胞大规模培养技术的流感疫苗生产工艺中获得实现病毒高产率的关键所在。尽管目前利用动物细胞大规模培养技术生产流感疫苗仍有不少技术瓶颈存在和诸多问题亟待探明，但通过更加深入的研究，这些问题将有望一一解决，该技术也将被更大范围地推广到流感疫苗的产业化生产中，为流感的季节性流行和潜在大暴发的防控提供重要保障。作者吴熠潇1 综述    谭文松1，2 审校1华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2上海倍谙基生物科技有限公司，上海 201203通信作者：谭文松，Email：wstan@ecust.edu.cn引用本文：吴熠潇，谭文松. 动物细胞大规模培养生产人流感疫苗研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 300-305.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221125-00080识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

近日，全球疫苗四大天王中的两家——赛诺菲和GSK公布了2023H1业绩：赛诺菲净收入201.87亿欧元，同比增长4.4%，其中生物制药业务收入174.67亿欧元（+4.1%），疫苗业务收入23.90亿欧元（+11.9%），消费者保健业务收入27.20亿欧元（+6.1%）；GSK总营收141.29亿英镑，同比下降2%，其中专科药物营收47.59亿英镑（+21 %），疫苗营收40.63亿英镑（+16%），普药营收53.07亿英镑（+8%。）。下面主要看看这两家企业疫苗板块的情况。赛诺菲2023上半年，赛诺菲疫苗板块营收为23.90亿欧元，同比增长11.9%，表现强劲。具体到2023Q2季度，其疫苗板块营收12.23亿欧元，同比增长9.1%；其中，流感疫苗营收0.99亿欧元（-10.4%）、脊髓灰质炎系列疫苗营收6.17亿欧元（+12.4）、加强疫苗营收1.50亿欧元（+0.7%）、脑膜炎疫苗/旅行和地方性疫苗营收2.70亿欧元（-5.7%），其他疫苗营收0.87亿欧元（+258.3%）。在流感疫苗方面，2023年赛诺菲的流感疫苗销售情况与去年同期大致持平。流感疫苗表现的关键驱动因素为Efluelda在欧盟市场主要市场的扩张；在世界其他地区，四价流感疫苗（QIV）逐步替代三价流感疫苗（TIV）。流感疫苗表现的关键阻碍因素为疫苗接种覆盖率仍低于大流行前的水平；标准剂量疫苗的净价格遭受侵蚀。在疫苗管线的进展方面，赛诺菲提到了SP0202 (PCV21)、SP0125 (RSV toddler)和Beyfortus这三个产品。SP0202 (PCV21)PCV21是由SK bioscience与赛诺菲联合研发的21价肺炎球菌结合候选疫苗，其将特定蛋白与肺炎链球菌的多糖荚膜相结合。该疫苗覆盖21种血清型，高于目前市场上使用的PCV/13/15/20疫苗。据赛诺菲公布的PCV21疫苗的临床2期试验结果显示，该疫苗在安全性和免疫原性表现积极：PCV21在儿童人群中耐受性良好，所有4种剂量的安全性均与PCV13相当；与PCV20相比，PCV21的免疫反应良好。另外，PCV21不会干扰共同接种的推荐儿科疫苗（例如破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎和B型流感嗜血杆菌疫苗）的免疫原性和安全性。预计该疫苗将于2024年上半年启动临床3期试验，并于2027年提交上市申请。SP0125 (RSV toddler)SP0125为一款减毒活疫苗，也是首个被设计可用于保护所有幼儿的的RSV疫苗。据SP0125的1/2期数据显示，在安全性方面，SP0125与安慰剂类似；在疫苗应答方面，两次使用高剂量配方后，SP0125的疫苗反应强烈（93%），另外，低剂量和高剂量配方之间存在边际差异。赛诺菲预计该疫苗将于2024年上半年进入3期临床，并于2026年提交上市申请。BeyfortusBeyfortus是全球首个且唯一可广泛应用于婴儿人群的RSV预防用长效单克隆抗体，由赛诺菲和阿斯利康联合开发，通过结合表达于病毒粒子和受染细胞表面的RSV融合（F）蛋白达到中和RSV的目的，用于预防由RSV引起的下呼吸道疾病。据赛诺菲公布的Beyfortus 3b期临床试验HARMONIE的数据显示：该疫苗接种新生儿可以将RSV相关下呼吸道症状住院率降低83%，预计比孕妇接种RSV疫苗有效率高出3倍。2022年11月，Beyfortus获欧盟委员会批准，作为单剂量被动免疫疗法，用于所有新生儿和婴儿，在其第一个RSV季节预防RSV下呼吸道疾病（LRTI）；今年4月，该疫苗在加拿大获批上市；7月，Beyfortus又获得了FDA的监管批准。与GSK和辉瑞的RSV疫苗相比，Beyfortus聚焦的是婴儿群体，而前者则针对的是60岁及以上的老年人群。也就是说，目前Beyfortus在婴儿RSV预防领域尚无竞争对手。据赛诺菲预计，到2030年婴儿RSV预防市场的规模约为25亿欧元。葛兰素史克2023上半年，GSK疫苗板块营收为40.63亿欧元。具体到2023Q2季度，其疫苗板块营收20.22亿英镑，同比增长18%，与一季度持平，若不包含新冠业务则增长15%。其中，GSK的当家单品带状疱疹疫苗Shingrix继续保持强劲增势：2023年上半年，Shingrix营收17.13亿英镑，约等于2021年的全年销售额（17.21亿英镑）。Shingrix强劲的销售表现主要得益于其在全球范围内的扩张和需求的增长。值得注意的是，在报告期内Shingrix在日本获批用于18岁以上及高危成年人带状疱疹，目前Shingrix已在33个国家/地区获批上市。除了Shingrix外，同样保持双位数增长的还有脑膜炎疫苗，主要由b型脑膜炎疫苗Bexsero驱动。由于市场需求的增加以及被纳入国家免疫计划，Bexsero在2023Q2季度的销售额继续保持增长态势。在GSK的疫苗管线中，Arexvy和MenABCWY是公司的高潜力产品，预计其将推动公司业绩在未来几年内的持续增长。Arexvy是由RSV融合前（prefusion）F糖蛋白（RSVPreF3）与GSK公司专有的佐剂组合而成的一款RSV疫苗产品。2023年5月，Arexvy获得FDA批准上市，用于预防60岁及以上人群因RSV引起的下呼吸道疾病（LRTD），其也是全球首个获得监管机构批准的RSV疫苗。2023年6月，Arexvy在欧盟获批上市。据GSK表示，该疫苗产品是公司下一波疫苗创新的前沿。MenABCWY是一款脑膜炎疫苗Bexsero（脑膜炎球菌B群疫苗）和Menveo（脑膜炎球菌A、C、W和Y组结合疫苗）的结合疫苗。2023年5月，GSK公布了MenABCWY组合疫苗在3期试验中的初步积极结果：该候选疫苗在10-25岁的健康个体中间隔6个月接种两次，与接种2剂Bexsero和1剂Menveo相比，候选疫苗在5种奈瑟菌属脑膜炎球菌血清群（A、B、C、W和Y）的主要终点方面表现出非劣效性。此外，MenABCWY候选疫苗还在临床试验中表现出对110种不同的B型脑膜炎球菌（MenB）侵袭性菌株（占流行菌株的95%）的免疫效果。候选疫苗通常耐受良好，安全性特征与Bexsero和Menveo一致。截至目前，GSK共有68个疫苗产品和药品在研，17项已进入临床3期，覆盖抗感染、疫苗、传染、呼吸、肿瘤等领域。其中，疫苗管线有21个，包括1个注册，3个临床3期、9个临床2期、8个临床1期。此外，GSK还针对疫苗领域进行了2023年全年展望：排除大流行佐剂的销售，则销售额预计将增长15%左右，预计Shingrix将继续保持两位数增长，销量将再创佳绩；脑膜炎疫苗销售额预计将增长15%左右；流感疫苗预计销售额将下降，降幅降低至个位数。参考资料：赛诺菲、GSK 2023Q2业绩报告材料相关阅读：赛诺菲疫苗管线最新进展：12款候选产品，2年内推动5个项目进临床3期